结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖纯化方法及结核杆菌诊断试剂 技术领域 本发明属于医疗技术领域， 具体涉及一种结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖的制备方法 及结核杆菌诊断试剂。
背景技术 LAM 抗原 结核杆菌通过独特的细胞壁结构在属主体内生存、 繁殖。其结核杆 菌细胞壁含有多种成分 （图 1） ， 如： 孔蛋白 （Porin） ， 多糖， 脂类 （Lipids） ， 霉菌酸 （mycolic acid） ， 磷脂酰肌醇甘露糖苷 （phosphatidylinositol mannosides.PIM） ， 脂甘露聚糖 （lipomannans， LM） ， 脂阿拉伯甘露聚糖 （lipoarabinomannan， LAM)。其中， LAM 是分枝杆菌 细胞壁的主要成分， 达 15 毫克 /g 细菌总重量。LAM 广泛影响受感染的宿主的免疫系统。据 报道， 从结核分枝杆菌和麻风杆菌分离出的 LAM 能引起 T 细胞增殖抑制， 干扰与干扰素介导 的巨噬细胞激活， 清除有毒的游离氧自由基， 抑制蛋白激酶活性及基因编码介素 （IL） -2 和 IL - 5 和粒细胞合成 / 巨噬细胞集落刺激人类 T 细胞因子， 诱导巨噬细胞即刻早期基因表 达， 促进单核细胞肿瘤坏死因子的生成增强及补体活化。 研究结果表明， 作为属特异性抗原 LAM， 具有较强的免疫原性和免疫调节功能， 参与了结核杆菌感染的许多过程， 有助于对结 核病发病 （肺结核） 以及其他分枝杆菌感染。菌体内存在从 PI → PIMs → LM → AraLAM 的合 成过程。图 2 为脂阿拉伯甘露聚糖 （LAM） 、 脂甘露聚糖 （LM） 结构。
LAM 抗原的获得 LAM 抗原一般从大量培养的菌体中提取获得， 通常先将细胞壁 破碎， 首先经有机溶剂 （50-70% 乙醇、 苯酚等） 提取， 再通过疏水层析结合离子交换层析与凝 胶过滤， 要获得纯抗原， 制备过程非常复杂。即便如此， 由于脂阿拉伯甘露聚糖 （LAM） 与脂 甘露聚糖 （LM） 、 磷脂酰肌醇甘露糖苷 （PIM） 结构等非常相近， 由于要将 LM、 PIM、 多糖等近似 成分从 LAM 抗原溶液中去除需要多步过程。导致批量制备十分困难， 往往使用混合性抗原。
LAM 抗原用于循环结核杆菌抗体检测 由于脂阿拉伯甘露聚糖 （LAM） 可刺激机 体产生相应的抗体， 血清 LAM 抗体检测可作为结核病一项有效的辅助诊断方法。
结核杆菌抗体诊断试剂中脂阿拉伯甘露聚糖 （LAM） 的纯度直接决定了血清 LAM 抗 体检测产品质量的优劣 （灵敏度和特异度） 。一些非属特异性抗原如脂甘露聚糖 （LM） ， 磷脂 酰肌醇甘露糖苷 （PIM） 等会严重干扰检测结果， 降低试剂的特异性。
因此， 高纯度 LAM 抗原对于结核杆菌的抗体诊断的产品质量至关重要。
LAM 抗原用于结核杆菌抗原检测 抗原检测不但可以用于传染病病原体的发现 和诊断， 还能对治疗中的病人进行实时评估， 是传染病诊断较推崇的方法。当人体、 动物体 内感染了结核杆菌或结核菌在体内繁殖， 尿液中可发现脂阿拉伯甘露聚糖 （LAM） ， 由于该检 测不受感染病灶位置 （肺、 胃、 肾、 骨、 脊髓、 脑、 膀胱等） 的限制。因此， 检测尿液中阿拉伯甘 露聚糖 （LAM） 可能成为结核病诊断的突破性手段。
但结核病人尿液中脂阿拉伯甘露聚糖 （LAM） 浓度较低 （0.01-1ng/mL） ， 只有较高 灵敏度的免疫学方法或经过其它浓缩、 富集方法处理后才能测定， 而提高免疫学方法灵敏 度的前提是高纯度、 高亲和力抗体， 这种抗体的制备需要高纯度脂阿拉伯甘露聚糖 （LAM） 。
发明内容 本发明的一个目的是提供一种简便的获得高纯度结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖 （LAM） 的方法， 另一目的是提供一种以得到的高纯度 LAM 抗原为基础制备的结核杆菌抗体 检测试剂和 LAM 抗原检测试剂。
本发明是利用 LAM 抗原含有 3 个甘露糖其它杂质 （LM、 PIM 等） 只含有一个 1 个甘 露糖的结构上的差异 （图 1、 图 2） ， 又利用凝集素 （如扁小扁豆凝集素） 对 3 个甘露糖分支结 构的亲和力远高于 2 个甘露糖和 1 个甘露糖的亲和力特性， 使用凝集素进行 LAM 抗原纯化， 得到纯度达到 90 % 以上的 LAM 抗原， 更优的可得到纯度达到 95 % 以上的 LAM 抗原。上述 纯化得到的高纯度抗原可组成试剂用于 LAM 抗体检测 ； 另外上述纯化得到的高纯度抗原还 可组成试剂用于尿液 LAM 抗原的富集、 LAM 抗体纯化及尿液 LAM 抗原检测。
1、 本发明提供的获得高纯度结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖 （LAM） 的方法， 是采用现 有的亲和纯化的方法， 其基本步骤包括 ： 装柱、 上样、 洗涤、 解离、 电泳分离及分析。其中， 采 用凝集素 （如扁小扁豆凝集素） 作为亲和纯化试剂。
本 发 明 方 法 中， 所指凝集素包括 ： 刀 豆 凝 集 素 或 刀 豆 素 A（Concanavalin ensifomis agglutinin， COA） ； 扁豆凝集素 （Lens cuinaris agglutinin， LCA） ； 豌豆凝集素 （Pisum satiwum agglutinin） ； 双花扁豆凝集素 （Dolichos bifows agglutinin， DBA） ； 槐 凝集素 （Sophora japonica agglutinin， SjA） ； 花生凝集素 （Peanut agglutinin ； PNA） ； 麦 胚素 （Wheat germ agglutinin, WGA） ； 大豆凝集素 （Soybean agglutinin, SBA） 等。
本发明方法中， 所指凝集素尤其是指能与甘露糖、 葡萄糖特异结合的凝集素， 包 括： 刀豆凝集素或刀豆素 A（Concanavalin ensifomis agglutinin， COA） ； 扁小扁豆凝集素 （Lens cuinaris agglutinin， LCA） ； 豌豆凝集素 （Pisum satiwum agglutinin， PSA） 等。
本发明方法中， 所指凝集素优选扁小扁豆凝集素 （Lens cuinaris agglutinin， LCA） 。
本发明中， 所述 LAM 抗原的纯化、 尿液 LAM 抗原富集是指通过一般常规方法如亲和 层析或其它固相 （磁珠等） 方法进行 ； 本发明中， 所述 LAM 抗体检测是指利用凝集素亲和纯化的高纯度 LAM 抗原进行血清中 抗体测定 ； 能提高检测试剂的特异性。
本发明中， 所述 LAM 抗原检测是指将凝集素亲和纯化的高纯度 LAM 抗原交联到层 析柱料上， 通过大规模纯化获得高纯度抗体， 进而建立高灵敏度免疫学方法用于尿液中脂 阿拉伯甘露聚糖抗原检测。
本发明中， 所述 LAM 抗原检测还可以是利用凝集素代替抗体并与抗体结合起来进 行检测， 可选择使用酶、 金溶胶、 化学发光、 荧光、 时间分辨荧光等放大系统进行检测。
2、 本发明还提供以上述方法得到的高纯度 LAM 抗原为基础制备的结核杆菌抗体 检测试剂。
该结核杆菌抗体检测试剂的基本组成 ： 封闭液、 洗涤液、 金溶胶标记物 （羊抗人 IgG 金溶胶标记物） 、 渗滤反应板 （含 NC 膜、 吸水纸、 LAM 抗原、 人 IgG） 。
该试剂的主要特征在于渗滤反应板中使用 95% 以上纯度的 LAM 抗原包被， LAM 抗原 用量根据金溶胶标记物浓度可调整， 以 0.01-2mg/mL 浓度包被为宜 , 最好佳在 0.05-1 mg/
mL。 封闭液、 洗涤液中含磷酸或 TRIS 缓冲液， 其 PH 值范围以 6.5-8.5 为宜， 最好 7.0-8.0 之间， 最佳 7.2。
封闭液、 洗涤液中含有适量的表面活性剂吐温 -20 达到封闭目的， 吐温 -20 的含量 按重量计为封闭液或洗涤液的 0.01-0.1%， 最佳 0.05%。
封闭液、 洗涤液中还含有适量的聚乙二醇 （PEG） 增加膜的通透性， 提高抗原抗体反 应速度， PEG 分子量在 2000-40000 之间， 最好 10000-20000， PEG 用量按重量计为封闭液或 洗涤液的 0.1-2%， 最佳 1%。
3、 本发明还提供以上述方法得到的高纯度 LAM 抗原为基础制备的 LAM 抗原检测试 剂。
该试剂的基本组成 ： LCA 富集柱或 LCA 富集管及夹心法免疫检测试剂盒。
LCA 富集柱 （LCA -Sepharose 4B） 或 LCA 富集管 （LCA 包被的免疫磁颗粒） 用于样 本的前处理， 对尿液中含有的 LAM 进行富集或浓缩， 达到提高检测的灵敏度。
LCA -Sepharose 4B 中 Sepharose 4B 上交联的 LCA 量不低于 1mg/mL， 最好 2 mg/ mL 以上 ； 使用免疫磁颗粒含 LCA 量不低于 0.01mg/mg， 最好在 0.03 mg/mg 以上。
夹心法免疫检测试剂盒由酶标记抗体、 反应底物、 洗涤液及微量测定反应板组成。
夹心法免疫检测试剂盒使用的抗体 （酶标记抗体、 微量测定反应板包被的抗体） 必 须通过亲和层析纯化获得， 即利用亲和层析纯化抗体， 经过亲和层析获得的抗体对 LAM 抗 原具有较高的特异性和亲和力， 能达到 LAM 夹心法免疫试剂检测的灵敏度。
LAM 偶联到固相载体获得亲和层析柱， 即亲和层析制备的主要特征在于将实施例 1 获得的高纯度 LAM 偶联到固相载体获得亲和层析柱 （LAM-beads） ， 交联可选择使用溴化氰 活化、 过碘酸钠氧化、 碳二亚胺偶联等方法连接， 最佳采用低浓度过碘酸钠氧化方法。
所述低浓度过碘酸钠氧化法指所用过碘酸钠浓度低于常规用量， 氧化 LAM 抗原得 过碘酸钠浓度以 1mM-10mM 为宜， 最好 5mM。 结核杆菌 LAM 抗原检测试剂制备过程如图 6 所示。
附图说明 图 1 为结核杆菌细胞壁结构。
图 2 为脂阿拉伯甘露聚糖 （LAM） 、 脂甘露聚糖 （LM） 结构。
图 3 为 刀 豆 凝 集 素 -（COA-Sepharose 4B， 2-5）与 扁 小 扁 豆 凝 集 素 （LCA -Sepharose 4B， 7-10） 用于脂阿拉伯甘露聚糖 （LAM） 纯化， 纯化后 12%SDS-PAGE 经银染显色 后的电泳图。
1： Crude 为上样液， 结核菌细胞壁参考文献 方法提取纯化后产物。其中 ： 2， 7： Filtration 为过柱液， 即上样流出液， 3， 4， 8， 9： Elute 为洗涤液， 5， 10 ： Wash 为解离液 6： M 分子量标记， 从上往下依次为 97, 66, 43, 31, 20, 14.4KD 结果显示 ： 化学方法纯化的 LAM（上样液） 中含有大量杂质 （包括 LM， PIM 等） ， 经过 LCA -Sepharose 4B 处理， 泳道 10 几乎完全是 LAM（仅含有极少量的 LM） ； COA-Sepharose 4B 也
能吸附 LAM， 但效果不如 LCA， 尤其是 PIM。
图 4 为扁小扁豆凝集素夹心法检测 LAM 抗原。
图 5 为 LAM 抗体检测结果。
图 6 为结核杆菌 LAM 抗原检测试剂制备流程。 具体实施方式
1. 获得高纯度结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖 （LAM） 的方法 ： 本发明发现了一类植物凝集素对结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖 （LAM） 具有非常高的亲和 性， 藉此建立了结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖 （LAM） 抗原凝集素亲和层析的纯化方法， 使用该 方法可方便地大量获得纯度达 95% 以上的 LAM 抗原。
实施例 1. 实验材料 ： 刀豆凝集素 - 葡聚糖凝胶 4B（COA-Sepharose 4B） ， 扁小扁豆凝集素 - 葡聚 糖凝胶 4B （LCA -Sepharose 4B） 购自 GE 公司 （原 Pharmacia） ， 甲基葡萄糖苷购自 Sigma 公 司， 其它试剂购自国药股份 （上海） 有限公司。
脂阿拉伯甘露聚糖 （LAM Crude） 从结核菌细胞壁参考文献 方法提取与纯化， 脂 阿拉伯甘露聚糖 （LAM Crude） 以 20mM Tris-HCl, pH7.6,0.15M NaCl, 1mM MgCl2, 1mM MnCl2 平衡， 总糖含量 （1mg/ml） 。
亲和纯化过程 ： 1． 装柱 ： 分别取 COA-Sepharose 4B 及 LCA -Sepharose 4B 各 1mL 装入离心柱， 以 20mM Tris-HCl, pH7.6, 0.15M NaCl, 1mM MgCl2, 1mM MnCl2 平衡。
2． 上 样 ： 将 样 品 各 0.5ml 加 入， 5min 后 离 心， 离心出来的液体为过柱液 （Filtration） 。
3．洗涤 ： 以 20mM Tris-HCl, pH7.6, 0.15M NaCl, 1mM MgCl2, 1mM MnCl2 洗涤， 离心 2 次， 分别依次获得 Elute 1， Elute 2。
4．解离 ： 加入 20mM Tris-HCl, pH7.6, 0.15M NaCl, 0.5M 甲基葡萄糖苷 , 1mM MgCl2, 1mM MnCl2 5min 后离心， 离心出来的液体为解离液 （WASH） 。
5．电泳分离及分析 ： 将亲和纯化过程中不同的部分使用 12%SDS-PAGE， 经银染后 碱显色。
泳道说明 ： 1： 为上样液为脂阿拉伯甘露聚糖 （LAM Crude） /PBS， 总糖含量 （1mg/ml） 2， 7： Filtration 为过柱液， 即上样流出液， 3， 4， 8， 9： Elute 为洗涤液， 5， 10 ： Wash 为洗脱液 6： M 分子量标记， 从上往下依次为 97, 66, 43, 31, 20, 14.4KD 图 3 实验结果显示 ： 化学方法纯化的 LAM （上样液） 中含有大量杂质 （包括 LM， PIM 等） ， 经 过 LCA -Sepharose 4B 处理， 泳道 10 几乎完全是 LAM （仅含有极少量的 LM） ； COA-Sepharose 4B 也能吸附 LAM， 但效果不如 LCA， 尤其是 PIM。
一般方法获得的粗提脂阿拉伯甘露聚糖 LAM （LAM Crude） （图 3 . 泳道 1， Crude） ， 纯化后的 LAM 抗原 （图 3 . 泳道 10 WASH） 。经扫描灰度计算纯度， 粗提脂阿拉伯甘露聚糖 LAM 纯度仅占总糖量的 30%， 经该方法纯化后 LAM 抗原纯度能达到 95% 以上。
实施例 2. 实验材料 : ： 扁小扁豆凝集素 （LCA） 从扁小扁豆自制纯化， 其它试剂购自国药股份 （上 海） 有限公司。
脂阿拉伯甘露聚糖 （LAM Crude）以 20mM Tris-HCl, pH7.6,0.15M NaCl, 1mM MgCl2, 1mM MnCl2 平衡液平衡 ； 扁小扁豆凝集素 （LCA） 金溶胶标记 ： 常规柠檬酸三纳方法制备胶体金， 并选择最佳标 记物浓度， 进行扁小扁豆凝集素标记， 获得扁小扁豆凝集素 （LCA） 金溶胶标记物 （不含蔗 糖） ； 扁小扁豆凝集素 （LCA）固定 ： 将扁小扁豆凝集素 （LCA） 1mg/mL 点在 0.6um 孔径的硝 酸纤维素膜 (NC) 条上 （5mm×3mm） ， 干燥后， 以 20mM Tris-HCl, pH7.6, 0.15M NaCl, 1mM MgCl2, 1mM MnCl2 3%BSA, 0.05%TWEEN-20 封闭 ； 夹心法检测 ： 在 96 孔微孔板上， 将 20ul 扁小扁豆凝集素 （LCA） 金溶胶标记物分别与 20ul 平衡液、 20ul 脂阿拉伯甘露聚糖 （LAM Crude）总糖含量 0.1mg/ml、 20ul 脂阿拉伯甘露聚糖 （LAM Crude） 1mg/ml 混合， 将三根硝酸纤维素膜 (NC) 条 （5mm×3mm） 分别插入孔中， 利用层析法 显色。 图 4 实验结果显示 ： 脂阿拉伯甘露聚糖 0.1、 1mg/ml 均显示斑点， 结果说明， 由于 LAM 抗原中存在 3 个甘露糖分支结构有两个， 能结合 2 个扁小扁豆凝集素， 形成三明治结构。 由于尽管以上 LCA 检测存在非特异结合 （许多菌细胞壁的脂多糖中含有甘露糖） ， 实验结果提示 ： 但使用单一的扁小扁豆凝集素夹心法可以用于 LAM 抗原的检测。
2. 以高纯度 LAM 抗原为基础制备的结核杆菌抗体检测试剂 ： 检测试剂组成 ： 封闭液、 洗涤液、 金溶胶标记物 （羊抗人 IgG 金溶胶标记物） 、 渗滤反应 板 （含 NC 膜、 吸水纸、 LAM 抗原、 人 IgG） 。
试剂的主要特征在于渗滤反应板中使用 95% 以上纯度的 LAM 抗原包被， LAM 抗原用 量根据金溶胶标记物浓度调整， 以 0.01-2mg/mL 浓度包被为宜 , 最好佳在 0.05-1 mg/mL。
封闭液、 洗涤液中含磷酸或 TRIS 缓冲液， 其 PH 值范围以 6.5-8.5 为宜， 最好 7.0-8.0 之间， 最佳 7.2。
封 闭 液、 洗 涤 液 中 含 有 适 量 的 表 面 活 性 剂 吐 温 -20 达 到 封 闭 目 的， 用量在 0.01-0.1% 之间， 最佳 0.05%。
封闭液、 洗涤液中还含有适量的聚乙二醇 （PEG） 增加膜的通透性， 提高抗原抗体反 应速度， PEG 分子量在 2000-40000 之间， 最好 10000-20000， PEG 用量在 0.1-2% 之间， 最佳 1%。
金溶胶标记物可按一般制备方法配制。
试剂的使用方法是， 在渗滤反应板中加封闭液 4 滴， 加血清 50uL， 加洗涤液 4 滴， 加 金溶胶 3 滴， 加洗涤液 4 滴， 观测结果。
由于一般方法纯化的 LAM 抗原仅有 50% 纯度， 含杂大量 （近 30-50%） 脂甘露聚糖 （LM） ， 磷脂酰肌醇甘露糖苷 （PIM） ， LM、 PIM 作为非属特异性抗原会干扰反应， 因此， 使用粗 提 LAM 抗原检测会使 LAM 抗体检测的特异性降低。试剂使用了本利用实例 1 获得的 95% 以
上纯度 LAM 抗原作为检测抗体的抗原使检测的特异性提高。
实施例 3. 实验材料 ： 血清 184 份， 其中， 确认结核病的血清 78 份， 非结核病人血清 106 份。
羊抗人 IgG 购自 Sigma 公司， 柠檬酸三钠、 氯金酸、 碳酸钾、 氯化钠、 牛血清白蛋白 （BSA） 、 吐温 -20、 聚乙二醇等试剂购自国药上海化学试剂有限公司， 0.65um 硝酸仟维素膜 NC 购自 AMERSHAM 公司。金溶胶、 羊抗人 IgG 金溶胶标记物渗滤反应盒由厦门波生生物技 术有限公司提供， 实验过程是 ： 1．封闭液配制 ： 0.1%BSA/ 0.05% 吐温 -20/1% 聚乙二醇 PH7.2 磷酸缓冲液 （PBS） ， 2．洗涤液配制 ： 0.05% 吐温 -20/1% 聚乙二醇 PH7.2 磷酸缓冲液 （PBS） ， 3．金溶胶制备、 羊抗人 IgG 金溶胶标记物配制方法 ： 将 0.01% 氯金酸 100mL 煮沸， 加入 1% 柠檬酸三钠 1mL， 冷却。按常规方法碳酸钾调节 pH， 加入 10%NaCl 判断并选择抗体最佳 标记浓度， 确定 10ug/mL 为宜， 在 100mL 金溶胶中加入碳酸钾后， 加入 1mg 羊抗人 IgG， 混合 后加入 10mg/mL BSA 5mL。
4． 将 0.65um 硝酸仟维素膜裁成 1.5×1.5cm 正方形， 按常规生产方法装入含吸水 纸的渗滤反应盒中， 在渗滤反应盒硝酸仟维素膜中间点上混合或纯化 LAM 抗原及阳性对照 点 （纯化人 IgG） 。 5．检测过程 ： 加封闭液 4 滴， 加血清 50uL， 加洗涤液 4 滴， 加金溶胶 3 滴， 加洗涤 液 4 滴， 观测结果。
6．检测结果 ： 对确认结核病的血清 78 份， 非结核病人血清 106 份的检测如表 1 ： 表 1 确认结核病的血清 78 份， 非结核病人血清 106 份的检测结果
。粗提脂阿拉伯甘露聚糖 LAM 经纯化后对阳性血清检测的灵敏度未降低 （74.3%） ， 但 106 份非结核病人血清检测特异性从 89.7% 提高到 94.3%。说明粗提脂阿拉伯甘露聚糖 LAM 经过纯化能明显提高诊断试剂的特异性 （图 5， 部分 LAM 抗体检测结果） 。
3. 以高纯度 LAM 抗原为基础制备的结核杆菌 LAM 抗原检测试剂 : 试剂的基本组成 ： LCA 纯化 / 富集管及夹心法免疫检测试剂盒。
LCA 纯化 / 富集管 （含 LCA -Sepharose 4B 或 LCA 包被的免疫磁颗粒） 用于样本的 前处理， 对尿液中含有的 LAM 进行富集或浓缩， 达到提高检测的灵敏度。
LCA -Sepharose 4B 中 Sepharose 4B 上交联的 LCA 量不低于 1mg/mL， 最好 2 mg/ mL 以上 ； 使用免疫磁颗粒含 LCA 量不低于 0.01mg/mg， 最好在 0.03 mg/mg 以上。
夹心法免疫检测试剂盒由酶标记抗体、 反应底物、 洗涤液及微量测定反应板组成。
夹心法免疫检测试剂盒特征在于使用的抗体 （酶标记抗体、 微量测定反应板包被 的抗体） 必须通过亲和层析纯化获得， 即利用亲和层析纯化抗体， 经过亲和层析获得的抗体
对 LAM 抗原具有较高的特异性和亲和力， 能达到 LAM 夹心法免疫试剂检测的灵敏度。
LAM 偶联到固相载体获得亲和层析柱， 即亲和层析制备的主要特征在于将实施例 1 获得的高纯度 LAM 偶联到固相载体获得亲和层析柱 （LAM-beads） ， 交联可选择使用溴化氰 活化、 过碘酸钠氧化、 碳二亚胺偶联等方法连接， 最佳采用低浓度过碘酸钠氧化方法。
所述低浓度过碘酸钠氧化法指所用过碘酸钠浓度低于常规用量， 以 1mM-10mM 为 宜， 最好 5mM。 结核杆菌 LAM 抗原检测试剂制备过程如图 6 所示。结核杆菌 LAM 抗原检测试剂制备、 应用分为 5 部分 ： A．LCA 纯化 / 富集管 （含 LCA -Sepharose 4B） 制备 ： 包括 LCA 纯化及交联。
B．LAM 抗原纯化与抗体亲和层析柱的的制备 ： 包括菌培养、 化学纯化、 抗原亲和纯 化、 抗原交联。
C．LAM 抗体制备与纯化 ： 包括菌培养、 免疫动物、 抗体亲和纯化。
D．夹心法免疫检测试剂配制 ： 包括抗体标记、 抗体包被 底物、 洗涤液等配制。
E． 尿液中脂阿拉伯甘露聚糖 LAM 抗原检测 ： 根据灵敏度要求选择使用直接检测或 富集后检测方法。