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本发明提供一种和厚朴酚在制备抗肿瘤血管形成药物中的用途，该和厚朴酚英文名为honokiol，CAS number：35354－74－6，分子量：266.33，本发明制备的和厚朴酚药物包括制剂允许的药物赋形剂或载体。本发明提供的和厚朴酚也在制备临床肿瘤化疗药物中的应用。剂型主要包括肠道或非肠道组合药的剂型。制剂形式主要包括液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、滴丸剂或注射剂。本发明提供的和厚朴酚药物组合物可促进低氧诱导因子－1的分解、抑制血管内皮生长因子和一氧化氮合成酶的表达，可有效抑制肿瘤的血管形成，且毒性低，具有很好的临床抗肿瘤药的应用前景。

1.  和厚朴酚在制备抗肿瘤血管形成药物中的用途，和厚朴酚，英文名为honokiol，CAS number：35354-74-6，分子量：266.33，化学命名为：3，5’-diallyl-4，2’-dihydroxybiphenyl，分子式为C₁₈H₁₈O₂，其特征是：和厚朴酚与药物赋形剂或载体组合，在制备抗肿瘤血管形成药物中的应用。

2.  根据权利要求1所述的和厚朴酚在制备抗肿瘤血管生成药物中的用途，其特征是：在制备抗肿瘤化疗药物中的应用。

3.  根据权利要求1-2所述的和厚朴酚在制备抗肿瘤血管形成药物中的用途，其特征是：和厚朴酚的药物组合物，制剂形式主要包括液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、滴丸剂或口崩制剂。

4.  根据权利要求3所述的和厚朴酚药物组合物的制剂，其特征是：所述制剂的给药形式主要包括口服给药或注射给药。

和厚朴酚在制备抗肿瘤血管形成药物中的用途
技术领域
本发明属天然化合物的用途，涉及从植物提取的和厚朴酚的新用途，尤其涉及和厚朴酚在制备抗肿瘤血管形成药物中的用途。
背景技术
近年来，肿瘤生长中的血管新生问题正日益受到重视，积累了一些关于肿瘤血管新生依赖性的证据，并发现血管新生受控于一系列正负调控因子。正常细胞是非血管新生性的(nonangiogenic)，无论是在癌前期还是癌变转化期都必须发生从非血管新生性到血管新生性的表型转换，肿瘤才能得以生长。血管新生模型的组织学观察发现血管新生有几个明显的分期^【1】：血管通透性增加引起血浆蛋白外渗(extravasation)及周围细胞外基质的降解；排列于已存血管腔面的内皮细胞开始从亲代母血管向血管新生刺激物方向游走迁移；位于迁移游走前沿后面的内皮细胞增生，而位于最邻近新毛细血管的内皮细胞开始分化形成新的管腔；新形成的管腔将最终开放与血流相通，继而一些毛细血管不断延伸，另一些因回流量较低而收缩消失。
肿瘤组织的另一特点是形成新生血管以保证不断增殖的需要，血管形成愈丰富，肿瘤生长越旺盛^【2】。血管新生是由许多基因参与调控的整体过程，包括诱导型一氧化氮合成酶基因(iNOS)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF的II型受体(flt-1)、胶原-4脯氨酸羟化酶(collegen proly-4hydroxydationase)、组织金属蛋白酶抑制因子(TIMP)、尿激酶型血浆纤溶酶激活子受体(uPA受体)、血小板来源生长因子(PDGF)、血浆纤溶酶原激活抑制因子-1(PAL-1)等，这些基因都是低氧诱导因子-1(HIF-1)的直接靶基因^【2】，它们的表达产物参与新生血管形成的整个过程，因此，HIF-1在肿瘤新生血管形成过程中起着关键的作用。
肿瘤组织常处于低氧状态，低氧状态使肿瘤组织内的HIF-1含量增加，HIF含量增加导致肿瘤血管生成，肿瘤血管丰富，肿瘤得以迅速发展。反之，若能有效控制肿瘤血管的生成，肿瘤就不能生长。肿瘤血管生成已成为肿瘤治疗的最重要的靶点之一^【2】。
和厚朴酚是从植物厚朴中提取的一种天然化合物。其化学结构如下：

和厚朴酚在对其抗血栓^【3】、抗焦虑^【4】等体内实验时，证明能被胃肠道吸收，并具有体内滞留时间较长、没有明显毒副作用等特点。至今为止只有一篇报道和厚朴酚能抑制血管生成，但该报道只限于和厚朴酚阻断血管内皮生长因子(VEGF)对血管内皮生长因子II型受体磷酸化的阻断作用。而肿瘤血管生成的最关键因素是低氧诱导因子-1(HIF-1)及其作用的一系列靶基因的表达，如VEGF，一氧化氮合成酶等^【5】。
发明内容
本发明的目的是提供一种和厚朴酚在制备抗肿瘤血管形成药物中的用途，该和厚朴酚英文名为honokiol，CAS number：35354-74-6，分子量：266.33，化学命名为：3，5’-diallyl-4，2’-dihydroxybiphenyl，分子式为C₁₈H₁₈O₂，对人体毒性小，本发明制备的和厚朴酚药物包括制剂允许的药物赋形剂或载体。
本发明的另一个目的是提供和厚朴酚在制备临床抗肿瘤药物中的应用。
本发明所述的和厚朴酚药物可按本制剂领域已知方法制成肠道或非肠道组合药的剂型。制剂形式主要包括液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、滴丸剂或注射剂。
制剂的给药形式主要包括口服给药或注射给药。
本发明的关键之处是证明了和厚朴酚可抑制低氧诱导因子-1(HIF-1)的表达，促进低氧诱导因子-1的分解；和厚朴酚可抑制血管内皮生长因子和一氧化氮合成酶的表达；证明了和厚朴酚抑制血管生成的作用靶点。
本发明的有益效果如下：(1)和厚朴酚可有效抑制肿瘤的血管形成，实验证明该化合物可作用于低氧诱导因子-1，血管内皮细胞生长因子，一氧化氮合成酶等，能有效控制肿瘤血管的形成，具有临床应用前景；(2)和厚朴酚毒性低，而目前所用的临床抗肿瘤药物对人体都有较大的毒性；(3)和厚朴酚具有很好的临床抗肿瘤药的应用前景。
附图说明
图1A为和厚朴酚对人结肠上皮癌细胞系RKO细胞内低氧诱导因子-1mRNA含量的影响。
图1B为和厚朴酚对RKO细胞内低氧诱导因子-1mRNA含量影响的直方图。
图2A为和厚朴酚对RKO细胞内低氧诱导因子-1蛋白质含量的影响。
图2B为和厚朴酚对RKO细胞内低氧诱导因子-1蛋白质含量影响的直方图。
图3A为和厚朴酚对RKO细胞内血管生长因子mRNA含量影响。
图3B为和厚朴酚对RKO细胞内血管生长因子mRNA含量影响的直方图。
图4为和厚朴酚对RKO细胞内血管生长因子蛋白质含量的影响。
图5A为和厚朴酚对RKO细胞内一氧化氮合成酶的蛋白质含量的影响。
图5B为和厚朴酚对RKO细胞内一氧化氮合成酶的蛋白质含量影响的直方图。
图6A为和厚朴酚对RKO细胞内热休克蛋白70的mRNA含量的影响。
图6B为和厚朴酚对RKO细胞内热休克蛋白70地mRNA含量影响的直方图。
图7A为和厚朴酚对RKO细胞内热休克蛋白70的蛋白质含量的影响。
图7B为和厚朴酚对RKO细胞内热休克蛋白70的蛋白质含量影响的直方图。
图8为和厚朴酚对荷人大肠癌RKO细胞异种移植物的Balb/C裸鼠的治疗作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述：
实施例1：和厚朴酚对肿瘤细胞内低氧诱导因子-1(HIF-1)mRNA的抑制
HIF-1是肿瘤血管生成的最关键因子之一，HIF-1含量减少，肿瘤组织中的血管生成就会受阻，反之，肿瘤组织中的血管就会增生而促进肿瘤生长。
(1)实验材料：
细胞株：大肠癌细胞株RKO来源于美国American Type CultureCollection(ATCC)公司。
试剂：和厚朴酚，中国药品与生物制品鉴定所；逆转录试剂盒(Promage，美国)，逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)试剂盒，热稳定DNA合成酶(Taq酶上海生工)。
仪器：培养瓶，培养板，二氧化碳培养箱，PCR仪，FCM仪。
(2)实验方法：
细胞培养：分组：根据不同和厚朴酚浓度分为5组，分别以1、2、3、4、5表示。1组为对照；2组加氯化钴(CoCl₂)(150uM)；3组CoCl₂(150uM)+和厚朴酚0.1ug/ml；4组CoCl₂(150uM)+和厚朴酚0.5ug/ml；5组CoCl₂(150uM)+和厚朴酚1ug/ml。
药物诱导：RKO细胞2×10⁴每孔接种于24孔板，每组3个复孔；用含3％小牛血清的RPIM1640培养基稀释和厚朴酚储存液(5mg/ml)，充分混匀，配成所需浓度，并以此更换细胞培养液；药物作用1小时后加入CoCl₂(对照组除外)，使其终浓度为150uM，继续培养3小时。收集细胞，提取RNA或蛋白质，做相应的RT-PCR。
RT-PCR：收集细胞，弃去培养液，冰生理盐水洗3次后用RNA提取试剂Trizol(每孔400ul)提取细胞RNA(按Trizol试剂说明进行)。RNA逆转录成cDNA按逆转录试剂盒方案进行，引物为寡核苷酸脱氧胸腺嘧啶(OligodT)。PCR的引物如表1。
表1：引物序列
Primers    Upstream primer(5’-3’)    Downstream primer(5’-3’)    Size(bp)
HIF-1α          CCAGTTACGTTCCTTCGATCAG      TCACCAAACAGAGCAGGAAAAG        143
PCR的反应体系按照PCR试剂盒方案进行。
PCR条件如下：
HIF-1：94℃ 5分钟→35循环{94℃30秒→54℃30秒→72℃30秒}→72℃5分钟。
PCR产物电泳：用1×TAE【三羟甲基氨基甲烷(tris)-冰醋酸-二乙胺四乙酸(EDTA)】电泳缓冲液配制1.5％琼脂糖凝胶，加0.1％溴化乙啶(EB)按说明制成水平DNA电泳胶块。加2×上样缓冲液，加样于加样孔，100V恒压电泳约20分钟。紫外成像仪上摄像。
(3)实验结果：
参见图1A和图1B，图1A：用RT-PCR法检测，细胞在化学低氧环境下用不同浓度和厚朴酚处理4小时。可见随着和厚朴酚浓度增加，HIF-1mRNA含量减小。泳道1：常氧对照；泳道2：CoCl₂；泳道3：CoCl₂+0.1μg/ml和厚朴酚；泳道4：CoCl₂+0.5μg/ml和厚朴酚；泳道4：CoCl₂+1.0μg/ml和厚朴酚。β-actin为内对照。图1B：各组HIF-1αRT-PCR产物的条带灰度值分别除去相应β-actin条带的影响因子。图中组别1-5分别代表常氧对照、CoCl₂低氧对照、CoCl₂+0.1μg/ml和厚朴酚、CoCl₂+0.5μg/ml和厚朴酚和CoCl₂+1.0μg/ml和厚朴酚。CoCl₂(150uM)诱导3hrs对RKO细胞HIF-1αmRNA表达有微弱的上调。和厚朴酚浓度依赖性下调RKO细胞HIF-1αmRNA表达，0.1、0.5和1ug/ml三个浓度分别比CoCl₂对照组下调7.6％、15.9％和46.7％，说明和厚朴酚0.1-1ug/ml之间浓度时抑制HIF-1α基因转录。
实施例2：和厚朴酚对肿瘤细胞内低氧诱导因子-1(HIF-1)蛋白质的抑制
实施例1表明和厚朴酚可抑制HIF-1的基因转录，但并没有证明和厚朴酚可使肿瘤细胞中的HIF-1蛋白质含量也下降。该实施例证明和厚朴酚有此作用。
(1)实验材料：
细胞株：大肠癌细胞株RKO来源于美国ATCC公司。
试剂：和厚朴酚，中国药品与生物制品鉴定所；聚偏氟乙烯膜(PVDF)膜(Bio-Rad公司)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠抗体(KPL，美国)，鼠抗人HIF-1α(NeoMarkers，美国)，化学发光检测系统ECL反应液(SantaCruz公司)，蛋白质测定试剂盒(DC Protein Assay Kit，Bio-Rad公司)，免疫组织化学试剂盒(福州迈新公司)。
仪器：培养瓶，培养板，二氧化碳培养箱，电泳仪，电转膜仪。
(2)实验方法：细胞培养：分组：根据不同和厚朴酚浓度分为5组，分别以1、2、3、4、5表示。1组为对照；2组加CoCl₂(150uM)；3组CoCl₂(150uM)+和厚朴酚0.1ug/ml；4组CoCl₂(150uM)+和厚朴酚0.5ug/ml；5组CoCl₂(150uM)+和厚朴酚1ug/ml。
药物诱导：RKO细胞2×10⁴每孔接种于24孔板，每组3个复孔；用含3％小牛血清的RPIM1640培养基稀释和厚朴酚储存液(5mg/ml)，充分混匀，配成所需浓度，并以此更换细胞培养液；药物作用1小时后加入CoCl₂(对照组除外)，使其终浓度为150uM，继续培养3小时。收集细胞，提取RNA或蛋白质，做西部印迹法(Western Blot)检测细胞内的HIF一1蛋白质含量。
Western blot：收集培养细胞，用生理盐水洗两次，细胞沉淀加入1×蛋白提取缓冲液(protein extract buffer)，吹散，沸水中煮15min，13000转速(rpm)离心20分钟，取上清测定蛋白质浓度(按DC Protein Assay Kit说明书进行)。取蛋白提取物50ug，加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5分钟，做SDS-PAGE电泳，积层胶恒压50V，分离胶恒压100V，电泳至溴酚蓝染料到达凝胶最前沿，停止电泳。
转膜：电泳结束后揭胶，并将凝胶浸于适量的转膜缓冲液(Transfer buffer)中，平衡30分钟。同时截取适当大小的PVDF膜和2张3M滤纸，将PVDF膜先在无水甲醇中浸湿，然后同滤纸一同浸于Transfer buffer中，平衡10～15分钟，膜放阳极、胶放阴极，两面各垫2张3M滤纸，恒流110mA，4℃层析柜中转膜过夜。
封闭：将转有蛋白的膜浸于含10％脱脂奶粉的缓冲液(TBST)中封闭1hr。杂交：取出已封闭的膜，然后浸于1：400-500稀释的鼠抗人HIF-1(用含5％脱脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，4℃过夜，TBST漂洗5min×5次，再浸于1∶10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(用含5％脱脂奶粉的TBST、pH 7.4配制)中，TBST漂洗5分钟×5次。
压片、洗片：取出膜，配制显色液(ECLA液0.7ml+ECL B液0.7ml)，加在膜上，5分钟后吸去多余液体，保鲜膜封膜，固定在暗盒内，压片，洗片。
(3)实验结果
参见图2A和图2B，图2A：细胞在化学低氧环境下用不同浓度和厚朴酚处理4小时。用Western Blot方法检测，可见随着和厚朴酚浓度增加，HIF-1蛋白质含量A表达减小，泳道1：常氧对照；泳道2：CoCl₂；泳道3：CoCl₂+0.1μg/ml和厚朴酚；泳道4：CoCl₂+0.5μg/ml和厚朴酚；泳道4：CoCl₂+1.0μg/ml和厚朴酚。β-actin为内对照)。图2B：各组HIF-1α蛋白条带的灰度值分别去除相应β-actin条带的影响因子。图中组别1-5分别代表常氧对照、CoCl₂低氧对照、CoCl₂+0.1μg/ml和厚朴酚、CoCl₂+0.5μg/ml和厚朴酚和CoCl₂+1.0μg/ml和厚朴酚。RKO细胞基础水平HIF-1α蛋白表达较低，不易检测到。CoCl₂150uM诱导3小时显著上调RKO细胞HIF-1α蛋白表达。和厚朴酚浓度依赖性下调CoCl₂(150uM)所致的RKO细胞HIF-1α蛋白积聚(参见图2A)。把western blot结果用图像软件(Scion Image)换算成灰度值，并作直方图(参见图2B)，可以看出，CoCl₂(150uM)诱导的HIF-1α蛋白积聚比1组(空白对照组)增加约13倍。和厚朴酚0.1ug/ml浓度时，对CoCl₂所致的HIF-1α蛋白积聚没有明显影响，而0.5和1ug/ml浓度时，梯度抑制CoCl₂所致的HIF-1α蛋白上调，与2组(CoCl₂对照组)相比分别下调28％和63.9％。和厚朴酚三个浓度对RKO细胞HIF-1mRNA及蛋白水平的影响趋势基本一致。此结果说明和厚朴酚可使细胞内的HIF-1α蛋白质含量下降。
实施例3：和厚朴酚对RKO细胞血管生长因子(VEGF)mRNA表达的影响
HIF-1可上调血管生长因子VEGF，后者刺激肿瘤血管生成。和厚朴酚可下调HIF-1，肿瘤细胞内HIF-1下降，VEGF也理应下降。以此推理，和厚朴酚处理肿瘤细胞，VEGF也应该下调。
(1)实验材料
细胞：大肠癌细胞株RKO来源于美国ATCC公司。
试剂：逆转录试剂盒和PCR试剂盒为美国Promega公司产品。和厚朴酚，中国药品与生物制品鉴定所。
仪器：PCR仪。
(2)实验方法
药物诱导：RKO细胞2×10⁵接种于6孔板，用含10％小牛血清的RPIM1640培养基常规培养24小时，使贴壁；用含3％小牛血清的RPIM1640培养基稀释和厚朴酚储存液(5mg/ml)，充分混匀，配成所需浓度，并以此更换细胞培养液；药物作用1小时后加入CoCl₂(对照组除外)，使其终浓度为150uM，培养4小时后更换培养液，以除去CoCl₂，继续用不同浓度的和厚朴酚作用3小时。收集细胞，提取RNA，逆转录成cDNA，做PCR检测VEGF的丰度。PCR引物如下：
引物      上游引物(5’-3’)      下游引物(5’-3’)        产物(bp)
VEGF-A    GCAGAATCATCACGAAGTGG    GCATGGTGATGTTGGACTCC    212
反应条件如下：
VEGF-A：95℃5分钟→35循环{95℃30秒，56℃30秒，72℃1分钟}→72℃7分钟。
PCR产物电泳：用1×TAE电泳缓冲液配制1.5％琼脂糖凝胶，加0.1％EB按说明制成水平DNA电泳胶块。加2×上样缓冲液，加样于加样孔，100V恒压电泳约20分钟。紫外成像仪上摄像。
(3)实验结果：
不同浓度和厚朴酚作用于常氧或CoCl₂(150uM)模拟低氧组RKO细胞4hrs，取总RNA逆转录为cDNA，作PCR分析。参见图3A和图3B，图3A：细胞在化学低氧环境下用不同浓度和厚朴酚处理4小时，用RT-PCR方法检测，可见随着和厚朴酚浓度增加，VEGF的mRNA含量减小。泳道1：常氧对照；泳道2：CoCl₂；泳道3：CoCl₂+0.1μg/ml和厚朴酚；泳道4：CoCl₂+0.5μg/ml和厚朴酚；泳道4：CoCl₂+1.0μg/ml和厚朴酚，β-actin为内对照。图3B：各组VEGFRT-PCR产物的条带分别除去其相应β-actin条带的影响因子，其中组别1-5分别代表常氧对照、CoCl₂低氧对照、CoCl₂+0.1μg/ml和厚朴酚、CoCl₂+0.5μg/ml和厚朴酚和CoCl₂+1.0μg/ml和厚朴酚。CoCl₂(150uM)显著上调RKO细胞VEGF mRNA表达，PCR产物条带的灰度值是对照组的1.7倍。和厚朴酚0.1-1ug/ml浓度时，剂量依赖性下调模拟低氧引起的VEGF mRNA表达上调。1ug/ml浓度时灰度值比低氧对照组下调44％，具有显著差异，说明和厚朴酚可抑制VEGF的表达。
实施例4：和厚朴酚对RKO细胞VEGF蛋白质表达的影响
实施例3证明和厚朴酚处理肿瘤细胞后，细胞内VEGF mRNA水平下降，但不表明细胞内VEGF的蛋白质水平下降。检测细胞内VEGF蛋白质的水平是必需的。
(1)实验材料
细胞：大肠癌细胞株RKO来源于美国ATCC公司。
试剂：鼠抗人VEGF和免疫荧光试剂盒为福州迈新公司产品。和厚朴酚，中国药品与生物制品鉴定所。
仪器：德国蔡氏荧光显微镜。
(2)实验方法
药物诱导：RKO细胞2×10⁵接种于6孔板，用含10％小牛血清的RPIM1640培养基常规培养24小时，使贴壁；用含3％小牛血清的RPIM1640培养基稀释和厚朴酚储存液(5mg/ml)，充分混匀，配成所需浓度，并以此更换细胞培养液；药物作用1小时后加入CoCl₂(对照组除外)，使其终浓度为150uM，培养4小时后更换培养液，以除去CoCl₂，继续用不同浓度的和厚朴酚作用3小时。收集细胞，用鼠抗人VEGF与细胞温育，再用荧光素FITC标记兔抗鼠IgG标记细胞，在荧光显微镜下观察细胞的荧光强度。荧光越强表示VEGF含量越高。
(3)实验结果
RKO细胞经150uM CoCl₂作用4小时，并用不同浓度和厚朴酚处理8小时，检测细胞内高分子量VEGF(34-50kDa)的表达量。34-50kDa蛋白是细胞内非分泌形式的VEGF，当被剪接成189kDa、165kDa、121kDa等活性分子后，即被分泌出细胞，产生血管内皮生长因子的生理作用。我们用FITC荧光标记的二抗结合经VEGF一抗作用的细胞涂片，在荧光显微镜下观察，发现150uM CoCl₂作用后的RKO细胞高分子量VEGF阳性细胞数明显增加，荧光主要分布在细胞质，不同浓度和厚朴酚(0.1-1ug/ml)作用8小时明显减少模拟低氧引起的阳性细胞增加。每组随机取150个细胞进行统计，结果参见图4，细胞在化学低氧环境下用不同浓度和厚朴酚处理8小时，用荧光免疫组织化学法检测RKO细胞内的荧光强度，荧光值反映VEGF的表达量，可见随着和厚朴酚浓度增加，高分子量VEGF的蛋白表达量减少，组别1-5分别代表常氧对照、CoCl₂低氧对照、CoCl₂+0.1μg/ml和厚朴酚、CoCl₂+0.5μg/ml和厚朴酚和CoCl₂+1.0μg/ml和厚朴酚，“**”表示与常氧对照组相比P＜0.01；“+”表示与低氧对照组相比P＜0.05；“++”表示与低氧对照组相比P＜0.01。
CoCl₂(150uM)作用4小时明显上调RKO细胞内VEGF蛋白表达，其荧光值比对照组增加5.6倍，T检验两组间差异非常显著(P＜0.01)。和厚朴酚0.1-1ug/ml均表现为下调CoCl₂引起的VEGF表达增加，其中H0.1组比单独低氧组减少29.5％(P＜0.01)，H0.5组和H1组分别减少76.4％和80％，与单独低氧组相比均有显著差异(P＜0.05)。该实验证明，和厚朴酚处理肿瘤细胞后，细胞内VEGF蛋白质含量下降。
实施例5：和厚朴酚对诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)的影响
iNOS是HIF-1调控的一个重要的下游基因，该基因的表达可促经肿瘤组织中的血管生成。由于和厚朴酚可下调HIF-1，因此也会引起iNOS表达的下调。
(1)实验材料
细胞：细胞：RKO细胞来源于美国ATCC公司。
试剂：和厚朴酚，中国药品与生物制品鉴定所；鼠抗人iNOS(NeoMarkers，美国)，HRP标记的羊抗鼠抗体(Santa Cruz，美国)。化学发光检测系统ECL反应液(Santa Cruz，美国)
仪器：电泳仪，电转膜仪
(2)实验方法
药物诱导：RKO细胞2×10⁴每孔接种于24孔板，每组3个复孔；用含3％小牛血清的RPIM1640培养基稀释和厚朴酚储存液(5mg/ml)，充分混匀，配成所需浓度，并以此更换细胞培养液；药物作用1小时后加入CoCl₂(对照组除外)，使其终浓度为150uM，继续培养3小时。收集细胞，提取RNA或蛋白质，做Western Blot检测细胞内的HIF-1蛋白质含量。
Western blot：收集培养细胞，用生理盐水洗两次，细胞沉淀加入1×proteinextract buffer，吹散，沸水中煮15分钟，13000转/分钟(rpm)离心20分钟，取上清测定蛋白质浓度(按DC Protein Assay Kit说明书进行)。取蛋白提取物50ug，加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5分钟，做SDS-PAGE电泳，积层胶恒压50V，分离胶恒压100V，电泳至溴酚蓝染料到达凝胶最前沿，停止电泳。
转膜：电泳结束后揭胶，并将凝胶浸于适量的Transfer buffer中，平衡30分钟。同时截取适当大小的PVDF膜和2张3M滤纸，将PVDF膜先在无水甲醇中浸湿，然后同滤纸一同浸于Transfer buffer中，平衡10～15分钟，膜放阳极、胶放阴极，两面各垫2张3M滤纸，恒流110mA，4℃层析柜中转膜过夜。
封闭：将转有蛋白的膜浸于含10％脱脂奶粉的TBST中封闭1小时。杂交：取出已封闭的膜，然后浸于1：400-500稀释的鼠抗人iNOS(用含5％脱脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，4℃过夜，TBST漂洗5分钟×5次，再浸于1：10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(用含5％脱脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，TBST漂洗5分钟×5次。压片、洗片：取出膜，配制显色液(ECLA液0.7ml+ECL B液0.7ml)，加在膜上，5分钟后吸去多余液体，保鲜膜封膜，固定在暗盒内，压片，洗片。
(3)实验结果
参见图5A和图5B，图5A：细胞在化学低氧环境下用不同浓度和厚朴酚处理4小时，用Western Blot法检测，可见随着和厚朴酚浓度增加，HSP70蛋白含量减小，β-actin为内对照。图5B：各组iNOS蛋白条带分别除去其相应β-actin条带的影响因子，图中组别分别代表常氧(N)和低氧(H)时不同和厚朴酚(0-1ug/ml)作用浓度。每组取50ug蛋白进行Western blot检测，RKO细胞基础水平iNOS蛋白表达丰度较高。CoCl₂(150uM)模拟低氧时，轻度上调RKO细胞iNOS蛋白表达，其Western blot条带的灰度值与常氧对照组相比增强了21.4％。常氧组和厚朴酚0.1-1ug/ml之间浓度表现为剂量依赖性iNOS蛋白表达下降，但0.1ug/ml浓度与对照组相比反而微弱上调，这可能由实验误差造成，也可能表示该浓度对常氧时iNOS蛋白表达无明显影响。化学低氧时，和厚朴酚0.1-1ug/ml之间浓度也表现为剂量依赖性iNOS蛋白表达下降，0.1ug/ml浓度与CoCl₂单独作用组相比无明显差别，说明该浓度对常氧和化学低氧RKO细胞iNOS蛋白表达无明显影响。比较常氧组与低氧组Westernblot条带的灰度值，发现相同剂量和厚朴酚对RKO细胞iNOS蛋白表达的影响与环境氧含量无明显相关，说明和厚朴酚对RKO细胞iNOS蛋白的调节不受氧分压影响。
该实验结果说明：和厚朴酚可抑制iNOS的表达。
实施例6：和厚朴酚对RKO细胞HSP70mRNA的影响。
(1)实验材料
细胞：RKO细胞来源于美国ATCC公司。
试剂：和厚朴酚，中国药品与生物制品鉴定所；逆转录试剂盒和PCR试剂盒为美国Promega公司产品。
仪器：PCR仪。
(2)实验方法
药物诱导：RKO细胞2×10⁵接种于6孔板，用含10％小牛血清的RPIM1640培养基常规培养24小时，使贴壁；用含3％小牛血清的RPIM1640培养基稀释和厚朴酚储存液(5mg/ml)，充分混匀，配成所需浓度，并以此更换细胞培养液；药物作用1小时后加入CoCl₂(对照组除外)，使其终浓度为150uM，培养4小时后更换培养液，以除去CoCl₂，继续用不同浓度的和厚朴酚作用3小时。收集细胞，提取RNA，逆转录成cDNA，做PCR检测VEGF的丰度。PCR引物如下：
引物     上游引物(5’-3’)         下游引物(5’-3’)         产物(bp)
HSP70    CAAGATCAGCGAGGCTGACAAG    AACTGTACACAGGGTGGCAGTG    500
反应条件如下：HSP70：95℃5分钟→35个循环{95℃30秒，56℃30秒，72℃1分钟}→72℃7分钟
PCR产物电泳：用1×TAE电泳缓冲液配制1.5％琼脂糖凝胶，加0.1％EB按说明制成水平DNA电泳胶块。加2×上样缓冲液，加样于加样孔，100V恒压电泳约20分钟。紫外成像仪上摄像。
(3)实验结果
参见图6A和图6B，图6A：细胞在化学低氧环境下用不同浓度和厚朴酚处理4小时，用RT-PCR法检测，可见随着和厚朴酚浓度增加，HSP70 mRNA含量减小，泳道1：常氧对照；泳道2：CoCl₂；泳道3：CoCl₂+0.1μg/ml和厚朴酚；泳道4：CoCl₂+0.5μg/ml和厚朴酚；泳道4：CoCl₂十1.0μg/ml和厚朴酚。β-actin为内对照。图6B：各组HSP70RT-PCR产物条带分别除去其相应β-actin条带的影响因子，图中组别1-5分别代表常氧对照、CoCl₂低氧对照、CoCl₂+0.1μg/ml和厚朴酚、CoCl₂+0.5μg/ml和厚朴酚、CoCl₂+1.0μg/ml和厚朴酚。CoCl₂(150uM)上调RKO细胞HSP70mRNA表达，其PCR产物条带的灰度值比对照组上调224％。和厚朴酚浓度依赖性下调化学低氧所致的RKO细胞HSP70mRNA上调，PCR产物条带的灰度值与CoCl₂单独作用组相比分别减少了73.1％、76.5％和87.8％。这个结果说明和厚朴酚可抑制HSP70的表达，由于HSP70可阻止HIF-1的降解，HSP70的表达下降可导致HIF-1的降解。
实施例7：和厚朴酚对RKO细胞HSP70蛋白质的影响。
(1)实验材料
细胞：RKO细胞来源于美国ATCC公司。
试剂：和厚朴酚，中国药品与生物制品鉴定所；鼠抗人HSP70(NeoMarkers，美国)，HRP标记的羊抗鼠抗体(Santa Cruz，美国)。化学发光检测系统ECL反应液(Santa Cruz，美国)
仪器：电泳仪，电转膜仪。
(2)实验方法
药物诱导：RKO细胞2×10⁴每孔接种于24孔板，每组3个复孔；用含3％小牛血清的RPIM1640培养基稀释和厚朴酚储存液(5mg/ml)，充分混匀，配成所需浓度，并以此更换细胞培养液；药物作用1小时后加入CoCl₂(对照组除外)，使其终浓度为150uM，继续培养3小时。收集细胞，提取RNA或蛋白质，做Western Blot检测细胞内的HIF-1蛋白质含量。
Western blot：收集培养细胞，用生理盐水洗两次，细胞沉淀加入1×proteinextract buffer，吹散，沸水中煮15min，13000rpm离心20min，取上清测定蛋白质浓度(按DC Protein Assay Kit说明书进行)。取蛋白提取物50ug，加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5min，做SDS-PAGE电泳，积层胶恒压50V，分离胶恒压100V，电泳至溴酚蓝染料到达凝胶最前沿，停止电泳。转膜：电泳结束后揭胶，并将凝胶浸于适量的Transfer buffer中，平衡30min。同时截取适当大小的PVDF膜和2张3M滤纸，将PVDF膜先在无水甲醇中浸湿，然后同滤纸一同浸于Transfer buffer中，平衡10～15min，膜放阳极、胶放阴极，两面各垫2张3M滤纸，恒流110mA，4℃层析柜中转膜过夜。封闭：将转有蛋白的膜浸于含10％脱脂奶粉的TBST中封闭1hr。杂交：取出已封闭的膜，然后浸于1∶400-500稀释的鼠抗人HSP70(用含5％脱脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，4℃过夜，TBST漂洗5min×5次，再浸于1∶10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(用含5％脱脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，TBST漂洗5min×5次。压片、洗片：取出膜，配制显色液(ECL A液0.7ml+ECL B液0.7ml)，加在膜上，5min后吸去多余液体，保鲜膜封膜，固定在暗盒内，压片，洗片。
(3)实验结果
每组取10ug蛋白进行western blot检测。结果参见图7A和图7B，图7A：细胞在化学低氧环境下用不同浓度和厚朴酚处理4小时，用Western Blot法检测，可见随着和厚朴酚浓度增加，HSP70蛋白含量减小，泳道1：常氧对照；泳道2：CoCl₂；泳道3：CoCl₂+0.1μg/ml和厚朴酚；泳道4：CoCl₂+0.5μg/ml和厚朴酚；泳道4：CoCl₂+1.0μg/ml和厚朴酚。β-actin为内对照。图7B：各组HSP70蛋白条带分别除去其相应β-actin条带的影响因子，图中组别1-5分别代表常氧对照、CoCl₂低氧对照、CoCl₂+0.1μg/ml和厚朴酚、CoCl₂+0.5μg/ml和厚朴酚、CoCl₂+1.0μg/ml和厚朴酚。CoCl₂(150uM)模拟低氧上调RKO细胞HSP70蛋白表达，western blot条带的灰度值与对照组相比增强了195.4％，具有显著差异。和厚朴酚0.1-1ug/ml浓度时剂量依赖性抑制CoCl₂对RKO细胞HSP70蛋白表达的影响，抑制率分别为22.8％、35.8％和75.2％。这个结果与实施例5共同说明和厚朴酚可抑制细胞内HSP70的表达，使细胞内HSP70的含量降低，后者含量的降低可导致HIF-1α的降解。
实施例8：和厚朴酚在体对人结肠癌细胞系RKO细胞所致实体瘤及腹水瘤的抑制作用
(1)实验材料：
细胞系：人结肠癌细胞系RKO来源于美国ATCC公司；和厚朴酚，中国药品与生物制品鉴定所。
动物：Babl/c小鼠(上海动物中心)
无菌饲养室及饲料(浙江省中医学院提供)
(2)实验方法
腹水瘤模型：取对数生长期RKO细胞→0.25％胰酶消化片刻→离心、生理盐水洗3次，彻底去除胰酶→细胞沉淀溶于无血清RPIMl640培养基，使成2×10⁶/ml→每鼠腹腔接种100ul(含2×10⁵细胞)→观察腹部膨隆情况。
实体瘤模型：取腹水瘤鼠一只→引颈处死→碘酊消毒皮肤，75％乙醇浸泡片刻→剪开腹壁皮肤，无菌生理盐水1000ul冲淋腹腔→收集冲洗液→每鼠50ul(约含2×10⁵细胞)接种于腋部皮下→隔天称量体重，卡尺测量瘤体体积。
分组及用药：腹水瘤及实体瘤各分为3组：空白对照组、溶剂组、用药组。和厚朴酚溶于PEG400/蔗糖(体积比7∶3)溶液，使成25mg/ml，放置37℃摇床振荡2小时，分装备用。用药组隔天每鼠灌胃5mg(100ul)和厚朴酚溶液，溶剂组给予等体积PEG400/蔗糖溶液，对照组给予等体积生理盐水，隔天一次，连续用药至对照组死亡。隔天称量体重及测量瘤体大小或腹部膨隆情况。
(3)实验结果
<1>和厚朴酚对RKO细胞成腹水瘤的抑制作用
腹水瘤组在腹腔接种当天开始用药，每天观测腹部膨隆，隔天记录体重。比较各组平均生存时间。结果如表1所示，溶剂组和对照组的平均寿命分别是28.8天和29.7天，两组之间无显著差异，说明PEG400/蔗糖溶液对Babl/c小鼠无明显毒副作用。和厚朴酚用药组平均寿命50.9天，比对照组延长22.18天，最大生存时间是对照组的176.7％，两组之间有显著差异(P＜0.05)，说明和厚朴酚能有效抑制RKO细胞形成腹水瘤，并延长荷瘤鼠的生存时间。
表1  和厚朴酚对荷人RKO腹水瘤Balb/C裸鼠的平均生存时间盒生存延长时间的影响
实验分组    动物数    MST(天)    T/C(％)
对照组        7        28.8       100
溶剂组        6        29.7       104.5
和厚朴酚      7        50.9       176.7^*
平均生存时间(mean survival time，MST)。生存时间延长率(The survivalrate，T/C％)，T/C(％)＝[试验组的平均生存时间/对照组的平均生存时间]×100％.^*∶P＜0.01，与溶剂组相比。
<2>和厚朴酚对RKO细胞成实体瘤的抑制作用取Babl/c小鼠10只，待瘤体增长至约5×5mm时，随机分为对照组(3只)、溶剂组(3只)与用药组(4只)。用药组每次灌胃5mg和厚朴酚，隔天一次，持续21天。溶剂组给予等体积溶剂(PEG400/蔗糖)，对照组给予等体积生理盐水。隔天称重及测量瘤体大小，以每周最后一次的数据作图，结果参见图8，Y轴代表肿瘤体积，X-轴代表药物治疗天数，可见和厚朴酚可显著遏制肿瘤的生长，“*”表示与对照组相比P＜0.05。
结果为：对照组和用药组开始时的平均瘤体体积分别为0.185cm³和0.171cm³，一周后两组的增长率分别是361％和198％，相差1.8倍，但统计表明无组间差异(P＝0.055＞0.05)。第2周时对照组14天平均增长1182％，而用药组只增长710％，前者与后者的比值为1.66，但统计表明有组间差异(P＝0.011＜0.05)。第3周时用药组的增长明显减慢，21天平均增长率是901％，而对照组达到1626％，两组间差异显著(P＜0.05)。第4周时对照组动物陆续死亡，而用药组也停止给药，但瘤体增长未见明显增快，反而其中一只出现瘤体脱落现象。溶剂组与对照组无组间差异。以上结果表明，和厚朴酚对RKO细胞所致实体瘤具有显著的抑瘤效果。
这些结果充分说明和厚朴酚可通过抑制肿瘤血管生成而抑制肿瘤生长。
综上所述，和厚朴酚可有效抑制肿瘤血管生成的最关键的靶点HIF-1，HIF-1被抑制后，血管生长因子(VEGF)、一氧化氮合成酶等促血管生长的关键因子也被抑制。我们进而用动物证明和厚朴酚可有效抑制肿瘤生长。说明和厚朴酚通过抑制HIF-1可有效遏制肿瘤生长。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明涉及的部分参考文献
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5.Bai X，Cerimele F，Ushio-Fukai M，Waqas M，Campbell PM，Govindarajan B，Der CJ，Battle T，FrankDA，Ye K，Murad E，Dubiel W，Soff G，Arbiser JL.Honokiol，a small molecular weight natural product，inhibits angiogenesis in vitro and tumor growth in vivo.J Biol Chem.2003 Sep 12；278(37)：35501-35507