用于分离对映体混合物的新型手性选择物及固定相 技术领域 本发明涉及 α- 未被取代的 β- 氨基酸尤其是其衍生物作为手性选择物用于分离 物质混合物、 优选手性物质的混合物、 更优选对映体混合物、 特别是选自 β- 氨基酸及其衍 生物、 α- 氨基酸和 α- 羟基酸中的物质的对映体的用途， 本发明还涉及包含 α- 未被取代 的 β- 氨基酸尤其是其衍生物作为中心手性物质的手性固定相 (CSP)、 它们的合成、 以及利 用这些固定相分离物质混合物、 优选手性物质的混合物、 更优选对映体混合物、 特别是选自 β- 氨基酸及其衍生物、 α- 氨基酸和 α- 羟基酸中的物质的对映体混合物的方法。
背景技术
对用于化学和药物用途的对映体纯物质和活性成分的增长的需要已经导致大量 立体选择性分离技术的发展， 特别是在色谱领域， 其可以以分析级使用， 用于控制对映体纯 度并抑制外消旋过程、 用于药物质量控制和用于药物代谢动力学研究， 或者以制备级使用， 以提供对映体纯的化合物。
与非对映体相反， 对映体在非手性的环境中具有完全相同的化学及物理特性。因 此， 色谱对映体分离可以用间接法来进行， 即， 使分析物与手性衍生化试剂反应以生成非对 映体混合物， 该混合物与对映体混合物不同， 其可以在非手性相材料上分离 ； 或者通过所谓 的使用能结合进移动或固定相的手性选择物的直接法来进行。此时， 分离性能取决于分析 物和选择物之间通过非共价相互作用形成的非对映体络合物的不同稳定性。
在对映体分离的领域中， 已经发现了直接法和间接法， 以各种各样的色谱和电 泳的方法， 例如气相色谱法 (GC)、 高效液相色谱法 ( 也称为高压液相色谱法， HPLC)、 薄 层色谱法 (TLC)、 超 - 和亚临界液体色谱法 (SLC)、 毛细管电色谱法 (CEC) 和毛细管电泳 法 (CE)(Gübitz and Schmid(Eds.)， Methods in Molecular Biology， Vol.243 ： Chiral Separations ： Methods and Protocols， Humana Press Inc ： Totowa， NJ ： 2004 ； Gübitz und Schmid， Biopharm.Drug Dispos.2001， 22， 291-336)。
分析物的衍生化意味着至少一个加入反应步骤， 其会导致生成不希望的副产物和 分解产物并导致 ( 部分 ) 消旋化。此外， 在分析物中必须存在用于衍生化的合适的官能 团， 并且手性衍生试剂必须可以以高对映体纯度获得 (Gübitz and Schmid， Biopharm.Drug Dispos.2001， 22， 291-336)， 这就是为什么现在更优选非衍生的直接色谱法或电泳法。
虽然就操作而言， 将手性选择物加入到色谱或电泳体系的流动相中是用于对映体 分离的简单方法， 但其费用非常高且并非在任何场合都可行。
使用其中手性选择物共价健合或吸附到载体材料上的手性固定相的直接色谱方 法就操作而言是很方便的， 并且 - 假定手性相材料有足够的分离性能 - 也适用于制备级。 具 体地说， 在手性固定相领域中， 一方面， 手性选择物使得手性化合物的两种对映体可有效地 分离， 但另一方面， 要求其具有足够的可变性以使其可应用于宽范围的化合物。
直接法的一种改型是配体交换方法 (LE)， 其是基于在金属离子、 手性选择物与分 析物之间形成的三重混合的络合物， 手性选择物与分析物二者在金属离子上都起配位体的作用。成功分离的关键在于混合络合物与分析物的 (R) 和 (S) 对映体之间不同的稳定常 数。 配体交换原则已经在上述的许多方法中成功地用于对映体分离 ： 首先， 在毛细管电泳中 将手性选择物加入到电解液中， 其次， 在经典的柱色谱法、 高效液相色谱法、 薄层色谱法和 毛细管电色谱法中使用手性固定相， 在这些情况下手性选择物可共价健合或吸附到载体材 料上。
然而， 因为手性分离至今还不能预期， 所以寻找有效和快速的手性固定和流 动 相 的 适 当 组 合 仍 然 是 对 色 谱 法 的 一 大 挑 战 (Subramanian， Practical Approach to Chiral Separations by Liquid Chromatography， Wiley-VCH ： Weinheim 1994 ； Gübitz and Schmid(Eds.)， Methods in Molecular Biology， Vol243 ： Chiral Separations ： Methods and Protocols ，Humana Press Inc ： Totowa ，NJ ： 2004 ； Francotte ，GIT Labor-Fachzeitschrift 5/2006， 452-455)， 而且深入的研究已经导致新的和改善的相 材料 ( and Lindner， In ： Separation Methods in Drug Synthesis and Purification， Valkó(Ed.)， Elsevier ： Amsterdam2000， 337-437)。 按 照 Armstrong 等 人 报导 (Anal.Chem.2001， 73， 557A-561A)， 早在 2001 年， 仅用于高效液相色谱， 就有超过 100 种基于不同选择物的手性固定相可以通过商业获得。每家厂商都提供综合利用手册， 其中 有品种繁多的各种各样的分离情况， 例如对于脂肪族的、 芳香族的、 脂环族的或杂环的手性 胺、 酒精、 氨基醇或 α- 氨基酸及其衍生物， 在特定产品的方法中几乎都专门列出。这种大 量能够通过商业获得的手性固定相， 首先表明这些分离方法有巨大的意义并且人们对其有 兴趣， 但应当说明， 迄今为止， 影响手性固定相直接色谱和电泳法利用的一大弊病在于 ： 通 常来说， 要获得高效的分离， 需要一系列 ( 昂贵的 ) 手性固定相， 即使是结构上密切相关的 单元的情况下。
因此， 内部研究以及文献数据表明， 迄今为止， 对于手性色谱法， 需要大量能 用 于 气 相 色 谱 法 (GC) 或 液 相 色 谱 法 ( 例 如 HPLC) 的 固 定 相， 例 如 β- 氨 基 酸 及 其 衍 生 物。 例 如， 现 有 技 术 已 经 公 开， 纤 维 素 氨 基 甲 酸 酯 相、 多 糖 衍 生 物、 冠 醚 (Berkecz et al. ， J.Chromatogr.A ， 2006 ， 1125 ， 138-143 ； Hyun et al. ， J.Sep.Sci.2005 ， 28 ， 421-427)、 配 体 交 换 相 (Hyun et al.， J.Sep.Sci.2003， 26， 1615-1622 ； Hyun et al.， Biomed.Chromatogr.2003， 17， 292-296) 或 大 环 糖 肽 相 (Sztojkov-Ivanov et al.， Chromatographia 2006， 64， 89-94 ； Illisz et al.， J.Sep.Sci.2006， 29， 1305-1321 以及其 中引用的文献 ； D’ Acquarica et al.， Tetrahedron ： Asymmetry 2000， 11， 2375-2385)。
近几年， 由于具有独特的药理学的性质， β- 氨基酸已经作为关键组分结合进大量 的拟肽物和其他生理活性物质 (Kuhl et al.， Amino Acids 2005， 29， 89-100)。与此有关 的是对用于检测合成单元和最终产物的对映体纯度的分析方法的高涨需要， 具体地说， 也 在于存在显著过量的旋光对映体的情况下检测一种对映体痕量的痕量测定需求 (Juaristi and Soloshonok， Enantioselective Synthesis of β-Amino Acids， Wiley-VCH ： New York 2005)。 发明内容
本发明的目的是提供新的手性选择物， 基于该手性选择物， 能提供用于分离物质 混合物、 优选手性物质的混合物、 更优选对映体混合物、 特别是选自 β- 氨基酸及其衍生物、 α- 氨基酸和 α- 羟基酸中的物质的对映体的新手性相， 这使得可以用色谱法、 特别是 借助于高效液相色谱法在分析和预备级上高效且基本上非常通用地分离手性化合物的对 映体对。
如今已经发现， 十分令人惊讶地， 在分离物质混合物、 优选手性物质的混合物、 更 优选对映体混合物、 特别是 β- 氨基酸及其衍生物中， α- 未被取代的 β- 氨基酸衍生物是 柔性的且是具有非常高选择性的手性选择物。 可以使用本发明的选择物进行对映体分离的 其他物质种类是， 例如， α- 氨基酸和 α- 羟基酸。因此， 本发明的一个独特的优势在于包 含基于 α- 未被取代的 β- 氨基酸衍生物的手性相可令人惊讶地普遍应用于大量物质种类 的色谱分离。
因此， 本发明提供结构 (I) 的手性选择物的用途
其中， n ＝ 1-5， 优选 n ＝ 1 或 n ＝ 2， R1 ＝ (C1-C4)- 烷基、 (C6-C10)- 芳基、 (C7-C13)- 芳烷 基、 (C7-C10)- 杂 芳 烷 基、 吡 啶 基、 羟 甲 基、 CH(OH)CH3、 CH2CONH2、 CH2COOH、 (CH2)2CONH2、 (CH2)2COOH、 (CH2)4NH2、 (CH2)2SCH3 或 (CH2)3NHC(NH)NH2 ；
并且当所述手性选择物通过连接基 (linker)X 共价地连接至载体材料时， R2 ＝ 3， 5- 二硝基苯甲酰基或萘基
或 者 当 X ＝ OH 时， R2 ＝ CH2CHR3R4， 其 中 R3 ＝ H 或 OH 且 R4 ＝ (C1-C20)- 烷 基、 (C6-C10)- 芳基或 (C7-C13)- 芳烷基。
根据本发明， 对于 C3 碳原子 (β- 碳原子 )， 所述手性选择物主要以一种绝对构型 存在， 而对于可能存在于侧链的立构中心， 则不必主要以一种绝对构型存在。
在本发明的范围内， (C1-C4)- 烷基表示具有 1-4 个饱和碳原子且可以有任何希望 的支链的基团， 优选甲基、 异丙基、 异丁基和仲丁基。
在本发明的范围内， (C6-C10)- 芳基表示具有 6-10 个碳原子的芳基， 优选苯基和 1- 和 2- 萘基基团， 其可被其他基团或官能团， 特别是氟、 氯、 溴、 甲基和 / 或三氟甲基基团、 和羟基和 / 或氰基单 -、 低 -、 多 - 或全取代。
在 本 发 明 的 范 围 内， (C7-C13)- 芳 烷 基 优 选 表 示 通 过 亚 甲 基 键 合 到 分 子 的 (C6-C10)- 芳基， 且进一步优选苯乙基和二苯甲基。
在本发明的范围内， (C7-C10)- 杂芳烷基优选表示通过亚甲基键合到分子的吡啶基 或吲哚基。
在本发明的范围内， 萘基优选表示 1- 萘基或 2- 萘基， 其可以有键合的其他的取代 基。
优选 R1 ＝苯基 ； 在特别优选的实施方案中， R1 ＝苯基且 n ＝ 1 或 n ＝ 2。此外， 优 4 选 R ＝苯基。
本发明进一步提供通过结构 (I) 描述的手性选择物在制备用于对物质混合物、 优 选手性物质混合物、 更优选对映体混合物、 特别是选自 β- 氨基酸及其衍生物、 α- 氨基酸 和 α- 羟基酸中的物质的对映体进行色谱分离方法中的固定相的用途， 并且所述手性选择物可共价地键合到或吸附到基于硅胶或整块料 (monolith) 的载体材料上。
结构 (I) 表示的手性选择物和基于该手性选择物手性固定相适于在对物质混合 物、 优选手性物质混合物、 更优选对映体混合物、 特别是选自 β- 氨基酸及其衍生物、 α- 氨 基酸和 α- 羟基酸中的物质的对映体进行色谱分离的方法中作为选择物。所述样品包括对 映体混合物， 还可包含将被除去的其他化合物， 例如副产物和 / 或杂质。本发明范围内的色 谱方法包括薄层色谱法 (TLC)、 毛细管电色谱法 (CEC)， 并更优选高效液相色谱 (HPLC)。本 发明范围内的其他色谱方法是微晶片上的微高效液相色谱 (μ-HPLC) 和毛细管电色谱法 (CEC)( 所谓的微流体芯片技术 )。本发明的独特优势在于所述手性选择物使得可以制备在 各种条件下都很稳定并且可在普通的相模式 (NP)、 或在极性 - 有机模式 (PO) 和反相模式 (RP) 下使用的固定相。本发明的进一步优势为由于手性选择物的高选择性， 手性选择物允 许对映体的微量痕量测定。
进一步优选的色谱方法为配体交换模式， 其中流动相含有带正电荷的金属离子， 优选二价金属离子， 特别是铜 (II) 离子 (Davankov， J.Chromatogr.1971， 60， 280-283)。在 2 配体交换模式中， 优选结构 (I) 的手性选择物的吸附体， 其中， X ＝ OH 且 R ＝ CH2CHR3R4， 其 3 4 中 R ＝ H 或 OH 且 R ＝ (C1-C20)- 烷基、 (C6-C10)- 芳基或 (C7-C13)- 芳烷基。 本发明进一步提供一种用于对物质混合物、 优选手性物质混合物、 更优选对映体 混合物、 特别是选自 β- 氨基酸及其衍生物、 α- 氨基酸和 α- 羟基酸中的物质的对映体进 行色谱分离方法中的手性固定相， 其包括载体材料和手性选择物， 其特征在于所述手性选 择物是如下结构的 α- 未被取代的 β- 氨基酸衍生物 ：
其中 n ＝ 1-5， 优选 n ＝ 1 或 n ＝ 2， R1 ＝ (C1-C4)- 烷基、 (C6-C10)- 芳基、 (C7-C13)- 芳 烷 基、 (C7-C10)- 杂 芳 烷 基、 吡 啶 基、 羟 甲 基、 CH(OH)CH3、 CH2CONH2、 CH2COOH、 (CH2)2CONH2、 2 (CH2)2COOH、 (CH2)4-NH2、 (CH2)2-SCH3 或 (CH2)3NHC(NH)NH2， R ＝ 3， 5- 二硝基苯甲酰基或萘 基， 且 X 是手性选择物共价连接到载体材料上的连接基。
根据本发明， 对于 C3 碳原子 (β- 碳原子 )， 所述手性选择物主要以一种绝对构型 存在。
优选地， R1 ＝苯基 ； 在一个实施方案中， 特别优选 R1 ＝苯基且 n ＝ 1 或 n ＝ 2。
连接基 X 优选是具有伯氨基的氨烷基连接基， 更优选是氨丙基连接基， 所述选择 物作为酰胺通过连接基键合到载体材料上。所述实施方案如结构 (IIa) 所示 ：
在本发明的范围内优选的载体材料是基于硅胶或整块料的材料。 本发明进一步提供一种用于制备含有结构 (II) 或 (IIa) 的手性选择物的手性固定相， 包括以下步骤 ： (ia) 用适于酰化的 3， 5- 二硝基苯甲酰衍生物优选为 3， 5- 二硝基苯 2 甲酰氯对 α- 未被取代的 -β- 氨基酸或相应的 β- 氨基酸酯进行酰化 (R ＝ 3， 5- 二硝 基苯甲酰基 )， 或 (ib) 合成 α- 未被取代的 N- 萘基化的 β- 氨基酸或相应的 β- 氨基酸 2 酯 (R ＝萘基 )(ii) 任选地， 水解所述酯官能团， (iii) 任选地， 偶合其他的 α- 未被取代 的 -β- 氨基酸单元， (iv) 使所述手性选择物通过共价， 任选地通过连接基， 接合至载体材 料上。通式结构 (II) 和 (IIa) 的化合物可以通过以下方法制备， 例如， 通过用适于酰化 的 3， 5- 二硝基苯甲酰衍生物优选为 3， 5- 二硝基苯甲酰氯对相应的 β- 氨基酸或相应的 2 β- 氨基酸酯进行酰化 (R ＝ 3， 5- 二硝基苯甲酰基 )( 类似于制备包括那些基于 β- 氨 基酸的手性相的方法， Pirkle 等人报告 (J.Chromatogr.1980， 192， 143-158))。主要以一 种对映体形式存在的 α- 未被取代的 N- 萘基化的 β- 氨基酸或相应的 β- 氨基酸酯 (R2 ＝萘基 ) 的合成， 可以是例如， 由相应的 β- 氨基酸和萘酚通过经典的布赫尔反应来合成 (Pirkle 和 Pochapsky 报导了用于制备具有高对映体纯度的 N-(2- 萘基 )-2- 氨基酸及酸 酯的类似方法 (J.Org.Chem.1986， 51， 102-105))。要求所述 β- 氨基酸与重复的 β- 氨 基酸单元 (n ＞ 1) 形成选择物， 这可以通过， 例如， 溶液中经典的缩氨酸合成路线来实现。 对于其细节以及其他合成法， 可参考关于缩氨酸合成的相关已知文献 ( 如 Houben-Weyl， Methoden der organischen Chemie[Methods of Organic Chemistry]， Volume 15/1and 15/2 ； M.Bodanszky， Principles of Peptide Synthesis， Springer Verlag 1984)。
此外， 本发明提供一种使用由结构 (II) 或 (IIa) 描述的手性选择物或基于其的手 性固定相对物质混合物、 优选手性物质混合物、 更优选对映体、 特别是选自 β- 氨基酸及其 衍生物、 α- 氨基酸和 α- 羟基酸中的物质的对映体进行色谱分离的方法， 包括 ： (i) 使待分 离的物质混合物的溶液与含有载体材料和结构 (II) 或 (IIa) 的手性选择物的手性固定相 接触， (ii) 使用流动相， 基于物质混合物中各个成分与固定相之间的不同相互作用来分离 各个成分， (iii) 任选地， 收集流动相的馏分并从其中分离经色谱纯化的物质。此方法还适 于对映体特别是 α- 和 β- 氨基酸对映体的微量痕量检测。优选液相色谱法， 特别是 HPLC 法。其可以， 例如， 在不加入金属离子的情况下通过正常相模式 (NP)、 极性 - 有机模式 (PO) 或反相模式 (RP) 来进行。
此外， 本发明提供一种用于对物质混合物、 优选手性物质混合物、 更优选对映体、 特别是选自 β- 氨基酸及其衍生物、 α- 氨基酸和 α- 羟基酸中的物质的对映体进行色谱 分离的手性固定相， 包括 ： 载体材料和手性选择物， 其特征在于所述手性选择物是如下结构 的 α- 未被取代的 -β- 氨基酸衍生物
其 中 R1 ＝ (C1-C4)- 烷 基、 (C6-C10)- 芳 基、 (C7-C13)- 芳 烷 基、 (C7-C10)- 杂 芳 烷 基、 吡 啶 基、 羟 甲 基、 CH(OH)CH3、 CH2CONH2、 CH2COOH、 (CH2)2CONH2、 (CH2)2COOH、 (CH2)4-NH2、 3 4 (CH2)2-SCH3 或 (CH2)3NHC(NH)NH2， R ＝ H 或 OH 和 R ＝ (C1-C20)- 烷 基、 (C6-C10)- 芳 基 或 (C7-C13)- 芳烷基。
根据本发明， 对于 C3 碳原子 (β- 碳原子 )， 所述手性选择物主要以一种绝对构型 存在， 而在 2′位置上可能存在的立构中心则不必主要以一种绝对构型存在。
优先 R1 ＝苯基。
在本发明的范围内， R4 优选为被短链取代的苯基， 更优选未被取代的苯基， 或具有 1-20 个碳原子、 优选具有 4-18 个碳原子、 更优选具有 6-16 个碳原子、 特别是具有 10-12 个 碳原子的直链或支链化的烷基， 且更优选为正癸基。 在特别优选的具体实施方式中， R1 ＝苯 基且 R4 ＝正癸基。
式 (III) 的手性选择物可应用于合适的载体材料， 优选通过所谓的动态覆盖吸附 到反相材料 (RP 材料 ) 优选基于硅胶或整块料上。优选的 RP 材料是， 例如， RP-2、 RP-4、 RP-5、 RP-6、 RP-8、 RP-12 以及特别是 RP-18。
本发明进一步提供一种用于制备含有结构 (III) 的手性选择物的手性固定相的 方法， 包括以下步骤 ： 制备如权利要求 15-22 任一项的手性固定相方法用的 N- 烷基化的氨 基酸包括以下步骤 ： (i) 制备 N- 烷基化的氨基酸， (ii) 使 N- 烷基化的氨基酸吸附至载体材 料上。
通式结构 (III) 的化合物可以通过以下方法制备， 例如， 用等摩尔量的强碱例如 甲醇钠使适当的环氧化合物与特定的 β- 氨基酸反应 (Busker et al.， DE3 143 726A1)。 这会导致 2 ′碳原子的外消旋化构型。制备结构 (III) 的手性选择物的另一种方法是用 n- 烷基溴使适当的 β- 氨基酸 N- 烷基化 ( 例如， 根据 Davankov et al.， Chromatographia 1980， 13， 677-685)。 此外， 优选一种使用由结构 (III) 描述的手性选择物或基于其的手性固定相， 在 分析级、 半制备级或制备级上色谱分离物质混合物、 优选手性物质混合物、 更优选对映体混 合物、 特别是选自 β- 氨基酸及其衍生物、 α- 氨基酸和 α- 羟基酸中的物质的对映体的方 法， 特别是在加入金属离子优选二价金属离子且更优选铜 (II) 离子的配体交换模式 (LE) 中。 这种方法包括 ： (i) 使待分离的物质混合物的溶液与含有结构 (III) 的手性选择物的手 性固定相接触， (ii) 基于物质混合物中各个成分与手性选择物之间的不同相互作用， 使用 含有二价过渡金属离子且优选铜 (II) 离子的流动相来分离该物质混合物中的各个成分， (iii) 就制备或半制备液相色谱应用而言， 任选地， 收集流动相的馏分并从其中分离经色谱 纯化的物质。此方法还适于对映体优选是 α- 和 β- 氨基酸对映体的微量痕量检测。
在本文的范围内， 色谱分离是指在固定相上分离物质混合物、 优选手性物质混合 物、 更优选对映体混合物、 特别是选自 β- 氨基酸及其衍生物、 α- 氨基酸和 α- 羟基酸中的 物质的对映体， 该过程或者是指不进行所分离物质的后续分离的仅以分析为目的的过程、 或者是指为了半制备或制备目的而进行后续的从色谱系统的成分和存在于样品中的其他 物质中分离被分离的物质的过程。
在本发明的范围内， “主要以一种绝对构型” 是指一种光学活性的旋光对映体形式 超过 50％、 优选至少 90％、 尤其至少 95％， 且更优选对映体纯的形式。
如已经提到过的， 现有技术中公开了大量的手性选择物以及基于这些手性选择物 的固定相。例如， 为了通过高效液相色谱分离 β- 氨基酸及其衍生物， 迄今为止， 已经使用 了基于冠醚、 β- 氨基酸衍生物或大环糖肽的手性选择物。表 1 中对比了现有技术中用于 分离对映体 β- 氨基酸的各种已知色谱方法， 根据本发明的教导可以得到结果。分离柱的
特性以通常方式通过负载系数 k1 和 k2、 分离系数 α 和分离度 (resolution)Rs 表示 - 例如， 在 Meyer， Praxis der Hochdruckflüssigkeits-chromatographie [High-Pressure Liquid Chromatography in Practice]， Wiley-VCH Weinheim 2004 中描述的方法。准确的色谱分 析条件可以从具体的原始文献中获得。
表1： 通式结构 H2N-CHR1-CH2-CO2H 的 β- 氨基酸的对映体混合物在手性固定相上 的色谱分离
ab 本发明 ； n.s. ＝未指定 * 其他参数 ： 比较文献 / 本发明实施例 ： 流速 1ml/min， 30℃[1]Sztojkov-Ivanov et al.， Chromatographia 2006， 64， 89-94.
[2]Hyun et al.， J.Sep.Sci.2003， 26， 1615-1622.
[3]Péter et al.， J.Chromatogr.A 2001， 926， 229-238.
[4]D’ Acquarica et al.， Tetrahedron ： Asymmetry 2000， 11， 2375-2385.
[5]Hyun et al.， J.Sep.Sci.2002， 25， 648-652.
[6]Berkecz et al.， J.Chromatogr.A 2006， 1125， 138-143.
[7]Madhavan， Chromatographia 2007， 66， 243-246.
从表 1 可以明显看出， 在以分离系数 α 和对映体分离度 Rs 为特征的分离性能方 面、 特别是在半制备和制备应用方面， 本发明的选择物及基于该选择物的固定相与现有技 术已知的选择物相比， 非常有优势。此外， 它们显示出普遍的适用性 ； 这也参考了表 2-4 显 示的结果。
现有技术中也公开了基于 α- 氨基酸的手性选择物， 并与结构 (II) 描述的选择物 有一定的相似性 (Welch， J.Chromatogr.A 1994， 3-26)。然而， 其中描述的手性选择物无一 是 α- 未被取代的 β- 氨基酸衍生物。而且， 甚至在现有技术中不同的出处都指出， 与手性 识别有关的官能团之间有相对较大的距离和选择物较高的构象灵活性 ( 与 α- 氨基酸或与 α- 取代的 β- 氨基酸相比， 由于本发明选择物中额外的亚甲基， 会出现这种情况 )， 在分离 性能上具有副作用 ( 特别参见， Pirkle and McCune， J.Chromatogr.1988， 441， 311 ； Wang et al.， Anal.Chem.2000， 72， 5459-5465 ； Welch， J.Chromatogr.A 1994， 3-26)。 附图说明
图 1 表示使用实施例 1 的手性固定相时不同 β- 氨基酸衍生物光学异构体的色谱 分离度。
图 2 表示使用实施例 2 的手性固定相时不同 β- 氨基酸衍生物光学异构体的色谱 分离度。
图 3 表示使用实施例 3 的手性固定相时不同 α- 和 β- 氨基酸及 α- 羟基酸的光 学异构体的色谱分离度。
图 4 表示实施例 2 的手性固定相在确定对映体纯度中特别是微量痕量检测领域 中的应用。上边的色谱图表示使用实施例 2 的手性固定相时 (R)- 和 (S)-3- 叔丁氧羰基 氨基 -3- 苯基丙酸消旋混合物的色谱分离度。中间的色谱图表示在此相上的纯 (S)-3- 叔 丁氧羰基氨基 -3- 苯基丙酸的色谱。下边的色谱图表示加入 1％的 (R)-3- 叔丁氧羰基氨 基 -3- 苯基丙酸的 (S)-3- 叔丁氧羰基氨基 -3- 苯基丙酸的分离度。 具体实施方式
实施例
以下实施例用于详细阐述本发明， 但不以任何方式对其产生限制。
实施例 1
(S)-3(3， 5- 二硝基苯甲酰氨基 )-3- 苯丙酸共价连接至氨丙基功能化的硅胶基体 ( 氨基相 ) 的手性固定相的制备
(1)(S)-3-(3， 5- 二硝基苯甲酰氨基 )-3- 苯丙酸的合成将 16g(S)-3- 氨基 -3- 苯丙酸 ((S)-β- 苯丙氨酸 ) 与 80ml 5％的氢氧化钠水溶 液混合， 并通过加入 50％的氢氧化钠水溶液将所得溶液的 pH 值调节至 11-12。加入 20ml 四氢呋喃后， 将反应混合物冷却至 10℃， 在 60 分钟的时间内加入 23.1g 二硝基苯甲酰氯在 60ml 四氢呋喃中的溶液， 并将反应混合物再搅拌 60 分钟。通过蒸馏除去有机相， 残留的水 相用甲基叔丁酯萃取两次。将水相与 200ml 乙酸乙酯混合并通过加入 4N 的盐酸将 pH 调节 至 1-2。分离各个相， 有机相用 200ml 饱和氯化钠溶液洗涤。在 45℃和 p ＝ 150mbar 下蒸 馏出溶剂之后， 将残余物置于 300ml 环己烷中。滤出产物并在 40℃干燥。所述产物通过制 备高效液相色谱在反相材料上 ( 例如 Kromasil RP-18， 粒径 10μm) 在乙腈 / 水 / 三氟乙 酸的溶剂混合物中进一步纯化。产量 ： 8.0g， HPLC 纯度 99.8 面积％ ； 元素分析 ： 53.4％ C， 1 3.6％ H， 12.7％ N ； H NMR(DMSO)δ(ppm) ： 2.85(dd， 1H)， 2.96(dd， 1H)， 5.48(m， 1H)， 7.26(t， 1H)， 7.35(t， 2H)， 7.44(d， 2H)， 8.96(t， 1H)， 9.07(d， 2H)， 9.58(d， 1H)， 13.30(s， 1H， CO2H)。
(2)(S)-3-(3， 5- 二硝基苯甲酰氨基 )-3- 苯丙酸连接至氨丙基功能化的硅胶相 ( 氨基相 )
将 4.1g 氨基相 (YMC- 凝胶氨基 NH12SO5， 粒径 5μm) 悬浮在 4g(S)-3(3， 5- 二硝 基苯甲酰氨基 )-3- 苯丙酸于 200ml 四氢呋喃的溶液中， 并在搅拌下将反应混合物与 3.2g N- 乙氧羰基 -2- 乙氧基 -1， 2- 二氢喹啉 (EEDQ) 混合。室温下 8h 后， 将相材料滤出， 分别用 50ml 甲醇和乙醚洗涤并干燥。产量 ： 4.6g 所要求的载体材料， 元素分析 ： 10.6％ C， 1.2％ H 和 2.4％ N ； 相当于 0.4mmol/g 的覆盖率。
通过平衡 - 密度法在 300bar 下填充 250×5mm 的 HPLC 柱 ( 参见 Meyer， Praxis der Hochdruckflüssigkeitschromatographie， Wiley-VCH ： Weinheim2004)。
应用实施例 1
实施例 1 制备的分离柱适用于多种 β- 氨基酸或 β- 氨基酸衍生物 ( 表 2) 在 HPLC 条件下的色谱分离。图 1 表示使用实施例 1 的分离柱时不同 β- 氨基酸衍生物的光学异构 体的色谱分离度 (chromatographic resolution)。
表2
流动相 A ： 异己烷 / 乙醇 / 三氟乙酸 (800+200+1， v/v/v)
流动相 B ： 异己烷 / 甲基叔丁酯 / 乙醇 / 三氟乙酸 (800+150+50+1， v/v/v/v)
* 其他参数 ： 流速 1ml/min， 温度 30℃
实施例 2 ：
(S)-3-[(S)-3-(3， 5- 二硝基苯甲酰氨基 )-3- 苯丙酰胺 ]-3- 苯丙酸 (3-(3， 5- 二 硝基苯甲酰基 )-(S)-β- 苯丙氨酰 -(S)-β- 苯丙氨酸 ) 共价连接至氨丙基功能化的硅胶 基体 ( 氨基相 ) 的手性固定相的制备
(1)(S)-3-[(S)-3-(3， 5- 二硝基苯甲酰基 )-3- 苯丙酰胺 ]-3- 苯丙酸 (3-(3， 5- 二 硝基苯甲酰基 )-(S)-β- 苯丙氨酰 -(S)-β- 苯丙氨酸 ) 的合成
a.(S)-3-(3， 5- 二硝基苯甲酰氨基 )-3- 苯丙酸乙酯的合成
将 11.49g(S)-3- 苯丙酸乙酯盐酸盐悬浮在 100ml 四氢呋喃中并在冰浴中冷却至 0-10℃。加入 14ml 三乙胺后， 在搅拌和冷却下 30 分钟内加入 11.52g 3， 5- 二硝基苯甲酰 氯于 40ml 四氢呋喃中的溶液。移去冷却浴， 并将反应混合物再搅拌 120 分钟， 在此过程中， 其升至室温。过滤反应混合物， 滤液浓缩至干燥 ( 产物部分 1)。将滤饼 - 由盐酸三乙胺和 其他产物组成 - 置于 100ml 乙酸乙酯中并在 35℃消化 20 分钟。过滤悬浮物， 弃去滤饼。在
40℃将滤液减压浓缩至干燥 ( 产物部分 2)。合并上述产物部分。产量 ： 16.4g ； HPLC 纯度 ＞ 97 面积％。为了进一步纯化， 室温下将粗品在 400ml 水中消化 2h 然后过滤。湿产量为 15.4g。HPLC 纯度为 99.8 面积％。产物进一步反应而无需进一步纯化。
b. 水解成 (S)-3-(3， 5- 二硝基苯甲酰氨基 )-3- 苯丙酸
将从反应 a 获得的 15.4g(S)-3-(3， 5- 二硝基苯甲酰氨基 )-3- 苯丙酸乙酯溶于 100ml 四氢呋喃中， 并将获得的溶液与 50ml 水混合。 强烈搅拌下， 将稍微混浊的反应混合物 加热至 45℃， 用 32％氢氧化钠水溶液将 pH 调节至 13-13.5 并在反应过程中保持恒定。反 应终止后 (HPLC 检测＞ 99 面积％的转化率 )， 通过加入 6N 盐酸将溶液的 pH 调节至 7-8， 然 后在减压下蒸馏出有机溶剂。用水将水溶液稀释至 350ml， 并在强烈搅拌下用 6N 盐酸将 pH 调节至 1-2。抽滤出沉淀产物并用水洗两次。在 40℃减压干燥后， 测得产量 13.67g。HPLC 纯度为 99.8 面积％。
c.2， 5- 二氧吡咯烷 -1- 基 (S)-3-(3， 5- 二硝基苯甲酰氨基 )-3- 苯丙酸酯 (3-(3， 5- 二硝基苯甲酰基 )-(S)-β- 苯丙氨酸 2， 5- 二氧吡咯烷 -1- 基酯 )
将 12g 来自反应 b) 的 (S)-3-(3， 5- 二硝基苯甲酰氨基 )-3- 苯丙酸溶解于 120ml 四氢呋喃中并与 3.92g N- 羟基 - 琥珀酰亚胺混合。在 0-5℃冰浴中冷却， 往反应混合物中 分批加入 7.1g 二环己基碳化二亚胺。加入结束后， 将混合物置于冰浴中并进一步搅拌直到 溶液达到室温。反应结束后 (HPLC 检测＞ 95 面积％的转化率 )， 将沉淀的二环己基脲过滤 并用四氢呋喃洗澡。减压下浓缩滤液， 并将残余物消化在 250ml 2- 丙醇中回流 2h。抽滤出 产物， 用 2- 丙醇洗涤并在 50℃减压干燥。产量为 13.87g ； HPLC 纯度 98.8 面积％ d. 转化成 (S)-3-[(S)-3-(3， 5- 二硝基苯甲酰氨基 )-3- 苯丙酰胺 ]-3- 苯丙酸 (3-(3， 5- 二硝基苯甲酰基 )-(S)-β- 苯丙氨酰基 -(S)-β- 苯丙氨酸 )
将 5.65g(S)-3- 氨基 -3- 苯丙酸悬浮在 70ml 水中， 通过加入氢氧化钠溶液将悬浮 液的 pH 调节至 10.5-11， 并加入 70ml 四氢呋喃。在冰浴下将混合物冷却至 0-5℃并在搅 拌下 15 分钟内分批加入 13g(S)-3-(3， 5- 二硝基苯甲酰氨基 )-3- 苯丙酸 2， 5- 二氧吡咯 烷 -1- 酯。加入结束后， 通过加入氢氧化钠溶液将反应混合物的 pH 保持在 9-9.5。在达到 恒定的 pH 具有基本上完全的转化率时 (HPLC 检测 ； ＜ 0.5 面积％的反应物 )， 用水将溶液稀 释至 800ml 的体积， 通过加入 4N 的盐酸使得 pH 为 1.5-2 并进一步搅拌混合物 30 分钟。抽 滤出固体， 用水洗并在 50℃下减压干燥。将干燥的固体在 40℃下在 250ml 四氢呋喃中消化 20 分钟， 冷却悬浮液并抽滤出固体 ( 产物部分 1)。在 40℃水浴下将母液浓缩至约 70-80ml 的体积， 将得到的悬浮液冷却至室温， 并抽滤出固体 ( 产物部分 2)。 合并上述产物部分并在 1 50 ℃减压干燥。产量为 11.1g ； HPLC 纯度＞ 99.5 面积％ ； H NMR(DMSO)δ(ppm) ： 2.64(d， 2H)， 2.77(m， 2H)， 5.15(m， 1H)， 5.52(m， 1H)， 7.10-7.20(m， 5H)， 7.25(t， 1H)， 7.31(t， 2H)， 7.39(d， 2H)， 8.44(d， 1H)， 8.95(m， 1H)， 9.01(m， 2H)， 9.53(d， 1H)， 12.17(s， 1H， CO2H)。
(2)(S)-3-[(S)-3-(3， 5- 二硝基苯甲酰氨基 )-3- 苯丙酰胺 ]-3- 苯丙酸共价连接 至氨丙基功能化的硅胶相 ( 氨基相 )
将 5g 氨基相 (YMC- 凝胶氨基 NH12SO5， 粒径 5μm) 悬浮在 4.7g(S)-3-[(S)-3-(3， 5- 二硝基苯甲酰氨基 )-3- 苯丙酰胺 ]-3- 苯丙酸于 1L 四氢呋喃的溶液中， 并在搅拌下将 反应混合物与 4g N- 乙氧羰基 -2- 乙氧基 -1， 2- 二氢喹啉 (EEDQ) 混合。室温下 24h 后， 将相材料滤出， 分别用 100ml 甲醇和乙醚洗涤然后干燥。元素分析 ： 12.44％ C， 1.36％ H 和
2.76％ N ； 相当于 0.312mmol/g 的覆盖率。
通过平衡 - 密度法在 300bar 下填充 250x 5mm 的 HPLC 柱 ( 参见 Meyer， Praxis der Hochdruckflüssigkeitschromatographie， Wiley-VCH ： Weinheim2004)。
应用实施例 2
实施例 2 制备的分离柱也适用于在 HPLC 条件的多种 β- 氨基酸或 β- 氨基酸衍 生物 - 在某些情况下， 与单体相比具有更高的选择性。这是由于通过二肽选择物对不同的 分析物具有更强的手性识别。
表 3 总结了结果。图 2 表示使用实施例 2 的分离柱时不同 β- 氨基酸衍生物的光 学异构体的色谱分离度。
表3
流动相 A ： 异己烷 /2- 丙醇 / 三氟乙酸 (900+100+1， v/v/v)流动相 B ： 乙腈 / 水 / 乙酸 (700+300+1， v/v/v)
流动相 C ： 异己烷 / 乙醇 / 三氟乙酸 (750+250+1， v/v/v)
* 其他 ： 流速 1ml/min， 温度 30℃。
实施例 3
具有含有 (3S)-3-(2-(R， S)- 羟基十二烷基氨基 -3- 苯丙酸的 RP 载体材料的动态 涂层的手性固定相的制备
(1)(3S)-3-(2-(R， S)- 羟基十二烷基氨基 -3- 苯丙酸的制备
将 27.01g 甲醇钠和 82.6g(S)-3- 氨基 -3- 苯丙酸溶解在 800ml 甲醇中。加入 92g 1， 2- 环氧十二烷后， 将溶液在室温下搅拌 20h。 随后， 用甲醇盐酸将溶液的 pH 调节至 pH 6， 并滤去结晶出来的氯化钠。蒸馏出甲醇后， 残留油状残余物， 其在与 700ml 丙酮搅拌的过 1 程中结晶。这生成 153.4g 无色结晶。 H NMR(DMSO)δ(ppm) ： 0.85(t， 3H)， 1.13-1.31(m， 18H)， 2.28/2.60/2.70/2.86(m， 2H)， 3.02(m， 1H)， 3.34(m， 1H)， 3.66-3.78(m， 1H)， 4.57(m， + 1H)， 5.20/5.29(s， br.， 1H， OH)， 7.42(m， 3H)， 7.60(m， 2H)， 9.40(s， br.， 2H， NH2 )， 12.56(s， 1H， CO2H)
(2)RP18 载体材料的动态涂层
将 1g(3S)-3-(2-(R， S)- 羟基十二烷基氨基 -3- 苯丙酸溶解在 50ml 甲醇 ( 选 择物溶液 ) 中， 并且用甲醇清洗将要被覆盖的固定相 (Kromasil C18， 柱长 250mm， 内柱径 4.6mm)。随后， 在 1ml/min 的流速循环下将选择物溶液泵送经过柱 3h。在 4ml/min 流速下 甲醇清洗步骤之后， 在室温下和 1ml/min 流速下将饱和的醋酸铜 (II) 甲醇溶液泵送经过所 述柱约 30 分钟。据此， 已经制备完成用于色谱用途的分离柱。
应用实施例 3
实施例 3 修饰的分离柱适于在配体交换模式下多种 β- 氨基酸及其衍生物， 以及 α- 氨基酸和 α- 羟基酸的对映体分离。
表 4 总结了结果。图 3 表示使用实施例 2 的分离柱时不同 β- 氨基酸的光学异构 体的色谱分离度。
表4
流动相 ： 0.1mM 醋酸铜 (II) 溶液 / 甲醇 (900+100， v/v)， 流速 ： 1ml/min， 温度 ： 30℃。