一种蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵及其制备方法与应用 技术领域 本发明属于医用止血材料领域， 涉及一种蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵及其制备方 法， 尤其是涉及一种能快速止血、 止血机制多样、 可用于术中植入性止血并可预防创面伤口 感染、 促进创面愈合的蝇蛆壳来源壳聚糖及其止血海绵和其制备方法。
背景技术
出血是引起各种创伤死亡的主要原因。 快速止血是各种手术及创伤急救的重要环 节。 局部止血材料由于在对手术及突发性事故的急救治疗中有着简便、 迅速等特点， 是院前 及术中急救止血的首选措施。对理想局部止血材料的研发一直是国内外关注的热点。
壳聚糖是一种自然界含量丰富的天然高分子线性多糖。早期大量研究已证明壳 聚糖无毒性、 无免疫原性， 且具有良好的生物降解性、 抗菌活性及促进创伤愈合等生物学优 势。近年来研究发现壳聚糖还具备独特的止血活性。迄今为止， 越来越多的研究开始关注 这种生物学特性良好的新型止血材料。如美国 HemCon Medical Technologies 公司生产的 HemCon 止血绷带， 已于 2002 年 9 月由美国 FDA 批准生产， 用于中重度大出血救治。迄今美 国 FDA 已批准数种壳聚糖类止血产品用于暂时性外用止血急救， 国内目前类似产品较少。
现有研究表明， 壳聚糖的各种生物学活性， 包括止血活性与其提取制备工艺及原 料来源密切相关。目前， 壳聚糖的制备原料多采用天然收集的虾蟹壳经高浓度酸碱高温长 时间提取制备， 在原料的质量控制以及生产工艺的重现性方面存在较大隐患。 此外， 由于环 境污染等造成的国内天然壳聚糖生产原料不足问题日益明显， 开发新资源、 降低生产成本 也是目前的迫切任务。 发明内容
本发明提供了一种能快速止血、 止血机制多样、 可用于术中植入性止血并可预防 创面伤口感染、 促进创面愈合的壳聚糖止血海绵。
本发明所提供的壳聚糖止血海绵， 是以蝇蛆壳为来源提取制备的。
所述蝇蛆壳的来源是广泛的， 如一种人工繁殖的食草蝇的蝇蛆壳。
本发明的第二个目的是提供一种上述壳聚糖止血海绵的制备方法。
本发明所提供的制备方法， 可包括以下步骤 ：
1) 将清洁干燥后的蝇蛆壳粉碎， 用盐酸溶液除金属离子， 用氢氧化钠溶液脱蛋白 质， 用过氧化氢溶液脱色， 用氢氧化钠溶液梯度脱乙酰化， 干燥后成粉剂 ；
2) 将步骤 1) 获得的壳聚糖粉剂溶解于稀乙酸溶液中， 冷冻干燥， 灭菌， 得到蝇蛆 壳来源壳聚糖止血海绵。
在上述蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵的制备方法中， 所述步骤 1) 中盐酸溶液的浓 度优选为 0.5-10mol/L， 氢氧化钠溶液的重量浓度优选为 1-20％， 过氧化氢溶液的重量浓 度优选为 1-20％， 氢氧化钠溶液重量浓度梯度优选为 30-60％ ； 其中， 脱乙酰化次数为 2-6 次， 反应时间为 4-18 小时， 温度 40-90℃。所述步骤 2) 中优选为按重量体积比浓度 0.5-20％将壳聚糖粉剂溶解于 0.5-10％ 的稀乙酸溶液中。
此外， 步骤 2) 中将壳聚糖粉剂溶解于稀乙酸溶液后， 可倒入模具中自流平并 预冷， 再将模具冷冻干燥， 使模具中物质呈微多孔状结构的海绵体， 孔腔隙直径优选为 0.5-20μm。
将海绵体取出即为蝇蛆壳来源壳聚糖海绵 ； 再经密封包装、 灭菌得到蝇蛆壳来源 壳聚糖止血海绵成品。
本发明的另一目的是提供以上所述蝇蛆壳来源壳聚糖海绵的新用途。 该蝇蛆壳来 源壳聚糖海绵可以在制备创伤性出血的外用急救止血材料和 / 或术中植入性止血材料中 的应用 ； 还可以在制备兼具止血、 防创面伤口感染和促进创面愈合的功能材料中的应用。
本发明提供了一种蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵、 其制备方法及应用。该蝇蛆壳来 源壳聚糖止血海绵的止血机制和特点如下 ：
1) 该止血海绵呈微多孔状结构， 孔腔隙直径 0.5-20μm， 利于血细胞的吸附和聚 集， 是其物理机械性止血基础 ；
2) 该止血海绵与抗凝全血共孵育两分钟即可大量吸附局部红细胞并引起红细胞 形态学的显著变化， 呈明显多角状或有伪足形成 ；
3) 该止血海绵与富含血小板血浆共孵育两分钟即可引起局部血小板的明显激 4) 该止血海绵可在不依赖红细胞及血小板存在的前提下明显促进局部凝血酶生活；
成。 本发明蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵的生物学活性如下 ：
1) 该止血海绵可抑制大肠杆菌及多种金黄色葡萄球菌的生长 ；
2) 该止血海绵可促进成纤维细胞及原代肝细胞的增殖 ；
3) 该止血海绵在体内可吸收降解， 具备良好的血液、 细胞以及组织相容性。
实验证明， 该壳聚糖止血海绵能有效激活局部血小板、 吸附红细胞并促进局部凝 血酶生成， 有效粘合局部组织伤口而发挥迅速、 稳定的止血活性， 同时有选择性抗菌及促进 细胞增殖作用。本发明对控制中度创伤性出血及组织脏器弥漫面出血效果良好， 不仅可适 用于创伤性出血的外用急救， 尤其适用于术中植入性止血。 此外， 它还具有预防创面伤口感 染、 促进创面愈合的功能。本发明壳聚糖止血海绵的提取原料可来源于人工繁殖食草蝇的 蝇蛆壳， 来源广泛， 成本低， 适合大面积推广和应用。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图 1 为不同浓度 CS 浸提液对 L929 细胞的体外细胞毒性实验结果 图 2 为 1.0％、 0.5％和 0.25％组 CS、 GS 和 OC 体外原代肝细胞孵育结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。 所述百分比浓度如无特别说 明均为质量百分比浓度。本发明蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵的制备方法， 可包括以下步骤 ：
1) 将清洁干燥后的人工养殖蝇蛆壳粉碎 ( 过 100 目筛网 )， 用 0.5-10mol/L 盐酸溶 液除金属离子， 用 1-20％氢氧化钠溶液脱蛋白质， 用 1-20％过氧化氢溶液脱色， 用 30-60％ 氢氧化钠溶液梯度浸泡脱乙酰化 ( 脱乙酰化次数为 2-6 次， 反应时间为 4-18 小时， 制备温 度 40-90℃ )， 干燥后成粉剂。
2) 将上述壳聚糖粉剂按重量体积比浓度 0.5-20％溶解于 0.5-10％稀乙酸溶液， 倒入模具中自流平并 -20℃预冷。
3) 将步骤 2) 中模具放入冷冻干燥机中冷冻干燥 (-50℃， 48-72h)， 使模具内物质 呈微多孔状结构的海绵体， 孔腔隙直径 0.5-20μm。
4) 取出模具内的海绵体， 即为蝇蛆壳来源壳聚糖海绵。再经密封包装， 灭菌， 得到 蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵成品。
实施例 1、 蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵的制备
用本发明的方法制备蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵， 具体方法包括以下步骤 ：
1) 将清洁干燥后的人工养殖蝇蛆壳粉碎， 用 0.5mol/L 盐酸溶液除金属离子， 用 1％氢氧化钠溶液脱蛋白质， 用 1％过氧化氢溶液脱色， 分别用 30％、 60％氢氧化钠溶液 2 次 梯度脱乙酰化， 单次反应时间 18 小时， 制备温度 90℃， 干燥后成粉剂。
2) 将上述壳聚糖粉剂按重量体积比浓度 0.5％溶解于 0.5％稀乙酸溶液中， 倒入 模具中自流平并 -20℃预冷。
3) 将模具放入冷冻干燥机中冷冻干燥 (-50℃， 72h)， 使模具内物质呈微多孔状结 构的海绵体， 孔腔隙直径 0.5-20μm。
4) 取出模具内的海绵体， 即为蝇蛆壳来源壳聚糖海绵。 再经密封包装、 灭菌得到蝇 蛆壳来源壳聚糖止血海绵成品。
实施例 2、 蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵的制备
用本发明的方法制备蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵， 具体方法包括以下步骤 ：
1) 将清洁干燥后的人工养殖蝇蛆壳粉碎， 用 5mol/L 盐酸溶液除金属离子， 用 10％ 氢氧化钠溶液脱蛋白质， 用 10％过氧化氢溶液脱色， 分别用 30％、 40％、 50％、 60％氢氧化 钠溶液 4 次梯度脱乙酰化， 单次反应时间 10 小时， 制备温度 60℃， 干燥后成粉剂。
2) 将上述壳聚糖粉剂按重量体积比浓度 10％溶解于 5％稀乙酸溶液中， 倒入模具 中自流平并预冷。
3) 将模具放入冷冻干燥机中冷冻干燥 (-50℃， 48h)， 使模具内物质呈微多孔状结 构的海绵体， 孔腔隙直径 0.5-20μm。
4) 将海绵体密封包装， 灭菌， 得到蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵。
实施例 3、 蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵的制备
用本发明的方法制备蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵， 具体方法包括以下步骤 ：
1) 将清洁干燥后的人工养殖蝇蛆壳粉碎， 用 10mol/L 盐酸溶液除金属离子， 用 20 ％氢氧化钠溶液脱蛋白质， 用 20 ％过氧化氢溶液脱色， 分别用 35 ％、 40 ％、 45 ％、 50 ％、 55％、 60％氢氧化钠溶液 6 次梯度脱乙酰化， 单次反应时间 4 小时， 制备温度 40℃， 干燥后成 粉剂。
2) 将上述壳聚糖粉剂按重量体积比浓度 20％溶解于 10％稀乙酸溶液， 倒入模具中自流平并预冷。
3) 将模具放入冷冻干燥机中冷冻干燥 (-50℃， 60h)， 使模具内物质呈微多孔状结 构的海绵体， 孔腔隙直径 0.5-20μm。
4) 将海绵体密封包装， 灭菌， 得到蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵。
抗菌实验
采用抑菌圈法测定 ： 待测菌株 (E coli.25922、 SA.10442、 SA.25923、 SA.4744) 常 规复苏培养， 取菌液适量分别接种于各琼脂培养基表面后， 均匀分布打孔， 孔内分别加入质 量体积浓度为 0.01％或 0.03％的壳聚糖止血海绵 - 生理盐水浸提溶液 ( 浸提条件为 37℃， 24h)， 置于 37℃培养箱内培养 12-24 小时。阴性对照为生理盐水及 1％乙酸溶液， 培养结束 后取出， 测量各孔周围抑菌圈半径值。
实验结果如表 1 所示， 表明本发明的蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵对大肠杆菌及多 种金黄色葡萄球菌有抑制作用。
表 1 壳聚糖海绵 CS 抑制细菌生长的抑菌圈半径值
-： 无抑菌圈产生 ；
+/- ： 接种圈周围菌株生长可疑减弱， 但未形成明显抑菌圈促进细胞增殖实验
受试细胞株分别采用成纤维 L929 细胞株和新鲜分离的大鼠原代肝细胞。 采用 MTT 法评价壳聚糖海绵 (CS) 对以上两种细胞的增殖影响。壳聚糖止血海绵用 DMEM 培养基浸提 (37℃、 5％ CO2 细胞培养箱、 24h)， 取上层浸提液进行实验。 其中， 在对 L929 细胞的增殖影响 实验中， 阴性细胞组为空白培养基 ( 含 10％胎牛血清及 100U/mL 青 - 链霉素的 DMEM 完全培 养基 ) 培养， 阳性细胞组采用含 0.5％苯酚溶液的培养基培养 ； 受试壳聚糖海绵浸提比例为 2 1.25cm /mL 浸提液， 即为 100％组 ； 50％组采用空白 DMEM 培养基对 100％组稀释 1 倍得到。 壳聚糖对大鼠原代肝细胞的增殖影响考察实验中， 对照止血材料分别为氧化纤维素止血纱 布 (OC) 和明胶海绵 (GS)， 止血材料的浸提比例采用重量体积比， 依次为 1.0、 0.5、 0.25％。
实验结果如图 1( 不同浓度 CS 浸提液对 L929 细胞的体外细胞毒性 ) 和图 2(1.0％、 0.5％和 0.25％组 CS、 GS 和 OC 体外原代肝细胞孵育结果 (n ＝ 6)) 所示， 表明本发明的蝇 蛆壳来源壳聚糖止血海绵具有较明显的促进细胞增殖作用， 体外可显著促进成纤维细胞及 大鼠原代肝细胞的增殖。
止血动物实验
1、 大鼠股静脉出血模型实验
大鼠腹腔注射 2％戊巴比妥钠 10mg/100g 麻醉， 仰卧位固定于鼠板， 75％酒精消毒
腹股沟区， 无菌操作纵向切开腹股沟区皮肤， 暴露皮下组织肌肉， 血管钳钝性暴露并游离中 上段股静脉， 剪刀剪断股静脉制造失血模型。分别取壳聚糖海绵 (CS) 和对照止血材料明胶 海绵 (GS) 适量直接应用于血管断端出血部位， 手法按压止血， 计时， 1 分钟后轻轻松开并观 察出血情况， 如再无活动性出血则定义为止血， 记录按压次数 ； 如仍出血， 则重复手法按压 1 分钟， 直至血止， 记录按压次数。统计方法采用成组设计 t 检验。
实验结果如表 2 所示， 表明本发明的蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵对大鼠股静脉损 伤的上血效率均优于对照止血材料明胶海绵及氧化纤维素止血纱布。
表 2CS 和 GS 在大鼠股静脉出血模型中的止血效果比较 (n ＝ 6)
*： P ＜ 0.01vs.GS
2、 大鼠股动脉出血模型实验
大鼠腹腔注射 2％戊巴比妥钠 10mg/100g 麻醉， 仰卧位固定于鼠板， 75％酒精消毒 腹股沟区， 无菌操作纵向切开腹股沟区皮肤， 暴露皮下组织肌肉， 血管钳钝性分离并暴露中 上段股动脉， 剪刀剪断股动脉制造失血模型。分别取 CS 和对照止血材料氧化纤维素止血纱 布 (OC) 适量直接应用于血管断端出血部位， 手法按压止血， 计时， 1 分钟后轻轻松开并观察 出血情况， 如再无活动性出血则定义为止血， 记录按压次数 ； 如仍出血， 则重复手法按压 1 分钟， 直至血止， 记录所需按压次数。统计方法采用成组设计 t 检验。
实验结果如表 3 所示， 表明本发明的蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵对大鼠股动脉损 伤的止血效率均优于对照止血材料明胶海绵及氧化纤维素止血纱布。
表 3CS 和 OC 在大鼠股动脉出血模型中的止血效果比较 (n ＝ 6)
*： P ＜ 0.01vs.OC
3、 兔股动脉出血模型实验
新西兰大耳白兔耳缘静脉注射 2％戊巴比妥钠麻醉， 仰卧位固定， 75％酒精消毒腹 股沟皮肤， 备皮。无菌操作纵向切开腹股沟区皮肤， 暴露皮下组织肌肉， 血管钳钝性暴露并 游离中上段股动脉， 剪刀部分剪断股动脉制造出血模型。分别取 CS 和对照止血材料 OC 适 量直接应用于股动脉断端出血部位， 手法按压止血， 计时， 3 分钟后轻轻松开并观察出血情 况， 如再无活动性出血则定义为止血， 记录按压次数 ； 如仍出血， 则重复手法按压 3 分钟， 直 至血止， 记录按压次数。
实验结果如表 4 所示， 表明本发明的蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵对家兔股动脉损
伤出血模型上的止血效率均优于对照止血材料明胶海绵及氧化纤维素止血纱布。
表 4CS 和 OC 在家兔股动脉出血模型中的止血效果比较 (n ＝ 4)
4、 大鼠肝损伤出血模型植入性应用
实验所有操作步骤均在无菌条件下进行 ：
大鼠腹腔注射 2％戊巴比妥钠 10mg/100g 麻醉， 仰卧固定于鼠板， 备皮， 消毒。无 3 菌打开腹腔暴露肝脏组织， 在肝左叶建立 8×8×5mm 大小肝组织缺损， 自由出血 10 秒 ( 无 菌纱布收集积血， 天平称量并计算沾血前后纱布重量差， 表征自由出血量， 作为各组模型出 3 血程度比较的参数指标 ) 后， 立即将 CS、 GS 或 OC( 均为 12×12×5mm ) 置于缺损出血肝组 织表面， 以一块干净纱布覆盖其上手法按压止血 1 分钟， 松开后取下纱布观察， 10 分钟内无 再次活动性出血则记为急性期止血成功 ； 如继续出血， 则换一块新材料 ( 相同种类、 相同大 小 ) 重复上述手法按压程序， 直至止血成功， 记录手法按压次数。依次间断缝合关腹。
急性期止血效果的观察指标为所需手法按压次数。 慢性期止血效果的观察指标为 术后 4 小时存活率。统计方法采用成组设计 t 检验。实验结果如表 5 所示。
表 5CS、 GS 和 OC 大鼠肝损伤出血模型植入止血效果比较 (n ＝ 10)
该实验表明本发明的蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵对大鼠肝损伤出血模型上的止 血效率均优于对照止血材料明胶海绵及氧化纤维素止血纱布， 并且不仅适用于血管创伤性 出血的外用急救， 还可适用于术中植入性止血。