一种基于接头连接的DNAPCRFREE标签文库构建方法.pdf

一种基于接头连接的 DNA PCR-Free 标签文库构建方法
    【技术领域】
     本发明涉及核酸测序技术领域， 特别是基于接头连接的 DNA PCR-Free 标签文库技 术领域。 另外， 本发明还涉及标签技术， 以及实现多个样品在同一反应体系中进行文库构建 的方法。本发明的方法特别适用于第二代测序技术， 尤其是 solexa 测序技术。背景技术
     Illumina 公司提供的 Solexa DNA 测序平台， 可在一个反应中同时加入四种带荧 光标记的核苷酸， 采用边合成边测序 (Sequencing By Synthesis， SBS)， 具有所需样品量 少， 高通量， 高精确性， 拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点 [1-4]。 文库构建首 先需要将目的片段进行末端修复， 在目的片段的 3’ 末端连接 “A” 碱基， 将 3’ 末端带有 “A” 碱基的目的片段与 DNA 接头 ( 也称为 adapter) 连接， 通过 PCR 反应将目的片段进行扩增， 最后回收含有 DNA 接头的目的片段文库， 见图 1。 含有 DNA 接头的目的片段文库与测序芯片 上面的 DNA 接头进行杂交， 通过桥式 PCR 进行扩增后， 最后边合成边测序。在每个循环过程 里， 荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。互补的核苷和核苷酸片断的第一个 碱基配对， 通过酶加入到引物上。多余的核苷被移走。这样每个单链 DNA 分子通过互补碱 基的配对被延伸， 针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记， 这个标记会 释放出荧光， 最后收集到的荧光信号来翻译成碱基序列。目前这种 DNA 建库方法可以根据 需求运用于各种研究领域， 如基因组的 De Novo 测序， 基因组重测序、 转录组测序和表观基 因组测序等。 基于上述建库方法 illumina 公司也推出了 DNA 标签 ( 也称为 index) 建库方法， 如图 2 所示。在 DNA 标签建库流程中， PCR 过程 使用了 3 条 PCR 标签引物， 通过 PCR 导入 标签来构建 DNA 标签文库 [5]。专利申请 WO2005068656A1 和 WO2008093098A2 中公开了一 种使用标签序列标记核酸样品的来源从而可以将样品进行混合测序的方法， 可以通过 PCR 的过程将特定的核苷酸序列 ( 即， 标签序列 ) 通过 PCR 导入到文库中， PCR 标签引物序列见 表 1。这些带有标签的文库可以根据需求进行任意混合， 然后通过 solexa 测序仪器进行测 序， 最后将数据按标签标签序列进行分类。
     但是 illumina 公司提供的标签文库制备的方法存在着一些缺陷 ： 第一、 目前 illumina 公司只提供 12 个长度为 6bp 的标签序列， 标签的数量较少， 随着 solexa 测序通 量的增加， 不能对大量样本进行混合测序将是一个巨大的缺陷 ； 第二、 目前 illumina 公司 提供的标签建库方法是通过 PCR 反应将标签序列导入到目的片段文库中， 需要 3 条 PCR 引 物对目的片段进行扩增 ( 两条公用引物和一条 PCR 标签引物， 如表 1)， 而且 PCR 扩增效率不 高。第三、 illumina 公司提供的标签建库方法中接头不包含标签序列， 每一个标签文库需 要通过一个 PCR 反应来导入标签序列， 然后针对每一个标签文库都需要切胶回收， 将切胶 回收后的标签目的片段文库随后进行混合， 这样不仅费时费力， 而且费用也较高。
     因此， 对标签的序列及标签引入方法进行优化和改进， 使标签引入的效率提高， 扩 大标签序列的数量， 才能满足高通量的建库的要求， 以适应测序通量不断提高的现状， 使测
     序仪器的产能充分利用， 降低测序的成本。
     表 1 illumina 公司提供的标签序列及相对应的 PCR 标签引物序列
     发明内容 鉴于目前 illumina 公司的 solexa 测序平台提供的 DNA 标签文库制备方法的不 足， 本发明改良了 DNA 标签文库的制备方法， 通过连接 DNA PCR-Free 标签接头来导入标签 序列， 不需要经过 PCR 反应便可成功的构建 DNA 标签文库， 并应用于 solexa DNA 测序。
     通过测试含标签序列的 DNA PCR-Free 标签接头的连接效率和标签核酸序列的识 别率， 优化并筛选出 161 条长度为 8bp 的 DNA 标签序列 ( 如表 2， 8bp 的 DNA 标签序列 ) 及 DNA PCR-Free 标签接头序列。
     这些长度为 8bp 的标签之间的差异在 4 个碱基， 即至少 4 个碱基序列不同。当标 签的 8 个碱基中的任意一个碱基出现测序错误或合成错误， 都不影响到标签的最终识别。
     基于目前 illumina 公司的 solexa 测序平台提供的 DNA 标签文库制备方法， 本发
     明改良了标签序列， 分别设计了长度为 8bp 独特的标签序列， 将标签嵌入 DNA 接头中， 可以 分别本发明设计的 161 个 DNAPCR-Free 标签接头用于构建标签文库的方法， 不仅能提高了 DNA 标 签文库的制备的效率， 增大了 DNA 样品的测序通量， 也能提高标签的识别率， 极大的 降低了单个样品的 solexa 测序费用。
     标签设计首先需要考虑标签序列之间的可识别性和识别率的问题， 然后需要考虑 标签序列混合之后的每个位点的 GT 与 AC 碱基含量的平衡问题， 最后考虑数据产出的可重 复性和准确性。 在设计标签的过程中， 本发明充分考虑到以上几个因素， 同时避免了标签的 核酸序列出现 3 或 3 个以上连续的碱基， 这样可以降低序列在合成过程中或测序过程中的 错误率。同时尽量避免标签引物接头自身形成发夹结构， 提高 DNA 标签接头的连接效率。
     本发明对 illumina 提供的 DNA 接头序列进行优化， 将标签设计为长度为 8bp 的特 定序列， 通过含有所述标签序列的 DNA PCR-Free 标签接头的连接将标签序列导入目的文库 中。这样将建库方法优化以后， 不需要通过 PCR 反应来构建 DNA 标签文库。目前为止， 通过 这些 DNA PCR-Free 标签接头导入标签的建库方法及标签序列， 并没有相关的报道。如图 3 所示为 illumina 公司的 DNA 标签建库流程图， 图 4 为优化后基于接头连接的 DNA PCR-Free 标签文库构建方法实验流程图。
     表 2 长度为 8bp 的 DNA 标签序列 (DNA Index-1) 及 PCR-Free 标签序列 (PCR-Free Index-N)， PCR-Free Index-N 与 DNA PCR-Free 接头 1.0 等摩尔退火后形成 PCR-Free 标签接 头。 退火条件为 ： DNA PCR-Free 接头 1.0 与 PCR-Free Index-N 等摩尔量混合后， 95℃ 10min ； 70℃ 10min ； 65℃ 10min ； 60℃ 10min ； 55℃ 10min ； 50℃ 10min ； 4℃∞。升温至 95℃后， 所有 降温速度控制为每秒 0.1℃缓慢降温， 让两条序列结合在一起形成 Y 型结构的 PCR-Free 标 签接头。
     使用 Lasergene 的 PrimerSelect 软件预测 DNA PCR-Free 标签接头形成的最稳定 “Y 型” DNA PCR-Free 标签接头 (the most stable dimer overrall) 及能量值。
     DNA PCR-Free index1 接头
     The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol
     5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCATTGCTTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′
     |||||||||||| : ::: :: : ::: :
     3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′
     DNA PCR-Free index2 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTCGGATTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index3 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTCATCATTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index4 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCTCCTGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index5 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAGCTCGGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index6 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCAACAGGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index7 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTCAAGGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index8 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCTAACGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index9 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCACGTAGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: :3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index10 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTAAGAGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index11 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTACCTTCTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index12 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAAGTCTCTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index13 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAGAGATCTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index14 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCAGCGCTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index15 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATGAACCTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index16 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACCAGACTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index17 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTATAACTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′|||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index18 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCGGAAGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index19 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTAGTTATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index20 接头 The most stable dimar overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTCTTATATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index21 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGAATCGATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index22 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAATAAGATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index23 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTATGCCATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index24 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATTCTAATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index25 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTAATGTTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index26 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTTACTTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index27 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATTCACTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index28 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCATATGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index29 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCTTAATGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index30 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGGATATGGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index31 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTTGATGGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index32 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAAGATCGGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index33 接头The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTAACCGGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index34 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTAAGTCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index35 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTATTCGCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index36 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGAAGCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index37 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTCCAGTAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index38 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTGTCTAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index39 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAGCGCTAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index40 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCTGTGAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′DNA PCR-Free index41 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCAACTAAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index42 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATAGGAAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index43 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACTACAAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free in dex44 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGATGGTTCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index45 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCACATTCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index46 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTCTTGGTCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index47 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGAGGATCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index48 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAGTCCATCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: ::: :3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index49 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCACTAATCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index50 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTAAGGCGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index51 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAATAGAGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index52 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACTGTTCCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index53 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTTCCTCCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index54 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCGACTCCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index55 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTACAGGCCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index56 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTTAAGCCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′|||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index57 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTAATTACCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index58 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATAACACCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index59 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGTAGGACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index60 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGTAGGACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index61 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTCTCGACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index62 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAGGTTAACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index63 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTTGCAACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index64 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTCAATTAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index65 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCAAGTCTAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index66 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACAACCTAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index67 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTACCATAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index68 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGACACATAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index69 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAGATAATAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index70 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGCGGTGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index71 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTACTATGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index72 接头The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTGTTGGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index73 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAGTGAGGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index74 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCGCCGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index75 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTTATAGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free ind ex76 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCATGAGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index77 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTCACCTCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index78 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACCTTGCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index79 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATACTCCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′DNA PCR-Free index80 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTTCGACAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index81 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCATCATAAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index82 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCACATGAAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index83 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATGAGGAAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index84 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTCCTCCAAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index85 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTAGACAAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index86 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTCCAGAAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index87 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCTATCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: :3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index88 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTACTGTTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index89 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACACGCGGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index90 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTATCCAGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index91 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTAGGAATAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index92 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGAACGTGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index93 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCGCACAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index94 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATTGCGTTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index95 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTCGTAAGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′|||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index96 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCGTCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index97 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCGAAGTAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index98 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGGACTGCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index99 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGAGCATTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index100 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTCGCCGTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index101 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCAGCGGCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index102 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAAGGATGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index103 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCAATGGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index104 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTATTCTCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index105 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTCATTACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index106 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCCAAGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index107 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGGTATACTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index108 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTGCGTGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index109 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTCCGACGGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index110 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCAGGCATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index111 接头The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCCAGCGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index112 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCACACTGGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index113 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGGCCTCGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index114 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGGCGCGCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index115 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGCCACCTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index116 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCATGCGGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index117 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGGCAACAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index118 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGGTATCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′DNA PCR-Free index119 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGGCCAATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index120 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAGCCGTCCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index121 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACAGAGTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index122 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACGCAGCCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index123 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGAGCTGACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index124 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGATGGCTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index125 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGAATCATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index126 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGACAGACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: :3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index127 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTGGTCGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index128 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCGTGGAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index129 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACTTCCGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index130 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACATGTACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index131 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCGGCTAAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index132 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGATCCTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index133 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGACGATATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index134 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCTGGCCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′|||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index135 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAAGACGTCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index136 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCTCTCTAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index137 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAGCGTGTCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index138 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCGTTGTTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index139 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTGCTACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index140 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGTAACCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index141 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kGal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGTGTTAAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index142 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGATAGCCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index143 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTAACACCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index144 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAGTAGTTAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index145 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTCTGCCTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index146 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGGAGTAGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index147 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGCGCAGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index148 接头 The most stable dimar overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGCCTATAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index149 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGCTAGTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index150 接头The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCGAGCTCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index151 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGGATTAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index152 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGGACGGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index153 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGACTGAGGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index154 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTGTGTTAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index155 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTCGTCCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index156 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGGAGAGGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index157 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGGAATTCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′DNA PCR-Free index158 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTGGCGCCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index159 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCCTTAATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index160 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAAGCGATTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index161 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAACCGCAAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′附图说明 图1： ilumina 公司提供的常规 DNA 建库流程示意图。
     图2： illumina 公司提供的常规 DNA 标签建库流程示意图。
     图3： illumina 公司的 DNA 标签建库流程图。
     图4： 本发明提供的基于接头连接的 DNA PCR-Free 标签文库构建方法。
     图5： 实施例 1 所构建的文库电泳检测结果。泳道 1 ： D2000， 泳道 2-24 ： PCR-Free index 接头与 DNA 的连接产物 ； 泳道 25 ： 50bp ladder。所用的 D2000 和 50bp 的 marke 分别 产自天根公司和 NEB 公司。
     具体实施方式
     下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述， 但是本领域技术人员将会 理解， 下列实施例仅用于说明本发明， 而不应视为限定本发明的范围。
     本发明一方面提供了一组 DNA 标签， 所述 DNA 标签包括如下或由如下组成 ： 表2所 示的 161 个 DNA 标签或与之相差 1 个碱基的 DNA 标签中的至少 10 个， 或至少 20 个， 或至少 30 个， 或至少 40 个， 至少 50 个， 或至少 60 个， 或至少 70 个， 或至少 80 个， 或 90 个， 或至少 100 个， 或至少 110 个， 或至少 120 个， 或至少 130 个， 或至少 140 个， 或至少 150 个， 或全部 161 个，
     所 述 DNA 标 签 优 选 地 至 少 包 括 表 2 所 示 的 161 个 DNA 标 签 的 DNA Index1 ～DNA Index10， 或 DNA Index11 ～ DNA Index20， 或 DNA Index21 ～ DNA Index30， 或 DNA Index31 ～ DNA Index40， 或 DNA Index41 ～ DNA Index50， 或 DNA Index51 ～ DNA Index60， 或 DNA Index61 ～ DNA Index70， 或 DNA Index71 ～ DNA Index80， 或 DNA Index81 ～ DNA Index90， 或 DNA Index91 ～ DNA Index100， 或 DNA Index101 ～ DNA Index110， 或 DNA Index111 ～ DNA Index120， 或 DNA Index121 ～ DNA Index130， 或 DNA Index131 ～ DNA Index140， 或 DNA Index141 ～ DNA Index150， 或 DNA Index151 ～ DNA Index161， 或者他们 任何两个或多个的组合。
     在本发明的一个具体实施方式中， 所述 DNA 标签中所述的相差 1 个碱基包括标签 中 1 个碱基的取代、 添加或删除。
     在本发明的一个具体实施方式中， 提供了上文所述的 DNA 标签用于构建 DNA 标 签文库， 优选的 DNA PCR-Free 标签文库的用途， 其中 DNA 标签文库的 DNA 标签接头包含 所述 DNA 标签， 从而构成各自相对应的 DNA 标签接头， 所述 DNA 标签接头优选地用作 DNA PCR-Free 标签文库的 DNA PCR-Free 接头。
     在本发明的一个具体实施方式中， 在本发明所提供的用途中， 所述 DNA 标签插入 DNA PCR-Free 标签接头中， 或通过或不通过连接子连接在 DNA 接头的 3’ 末端， 优选地插入 DNA PCR-Free 标签接头中。所述连接子是 1-6 个核苷酸序列， 优选地 1-3 个核苷酸序列。
     在本发明的一个具体实施方式中， 提供了通过上文所述的 DNA 标签构建的 DNA 标 签文库， 优选的 DNA PCR-Free 标签文库。
     本发明另一方面含有上文所述的 DNA 标签的一组 DNA PCR-Free 标签接头， 其中 所述 DNA PCR-Free 标签接头优选地用作 DNA PCR-Free 标签文库的接头， 所述一组 DNA PCR-Free 标签接头由 DNA PCR-Free 接头 1.0 和 PCR-Free 标签序列组成， 所述 PCR-Free 标 签序列包括如下或由如下组成 ： 表 2 所示 161 个 PCR-Free 标签序列或与其所包含的 DNA 标 签序列相差 1 个碱基的 PCR-Free 标签序列中的至少 10 个， 或至少 20 个， 或至少 30 个， 或 至少 40 个， 至少 50 个， 或至少 60 个， 或至少 70 个， 或至少 80 个， 或 90 个， 或至少 100 个， 或至少 110 个， 或至少 120 个， 或至少 130 个， 或至少 140 个， 或至少 150 个， 或全部 161 个，
     所述 PCR-Free 标签序列优选地至少包括表 2 所示的 161 个 PCR-Free 标签序 列 中 的 PCR-Free Index-1 ～ PCR-Free Index-10， 或 PCR-Free Index-11 ～ PCR-Free Index-20， 或 PCR-Free Index-21 ～ PCR-Free Index-30， 或 PCR-Free Index-31 ～ PCR-Free Index-40， 或 PCR-Free Index-41 ～ PCR-Free Index-50， 或 PCR-Free Index-51 ～ PCR-Free Index-60， 或 PCR-Free Index-61 ～ PCR-Free Index-70， 或 PCR-Free Index-71 ～ PCR-Free Index-80， 或 PCR-Free Index-81 ～ PCR-Free Index-90， 或 PCR-Free Index-91 ～ PCR-Free Index-100， 或 PCR-Free Index-101 ～ PCR-Free Index-110， 或 PCR-Free Index-111 ～ PCR-Free Index-120， 或 PCR-Free Index-121 ～ PCR-Free Index-130，或 PCR-Free Index-131 ～ PCR-Free Index-140，或 PCR-Free Index-141 ～ PCR-Free Index-150， 或 PCR-Free Index-151 ～ PCR-Free Index-161， 或者 他们任何两个或多个的组合。
     在本发明的一个具体实施方式中， 上文所述 DNA PCR-Free 标签接头中所述的相差 1 个碱基包括标签中 1 个碱基的取代、 添加或删除。
     在本发明的一个具体实施方式中， 提供了所述 DNA PCR-Free 标签接头用于构建DNA 标签文库， 优选的 DNA PCR-Free 标签文库的用途。
     在本发明的一个具体实施方式中， 提供了通过上文所述的 DNAPCR-Free 标签接头 构建的 DNA 标签文库， 优选的 DNA PCR-Free 标签文库。
     本发明另一方面进一步提供了一种 DNA 标签文库的构建方法， 所述方法的特征在 于使用包含标签的 DNA PCR-Free 接头来构建 DNA 标签文库， 优选的 DNA PCR-Free 标签文 库， 其中所述方法不包括 PCR 步骤。
     在本发明另一方面进一步提供的 DNA 标签文库， 优选的 DNAPCR-Free 标签文库的 构建方法中， 包括 ：
     1)DNA 模板准备， 提供 n 个 DNA 样品， n 为整数且 1 ≤ n ≤ 161 的整数， 优选地 n 为 整数且 2 ≤ n ≤ 161， 所述 DNA 样品来自所有真核和原核 DNA 样品， 包括但不限于人 DNA 样 品； 优选地所述 DNA 模板长度为 250bp ；
     2) 末端修复 ；
     3)DNA 片段 3’ 末端加 “A” 碱基 ；
     5) 连接 DNA 标签接头， 其中对 DNA 片段使用不同的标签接头， 每一个标签接头连接 到 DNA 片段的两端。
     在本发明的一个具体实施方式中， 在上文所述方法中， 所述 DNA 标签接头是本发 明所述的 DNA PCR-Free 标签接头。
     在本发明的一个具体实施方式中， 提供了通过本发明所述的方法构建的 DNA 标签 文库， 优选的 DNA PCR-Free 标签文库。
     Paired End DNA 寡核苷酸序列 ：
     DNA PCR-Free 接头 1.0 ：
     AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
     DNA PCR-Free index 接头 ： ( 如表 2 所示 )
     主要实验仪器及试剂
     实施例 1 ： DNA 标签实验建库方法具体
     1.1DNA 模板准备
     以质粒 pMD18-T( 日本 takara) 为模板， 使用 Primer Premier5.0 软件设计引物， PCR 扩增产物长度为 250bp 的片段， 使用 NanoDrop 1000 仪器 ( 美国 NanoDrop) 检测扩增 产物的浓度， 然后根据浓度取 1ug 的该 PCR 产物作为文库构建的插入片段， 补水使其体积至 35μL。PCR 引物序列 ：
     pMD18-T 引物 1 ： CGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGG ；
     pMD18-T 引物 2 ： TTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCG。
     1.2 末端修复 [6]
     按照下列的配比准备反应混合 ：
     pMD18-T 质粒 DNA 模板 35μL
     T4 DNA 连接酶缓冲液 50μL
     dNTPs 混合液 4μL
     T4 DNA 聚合酶 5μL
     Klenow DNA 聚合酶 1μL
     T4 多聚核苷酸激酶 5μL
     总体积 100μL
     将舒适型恒温混匀器调至 20℃， 反应 30min， 然后用 QIAquick PCR 纯化试剂盒进 行纯化， 最后将样品溶于 32μL EB solution。
     1.3DNA 片段 3′末端加 “A” 碱基
     按照下列的配比准备反应混合物 ：
     末端修复后的 DNA 32μL
     Klenow 酶缓冲液 5μL
     dATP(1mM) 10μL
     Klenow 酶 (3′到 5′外切酶活性 ) 3μL
     总体积 50μL
     将舒适型恒温混匀器调至 37℃， 反应 30min， 然后用 MiniElute PCR 纯化试剂盒进 行纯化， 最后将样品溶于 10μL EB solution。
     1.4 连接 PCR-Free 标签接头
     按照下列的配比准备反应混合物 ：
     DNA 10μL
     T4 DNA 连接酶缓冲液 25μL
     DNA PCR-Free 标签接头 10μL
     T4 DNA 连接酶 5μL
     总体积 50μL
     注： 对于每一个 DNA 样品， 所使用的 PCR-Free 标签接头可为表 2 中所示 PCR-Free 标签序列 (PCR-Free Index-N) 中的任意一种与 DNA PCR-Free 接头 1.0 退火后的 PCR-Free 标签接头。
     将舒适型恒温混匀器调至 20℃， 反应 15min， 然后用 QIAquick PCR 纯化试剂盒进 行纯化， 最后将样品溶于 30μL EB solution。 1.5PCR-Free index 文库的胶回收纯化
     将连接产物于 2 ％的琼脂糖胶中进行电泳分离 ； 随后将目的片段条带切胶转移 至 Eppendorf 管中。用 QIAquick 胶纯化试剂盒进行胶纯化回收， 回收产物溶于 20μL EB solution。
     1.6PCR-Free index 文库检测
     1) 使用 Agilent 2100 Bioanalyzer 检测文库产量。
     2) 使用 QPCR 定量检测文库产量。
     构建的 44 个 DNA PCR-Free 标签文库， 使用 1％琼脂糖凝胶电泳结果如图 5a 和图 5b 所示， 图 5a 中分别使用了 D2000 和 50bp 的 marker ； 箭头所标记的为目的文库， 其中泳 道 1 和泳道 25 分别是 D2000 和 50bp 的 marker， 泳道 2-24 分别是 DNA PCR-Free 标签 1 文 库、 DNA PCR-Free 标签 2 文库、 DNA PCR-Free 标签 3 文库、 DNA PCR-Free 标签 4 文库、 DNA PCR-Free 标签 5 文库、 DNA PCR-Free 标签 6 文库、 DNA PCR-Free 标签 7 文库、 DNA PCR-Free 标签 8 文库、 DNA PCR-Free 标签 9 文库、 DNA PCR-Free 标签 10 文库、 DNA PCR-Free 标签 11 文库、 DNA PCR-Free 标签 12 文库、 DNA PCR-Free 标签 13 文库、 DNA PCR-Free 标签 14 文 DNA PCR-Free 标签 16 文库、 DNA PCR-Free 标签 17 文库、 库、 DNA PCR-Free 标签 15 文库、 DNA PCR-Free 标签 18 文库、 DNA PCR-Free 标签 19 文库、 DNA PCR-Free 标签 20 文库、 DNA PCR-Free 标签 21 文库、 DNA PCR-Free 标签 22 文库、 DNA PCR-Free 标签 23 文库。图 5b 中 分别使用了 D2000 和 50bp 的 marker ； 箭头所标记的为目的文库， 其中泳道 1 和泳道 25 分别 是 D2000 和 50bp 的 marker， 泳道 3-23 分别是 DNA PCR-Free 标签 101 文库、 DNA PCR-Free 标签 102 文库、 DNAPCR-Free 标签 103 文库、 DNA PCR-Free 标签 104 文库、 DNA PCR-Free 标 签 105 文库、 DNA PCR-Free 标签 106 文库、 DNA PCR-Free 标签 107 文库、 DNA PCR-Free 标 签 108 文库、 DNA PCR-Free 标签 109 文库、 DNA PCR-Free 标签 110 文库、 DNA PCR-Free 标
     签 111 文库、 DNA PCR-Free 标签 112 文库、 DNA PCR-Free 标签 113 文库、 DNA PCR-Free 标 签 114 文库、 DNA PCR-Free 标签 115 文库、 DNA PCR-Free 标签 116 文库、 DNA PCR-Free 标签 117 文库、 DNA PCR-Free 标签 118 文库、 DNA PCR-Free 标签 119 文库、 DNA PCR-Free 标 签 120 文库、 DNA PCR-Free 标签 121 文库。由于目的片段 (PCR 产物 ) 长度为 250bp， 接头 长度为 65bp 且为 “Y 型” 结构， 理论上目的片段两端连接上 DNA PCR-Free 标签接头后的会 增加 130bp 左右的分子量， 但是由于 DNA PCR-Free 标签接头为特殊的 “Y 型” 结构， 其在 琼脂糖中电泳的速度会比相同分子量的双链 DNA 电泳迁移率稍小， 电泳条带显示的位置为 500bp。 D2100 marker 从上往下的条带分别是 ： 2000bp、 1000bp、 750bp、 500bp、 250bp、 100bp ； 目的条带下方有部分条带， 为目的片段的一端连接上接头的产物， 其产物量不多， 不影响文 库构建的结果。结果表明， 接头全部成功连接到 pcr 产物上。
     Solexa 测序结果统计 ： 共测序 33932756 条读取结果 ( 也称为·reads)， 标签完全 识别即 0 mismatch 占 96.73％， 其他读取结果 (other reads) 占 3.27％， 所以测序结果标 签的完全识别的序列为～ 96.7％， 可以满足 solexa DNA 标签的测序要求。
     尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述， 本领域技术人员将会理解。根 据已经公开的所有教导， 可以对那些细节进行各种修改和替换， 这些改变均在本发明的保 护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
     参考文献
     1、 Paired-End sequencing User Guide ； illumina part#1003880
     2、 Preparing samples for ChIP sequencing for DNA ； illumina part#11257047 Rev.A ；
     3、 mRNA sequencing sample preparation Guide ； illumina part#1004898 Rev.D
     4、 Preparing 2-5kb samples for mate pair library sequencing ； illumina part#1005363 Rev.B ；
     本发明涉及核酸测序技术领域， 特别是基于接头连接的 DNA PCR-Free 标签文库技 术领域。 另外， 本发明还涉及标签技术， 以及实现多个样品在同一反应体系中进行文库构建 的方法。本发明的方法特别适用于第二代测序技术， 尤其是 solexa 测序技术。背景技术
     Illumina 公司提供的 Solexa DNA 测序平台， 可在一个反应中同时加入四种带荧 光标记的核苷酸， 采用边合成边测序 (Sequencing By Synthesis， SBS)， 具有所需样品量 少， 高通量， 高精确性， 拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点 [1-4]。 文库构建首 先需要将目的片段进行末端修复， 在目的片段的 3’ 末端连接 “A” 碱基， 将 3’ 末端带有 “A” 碱基的目的片段与 DNA 接头 ( 也称为 adapter) 连接， 通过 PCR 反应将目的片段进行扩增， 最后回收含有 DNA 接头的目的片段文库， 见图 1。 含有 DNA 接头的目的片段文库与测序芯片 上面的 DNA 接头进行杂交， 通过桥式 PCR 进行扩增后， 最后边合成边测序。在每个循环过程 里， 荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。互补的核苷和核苷酸片断的第一个 碱基配对， 通过酶加入到引物上。多余的核苷被移走。这样每个单链 DNA 分子通过互补碱 基的配对被延伸， 针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记， 这个标记会 释放出荧光， 最后收集到的荧光信号来翻译成碱基序列。目前这种 DNA 建库方法可以根据 需求运用于各种研究领域， 如基因组的 De Novo 测序， 基因组重测序、 转录组测序和表观基 因组测序等。 基于上述建库方法 illumina 公司也推出了 DNA 标签 ( 也称为 index) 建库方法， 如图 2 所示。在 DNA 标签建库流程中， PCR 过程 使用了 3 条 PCR 标签引物， 通过 PCR 导入 标签来构建 DNA 标签文库 [5]。专利申请 WO2005068656A1 和 WO2008093098A2 中公开了一 种使用标签序列标记核酸样品的来源从而可以将样品进行混合测序的方法， 可以通过 PCR 的过程将特定的核苷酸序列 ( 即， 标签序列 ) 通过 PCR 导入到文库中， PCR 标签引物序列见 表 1。这些带有标签的文库可以根据需求进行任意混合， 然后通过 solexa 测序仪器进行测 序， 最后将数据按标签标签序列进行分类。
     但是 illumina 公司提供的标签文库制备的方法存在着一些缺陷 ： 第一、 目前 illumina 公司只提供 12 个长度为 6bp 的标签序列， 标签的数量较少， 随着 solexa 测序通 量的增加， 不能对大量样本进行混合测序将是一个巨大的缺陷 ； 第二、 目前 illumina 公司 提供的标签建库方法是通过 PCR 反应将标签序列导入到目的片段文库中， 需要 3 条 PCR 引 物对目的片段进行扩增 ( 两条公用引物和一条 PCR 标签引物， 如表 1)， 而且 PCR 扩增效率不 高。第三、 illumina 公司提供的标签建库方法中接头不包含标签序列， 每一个标签文库需 要通过一个 PCR 反应来导入标签序列， 然后针对每一个标签文库都需要切胶回收， 将切胶 回收后的标签目的片段文库随后进行混合， 这样不仅费时费力， 而且费用也较高。
     因此， 对标签的序列及标签引入方法进行优化和改进， 使标签引入的效率提高， 扩 大标签序列的数量， 才能满足高通量的建库的要求， 以适应测序通量不断提高的现状， 使测
     但是 illumina 公司提供的标签文库制备的方法存在着一些缺陷 ： 第一、 目前 illumina 公司只提供 12 个长度为 6bp 的标签序列， 标签的数量较少， 随着 solexa 测序通 量的增加， 不能对大量样本进行混合测序将是一个巨大的缺陷 ； 第二、 目前 illumina 公司 提供的标签建库方法是通过 PCR 反应将标签序列导入到目的片段文库中， 需要 3 条 PCR 引 物对目的片段进行扩增 ( 两条公用引物和一条 PCR 标签引物， 如表 1)， 而且 PCR 扩增效率不 高。第三、 illumina 公司提供的标签建库方法中接头不包含标签序列， 每一个标签文库需 要通过一个 PCR 反应来导入标签序列， 然后针对每一个标签文库都需要切胶回收， 将切胶 回收后的标签目的片段文库随后进行混合， 这样不仅费时费力， 而且费用也较高。
     因此， 对标签的序列及标签引入方法进行优化和改进， 使标签引入的效率提高， 扩 大标签序列的数量， 才能满足高通量的建库的要求， 以适应测序通量不断提高的现状， 使测
     序仪器的产能充分利用， 降低测序的成本。
     表 1 illumina 公司提供的标签序列及相对应的 PCR 标签引物序列
     发明内容 鉴于目前 illumina 公司的 solexa 测序平台提供的 DNA 标签文库制备方法的不 足， 本发明改良了 DNA 标签文库的制备方法， 通过连接 DNA PCR-Free 标签接头来导入标签 序列， 不需要经过 PCR 反应便可成功的构建 DNA 标签文库， 并应用于 solexa DNA 测序。
     通过测试含标签序列的 DNA PCR-Free 标签接头的连接效率和标签核酸序列的识 别率， 优化并筛选出 161 条长度为 8bp 的 DNA 标签序列 ( 如表 2， 8bp 的 DNA 标签序列 ) 及 DNA PCR-Free 标签接头序列。
     这些长度为 8bp 的标签之间的差异在 4 个碱基， 即至少 4 个碱基序列不同。当标 签的 8 个碱基中的任意一个碱基出现测序错误或合成错误， 都不影响到标签的最终识别。
     基于目前 illumina 公司的 solexa 测序平台提供的 DNA 标签文库制备方法， 本发
     通过测试含标签序列的 DNA PCR-Free 标签接头的连接效率和标签核酸序列的识 别率， 优化并筛选出 161 条长度为 8bp 的 DNA 标签序列 ( 如表 2， 8bp 的 DNA 标签序列 ) 及 DNA PCR-Free 标签接头序列。
     这些长度为 8bp 的标签之间的差异在 4 个碱基， 即至少 4 个碱基序列不同。当标 签的 8 个碱基中的任意一个碱基出现测序错误或合成错误， 都不影响到标签的最终识别。
     基于目前 illumina 公司的 solexa 测序平台提供的 DNA 标签文库制备方法， 本发
     明改良了标签序列， 分别设计了长度为 8bp 独特的标签序列， 将标签嵌入 DNA 接头中， 可以 分别本发明设计的 161 个 DNAPCR-Free 标签接头用于构建标签文库的方法， 不仅能提高了 DNA 标 签文库的制备的效率， 增大了 DNA 样品的测序通量， 也能提高标签的识别率， 极大的 降低了单个样品的 solexa 测序费用。
     标签设计首先需要考虑标签序列之间的可识别性和识别率的问题， 然后需要考虑 标签序列混合之后的每个位点的 GT 与 AC 碱基含量的平衡问题， 最后考虑数据产出的可重 复性和准确性。 在设计标签的过程中， 本发明充分考虑到以上几个因素， 同时避免了标签的 核酸序列出现 3 或 3 个以上连续的碱基， 这样可以降低序列在合成过程中或测序过程中的 错误率。同时尽量避免标签引物接头自身形成发夹结构， 提高 DNA 标签接头的连接效率。
     本发明对 illumina 提供的 DNA 接头序列进行优化， 将标签设计为长度为 8bp 的特 定序列， 通过含有所述标签序列的 DNA PCR-Free 标签接头的连接将标签序列导入目的文库 中。这样将建库方法优化以后， 不需要通过 PCR 反应来构建 DNA 标签文库。目前为止， 通过 这些 DNA PCR-Free 标签接头导入标签的建库方法及标签序列， 并没有相关的报道。如图 3 所示为 illumina 公司的 DNA 标签建库流程图， 图 4 为优化后基于接头连接的 DNA PCR-Free 标签文库构建方法实验流程图。
     表 2 长度为 8bp 的 DNA 标签序列 (DNA Index-1) 及 PCR-Free 标签序列 (PCR-Free Index-N)， PCR-Free Index-N 与 DNA PCR-Free 接头 1.0 等摩尔退火后形成 PCR-Free 标签接 头。 退火条件为 ： DNA PCR-Free 接头 1.0 与 PCR-Free Index-N 等摩尔量混合后， 95℃ 10min ； 70℃ 10min ； 65℃ 10min ； 60℃ 10min ； 55℃ 10min ； 50℃ 10min ； 4℃∞。升温至 95℃后， 所有 降温速度控制为每秒 0.1℃缓慢降温， 让两条序列结合在一起形成 Y 型结构的 PCR-Free 标 签接头。
     使用 Lasergene 的 PrimerSelect 软件预测 DNA PCR-Free 标签接头形成的最稳定 “Y 型” DNA PCR-Free 标签接头 (the most stable dimer overrall) 及能量值。
     DNA PCR-Free index1 接头
     The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol
     5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCATTGCTTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′
     |||||||||||| : ::: :: : ::: :
     3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′
     DNA PCR-Free index1 接头
     The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol
     5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCATTGCTTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′
     |||||||||||| : ::: :: : ::: :
     3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′
     DNA PCR-Free index2 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTCGGATTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index3 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTCATCATTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index4 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCTCCTGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index5 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAGCTCGGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index6 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCAACAGGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index7 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTCAAGGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index8 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCTAACGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index9 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCACGTAGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: :3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index10 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTAAGAGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index11 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTACCTTCTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index12 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAAGTCTCTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index13 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAGAGATCTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index14 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCAGCGCTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index15 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATGAACCTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index16 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACCAGACTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index17 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTATAACTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′|||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index18 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCGGAAGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index19 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTAGTTATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index20 接头 The most stable dimar overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTCTTATATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index21 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGAATCGATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index22 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAATAAGATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index23 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTATGCCATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index24 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATTCTAATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index25 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTAATGTTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index26 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTTACTTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index27 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATTCACTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index28 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCATATGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index29 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCTTAATGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index30 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGGATATGGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index31 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTTGATGGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index32 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAAGATCGGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index33 接头The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTAACCGGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index34 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTAAGTCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index35 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTATTCGCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index36 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGAAGCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index37 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTCCAGTAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index38 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTGTCTAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index39 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAGCGCTAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index40 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCTGTGAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′DNA PCR-Free index41 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCAACTAAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index42 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATAGGAAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index43 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACTACAAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free in dex44 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGATGGTTCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index45 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCACATTCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index46 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTCTTGGTCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index47 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGAGGATCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index48 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAGTCCATCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: ::: :3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index49 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCACTAATCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index50 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTAAGGCGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index51 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAATAGAGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index52 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACTGTTCCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index53 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTTCCTCCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index54 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCGACTCCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index55 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTACAGGCCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index56 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTTAAGCCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′|||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index57 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTAATTACCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index58 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATAACACCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index59 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGTAGGACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index60 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGTAGGACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index61 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTCTCGACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index62 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAGGTTAACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index63 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTTGCAACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index64 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTCAATTAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index65 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCAAGTCTAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index66 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACAACCTAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index67 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTACCATAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index68 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGACACATAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index69 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAGATAATAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index70 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGCGGTGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index71 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTACTATGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index72 接头The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTGTTGGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index73 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAGTGAGGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index74 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCGCCGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index75 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTTATAGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free ind ex76 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCATGAGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index77 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTCACCTCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index78 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACCTTGCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index79 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATACTCCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′DNA PCR-Free index80 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTTCGACAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index81 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCATCATAAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index82 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCACATGAAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index83 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATGAGGAAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index84 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTCCTCCAAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index85 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTAGACAAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index86 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTCCAGAAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index87 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCTATCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: :3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index88 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTACTGTTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index89 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACACGCGGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index90 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTATCCAGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index91 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTAGGAATAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index92 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGAACGTGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index93 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCGCACAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index94 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATTGCGTTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index95 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTCGTAAGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′|||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index96 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCGTCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index97 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCGAAGTAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index98 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGGACTGCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index99 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGAGCATTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index100 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTCGCCGTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index101 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCAGCGGCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index102 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAAGGATGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index103 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCAATGGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index104 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTATTCTCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index105 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTCATTACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index106 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCCAAGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index107 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGGTATACTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index108 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTGCGTGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index109 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTCCGACGGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index110 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCAGGCATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index111 接头The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCCAGCGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index112 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCACACTGGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index113 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGGCCTCGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index114 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGGCGCGCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index115 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGCCACCTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index116 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCATGCGGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index117 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGGCAACAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index118 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGGTATCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′DNA PCR-Free index119 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGGCCAATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index120 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAGCCGTCCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index121 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACAGAGTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index122 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACGCAGCCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index123 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGAGCTGACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index124 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGATGGCTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index125 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGAATCATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index126 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGACAGACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: :3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index127 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTGGTCGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index128 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCGTGGAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index129 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACTTCCGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index130 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACATGTACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index131 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCGGCTAAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index132 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGATCCTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index133 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGACGATATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index134 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCTGGCCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′|||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index135 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAAGACGTCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index136 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCTCTCTAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : :::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index137 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAGCGTGTCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index138 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCGTTGTTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index139 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTGCTACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index140 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGTAACCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index141 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kGal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGTGTTAAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index142 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGATAGCCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index143 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTAACACCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index144 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAGTAGTTAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index145 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTCTGCCTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index146 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGGAGTAGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index147 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGCGCAGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index148 接头 The most stable dimar overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGCCTATAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index149 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGCTAGTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index150 接头The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCGAGCTCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index151 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGGATTAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index152 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGGACGGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index153 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGACTGAGGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index154 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTGTGTTAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index155 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTCGTCCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index156 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGGAGAGGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: :: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index157 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGGAATTCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′DNA PCR-Free index158 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTGGCGCCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index159 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCCTTAATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index160 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAAGCGATTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′ DNA PCR-Free index161 接头 The most stable dimer overall ： 12bp， -22.8kcal/mol 5′ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAACCGCAAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′ |||||||||||| : ::: : : : ::: : 3′ TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA 5′附图说明 图1： ilumina 公司提供的常规 DNA 建库流程示意图。
     图2： illumina 公司提供的常规 DNA 标签建库流程示意图。
     图3： illumina 公司的 DNA 标签建库流程图。
     图4： 本发明提供的基于接头连接的 DNA PCR-Free 标签文库构建方法。
     图5： 实施例 1 所构建的文库电泳检测结果。泳道 1 ： D2000， 泳道 2-24 ： PCR-Free index 接头与 DNA 的连接产物 ； 泳道 25 ： 50bp ladder。所用的 D2000 和 50bp 的 marke 分别 产自天根公司和 NEB 公司。
    具体实施方式
     下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述， 但是本领域技术人员将会 理解， 下列实施例仅用于说明本发明， 而不应视为限定本发明的范围。
     本发明一方面提供了一组 DNA 标签， 所述 DNA 标签包括如下或由如下组成 ： 表2所 示的 161 个 DNA 标签或与之相差 1 个碱基的 DNA 标签中的至少 10 个， 或至少 20 个， 或至少 30 个， 或至少 40 个， 至少 50 个， 或至少 60 个， 或至少 70 个， 或至少 80 个， 或 90 个， 或至少 100 个， 或至少 110 个， 或至少 120 个， 或至少 130 个， 或至少 140 个， 或至少 150 个， 或全部 161 个，
    所 述 DNA 标 签 优 选 地 至 少 包 括 表 2 所 示 的 161 个 DNA 标 签 的 DNA Index1 ～DNA Index10， 或 DNA Index11 ～ DNA Index20， 或 DNA Index21 ～ DNA Index30， 或 DNA Index31 ～ DNA Index40， 或 DNA Index41 ～ DNA Index50， 或 DNA Index51 ～ DNA Index60， 或 DNA Index61 ～ DNA Index70， 或 DNA Index71 ～ DNA Index80， 或 DNA Index81 ～ DNA Index90， 或 DNA Index91 ～ DNA Index100， 或 DNA Index101 ～ DNA Index110， 或 DNA Index111 ～ DNA Index120， 或 DNA Index121 ～ DNA Index130， 或 DNA Index131 ～ DNA Index140， 或 DNA Index141 ～ DNA Index150， 或 DNA Index151 ～ DNA Index161， 或者他们 任何两个或多个的组合。
     在本发明的一个具体实施方式中， 所述 DNA 标签中所述的相差 1 个碱基包括标签 中 1 个碱基的取代、 添加或删除。
     在本发明的一个具体实施方式中， 提供了上文所述的 DNA 标签用于构建 DNA 标 签文库， 优选的 DNA PCR-Free 标签文库的用途， 其中 DNA 标签文库的 DNA 标签接头包含 所述 DNA 标签， 从而构成各自相对应的 DNA 标签接头， 所述 DNA 标签接头优选地用作 DNA PCR-Free 标签文库的 DNA PCR-Free 接头。
     在本发明的一个具体实施方式中， 在本发明所提供的用途中， 所述 DNA 标签插入 DNA PCR-Free 标签接头中， 或通过或不通过连接子连接在 DNA 接头的 3’ 末端， 优选地插入 DNA PCR-Free 标签接头中。所述连接子是 1-6 个核苷酸序列， 优选地 1-3 个核苷酸序列。
     在本发明的一个具体实施方式中， 提供了通过上文所述的 DNA 标签构建的 DNA 标 签文库， 优选的 DNA PCR-Free 标签文库。
     本发明另一方面含有上文所述的 DNA 标签的一组 DNA PCR-Free 标签接头， 其中 所述 DNA PCR-Free 标签接头优选地用作 DNA PCR-Free 标签文库的接头， 所述一组 DNA PCR-Free 标签接头由 DNA PCR-Free 接头 1.0 和 PCR-Free 标签序列组成， 所述 PCR-Free 标 签序列包括如下或由如下组成 ： 表 2 所示 161 个 PCR-Free 标签序列或与其所包含的 DNA 标 签序列相差 1 个碱基的 PCR-Free 标签序列中的至少 10 个， 或至少 20 个， 或至少 30 个， 或 至少 40 个， 至少 50 个， 或至少 60 个， 或至少 70 个， 或至少 80 个， 或 90 个， 或至少 100 个， 或至少 110 个， 或至少 120 个， 或至少 130 个， 或至少 140 个， 或至少 150 个， 或全部 161 个，
     所述 PCR-Free 标签序列优选地至少包括表 2 所示的 161 个 PCR-Free 标签序 列 中 的 PCR-Free Index-1 ～ PCR-Free Index-10， 或 PCR-Free Index-11 ～ PCR-Free Index-20， 或 PCR-Free Index-21 ～ PCR-Free Index-30， 或 PCR-Free Index-31 ～ PCR-Free Index-40， 或 PCR-Free Index-41 ～ PCR-Free Index-50， 或 PCR-Free Index-51 ～ PCR-Free Index-60， 或 PCR-Free Index-61 ～ PCR-Free Index-70， 或 PCR-Free Index-71 ～ PCR-Free Index-80， 或 PCR-Free Index-81 ～ PCR-Free Index-90， 或 PCR-Free Index-91 ～ PCR-Free Index-100， 或 PCR-Free Index-101 ～ PCR-Free Index-110， 或 PCR-Free Index-111 ～ PCR-Free Index-120， 或 PCR-Free Index-121 ～ PCR-Free Index-130，或 PCR-Free Index-131 ～ PCR-Free Index-140，或 PCR-Free Index-141 ～ PCR-Free Index-150， 或 PCR-Free Index-151 ～ PCR-Free Index-161， 或者 他们任何两个或多个的组合。
     在本发明的一个具体实施方式中， 上文所述 DNA PCR-Free 标签接头中所述的相差 1 个碱基包括标签中 1 个碱基的取代、 添加或删除。
     在本发明的一个具体实施方式中， 提供了所述 DNA PCR-Free 标签接头用于构建DNA 标签文库， 优选的 DNA PCR-Free 标签文库的用途。
     在本发明的一个具体实施方式中， 提供了通过上文所述的 DNAPCR-Free 标签接头 构建的 DNA 标签文库， 优选的 DNA PCR-Free 标签文库。
     本发明另一方面进一步提供了一种 DNA 标签文库的构建方法， 所述方法的特征在 于使用包含标签的 DNA PCR-Free 接头来构建 DNA 标签文库， 优选的 DNA PCR-Free 标签文 库， 其中所述方法不包括 PCR 步骤。
     在本发明另一方面进一步提供的 DNA 标签文库， 优选的 DNAPCR-Free 标签文库的 构建方法中， 包括 ：
     1)DNA 模板准备， 提供 n 个 DNA 样品， n 为整数且 1 ≤ n ≤ 161 的整数， 优选地 n 为 整数且 2 ≤ n ≤ 161， 所述 DNA 样品来自所有真核和原核 DNA 样品， 包括但不限于人 DNA 样 品； 优选地所述 DNA 模板长度为 250bp ；
     2) 末端修复 ；
     3)DNA 片段 3’ 末端加 “A” 碱基 ；
     5) 连接 DNA 标签接头， 其中对 DNA 片段使用不同的标签接头， 每一个标签接头连接 到 DNA 片段的两端。
     在本发明的一个具体实施方式中， 在上文所述方法中， 所述 DNA 标签接头是本发 明所述的 DNA PCR-Free 标签接头。
     在本发明的一个具体实施方式中， 提供了通过本发明所述的方法构建的 DNA 标签 文库， 优选的 DNA PCR-Free 标签文库。
     Paired End DNA 寡核苷酸序列 ：
     DNA PCR-Free 接头 1.0 ：
     AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
     DNA PCR-Free index 接头 ： ( 如表 2 所示 )
     主要实验仪器及试剂
    
    实施例 1 ： DNA 标签实验建库方法具体
     1.1DNA 模板准备
     以质粒 pMD18-T( 日本 takara) 为模板， 使用 Primer Premier5.0 软件设计引物， PCR 扩增产物长度为 250bp 的片段， 使用 NanoDrop 1000 仪器 ( 美国 NanoDrop) 检测扩增 产物的浓度， 然后根据浓度取 1ug 的该 PCR 产物作为文库构建的插入片段， 补水使其体积至 35μL。PCR 引物序列 ：
     pMD18-T 引物 1 ： CGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGG ；
     pMD18-T 引物 2 ： TTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCG。
     1.2 末端修复 [6]
     按照下列的配比准备反应混合 ：
     pMD18-T 质粒 DNA 模板 35μL
     T4 DNA 连接酶缓冲液 50μL
     dNTPs 混合液 4μL
     T4 DNA 聚合酶 5μL
     Klenow DNA 聚合酶 1μL
     T4 多聚核苷酸激酶 5μL
     总体积 100μL
     将舒适型恒温混匀器调至 20℃， 反应 30min， 然后用 QIAquick PCR 纯化试剂盒进 行纯化， 最后将样品溶于 32μL EB solution。
     1.3DNA 片段 3′末端加 “A” 碱基
     按照下列的配比准备反应混合物 ：
     末端修复后的 DNA 32μL
     Klenow 酶缓冲液 5μL
     dATP(1mM) 10μL
     Klenow 酶 (3′到 5′外切酶活性 ) 3μL
     总体积 50μL
     将舒适型恒温混匀器调至 37℃， 反应 30min， 然后用 MiniElute PCR 纯化试剂盒进 行纯化， 最后将样品溶于 10μL EB solution。
     1.4 连接 PCR-Free 标签接头
     按照下列的配比准备反应混合物 ：
     DNA 10μL
     T4 DNA 连接酶缓冲液 25μL
     DNA PCR-Free 标签接头 10μL
     T4 DNA 连接酶 5μL
     总体积 50μL
     注： 对于每一个 DNA 样品， 所使用的 PCR-Free 标签接头可为表 2 中所示 PCR-Free 标签序列 (PCR-Free Index-N) 中的任意一种与 DNA PCR-Free 接头 1.0 退火后的 PCR-Free 标签接头。
     将舒适型恒温混匀器调至 20℃， 反应 15min， 然后用 QIAquick PCR 纯化试剂盒进 行纯化， 最后将样品溶于 30μL EB solution。 1.5PCR-Free index 文库的胶回收纯化
     将连接产物于 2 ％的琼脂糖胶中进行电泳分离 ； 随后将目的片段条带切胶转移 至 Eppendorf 管中。用 QIAquick 胶纯化试剂盒进行胶纯化回收， 回收产物溶于 20μL EB solution。
     1.6PCR-Free index 文库检测
     1) 使用 Agilent 2100 Bioanalyzer 检测文库产量。
     2) 使用 QPCR 定量检测文库产量。
     构建的 44 个 DNA PCR-Free 标签文库， 使用 1％琼脂糖凝胶电泳结果如图 5a 和图 5b 所示， 图 5a 中分别使用了 D2000 和 50bp 的 marker ； 箭头所标记的为目的文库， 其中泳 道 1 和泳道 25 分别是 D2000 和 50bp 的 marker， 泳道 2-24 分别是 DNA PCR-Free 标签 1 文 库、 DNA PCR-Free 标签 2 文库、 DNA PCR-Free 标签 3 文库、 DNA PCR-Free 标签 4 文库、 DNA PCR-Free 标签 5 文库、 DNA PCR-Free 标签 6 文库、 DNA PCR-Free 标签 7 文库、 DNA PCR-Free 标签 8 文库、 DNA PCR-Free 标签 9 文库、 DNA PCR-Free 标签 10 文库、 DNA PCR-Free 标签 11 文库、 DNA PCR-Free 标签 12 文库、 DNA PCR-Free 标签 13 文库、 DNA PCR-Free 标签 14 文 DNA PCR-Free 标签 16 文库、 DNA PCR-Free 标签 17 文库、 库、 DNA PCR-Free 标签 15 文库、 DNA PCR-Free 标签 18 文库、 DNA PCR-Free 标签 19 文库、 DNA PCR-Free 标签 20 文库、 DNA PCR-Free 标签 21 文库、 DNA PCR-Free 标签 22 文库、 DNA PCR-Free 标签 23 文库。图 5b 中 分别使用了 D2000 和 50bp 的 marker ； 箭头所标记的为目的文库， 其中泳道 1 和泳道 25 分别 是 D2000 和 50bp 的 marker， 泳道 3-23 分别是 DNA PCR-Free 标签 101 文库、 DNA PCR-Free 标签 102 文库、 DNAPCR-Free 标签 103 文库、 DNA PCR-Free 标签 104 文库、 DNA PCR-Free 标 签 105 文库、 DNA PCR-Free 标签 106 文库、 DNA PCR-Free 标签 107 文库、 DNA PCR-Free 标 签 108 文库、 DNA PCR-Free 标签 109 文库、 DNA PCR-Free 标签 110 文库、 DNA PCR-Free 标
    签 111 文库、 DNA PCR-Free 标签 112 文库、 DNA PCR-Free 标签 113 文库、 DNA PCR-Free 标 签 114 文库、 DNA PCR-Free 标签 115 文库、 DNA PCR-Free 标签 116 文库、 DNA PCR-Free 标签 117 文库、 DNA PCR-Free 标签 118 文库、 DNA PCR-Free 标签 119 文库、 DNA PCR-Free 标 签 120 文库、 DNA PCR-Free 标签 121 文库。由于目的片段 (PCR 产物 ) 长度为 250bp， 接头 长度为 65bp 且为 “Y 型” 结构， 理论上目的片段两端连接上 DNA PCR-Free 标签接头后的会 增加 130bp 左右的分子量， 但是由于 DNA PCR-Free 标签接头为特殊的 “Y 型” 结构， 其在 琼脂糖中电泳的速度会比相同分子量的双链 DNA 电泳迁移率稍小， 电泳条带显示的位置为 500bp。 D2100 marker 从上往下的条带分别是 ： 2000bp、 1000bp、 750bp、 500bp、 250bp、 100bp ； 目的条带下方有部分条带， 为目的片段的一端连接上接头的产物， 其产物量不多， 不影响文 库构建的结果。结果表明， 接头全部成功连接到 pcr 产物上。
     Solexa 测序结果统计 ： 共测序 33932756 条读取结果 ( 也称为·reads)， 标签完全 识别即 0 mismatch 占 96.73％， 其他读取结果 (other reads) 占 3.27％， 所以测序结果标 签的完全识别的序列为～ 96.7％， 可以满足 solexa DNA 标签的测序要求。
     尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述， 本领域技术人员将会理解。根 据已经公开的所有教导， 可以对那些细节进行各种修改和替换， 这些改变均在本发明的保 护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
     参考文献
     1、 Paired-End sequencing User Guide ； illumina part#1003880
     2、 Preparing samples for ChIP sequencing for DNA ； illumina part#11257047 Rev.A ；
     3、 mRNA sequencing sample preparation Guide ； illumina part#1004898 Rev.D
     4、 Preparing 2-5kb samples for mate pair library sequencing ； illumina part#1005363 Rev.B ；
     5、 Preparing samples for multiplexed Paired-End sequencing ； illumina part#1005361 Rev.B.44CN 101967476 A
    序列表1/57 页
     45CN 101967476 A序列表2/57 页
    46CN 101967476 A序列表3/57 页
    47CN 101967476 A序列表4/57 页
    48CN 101967476 A序列表5/57 页
    49CN 101967476 A序列表6/57 页
    50CN 101967476 A序列表7/57 页
    51CN 101967476 A序列表8/57 页
    52CN 101967476 A序列表9/57 页
    53CN 101967476 A序列表10/57 页
    54CN 101967476 A序列表11/57 页
    55CN 101967476 A序列表12/57 页
    56CN 101967476 A序列表13/57 页
    57CN 101967476 A序列表14/57 页
    58CN 101967476 A序列表15/57 页
    59CN 101967476 A序列表16/57 页
    60CN 101967476 A序列表17/57 页
    61CN 101967476 A序列表18/57 页
    62CN 101967476 A序列表19/57 页
    63CN 101967476 A序列表20/57 页
    64CN 101967476 A序列表21/57 页
    65CN 101967476 A序列表22/57 页
    66CN 101967476 A序列表23/57 页
    67CN 101967476 A序列表24/57 页
    68CN 101967476 A序列表25/57 页
    69CN 101967476 A序列表26/57 页
    70CN 101967476 A序列表27/57 页
    71CN 101967476 A序列表28/57 页
    72CN 101967476 A序列表29/57 页
    73CN 101967476 A序列表30/57 页
    74CN 101967476 A序列表31/57 页
    75CN 101967476 A序列表32/57 页
    76CN 101967476 A序列表33/57 页
     77CN 101967476 A序列表34/57 页
     78CN 101967476 A序列表35/57 页
     79CN 101967476 A序列表36/57 页
     80CN 101967476 A序列表37/57 页
     81CN 101967476 A序列表38/57 页
     82CN 101967476 A序列表39/57 页
     83CN 101967476 A序列表40/57 页
     84CN 101967476 A序列表41/57 页
     85CN 101967476 A序列表42/57 页
     86CN 101967476 A序列表43/57 页
     87CN 101967476 A序列表44/57 页
     88CN 101967476 A序列表45/57 页
     89CN 101967476 A序列表46/57 页
     90CN 101967476 A序列表47/57 页
     91CN 101967476 A序列表48/57 页
     92CN 101967476 A序列表49/57 页
     93CN 101967476 A序列表50/57 页
     94CN 101967476 A序列表51/57 页
     95CN 101967476 A序列表52/57 页
     96CN 101967476 A序列表53/57 页
     97CN 101967476 A序列表54/57 页
     98CN 101967476 A序列表55/57 页
     99CN 101967476 A序列表56/57 页
     100CN 101967476 A序列表57/57 页