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纤维素衍生物微粒、 该微粒的分散液、 该微粒的分散体及诊 断药
    技术领域 本发明涉及部分羟基被衍生化而成的纤维素微粒及该微粒的分散体、 以及使用该 微粒的诊断药。
     背景技术 目前， 尼龙、 聚乙烯、 聚丙烯腈、 聚苯乙烯、 纤维素等多种高分子微粒被应用到各种 用途中。其具体的用途不胜枚举， 例如光滑性赋予剂、 调色剂、 涂料用消光剂、 光扩散用添 加剂、 包装材料的抗粘连材料、 绝缘填料、 晶核剂、 层析用填充剂、 研磨剂和其他各种添加剂 等。 此外， 近年来液晶显示器间隔物、 分析仪器的校正用标准颗粒和多孔膜的检测用标准颗 粒、 诊断药用载体等的用途也在扩大。
     这些高分子微粒中， 纤维素具有其他合成高分子所不具备的各种特征。作为其特 征的具体例， 可列举出 (1) 化学性质比较稳定且难以溶解 ； (2) 具有耐热性， 高温下也不熔 解； (3) 为具有吸水性、 吸油性两者的两亲性聚合物 ； (4) 来源于天然物质， 可认为对人体无 害； (5) 具有赋形性和成形性 ； (6) 不易与蛋白质等物质发生相互作用， 且不引起吸附 ； (7) 具有多个羟基， 容易进行化学修饰 ； (8) 易燃、 且不产生有害物质 ； (9) 为生物降解性聚合 物， 可认为对环境无害等。
     利用上述 (1) ～ (9) 的特征， 纤维素微粒被应用于各种用途。具体用途不胜枚举， 例如涉及各种分级用柱填充剂、 酶载体、 微生物培养载体、 细胞培养载体、 滤材、 吸附剂、 药 物赋形材料、 药物崩解材料、 药物增量剂、 造粒基材、 食品用增粘调节剂、 触变性赋予材料、 分散稳定剂、 塑料增量剂、 填料、 化妆用粉底基材、 包装涂料用改性材料、 涂层剂、 煅烧法催 化剂制造用成型剂、 纤维壁用材料、 压敏复写纸用配合剂等多方面。
     纤维素为由 β- 葡萄糖分子形成的聚合物， β- 葡萄糖分子所具有的 3 个羟基给 其特征带来了较大的影响。 而且， 其部分羟基变换为其他结构的纤维素称为纤维素衍生物。 该纤维素衍生物根据取代的结构的种类、 表示取代程度的取代度等而具备各种特征。与纤 维素同样， 该纤维素衍生物也利用其特征而可应用于各种用途。
     本申请发明人等在过去发现了兼具微粒的粒径小、 且构成微粒的纤维素的平均聚 合度足够高等特征的纤维素微粒。 而且还令人惊奇地发现 ： 粒径小的纤维素微粒， 不加入表 面活性剂在水或各种介质中也不易引起凝集， 长期的分散稳定性优异。这些纤维素微粒是 兼具上述纤维素的特征和小粒径特征的有用的微粒， 可期待应用在各种用途中。 然而， 在构 成粒径小的纤维素衍生物的微粒时， 只可确定出非常有限种类的纤维素衍生物的微粒。
     作为目前已确定的粒径小的纤维素衍生物微粒， 可列举出专利文献 1 和专利文献 2 中记载的纤维素衍生物微粒。 它们均为预先将纤维素衍生化、 再将其成形为纳米级的小颗 粒状的纤维衍生物微粒。纤维素基本上不溶解于水、 有机溶剂或其混合物， 与此相对， 通过 衍生化可实现可溶性， 且能够利用溶解后的溶液成形为颗粒状。 然而， 由这些文献中记载的 方法所得到的纤维素衍生物微粒， 由于基本上为水溶性， 且在水中溶解， 因而可利用的用途
     非常有限。 另外， 考虑到将大部分羟基取代的话可实现非水溶性， 但那样的纤维素衍生物微 粒不能利用纤维素的亲水性特征。此时的用途也非常有限， 进而可推测到微粒自身在水中 凝集。
     即， 目前还尚未确定到粒径小、 在水中也不溶解， 且能够稳定地分散而存在的纤维 素衍生物微粒。这样的纤维素衍生物微粒被期待与纤维素微粒同样地应用于各种用途。作 为其中的一个例子可列举出诊断药用载体。
     诊断药是指用于对在生物体内存在的分子进行分析而检测体内的异常或变化的 试剂。 作为具代表性的诊断药， 可列举出免疫血清检查、 血液检查、 细胞检查和基因检查等。 此外， 并非是对在生物体内存在的分子进行分析而是对肽阵列或蛋白质阵列等氨基酸序列 进行调查的检查可以说也包括在广义的诊断药内。 不管怎样这些检查均是利用与检查对象 物质特异性相互作用的物质而进行的。诊断药中最具代表性的为免疫血清检查， 也称作免 疫测定。免疫测定是利用抗原与抗体的特异性反应的检查法， 其目的在于检测出肿瘤标志 物、 激素、 感染症、 自身免疫、 血浆蛋白、 TDM 及凝固 / 纤维蛋白溶解等检查对象物质。这样 的诊断药根据其简便性和迅速性而实际上被广泛应用于临床检查的领域中。而且， 目前的 现状为需要能够测定更微量的检查对象物质的高灵敏度。 使用了微粒的诊断药， 通过使微粒负载与检查对象物质特异性相互作用的物质、 并检测出在检查对象物质存在的情况下产生的变化来进行诊断。 作为诊断药用载体通常使 用称作金胶体的金纳米微粒或聚苯乙烯制纳米微粒。例如专利文献 3 中记载的使用金纳米 微粒的免疫层析法 (immuno-chromatography method)、 专利文献 4 中记载的使用聚苯乙烯 纳米微粒的胶乳法 (latex method) 等。
     然而， 由于这些纳米微粒通常为疏水性， 因此存在以下问题等 ： 保存稳定性低而使 微粒之间发生凝集、 沉降 ； 与检查对象物质以外的物质也发生相互作用而产生非特异性吸 附。此外为了改善保存稳定性有时也使用表面活性剂等稳定剂， 该稳定剂本身构成了非特 异性吸附的原因。此外， 多数的金或聚苯乙烯制的纳米微粒在制造阶段使用还原剂或乳化 剂来制造， 这些成分残留而构成了非特异性吸附的原因。 为了解决以上种种问题， 通常采取 通过白蛋白等封闭剂以亲水性物质包覆微粒表面等对策。然而， 目前的现状是其效果也还 称不上充分。非专利文献 1 中记载了通过使微粒表面完全亲水化而抑制非特异性吸附的方 法。但该方法在微粒的制造中比较费工夫， 也称不上是合理的。
     这样地用于免疫血清检查的微粒有时需要为亲水性的微粒。而且， 不限于免疫血 清检查， 在整个诊断药领域中有时也需要亲水性的微粒。 此外， 水在生物体中所占的比例非 常高， 考虑到多数在生物体内的分子的反应能在与水有关的环境下进行， 可预测为在面向 生物医学的用途中亲水性的微粒较为有用。然而现在一般的纳米微粒多为金属、 无机物及 聚合性聚合物等疏水性物质。从这样的状况来看， 可以说亲水性的纳米微粒不仅在诊断药 用途， 而且在各种用途中均有所需求。
     专利文献 1 ： 日本特表 2001-503101 号公报
     专利文献 2 ： 日本特开 2007-528436 号公报
     专利文献 3 ： 日本特开平 10-68730 号公报
     专利文献 4 ： 日本特开 2000-355553 号公报
     非专利文献 1 ： 高分子论文集， Vol.50， No.5， P431-435(5 月， 1993)
     发明内容 发明要解决的问题
     本发明的目的在于， 鉴于上述现状而提供非水溶性且亲水性的粒径小的纤维素衍 生物微粒、 该微粒的分散液和该微粒的分散体。此外， 其目的还在于提供一种诊断药， 其通 过使该纤维素衍生物微粒负载与检查对象物质特异性相互作用的物质， 而具有亲水性高、 保存稳定性优异、 且无需乳化剂或表面活性剂等额外成分等的优异特点。
     用于解决问题的方案
     本发明人等进行深入研究的结果， 成功地获得了一种纤维素衍生物微粒， 其通过 使在本发明人等已经报道的国际公开第 2008/084854 号小册子中记载的纤维素微粒的部 分羟基衍生化， 并调节其取代度， 而兼具不溶于水、 且亲水性高等特征。此外， 还发现 ： 通过 利用被衍生化的取代基使该纤维素衍生物微粒负载与检查对象物质特异性相互作用的物 质， 可作为诊断药用载体来使用， 从而完成了本发明。即本发明如以下所述。
     (1) 一种纤维素衍生物微粒， 其特征在于， 该纤维素衍生物微粒由纤维素的部分羟 基被取代基取代了的纤维素衍生物构成， 其平均粒径为 9 ～ 1000nm。
     (2) 根据上述 (1) 所述的纤维素衍生物微粒， 其特征在于， 所述取代的取代度为 2.5 以下。
     (3) 根据上述 (2) 所述的纤维素衍生物微粒， 其特征在于， 所述取代的取代度为 1.0 以下。
     (4) 根据上述 (1) ～ (3) 中任一项所述的纤维素衍生物微粒， 其特征在于， 所述取 代基包括羧基、 氨基、 季铵基、 羟烷基、 烷基、 乙酰基、 氰乙基、 硫酸基、 及用于将至少 2 个以 上的羟基彼此连接的桥接基中的任意 1 种以上。
     (5) 根据上述 (1) ～ (4) 中任一项所述的纤维素衍生物微粒， 其特征在于， 其通过 化学键合或物理吸附负载有纤维素以外的成分。
     (6) 根据上述 (5) 所述的纤维素衍生物微粒， 其特征在于， 被负载的所述纤维素以 外的成分包括与其他成分特异性相互作用的物质。
     (7) 根据上述 (5) 或 (6) 所述的纤维素衍生物微粒， 其特征在于， 被负载的所述纤 维素以外的成分包括生物材料。
     (8) 根据上述 (7) 所述的纤维素衍生物微粒， 其特征在于， 生物材料包括抗原或抗 体。
     (9) 一种诊断药， 其特征在于， 其含有上述 (1) ～ (8) 中任一项所述的纤维素衍生 物微粒。
     (10) 根据上述 (9) 所述的诊断药， 其特征在于， 纤维素衍生物微粒为上述 (5) ～ (8) 中任一项所述的纤维素衍生物微粒， 被负载的纤维素以外的成分包括与检查对象物质 特异性相互作用的物质。
     (11) 根据上述 (9) 或 (10) 所述的诊断药， 其特征在于， 纤维素衍生物微粒的 CV 值 为 30％以下。
     (12) 根据上述 (9) ～ (11) 中任一项所述的诊断药， 其特征在于， 诊断为免疫血清 诊断。
     (13) 一种待测物检测方法， 其特征在于， 将上述 (9) ～ (12) 中任一项所述的诊断 药与待测物混合， 对待测物中的检查对象物质进行检测。
     (14) 根据上述 (13) 所述的待测物检测方法， 其特征在于， 诊断药为上述 (10) ～ (12) 中任一项所述的诊断药， 根据纤维素衍生物微粒的凝集程度检测出待测物中的检查对 象物质。
     (15) 一种分散液， 其特征在于， 其将上述 (1) ～ (8) 中任一项所述的纤维素衍生物 微粒分散到液体中。
     (16) 一种成型体， 其特征在于， 其将上述 (1) ～ (8) 中任一项所述的纤维素衍生物 微粒固定在固体表面或分散到固体中。
     发明的效果
     本发明的纤维素衍生物微粒为过去没有的具有小粒径的纤维素衍生物微粒， 并 且， 兼具亲水性高、 保存稳定性高、 无需乳化剂或表面活性剂等额外成分等特征。 此外， 通过 利用纤维素衍生物的取代基而使纤维素衍生物微粒负载与检查对象物质特异性相互作用 的物质， 从而能够提供具有优异特点的诊断药。 附图说明 图 1 为实施例 1 中得到的羧基化纤维素微粒的电子显微镜照片， 其中， 摄影倍率为 2 万倍， 比例尺条为 1μm。
     图 2 为表示实施例 16 的诊断药评价结果的图 ( 横轴 ： 抗原浓度， 纵轴 ： 吸光度变 化 )。
     具体实施方式
     以下， 对本申请发明进行具体说明。
     本发明中的纤维素衍生物微粒为由纤维素衍生物形成的微粒， 其制造方法没有特 别的限制。 例如， 可采用将纤维素成型为微粒状后进行衍生化、 将预先被衍生化的纤维素衍 生物成形为微粒状等任意方法来制作。 当然， 构成原料的纤维素也没有特别的限制， 可使用 再生纤维素、 精制纤维素及天然纤维素等纤维素。 本发明中， 通过将天然纤维素溶解于铜氨 溶液、 并与凝固液混合， 而使其发生微相分离， 通过使颗粒浓相形成微粒而取出的方法将纤 维素成形为微粒状， 然后进行微粒的衍生化。
     本发明中的纤维素衍生物是指纤维素所具有的部分羟基被其他的不同取代基取 代后的物质。 其取代基的种类没有特别的限制。 具体而言， 可列举出包含羧基、 伯氨基、 仲氨 基或叔氨基、 季铵基、 羟烷基、 烷基、 乙酰基、 氰乙基、 硫酸基、 酰胺基、 醛基、 硝基、 硝酸基、 甲 苯磺酰基、 苯氨甲酸苯酯基 (phenyl carbanilate)、 三苯甲基、 及用于将至少 2 个以上的羟 基彼此连接的桥接基等取代基的基团。另外， 本发明中的桥接是指以任意的化合物使纤维 素的羟基之间连接。该桥接的方法和种类， 没有特别的限制， 例如可通过使用环氧氯丙烷、 福尔马林、 硅烷偶联剂、 环氧改性硅酮系桥接剂、 乙二醛系树脂等具有 2 个以上与羟基反应 的部分的化合物进行桥接。后述的实施例使用乙二醛系树脂或环氧氯丙烷进行了桥接。此 外， 进行纤维素染色的反应性染料也利用其与羟基的反应， 可以说染料也是取代基的一种。 用作诊断药的情况， 考虑到用于与抗体等生物材料结合的难易程度， 特别优选具有羧基或氨基的纤维素衍生物。 其原因在于， 生物材料不仅限于抗体其还可由各种氨基酸构成， 该纤 维素衍生物能够与氨基酸所具有的羧基或氨基形成酰胺键。此外， 可并用取代基种类不同 的纤维素衍生物， 也可用各种组合来进行取代。 例如， 在将纤维素衍生物微粒作为诊断药使 用时， 为了微粒表面的改性、 溶胀程度的改善等， 还可进行其他取代基的导入或桥接等的化 学修饰。 本发明中， 通过将纤维素微粒与苛性钠混合来调制碱纤维素， 进而通过加入反应剂 来进行衍生化。 例如， 加入氯乙酸钠作为反应剂， 进而在反应结束后用盐酸进行处理从而能 够实现羧基化， 通过使用 2- 氯乙胺作为反应剂能够实现伯氨基化， 进而加入环氧氯丙烷作 为反应剂进行环氧活化， 然后加氨水使环氧基开裂， 从而同时进行氨基化和桥接。此外， 可 通过使用乙二醛系树脂和与之相匹配的催化剂来进行桥接。改变反应剂的种类， 能够调制 各种衍生化， 从而能够获得各种纤维素衍生物微粒。
     本发明中的纤维素衍生物的取代程度用取代度来表示， 取代度越高表示越多的羟 基被取代。取代度是指平均每个纤维素的葡萄糖单元中多少个羟基被取代， 三个羟基全部 被取代的情况用取代度 3 来表示， 一个羟基被取代的情况用取代度 1 来表示， 羟基完全未被 取代的情况用取代度 0 来表示。另外， 最终取代度为构成纤维素的所有的葡萄糖的取代度 的平均值。 本发明的纤维素衍生物的取代度， 没有特别的限制。 然而， 由于其为亲水性， 因此， 取代度优选为 2.5 以下。取代度超过该值时有时无法达成本发明的目标亲水性。另外， 即 使取代度为 2.5 以下， 根据取代基的种类而呈现出水溶性， 有时也难以在水中使用。在那样 的情况下， 除了加入目标取代基外， 可导入桥接结构。由此能使纤维素不溶于水。由于根据 取代基的种类、 取代的羟基的位置等而使亲水性的程度发生变化， 因此难以笼统地规定用 于保持亲水性的取代度， 更优选为 2.0 以下， 进一步优选为 1.5 以下， 特别优选为 1.0 以下， 最优选为 0.5 以下。
     本发明的平均粒径是指用电子显微镜拍摄纤维素衍生物微粒、 通过对所得图像进 行图像解析而得到的体积换算中值粒径。其测定个数为 100 个以上。用电子显微镜拍摄的 图像为平面图像， 未必会显示出微粒的立体形状， 通过使微粒的观察个数为 100 个以上， 能 够以平均值来判断立体形状。但是， 用电子显微镜观察微粒时需要将分散在液体中的状态 的颗粒干燥。在该干燥时微粒凝集， 表观上的平均粒径发生变化， 因此需要引起注意。为了 确认干燥条件， 优选使用动态光散射式粒度分布装置， 在与永不干 (never dry) 的状态下的 粒径进行比较的同时决定干燥条件。另外， 本发明中微粒的干燥使用采用金属接触 (metal contact) 法的冻结干燥。 并且所得的体积换算粒径分布的标准偏差除以平均粒径所得的值 为 CV 值 (Coefficient of Variation( 变异系数 ) 的缩写 )， 其可用作表示微粒的均一性的 指标。
     本发明的微粒是指在通过上述电子显微镜进行的微粒的图像解析中微粒的短径 与长径之比 ( 长径 / 短径 ) 充分小的颗粒。该比值过大的棒状、 纤维状或网状的颗粒不包 括在微粒内。 为了发挥作为微粒的功能， 100 个微粒的平均值的长径 / 短径＝ 10.0 以下， 优 选为 5.0 以下， 特别优选为 3.0 以下， 进而优选为 2.0 以下。该值越小， 微粒的形状越接近 真球状。另外， 衍生化的取代度过高时， 所得的微粒可能无法维持颗粒形状， 在从使微粒分 散于 IPA 等有机溶剂的状态对颗粒进行干燥时， 其长径 / 短径足够小， 与此相对， 从使其分 散在水中的状态进行干燥的微粒， 其长径 / 短径会变大。此种情况下所得的物质， 还不能说
     是微粒， 且水中使用时会产生问题。
     平均粒径的测定采用电子显微镜图像而不是采用动态光散射方式的粒度分布测 定的原因在于 ： 纤维素衍生物在水中容易发生溶胀。这是由于通过衍生化而使得纤维素的 氢键变弱， 其程度根据衍生化的取代度、 种类而大不相同， 因此对各自进行比较评价是较为 困难的。
     本发明的纤维素衍生物微粒的平均粒径为 9 ～ 1000nm， 优选为 9 ～ 700nm。 平均粒 径在该范围时， 难以发生由于长期保存所致的沉降， 还可适用于诊断药。在用作诊断药时， 平均粒径优选 20 ～ 700nm。 平均粒径在 20nm 以下时， 难以检测出由与检查对象物质结合所 致的凝集。相反， 平均粒径大于 700nm 时， 在液体中保存时容易引起颗粒的沉降。平均粒径 更优选为 50 ～ 500nm。但是， 为了提高作为诊断药的灵敏度， 还可通过分级进行均一化， 或 者也可混合使用 2 种以上平均粒径的纤维素衍生物微粒。
     纤维素衍生物微粒是否溶解于水， 受到其取代基的种类、 取代度、 取代的羟基的位 置、 以及所负载的物质的种类等的影响， 不能笼统地定义其取代度。例如， 在钠盐型的羧甲 基化纤维素的情况下， 通常取代度低于 0.4 时不溶于水， 取代度 0.6 以上时被认为可溶于 水。此外， 2 位和 3 位的羟基优先被羧甲基化的纤维衍生物， 在取代度 0.3 时也认为可溶于 水。 此外， 在甲基化纤维素的情况下， 通常取代度 1.6 ～ 2.0 时被认为可溶于水。 这样， 不溶 于水的纤维素衍生物的取代度根据各种条件而大不相同， 因此不能笼统地规定其取代度。 本发明的 CV 值是指 Coefficient of Variation 的缩写， 通常被用作表示微粒的 均一性的指标。这些纤维素微粒分散液的粒度分布中以体积基准来表示分散度， 可通过下 述式子来定义。 该值越小， 表示粒度分布越尖锐， 纤维素微粒的大小也相应地越整齐。 此外， 其单位用 (％ ) 来表示。
     CV 值＝ ( 通过电子显微镜图像求得的体积粒度分布的标准偏差 )/( 通过电子显微 镜图像求得的体积平均中值粒径 )×100
     本发明的纤维素衍生物微粒的 CV 值， 没有特别的规定。但是， 在用作诊断药时， 优 选 30％以下。CV 值超过 30％时， 对作为诊断药的诊断的准确性带来不良影响。更优选为 25％以下， 进一步优选为 20％以下。 通常 CV 值变小时， 诊断的准确性提高， 但 CV 值过小时， 制造的工夫或成本变大。考虑到成本与准确性的平衡时， 优选 1％以上。
     本发明的纤维素衍生物微粒， 还可通过化学键合或物理吸附负载纤维素以外的成 分后进行利用。 作为化学键合或物理吸附的一个例子， 可列举出共价键、 离子键、 配位键、 金 属键、 氢键、 亲水吸附、 疏水吸附、 范德华结合等， 但不受它们的限制。通过上述各种力使纤 维素衍生物微粒负载纤维素以外的成分， 从而能够调制具备纤维素衍生物所不具有的功能 的微粒。 即使是不使纤维素发生衍生化的纤维素微粒， 也能够使其负载纤维素以外的成分， 可通过任意改变取代基的种类而使其负载各种成分。
     本发明的纤维素衍生物微粒所负载的成分是指纤维素衍生物以外的各种物质， 其 种类没有特别的限制。 作为其中的一个例子， 可列举出表面活性剂、 无机微粒、 有机微粒、 生 物材料、 染料、 离子性物质、 水溶性低分子、 封闭剂等， 但不受它们的限制。
     本发明的纤维素衍生物所负载的生物材料是指由生物体获得的各种材料， 其种类 没有特别的限制。 作为其中的一个例子， 可列举出胶原、 明胶、 纤维蛋白、 肝素、 透明质酸、 淀 粉、 壳多糖、 壳聚糖、 氨基酸、 肽、 蛋白质、 核酸、 碳水化合物、 脂肪酸、 萜类化合物、 类胡萝卜
     素、 四吡咯、 辅助因子、 类固醇、 类黄酮、 生物碱、 多聚乙酰、 配糖体、 酶、 抗体、 抗原等。 通过使 纤维素衍生物微粒负载这些生物材料， 使纤维素衍生物微粒的生物体适应性的提高、 作为 诊断药的利用等得以实现。
     本发明中， 通过使纤维素衍生物微粒负载与检查对象物质特异性结合的物质， 能 够将纤维素衍生物微粒用作诊断药。
     本发明的检查对象物质是指免疫血清检查、 血液检查、 细胞检查、 基因检查等检查 等中的测定对象， 其种类没有特别的限制。 例如可列举出肿瘤标志物、 激素、 感染症、 自身免 疫、 血浆蛋白、 TDM、 凝固 / 纤维蛋白溶解、 氨基酸、 肽、 蛋白、 基因、 细胞等。更具体而言， 可 列举出 CEA、 AFP、 铁蛋白、 β2M(β2 微球蛋白 )、 PSA、 CA19-9、 CA125、 BFP、 弹性蛋白酶 1、 胃 蛋白酶原 1·2、 便潜血、 尿中 β2M、 PIVKA-2、 尿中 BTA、 胰岛素、 E3、 HCG、 HPL、 LH、 HCV 抗原、 HBs 抗原、 HBs 抗体、 HBc 抗体、 HBe 抗原、 HBe 抗体、 HTLV-1 抗体、 HIV 抗体、 弓形虫抗体、 梅 毒、 ASO、 A 型流感抗原、 A 型流感抗体、 B 型流感抗原、 B 型流感抗体、 轮状病毒抗原、 腺病毒抗 原、 轮状病毒·腺病毒抗原、 A 群链球菌、 B 群链球菌、 念球菌抗原、 CD 菌、 隐球菌抗原、 霍乱 菌、 脑膜炎菌抗原、 粒细胞弹性蛋白酶、 幽门螺杆菌抗体、 O157 抗体、 O157 抗原、 钩端螺旋体 抗体、 曲霉菌抗原、 MRSA、 RF、 总 IgE、 LE 检测 (lupus erythematosus test， 红斑狼疮检测 )、 CRP、 IgG， A， M、 IgD、 转铁蛋白、 尿中白蛋白、 尿中转铁蛋白、 肌红蛋白、 C3·C4、 SAA、 LP(a)、 α1-AC、 α1-M、 触珠蛋白、 微量转铁蛋白、 APR 评分 (Acute Phase Reactant Score， 急性期 反应物评分 )、 FDP、 D- 二聚体、 纤溶酶原、 AT3、 α2PI、 PIC、 PAI-1、 蛋白质 C、 凝血因子 XIII、 IV 型胶原、 透明质酸、 GHbA1c、 各种抗原、 各种抗体、 各种病毒、 各种菌、 各种氨基酸、 各种肽、 各种蛋白质、 各种 DNA、 各种细胞等。
     本发明的与检查对象物质特异性相互作用的物质是指对上述检查对象物质进行 选择性吸附或结合的物质， 其种类没有特别的限制。例如可列举出抗原、 抗体、 氨基酸、 肽、 蛋白质、 碱基序列等。 尤其在使用了抗体的情况下， 能够在免疫血清检查中检测出各种抗原 的存在。 例如， 在使用抗体时， 其来源也没有特别的限制， 还可使用多克隆抗体、 单克隆抗体 的任一种。 此外， 这些负载物质的结合方式也没有特别的限制， 可以为物理吸附和化学键合 的任一种。考虑到负载时所耗费的工夫， 优选物理吸附 ； 从负载后的稳定性考虑， 优选化学 键合。
     本发明中， 在将纤维素衍生物微粒用作诊断药时， 其所负载的物质的负载量并不 能笼统地规定。 可根据检查对象物质的种类、 大小和其在待测物中的存在量， 负载物质的种 类及大小， 以及用于进行负载的纤维素衍生物微粒的大小， 取代度及取代基的种类等各种 条件， 适当调整后使用。
     本发明中， 在将纤维素衍生物微粒用作诊断药时， 可通过检测出在检查对象物质 存在的情况下产生的变化来进行诊断。 该变化根据测定原理而具有多种多样， 可将浊度、 色 调、 粒径、 电位、 吸光度、 光透过度、 与其他物质的相互作用等各种变化用于测定中。并且该 变化的检测方法可根据各个变化来进行选择， 可利用使用机器读取或目视判断等。本发明 中如后述那样， 使用紫外可见分光光度计测定特定波长的吸光度变化。
     在使用紫外可见分光光度计测定特定波长的吸光度变化时， 将构成诊断药的纤维 素衍生物微粒和待测物混合， 根据纤维素衍生物微粒的凝集程度， 可对待测物中的检查对 象物质进行定量。在该检测方法中， 较为理想的必要条件为 ： 纤维素衍生物微粒为具有纳米级的特定粒径的微粒， 且为亲水性， 发生凝集的情况较少， 稳定分散， 并且， 微粒的粒度整 齐。当满足该必要条件时， 能够高精度且无偏差地检测出检查对象物质。尤其在使用 CV 值 小的纤维素衍生物微粒时， 由于检查对象物质的量和粒径变化更均一化， 因此能够作为诊 断药更准确地测定。CV 值的值优选为 30％以下， 更优选为 25％以下， 进一步优选为 20％以 下。
     本发明中将纤维素衍生物微粒用作诊断药时， 可将纤维素微粒衍生物分散到各种 溶液中来使用， 优选在 pH ＝ 5.0 ～ 9.0 的缓冲液中使用。 例如可列举出磷酸缓冲液、 甘氨酸 缓冲液、 三羟甲基氨基甲烷缓冲液 (tris buffer)、 硼酸缓冲液、 柠檬酸缓冲液、 MES 缓冲液 等。并且， 其缓冲液的浓度也没有特别的限制， 可使用通常用作缓冲液的各种浓度。并且， 该溶液中的纤维素衍生物微粒浓度也没有特别的限制， 可根据检查对象物质的种类、 性质、 浓度等适当调整而使用。通常优选为 0.01 ～ 10wt％左右， 更优选为 0.1 ～ 1.0wt％。
     在将本发明的纤维素衍生物微粒用作诊断药时， 为了提高测定灵敏度或促进抗原 抗体反应也可使用各种敏化剂。此外， 为了抑制由待测物中存在的其他物质所引起的非特 异性吸附也可使用阻断剂等。
     本发明的纤维素衍生物微粒也可如诊断药那样分散到任意的液体中。此外， 还可 分散到任意的固体中来使用、 或使微粒固定于固体表面来使用等。 此外， 通过对纤维素衍生 物微粒进行着色， 还可提高微粒的可视性或者提高检测灵敏度。 此外， 通过在以往的诊断药中仅添加本发明的纤维素衍生物微粒， 还可期待出现 以下的效果 ： 利用纤维素的亲水性和稳定性， 提高试剂的稳定性、 提高测定灵敏度、 缩短反 应时间等。
     此外， 以例如负载与其他成分特异性相互作用的物质的例子对诊断药进行了详细 地说明， 除诊断药以外还可应用在吸附剂、 缓释剂及柱载体等中。
     实施例
     以下， 通过实施例对本发明进行更详细地说明， 但本发明并不仅限定于这些实施 例。在无特别记载的前提下所有的操作均在 25℃的环境下进行。
     < 以高压均质机进行的分散处理 >
     使用マィクロフルィディックス公司制的油压式超高压均质机 M-110-E/H。此时 的处理压力为 50MPa， 进行 10 次通过高压部分即腔室的操作。
     < 平均粒径的测定 >
     根据需要的倍率而使用以下 2 种电子显微镜进行纤维素微粒的观察。使用日本电 子株式会社制造的透射电子显微镜 JEM2000EX( 以 100kV 的加速电压和 5 万倍或 10 万倍的 倍率观察 )、 日本电子株式会社制造的扫描电子显微镜 JSM-6380( 以 10kV 的加速电压和 2 万倍的倍率观察 )。 由纤维素衍生物微粒分散液至粉末状纤维素衍生物微粒的干燥， 在没有 特别说明的前提下， 均利用液氮将纤维素衍生物微粒分散液快速冷冻并进行减压， 从而进 行冷冻减压干燥。
     将上述那样获得的图像使用マゥンテック公司制造的图像解析式粒度分布测定 软件 Mac-View， Ver.3 进行了分析。为了确保准确性， 其测定个数设定为 100 个以上， 在一 幅图像所显示的颗粒不足 100 个时， 对 2 幅以上的图像进行分析。
     < 纤维素微粒的羧基化的确认 >
     采用与上述同样的方法调制粉末状羧基化纤维素微粒， 使用日本电子制造的核磁 共振测定装置 JNM-ECA400 测定了 1H- 核磁共振谱。通过谱图读取与纤维素骨架的 C1 键合 的质子和羧甲基的亚甲基质子的积分值比， 并求出取代度。在以下条件下进行了测定。
     测定溶剂 ： 11wt％重氢氧化钠溶液 ( 由重水和重苛性钠调制 )
     C1 质子出现位置 ： 4.13ppm
     亚甲基质子出现位置 ： 3.37ppm， 3.65ppm
     < 纤维素微粒的氨基化的确认 >
     根据以往公知的方法采用凯氏法进行分析， 对氨基化纤维素微粒中所含的氮量进 行定量， 并由氨基化纤维素的分子量求出取代度。 但是， 有关含有桥接结构而无法定义分子 量的氨基化纤维素微粒， 无法求得取代度， 因此不能进行纤维素微粒的氨基化的确认。
     < 纤维素微粒的其他衍生化的确认 >
     与上述羧基化的确认同样， 通过比较各个取代基所对应的出现位置和 C1 质子出 现位置的积分值， 求得取代度。
     < 纤维素微粒的桥接化的确认 >
     测定桥接前的纤维素微粒重量和桥接后的纤维素微粒重量， 根据重量的增量值求 得桥接的取代度。 < 作为诊断药的性能评价 >
     使用紫外可见分光光度计 ( 日本分光株式会社制造， V-630) 进行了测定。在以下 条件下进行了测定。
     待测物 ： 3.0μl
     稀释液 ： 160μl
     诊断药量 ： 40μl
     测定波长 ： 600nm
     测定要点 ： 测定与待测物混合后即刻和 5 分钟后的吸光度变化值
     反应温度 ： 37℃
     < 实施例中使用的试剂等的说明 >
     丙酮 ： 和光纯药工业株式会社制造， 特级
     异丙醇 ： キシダ化学株式会社制造， 特级
     二甲基亚砜 ： 和光纯药工业株式会社制造， 特级
     四氢呋喃 ： 和光纯药工业株式会社制造， 特级
     氯乙酸钠 ： 和光纯药工业株式会社制造
     2- 氯乙胺盐酸盐 ： 和光纯药工业株式会社制造
     环氧氯丙烷 ： 和光纯药工业株式会社制造
     2- 吗啉乙磺酸 (MES 缓冲液用 ) ： 株式会社同仁化学研究所制造
     磷酸氢二钠 12 水合物 ( 磷酸缓冲液用 ) ： 和光纯药工业株式会社制造
     磷酸二氢钾 ( 磷酸缓冲液用 ) ： 和光纯药工业株式会社制造
     2- 氨基 -2-( 羟甲基 ) 丙烷 -1， 3- 二醇盐酸盐 (Tris 缓冲液用 ) ： Merck 公司制造
     1- 乙基 -3-(3- 二甲基氨丙基 ) 碳二亚胺盐酸盐 (EDC) ： 株式会社同仁化学研究所 制造
     抗 CRP 抗体 ： 和光纯药工业株式会社制造， Anti Human CRP 单克隆抗体 CRP 抗原 ： 和光纯药工业株式会社制造， LT·CRP-HSCalibrator Set T (5 种抗原浓度 ： 0.4、 1.2、 3.5、 16.0、 35.0mg/dl) 另外， 在实施例中没有特别记载的前提下， 均使用了和光纯药工业株式会社制造的试剂。 [ 实施例 1]
     采用现有公知的方法调制出纤维素浓度 0.37wt ％、 铜浓度 0.13wt ％、 氨浓度 1.00wt％的铜氨纤维素溶液。进一步调制出四氢呋喃浓度 89.0wt％、 水浓度 11.0wt％的凝 固液。
     使用磁力搅拌器一边缓慢搅拌 5000g 的凝固液， 一边添加预先制备好的铜氨纤维 素溶液 500g。继续搅拌 5 秒左右后， 添加 10wt％的硫酸 1000g 进行中和及再生， 得到含有 纤维素微粒的浆料 6500g。
     将得到的浆料以 10000rpm 的速度离心分离 10 分钟。沉淀物通过倾析取出， 注入 去离子水并搅拌， 然后再次离心分离。 重复数次该操作直至 pH 为 6.0 ～ 7.0， 之后利用高压 均质机进行分散处理， 得到纤维素微粒分散液 150g。测定所得的纤维素微粒的平均粒径的 结果为 261nm。另外， 其 CV 值为 18％。
     向部分所得的纤维素微粒分散液中添加纯水、 异丙醇， 将作为分散介质的异丙 醇∶水之比调节为 85 ∶ 15， 分散介质中的颗粒浓度调节为 0.20wt％， 准备好 100g( 其中纤 维素成分为 0.2g) 的纤维素微粒分散液。将纤维素微粒分散液与转子一起加入到茄型玻 璃烧瓶中， 安装玻璃制回流管。一边以约 10℃的自来水回流冷却， 一边以水浴加热 30 分钟 使纤维素微粒分散液为 50℃。另外在加热的同时使用磁力搅拌器缓慢地搅拌。此外， 调制 11％的苛性钠溶液， 在纤维素微粒分散液中边搅拌边加入 0.54g 该苛性钠溶液 ( 纤维素∶ 苛性钠的摩尔比为 1.0 ∶ 1.2)。进而继续搅拌 30 分钟， 调制成碱纤维素。调制成碱纤维素 后， 进而一边继续搅拌一边加入氯乙酸钠 70mg( 纤维素∶氯乙酸钠的摩尔比为 1.0 ∶ 0.5)。
     在 3 小时之内， 继续搅拌和回流， 进行纤维素的羧基化。经过 3 小时后， 停止水浴 的加热， 用冰水冷却茄型烧瓶， 直至反应后浆料的温度冷却到 20℃。冷却后一边继续搅拌， 一边加入 10％盐酸 5.0g 使得反应后浆料的 pH 为酸性。 与前述同样地， 使用离心分离机， 将 通过倾析 - 去离子水进行的稀释重复数次， 使得 pH 为 6.0 ～ 7.0， 之后利用高压均质机进行 分散处理， 得到羧基化纤维素微粒分散液 100g。测定所得的羧基化纤维素微粒的平均粒径 的结果为 264nm。此外， 其 CV 值为 19％。电子显微镜照片如图 1 所示。另外， 使用核磁共 振测定装置求得了取代度， 该取代度为 0.078。
     [ 实施例 2]
     使用实施例 1 中调制出的平均粒径 261nm 的纤维素微粒分散液， 所加入的氯乙酸 钠的量为 140mg( 纤维素∶氯乙酸钠的摩尔比为 1.0 ∶ 1.0)， 除此以外， 采用与实施例 1 同 样的方法进行纤维素的羧基化。 测定所得的羧基化纤维素微粒的平均粒径的结果为 263nm。 此外， 其 CV 值为 21％。取代度为 0.157。
     [ 实施例 3]
     使用实施例 1 中调制出的平均粒径 261nm 的纤维素微粒分散液， 所加入的氯乙酸 钠的量为 280mg( 纤维素∶氯乙酸钠的摩尔比为 1.0 ∶ 2.0)， 除此以外， 采用与实施例 1 同
     样的方法进行纤维素的羧基化。 测定所得的羧基化纤维素微粒的平均粒径的结果为 266nm。 并且， 其 CV 值为 22％。取代度为 0.312。
     [ 实施例 4]
     使用实施例 1 中调制出的平均粒径 261nm 的纤维素微粒分散液， 所加入的氯乙酸 钠的量为 560mg( 纤维素∶氯乙酸钠的摩尔比为 1.0 ∶ 4.0)， 除此以外， 采用与实施例 1 同 样的方法进行纤维素的羧基化。 测定所得的羧基化纤维素微粒的平均粒径的结果为 269nm。 并且， 其 CV 值为 22％。取代度为 0.486。
     [ 比较例 1]
     使用实施例 1 中调制出的平均粒径 261nm 的纤维素微粒分散液， 所加入的氯乙酸 钠的量为 700mg( 纤维素∶氯乙酸钠的摩尔比为 1.0 ∶ 5.0)， 除此以外， 采用与实施例 1 同 样的方法进行纤维素的羧基化。 为了测定所得的羧基化纤维素微粒的平均粒径而拍摄了电 子显微镜图像， 结果确认出网状的结构。另外， 取代度为 0.540。
     纤维素衍生物为羧基化纤维素的情况， 取代度为 0.54 时， 变得易溶于水， 无法维 持颗粒形状。
     [ 比较例 2]
     使用实施例 1 中调制出的平均粒径 261nm 的纤维素微粒分散液， 所加入的 11％苛 性钠的量为 4.50g( 纤维素∶苛性钠的摩尔比为 1.0 ∶ 10.0)， 氯乙酸钠的量为 7.0g( 纤维 素∶氯乙酸钠的摩尔比为 1.0 ∶ 50.0)， 除此以外， 采用与实施例 1 同样的方法进行纤维素 的羧基化。反应结束后尝试了使用了离心分离机进行水洗， 生成的羧基化纤维素溶解于作 为反应溶剂的 85％异丙醇 (15％为水 ) 中， 无法回收。
     [ 实施例 5]
     铜氨纤维素溶液的氨浓度为 6.3wt％， 凝固液为异丙醇， 除此以外， 采用与实施例 1 同样的方法， 得到平均粒径 9.2nm、 CV 值 20％的纤维素微粒。进而采用与实施例 3 同样的 方法进行了纤维素的羧基化， 得到平均粒径 9.8nm、 CV 值 20％、 取代度 0.320 的羧基化纤维 素微粒。
     [ 实施例 6]
     铜氨纤维素溶液的氨浓度为 8.5％， 凝固液为四氢呋喃 90.0wt％、 水 10.0wt％， 除 此以外， 采用与实施例 1 同样的方法， 得到平均粒径 521nm、 CV 值 26％的纤维素微粒。此外 采用与实施例 1 同样的方法进行纤维素的羧基化， 得到平均粒径 524nm、 CV 值 28％、 取代度 0.151 的羧基化纤维素微粒。
     [ 比较例 3]
     以现有公知的方法通过喷雾干燥法得到平均粒径 5121nm、 CV 值 10％的纤维素微 粒。此外， 采用与实施例 3 同样的方法进行纤维素的羧基化， 得到平均粒径 5020nm、 CV 值 11％、 取代度 0.325 的羧基化纤维素微粒。
     由实施例 1 ～ 6 和比较例 1 ～ 3 可确定， 羧基化的取代度为 ： 实施例 1 ＜实施例 2 ＜实施例 3 ＜实施例 4 ＜比较例 1 ＜比较例 2， 可根据所使用的苛性钠的量和反应剂的量来 控制取代度。并且， 即使改变所使用的纤维素微粒的大小也能够同样地实现衍生化。
     [ 实施例 7]
     将实施例 1 中调制出的平均粒径 261nm 的纤维素微粒分散液分散到纯水中， 使水中的颗粒浓度调整为 1.0wt％， 准备好 20g( 其中， 纤维素成分为 0.2g) 的纤维素微粒分散 液。接着， 与实施例 1 同样地将温度调节为 50℃， 边搅拌边加入苛性钠， 使水中的苛性钠浓 度调整为 9.0wt％， 继续搅拌 30 分钟。进一步加入 2- 氯乙胺盐酸盐 430mg( 纤维素∶ 2- 氯 乙胺盐酸盐的摩尔比为 1.0 ∶ 3.0)。 在 3 小时之内， 继续搅拌和回流， 进行纤维素的伯氨基 化。经过 3 小时后， 与实施例 1 同样地得到伯氨基化纤维素微粒分散液 100g。所得的伯氨 基化纤维素微粒的平均粒径为 259nm， CV 值为 19％， 取代度为 0.099。
     [ 实施例 8]
     所使用的 2- 氯乙胺盐酸盐的量为 1.43g( 纤维素∶ 2- 氯乙胺盐酸盐的摩尔比为 1.0 ∶ 10.0)， 除此以外， 采用与实施例 7 同样的方法得到伯氨基化纤维素微粒分散液 100g。 所得的伯氨基化纤维素微粒的平均粒径为 270nm， CV 值为 18％， 取代度为 0.209。
     [ 实施例 9]
     所使用的 2- 氯乙胺盐酸盐的量为 7.16g( 纤维素∶ 2- 氯乙胺盐酸盐的摩尔比为 1.0 ∶ 30.0)， 除此以外， 采用与实施例 7 同样的方法得到伯氨基化纤维素微粒分散液 100g。 所得的伯氨基化纤维素微粒的平均粒径为 268nm， CV 值为 21％， 取代度为 0.323。
     [ 实施例 10]
     所使用的反应剂为 2- 氯乙基三甲基氯化铵 9.56g( 纤维素∶ 2- 氯乙基三甲基氯 化铵的摩尔比为 1.0 ∶ 50.0)， 除此以外， 采用与实施例 7 同样的方法得到季氨基化纤维素 微粒。所得的季氨基化纤维素微粒的平均粒径为 265nm， CV 值为 22％， 取代度为 0.178。另 外， 与实施例 7 ～ 9 同样， 在改变所使用的反应剂的量时， 确认出可根据反应剂的量来控制 取代度。
     [ 实施例 11]
     所使用的反应剂为 2- 氯乙醇 4.97g( 纤维素∶ 2- 氯乙醇的摩尔比为 1.0 ∶ 50.0)， 除此以外， 采用与实施例 7 同样的方法得到羟乙基化纤维素微粒。所得的羟乙基化纤维素 微粒的平均粒径为 263nm， CV 值为 24％， 取代度为 0.257。另外， 通过 NMR 求得取代度。另 外， 与实施例 7 ～ 9 同样地， 在改变所使用的反应剂的量时， 确认出可根据所使用的反应剂 的量来控制取代度。
     [ 实施例 12]
     使用实施例 1 中调制出的 261nm 的纤维素微粒分散液， 所加入的 11％苛性钠溶液 的量为 2.25g( 纤维素∶苛性钠的摩尔比为 1.0 ∶ 5.0)， 作为反应剂使用碘甲烷 17.5g( 纤 维素∶碘甲烷的摩尔比为 1.0 ∶ 100.0) 来代替氯乙酸钠， 除此以外， 采用与实施例 1 同样 的方法得到甲基化纤维素微粒分散液 100g。所得的甲基化纤维素的平均粒径为 264nm， CV 值为 20％， 取代度 0.972。并且通过 NMR 求得取代度。另外， 与实施例 7 ～ 9 同样， 在改变 所使用的反应剂的量时， 确认出可根据所使用的反应剂的量来控制取代度。
     [ 实施例 13]
     所使用的反应剂为溴乙烷 6.73g( 纤维素∶溴乙烷的摩尔比为 1.0 ∶ 50.0)， 除此 以外， 采用与实施例 12 同样的方法得到乙基化纤维素微粒分散液。所得的乙基化纤维素微 粒的平均粒径为 251nm， CV 值为 20％， 取代度为 0.745。并且， 通过 NMR 求得取代度。另外， 与实施例 7 ～ 9 同样， 在改变所使用的反应剂的量时， 确认出可根据所使用的反应剂的量来 控制取代度。由实施例 7 ～ 13 可确定， 通过改变所使用的反应剂能够改变取代基的种类。
     [ 实施例 14]
     将实施例 1 中调制出的平均粒径 261nm 的纤维素微粒分散液分散到纯水中， 使水 中的颗粒浓度调整为 10.0wt％， 调制出 100g 的纤维素微粒分散液 ( 纤维素成分为 10g)。 一边用磁力搅拌器搅拌分散液且在 80℃的环境下进行回流， 一边加入乙二醛系树脂加工剂 “ベッカミン LF-X” ( 大日本油墨化学工业公司制 )50g、 氯化镁系催化剂 “カタリスト M” (大 日本油墨化学工业公司制 )15g， 继续搅拌 30 分钟进行纤维素微粒的桥接。对所得的桥接 纤维素微粒分散液与实施例 1 同样地使用离心分离机重复 3 次通过倾析 - 去离子水进行的 稀释操作， 得到桥接纤维素微粒分散液。根据纤维素的重量变化计算出被桥接的取代基的 比例。将被桥接的羟基的比例用取代度来表示时为 0.32。采用与比较例 2 同样的方法对 所得的桥接纤维素微粒进行羧基化时， 通过以离心分离机进行的处理能够回收微粒， 且获 得了羧基化及桥接化纤维素衍生物微粒。 所得的羧基化及桥接化纤维素衍生物微粒的平均 粒径为 275nm， CV 值为 23％。另外， 由于所得的羧基化及桥接化纤维素衍生物微粒不能溶 解于 11％重苛性钠溶液中， 因此， 根据在用 0.1％苛性钠溶液进行中和滴定使溶液的 pH 为 7.0 时的 0.1％苛性钠溶液的使用量来计算羧基化取代度时， 羧基化取代度为 2.13。 根据比较例 2 和实施例的比较， 通过在羧基化的基础上引入桥接结构， 不仅具有 较高的羧基化取代度， 同时还成功地获得不溶于水的微粒。
     [ 实施例 15]
     与 实 施 例 7 同 样 地， 将 纤 维 素 的 颗 粒 浓 度 调 节 为 1.0wt ％、 苛性钠浓度调节 为 9.0wt ％， 作 为 反 应 剂 加 入 环 氧 氯 丙 烷 2.28g( 纤 维 素 ∶ 环 氧 氯 丙 烷 的 摩 尔 比 为 1.0 ∶ 20.0)。
     3 小时之内， 继续搅拌和回流， 进行纤维素的羟基的环氧活化。经过 3 小时后， 进 一步加入 23wt％氨水 9.14g( 纤维素∶氨的摩尔比为 1.0 ∶ 100.0)， 用氨使环氧基开裂进 行伯氨基化和桥接。反应结束后， 与实施例 7 同样地进行水洗， 得到氨基化纤维素微粒分散 液 100g。测定所得的氨基化纤维素微粒的平均粒径的结果为 270nm。并且其 CV 值为 20％。 另外， 通过凯氏法定量氨基化纤维素中所含的氮成分时， 该氮成分含量为 1.21％。另外， 与 实施例 7 ～ 9 同样， 在改变所使用的反应剂的量时， 确认出可根据所使用的反应剂的量来控 制氮成分。这样地确认出， 通过使用环氧氯丙烷能够同时进行桥接和氨基化。
     将以上的实施例 1 ～ 15 和比较例 1 ～ 3 中得到的纤维素衍生物微粒的取代基的 种类、 取代度、 平均粒径、 CV 值、 由电子显微镜图像观察到的微粒的形状归纳示于表 1 中。 另 外， 将实施例 1、 5、 6 的中间过程得到的进行衍生化前的纤维素微粒分别作为比较例 4 ～ 6， 其平均粒径、 CV 值、 微粒的形状一并示于表示 1 中。
     [ 表 1]
     在评价所得的纤维素衍生物微粒和纤维素微粒的分散稳定性时， 除比较例 3 以 外， 均未添加表面活性剂等而保持稳定的分散状态。由于比较例 3 的粒径大， 放置数小时后 发生了沉降。
     [ 实施例 16]
     < 缓冲液的制作 >
     制备了以下 3 种缓冲液。制备方法按现有公知的方法进行， MES 和 Tris 缓冲液的 pH 调节采用盐酸和苛性钠， 磷酸缓冲液通过调节磷酸氢二钠 12 水合物和磷酸二氢钾的量 来进行 pH 调节。并且， 水全部使用去离子水。
     (1)MES 缓冲液 ： pH ＝ 5.0， MES 浓度 50mM
     (2) 磷酸缓冲液 ： pH ＝ 7.2， 磷酸浓度 50mM
     (3)Tris 缓冲液 ： pH ＝ 8.0， Tris 浓度 10mM
     < 羧基化纤维素微粒的碳二亚胺活化 >
     将实施例 1 中得到的羧基化纤维素微粒分散液 2.5g 在 15,000rpm 的速度下离心 分离 30 分钟。通过倾析取出沉淀物， 加入 0.5g MES 缓冲液并进行搅拌， 使羧基化纤维素微 粒分散到 ME S 缓冲液中。
     使 1- 乙基 -3-(3- 二甲基氨丙基 ) 碳二亚胺盐酸盐 ( 以下叫作碳二亚胺 ) 溶解于 MES 缓冲液中， 将碳二亚胺浓度调节为 20wt％， 取其中的 0.5g 加入到羧基化纤维素微粒分 散液中。 使用恒温振荡槽在 25 度的环境下反应 1 小时调制出碳二亚胺活化纤维素微粒。 反 应结束后在 15,000rpm 的速度下离心分离 30 分钟。通过倾析取出沉淀物， 加入磷酸缓冲液 0.67g 并进行搅拌， 使碳二亚胺活化纤维素微粒分散到磷酸缓冲液中。
     < 抗 CRP 抗体与碳二亚胺活化纤维素微粒的结合 >
     进而在碳二亚胺活化纤维素微粒分散液中加入抗 CRP 抗体水溶液 75μl， 用恒温 振荡槽在 25℃的环境下反应 20 小时， 调制出抗 CRP 抗体结合纤维素微粒。反应结束后在 15,000rpm 的速度下离心分离 30 分钟。通过倾析取出沉淀物， 加入 Tris 缓冲液 2g。在 15,000rpm 的速度下离心分离 30 分钟， 进行 2 次通过倾析取出沉淀物的操作， 加入 Tris 缓 冲液使得最终颗粒浓度为 0.40wt％。通过超声波分散机 ( 株式会社エスエムテ一公司制， UH-50) 对所得的分散液进行处理， 调制出负载抗 CRP 抗体的纤维素微粒分散液。
     < 抗体与微粒的结合量的计算 >
     在上述之外， 将抗 CRP 抗体加入到磷酸缓冲液中制备数种浓度的溶液， 使用分光 光度计 ( 日本分光公司制造， V-630) 在 280nm 的固定波长下测定吸光度， 制作抗 CRP 抗体 的标准曲线。对与上述抗 CRP 抗体反应后倾析时的上清液同样地用分光光度计进行测定， 计量未负载于微粒的抗 CRP 抗体量， 由此进行逆运算来计算负载在微粒的抗 CRP 抗体量时， 平均 1mg 颗粒的抗 CRP 抗体负载量为 180μg。
     < 胶乳免疫测定 >
     使用所得的负载抗 CRP 抗体的纤维素微粒的分散液， 对其作为诊断药的性能进行 了评价。对抗原浓度已知的 5 种待测物加上仅与 Tris 缓冲液混合的待测物 ( 相当于抗原 浓度为 0mg/dl) 共计 6 种待测物进行了测定。其结果如图 2 所示。
     由图 2 可确定， 负载抗 CRP 抗体的纤维素微粒根据 CRP 抗原的量而凝集程度发生 变化， 可作为诊断药来利用。
     [ 实施例 17]
     负载抗 CRP 抗体后制成微粒浓度 5.0wt％的水分散体， 除此以外， 采用与实施例 16 同样的方法调制出负载抗 CRP 抗体的纤维素微粒分散液。将所得的分散液滴加到载玻片 ( 松浪硝子工业公司制造， MAS コ一トスラィドグラス ) 上， 在 25℃的环境下静置干燥 24 小 时。用电子显微镜对滴加的部分进行观察时， 可确认出负载 CRP 抗体的纤维素微粒被固定 在表面上。
     产业上的可利用性
     本发明的纤维素衍生物微粒， 由于其粒径小且亲水性高， 因此无需表面活性剂等 就能实现稳定分散。此外， 还能负载多种化合物。例如通过负载抗体能够作为诊断药来利 用。