抗人非何杰金淋巴瘤嵌合抗体及其衍生物与应用 【技术领域】
本发明涉及一种抗人非何杰金淋巴瘤嵌合抗体及其衍生物与应用，特别涉及一种特异于CD22的嵌合抗体及其衍生物和以它们为活性成分的药物。
背景技术
非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)是一组多相(heterogeneous)的淋巴组织肿瘤。在美国，有百分之六到八的癌症被诊断为NHL，每年约有5.5万新病例。根据美国癌病协会(The American Cancer Society)估计，NHL男性发病率略高于女性，每年约有2.6万人死于此病(Cancer Statistics，CA：Cancer J.forClinicians，Jan/Feb 2000，Vol.50，No.1)。虽然现存很多有效的化疗药物可治疗NHL，但NHL仍然是美国第五大杀手。最常用的治疗方法包括高剂量化疗，放射治疗，及自我骨髓移植等。但这些疗法都未能使大部分患者获得较为持久的疾病缓解。
一般来说，被确诊患上轻度滤泡(low grade follicular)NHL的患者，平均存活时间大概有五到七年(Dana et al.1990.J.Clin.Oncol.8：1155-1162)。但是，除了I期还未扩散(Stage I localized)的淋巴瘤患者外，对大部分患者来说，常规的化疗手段并不能达到治愈的目的。多项研究指出，不同常规化疗方法和手段未能延长滤泡淋巴瘤患者地寿命(Klimo et al.1987.Semin.Hemat.24：26-34；Fisheret al.1993.N.Eng.J.Med.328：1002-1006；Longo et al.1991.J.Clin.Oncol.9：25-38)。
也有报告指出，用多种不同化疗组合的手段治疗患有广泛扩散NHL的患者具有60-80％的初步完全反应(initial complete response)(Dana et al.1990.J.Clin.Oncol.8：1155-1162；Klimo et al.1987.Semin.Hemat.24：26-34； Fisher et al.1993.N.Eng.J.Med.328：1002-1006)。尽管如此，但仍有20-40％的患者未能获得初步完全反应，而获得初步完全反应患者中有20-40％会复发。这些复发的患者仍可用传统抢救性的化疗方法(conventional salvage chemotherapy)医治，其中30-40％这类患者会达到初步完全反应；但大部分有第二次反应的患者会于短期内复发(Velasquez et al.1988.Blood 71：117-122；Cabanillas et al.1982.Blood60：693-697；Cabanillas et al.1987.J.Clin.Oncol.5：407-412)。
通过高剂量化疗(high-dose chemotherapy)，再加上自体骨髓移植(autologousbone marrow transplantation)或外围干细胞移植(ABMT/PSCT)，能使25-40％的复发或高危NHL患者达到长期免于病态的存活状态(Velasquez et al.1988.Blood71：117-122；Cabanillas et al.1982.Blood 60：693-697；Cabanillas et al.1987.J.Clin.Oncol.5：407-412)。但余下的60-75％的上述患者在接受过高剂量化疗及ABMT/PSCT治疗后还会复发。对尝试过传统抢救性的化疗方法及/或高剂量化疗及ABMT/PSCT但却无效的复发性NHL患者来说，极其缺乏崭新有效的治疗方法。
单克隆抗体的出现，提供了另一种治疗手段。自Milstein & Kohler在1975年发明了杂交瘤技术，单克隆抗体在临床诊断，治疗和预防方面的运用价值和开发前景已获得普遍的肯定。例如，单克隆抗体-放射性偶联物被用作治疗T细胞淋巴瘤(Rosenet al.1989.Nucl.Med.Biol.16：667-668)，恶性黑色素肉瘤(Larson et al.1983.J.Clin.Invest.72：2102-2114)，卵巢癌(Epenetos et al.1987.J.Clin.Oncol.5：1890-1899)，和何杰金病(Lenhard et al.1985.J.Clin.Oncol.3：1296-1300)。但是，单克隆抗体的临床应用，主要问题在于大部分的单克隆抗体都是来自小鼠的B细胞杂交瘤。这些鼠源的抗体不单会在人体内引发“人抗小鼠抗体”免疫反应(HAMA)，而且，也缺乏能引导人体自身免疫功能如以补体为媒介的细胞毒作用(CMC)或抗体依赖性细胞介导的细胞 毒作用(ADCC)等。直至二十世纪九十年代中期，美国药品监督管理局(FDA)才第一次批准一种治疗性的单克隆抗体，为NHL患者带来新的希望。1997年获准在美国上市的“利妥昔”(Rituxan)，是一个嵌合单克隆抗体(chimericantibody)，也是有史以来第一个被获准以裸抗体的形式治疗癌症的抗体，其特异标靶为CD20抗原。CD20抗原只在正常B细胞及恶性B细胞表面上找到。利妥昔用于治疗复发或对传统治疗失去反应的轻度(low grade)NHL最为有效。标准治疗NHL的方法对轻度NHL，复发性的中级别(intermediate)及高级别(high-grade)淋巴瘤并没有治愈的功效(Czuczman et al.1992.Contemporary Oncology，Septemberp.45-52)。约有80％的NHL是B细胞肿瘤，而超过95％的这类B癌细胞表面都表达区别性的CD20抗原。CD20抗原只在成熟的B细胞表面表达；大/小前B细胞，早/晚期组B细胞，造血的干细胞，一般的浆细胞，或非淋巴的正常组织等都不会表达CD20。所以，在免疫治疗的范畴里，CD20是一个非常吸引研究者注意的靶点。而且，CD20抗原并不会从细胞表面脱落，也不会与抗体结合后而调节其表达量。在适当的条件下，试管实验证明，利妥昔可以诱发ADCC，CDC等功能效应(Reff et al.1994.Blood83：435-445)。另外，利妥昔在试管实验里对B淋巴细胞株有生长抑止的作用，也可将已对化疗药产生抵抗力的癌细胞变得对化疗药，如白喉毒素，蓖麻毒素，順式铂氨(cisplatinum)，盐酸阿霉素(doxorubicin)，和依托泊甘(etoposide)等，更为敏感，及引起剂量反应(dose-response)的细胞凋亡作用(Demidem et al.1997.Cancer Biother.Radiopharmacol.12：177-185)。
虽然利妥昔被广泛证实对非何杰金淋巴瘤有效，但大部分的患者最终都会复发。其中一部分复发的患者对利妥昔已失去反应。而且，并不是每一个患有非何杰金淋巴瘤的患者都对利妥昔有反应。对这些不幸的患者来说，他们急需一种象利妥昔般有效和同样安全的另一种抗体的出现。其实，除了抗CD20抗体外，还有很多能针对不同特性而又特异于B细胞的抗体。就以抗CD22的抗体为例，这些抗体除了与正常B细胞有特异结合外，与其它正常组织并没有交叉反应。由于B细胞在人体内急速地更新代谢，而B细胞的特异抗体并不影响始祖干细胞，所以这些抗体在人体内的毒性只会是短暂并是过渡性质的，不会构成临床的问题(Stein et al.1993.Cancer Immunol.Immunother.37：1293-298)。
CD22抗原可在所有的B细胞内找到，包括前B细胞和祖B细胞(Dorkin et al.1989.In：Leukocyte Typing IV：White Cell Differentiation Antigens，Knapp etal.，Eds.P.63-64.Oxford University Press，New York，New York)。但CD22的表面表达，只有在不同分阶段的成熟B细胞的表面上找到。CD22对调节B细胞因抗原而引起的反应起着一定的作用(Tedder et al.1997.Annu.Rev.Immunol.15：481；Law et al.1994.Immunol.Today 15：442)。Sherbina等(Sherbina et al.1996.J.Immunol.157：4390-4398)证明了当B细胞抗原受体感应到刺激，细胞体内的CD22会急速的从细胞质移动至质膜处，从而使其在细胞受到刺激后5分钟内表面表达增长50-100％。而且，表面表达的CD22也不断地以t1/2小于一小时的速度急速的内化(Shanet al.1995.J.Immunol.154：4466)。与CD22在细胞表面结合的抗体也会以同样的速度被带进细胞体内(Shan et al.1995.J.Immunol.154：4466；Shih et al.1994.Int.J.Cancer 56：538；Leung et al.1995.Mol.Immunol.32：1413)。而抗NHL的鼠源母抗体对恶性B细胞的亲合力(avidity)比正常的B细胞明显要大。
科学界对治疗癌症有效的非偶联抗体(裸抗体)的作用机理并不清楚。一般来说，建议的作用机理是：(1)细胞凋亡(apoptosis)；(2)细胞生长抑制效果(growtharrest)；(3)抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)；(4)补体介导的细胞毒作用(CDC)等。由于缺乏一个合理的人NHL的动物模型，要证明或找出抗CD22抗体治疗淋巴瘤的作用机理非常困难。
抗CD22的人源化抗体hLL2(epratuzumab)曾在临床I，II期实验中应用，以治疗NHL患者。用法是以裸抗体的形式，用类似利托昔的方法用药(一星期一次，以静脉输液的方法用药，共四星期)，疗效非常显著。约有一半的患者对药物有客观疗效反应(objective response)，而其中一半有反应的患者病情都获得完全缓解(complete remission)(Leonard et al.2000.Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.19：17a；Leonard et al.2000.Blood 96：578a；Leonard et al.2002.Semin Oncol 29：81-86；Press et al.2001.Hematology 221-240)。值得注意的是，这种抗CD22的人源化抗体用于人体非常安全。在美国纽约的New York Weil Cornell Medical Center所进行的临床I/II期实验，患者被输液120-1000毫克/平方米/星期，共四次，基本上毒性反应都是与输液的过程而非与药物有关，而且只属Grade I毒性。症状包括发热，发冷，和低血压等。跟利妥昔一样，其作用机理到现在还未能被证实。
抗NHL的鼠源抗体(Campana et al.1985.J.Immunol.134：1524-1530)，曾被广泛应用作为免疫毒素，并取得一定程度的抗NHL及毛细胞白血病(hairy cellleukemia)临床前和临床疗效(Amlot et al.1993.Blood 82：2624-2633；Sausvilleet al.1995.Blood 85：3457-3465；Mansfield et al.1996.Bioconjugate Chem.7：557-563；Mansfield et al.1997.Blood 90：2020-2026)。由于免疫毒素内毒素部分都是从细菌或非人源的生物提取，本身的免疫原性非常高，在这种情况下，无论抗体部分是否人源化或嵌合化，对免疫毒素的整体免疫原性影响不大。所以，从来没有将抗NHL的鼠源母抗体嵌合化或人源化的尝试或报道。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种能保持原来的特异性与亲和力，低免疫原性的抗人非何杰金淋巴瘤嵌合抗体及其衍生物。
本发明提供的抗人非何杰金淋巴瘤嵌合抗体是特异于CD22的嵌合抗体SM03，其人源恆定区为同种型(isotype)人IGg1/人Kappa。其轻链(VK)及重链(VH)可变区氨基酸序列(variable region sequences)衍生于鼠源母抗体可变区氨基酸序列，如图1所示，其中鼠源母抗体的轻链可变区为SEQ ID №：1；鼠源母抗体的重链可变区为SEQ ID №：2；图中，框内的序列为CDR；所述SM03的轻链为序列表中SEQ ID №：7的氨基酸残基序列；所述SM03的重链为序列表中SEQ ID №：8的氨基酸残基序列。
所述SM03的轻链(VK)及重链(VH)可变区氨基酸序列(variable regionsequences)包括了在N-端及/或C-端引入与鼠源母抗体不同的人源抗体氨基酸残基，如图2所示，其中嵌合抗体SM03的轻链可变区为SEQ ID №：3；嵌合抗体SM03的重链可变区为SEQ ID №：4；划线部分的氨基酸残基是与鼠源母抗体可变区序列不同的序列，框内的序列为CDR。所述SM03的轻链为序列表中SEQ ID №：9的氨基酸残基序列；所述SM03的重链为序列表中SEQ ID №：10的氨基酸残基序列。
本发明所提供的嵌合抗体SM03的衍生物为SM03片段(Fab，Fab’，F(ab’)2，等)、单链抗体(scFv，diabodies)、抗体/抗体片段-因子(如，抗体/抗体片段-白细胞介素，抗体/抗体片段-干扰素，抗体/抗体片段-毒素)融合蛋白、抗体/抗体片段-化学偶联物(如，抗体/抗体片段-化学毒药，抗体/抗体片段-放射核素)等。
所述化学毒药为阿霉素(doxorubicin)，irinotecan，顺式铂氨(cisplatin)，等；所述放射核素为I125，I131，Y90，In111，Re188等。
本发明的另一个目的是提供一种构建嵌合抗体SM03表达载体的方法。
本发明所提供的构建嵌合抗体SM03表达载体的方法是将SM03的轻链及重链可变区的DNA序列连接到各自相应的人源轻链与重链表达载体的恆定区，得到嵌合抗体SM03的轻链和重链表达载体。具体的说，它可以包括以下步骤：
(1)克隆SM03的VK与VH的DNA序列；
(2)将克隆后的SM03的VK与VH的DNA序列插入阶段载体；
(3)将阶段载体中的VK与VH的DNA序列分别插入各自相应的人源轻链(CK)与重链(IgG1)表达载体的恆定区，得到SM03的轻链和重链表达载体。
所述阶段载体为VKpSTAGE和VHpSTAGE。
所述轻链和重链表达载体分别为SM03pEkappa和SM03 pEgamma1。
本发明的第三个目的是提供一种有效治疗与CD22表达有关疾病的药物，该药物源自母免疫球蛋白的免疫原性较低。
本发明所提供的治疗与CD22表达有关疾病的药物，它的活性成分是嵌合抗体SM03或其衍生物。
本发明提供的药物为嵌合抗体SM03的裸抗体，也可以是嵌合抗体SM03的抗体偶联物，可以注射的方式用于人体。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。
本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
上述药物的用量一般为100-400mg/m2(注射)，疗程为四星期，每星期用药一次。
由于嵌合抗体SM03也是抗CD22(B表位)的抗体，跟epratuzumab一样，也是人IgG1/kappa同种型，而且其鼠源母抗体已广泛地以免疫毒素的形式进行临床前及临床测试，证明了它只特异地与成熟B细胞或B癌细胞结合。以裸抗体，或与偶联物(如放射核素，毒素等)结合的方式应用于NHL患者身上，尤其对于那些对抗CD20抗体如利托昔等失去疗效反应的患者，是安全有效的治疗方法。
嵌合抗体SM03除了可以用裸抗体的形式作为治疗药物，其衍生物还可用于治疗不同的与CD22表达有关疾病(如，NHL，类风湿关节炎，红斑狼疮，及其它的自身免疫病等)。
本发明的发明人根据其鼠源母抗体可变区内的序列，用基因合成的方法，将VL与VH的DNA序列连接到各自相应的人源轻链(CK)与重链(IgG1)恆定区。带有嵌合抗体SM03的轻链(VK-CK)和重链(VH-CH1-hinge-CH2-CH3)的载体通过电穿孔法(electroporation)转染到SP2/0骨髓瘤细胞(myeloma cell line)及表达后，分离出的嵌合抗体有2/3的氨基酸序列是人源的IgG1/k同种型(isotype)。类似的IgG1/k同种型嵌合抗体，如利妥昔(rituximab)(IDEC/Genentech，CA，USA)，Reopro(Centocor，PA，USA)，Remicade(Centocor，PA，USA)，Simulect(Novartis，NJ，USA)等，已被广泛应用，并证实了其安全性和极少副作用。所以，嵌合抗体SM03的免疫原性极低。其中的IgG1人源Fc段，亦会加强抗体引发的免疫疗效。纯化后的嵌合抗体SM03经实验证明具有跟其鼠源母抗体一样的特异性和亲和力。
带有人源恆定区的嵌合抗体SM03具有生物效应活性如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，或补体介导的细胞毒作用(CMC)等。
嵌合单克隆抗体SM03可识别CD22抗原并与其作特异性之结合。嵌合单克隆抗体SM03与B细胞有特异性的结合，因而提供了一个对B细胞NHL有医疗潜力的工具/手段。
以本发明的免疫球蛋白为活性成分的药物可以在治疗患有CD22高度表达量的癌症或免疫系统疾病引起的风湿性关节炎等疾病中得到广泛应用。
【附图说明】
图1为嵌合抗体SM03鼠源母抗体的VK与VH的氨基酸序列
图2为嵌合抗体SM03的VK与VH的氨基酸序列
图3为嵌合抗体SM03的VK与VH的DNA序列
图4A为可变区序列未经修改的嵌合抗体SM03人Kappa恆定区嵌合轻链(VK-CK)免疫球蛋白的氨基酸序列
图4B为可变区序列未经修改的嵌合抗体SM03人IgG1重链(VH-CH1-hinge-CH2-CH3)免疫球蛋白的氨基酸序列
图5A为可变区序列经修饰后的嵌合抗体SM03人Kappa恆定区嵌合轻链(VK-CK)免疫球蛋白的氨基酸序列
图5B为可变区序列经修饰后的嵌合抗体SM03人IgG1重链(VH-CH1-hinge-CH2-CH3)免疫球蛋白的氨基酸序列
图6A为VK阶段载体的物理图谱
图6B为VH阶段载体的物理图谱
图7A为轻链表达载体的物理图谱
图7B为重链表达载体的物理图谱
图8为典型的3公升Celligen生物反应器生产数据图表
图9为表达并纯化后的抗体的SDS-PAGE分析
图10为嵌合抗体SM03的流式细胞术(flow cytometry)分析
图11为嵌合抗体SM03与鼠源抗体的竞争性流式细胞术分析
图12A为嵌合抗体SM03在玻管实验诱发的细胞毒性作用
图12B为嵌合抗体SM03在玻管实验诱发的细胞滞生作用
图13为克隆后的嵌合抗体SM03的鼠源母抗体VK与VH的DNA序列
【具体实施方式】
实施例1、克隆嵌合抗体SM03的鼠源母抗体的VK与VH的DNA序列
嵌合抗体SM03的鼠源母抗体的制造方法是先在Balb/c小鼠腹腔注射5×106人扁桃体淋巴细胞。八天之后，追加5×106人扁桃体淋巴细胞的静脉注射。四天后，小鼠的脾细胞与P3-NSI/1-Ag4-1骨髓瘤细胞融合。其后按照传统杂交瘤技术，找到一株细胞株，其分泌的嵌合抗体SM03的鼠源母抗体经过冰冻切片筛选，证实只与B淋巴细胞有反应性，与其它的正常组织如肾等并没有反应性(Campana D，Janossy G，Bofill M，et al.1985.J.Immunol.134：1524-1530)。利用Track mRNA IsolationKit(Invitrogen，San Diego，CA)，从3×107杂交瘤细胞分离出PolyA+ RNA，再用cDNA cycle kit(Invitrogen)提取cDNA。简单的说，1微克的polyA+ RNA配合一个特异鼠免疫球蛋白重链IgG的CH1部分的引物CH1B(5’-ACA GTC ACT GAG CTG G-3’)，或是一个特异鼠免疫球蛋白轻链Ck部分的引物Ck3BH1(5’-GCC GGA TCC TCA CTG GATGGT GGG AAG ATG GAT ACA-3’)用逆转录酶(Reverse Transcriptase)将相关的轻重链第一链(first-stranded)cDNA提取出来，然后再用常规RACE加PCR的方法分别以polyG oligos+Ck3BH1或polyG oligos+CH1B将相关的轻重链双链(double-stranded)cDNA扩增提取出来。扩增后的VH和VK DNA片段按照常规方法被克隆到TA Cloning Vector(Invitrogen)载体内。克隆后的DNA片段用Sanger的方法去解码VK与VH的DNA序列，克隆后的VK与VH的DNA序列如图13所示，图中，划线部分为限制酶切位点，其中克隆后的轻链可变区DNA序列为SEQ ID №：11；重链可变区DNA序列为SEQ ID №：12。
实施例2、VK与VH阶段载体(Staging Vector)的构建
要表达嵌合抗体SM03，其鼠源母抗体编码的VK和VH段DNA必先插入到植有人类轻链和重链区域编码DNA的表达载体中。为此，先将VK或VH段DNA插入适当的阶段载体。合成后的阶段载体在VK或VH段DNA的上游接上一个IgG的表达启动子(Promoter)，及一段信号肽(Signal Peptide)序列。
VK阶段载体来自于改良的M13VKPCR1(Orlandi et al.1989.PNAS86：3833-3837)。将其中载有IgG表达启动子(Promoter)序列和一段信号肽(SignalPeptide)序列的BamH1/HindIII段克隆到pBR322(ΔPvuII)载体内。pBR322(ΔPvuII)原为一pBR322载体(Strategene，La Jolla，CA，USA)，用限制酶Acc1/Bal1把载体中唯一的PvuII酶切点删除后，便成pBR322(ΔPvuII)载体。含有M13VKPCR1中的BamH1/HindIII段的pBR322(ΔPvuII)为VK阶段载体(VKpSTAGE)，其结构示意图如图6A所示。嵌合抗体SM03的鼠源母抗体的VK段连接到相应的表达启动子/信号肽序列上是通过以下步骤完成的：(1)以嵌合抗体SM03的鼠源母抗体的VK DNA序列为模板，以5’-GAC ATC CAG CTG ACC CAG ACT ACA TCC-3’及5’TTA GAT CTC CAGCTT GGT GCC TCC-3’为引物，通过标准的PCR方法，引入了一个PvuII和一个BglII限制酶切点，(2)用PvuII/BglII酶切嵌合抗体SM03的鼠源母抗体的VK基因的PCR产物，(3)将PvuII/BglII酶切过的嵌合抗体SM03的鼠源母抗体的VK基因的PCR产物克隆到VKpSTAGE相应的位置上。经过Sanger的方法证明克隆到VKpSTAGE的嵌合抗体SM03 PCR产物序列跟原来设计的一样，结果如图3所示，图中，粗体碱基表示与原来鼠源母抗体不同的DNA序列，划线的碱基为酶切位点。表达后的嵌合抗体在VK段中的N-端及C-端的氨基酸序列(如图5A)与原来鼠源的VK段(如图4A)有差异，图5A中，粗体氨基酸残基表示修饰后的氨基酸残基。
VH阶段载体是改良自M13VHPCR1(Orlandi et al.1989.PNAS 86：3833-3837)。将其中载有IgG表达启动子(Promoter)序列和一段信号肽(Signal Peptide)序列的BamH1/HindIII段克隆到pBS载体(Stratagene)内，得到VH阶段载体(VHpSTAGE)，其结构示意图如图6B所示。SM03抗体的鼠源母抗体的VK段连接到相应的表达启动子/信号肽序列上是通过以下步骤完成的：(1)以嵌合抗体SM03的鼠源母抗体的VH DNA序列为模板，以5’-CAG GTC CAA CTG CAG GAG TCT GGG GGA GGC-3’及5’-TGA GGAGAC GGT GAC CAG AGT CCC TTG GCC CCA GTA-3’为引物，通过标准的PCR方法，引入了一个PstI和一个BstEII限制切点，(2)用PstI/BstEII酶切嵌合抗体的SM03鼠源母抗体的VK基因的PCR产物，(3)将PvuII/BglII酶切过的嵌合抗体的SM03鼠源母抗体的VK基因的PCR产物克隆到VHpSTAGE相应的位置上。经过Sanger的方法证明克隆到VHpSTAGE的嵌合抗体SM03 PCR产物序列跟原来设计的一样，结果如图3所示。表达后的嵌合抗体在VH段中的N-端及C-端的氨基酸序列(如图5B)与原来鼠源的VH段(如图4B)有差异，图5B中，粗体氨基酸残基表示修饰后的氨基酸残基。
实施例3、嵌合抗体SM03表达载体的构建
嵌合抗体SM03的轻链表达载体pEkappa是一个约10kb的表达载体。它包含了一个上游的IgG增强子(Enhancer)，一个用来插入VK段的HindIII/BamH1克隆位点，和连着内含子(intron)的人Kappa轻链恆定区的基因序列(genomic sequence)。在轻链恆定区基因序列的下游，放置了一个用SV40启动子表达的hygromycin选择标记(selection marker)，其结构如图7A所示。从SM03VKpSTAGE用HindIII/BamH1限制性内切核酸酶把IgG启动子/信号肽/SM03 VK序列提取出来，再插入pEkappa的HindIII/BamH1克隆位点，便成为嵌合抗体SM03轻链表达载体(SM03pEkappa)(如图7A)。
重链表达载体pEgamma1是一个约10kb的表达载体。它包含了一个上游的IgG增强子(Enhancer)，一个用来插入VH段的HindIII/BamH1克隆位点，和连着内含子(intron)的人IgG1重链恆定区的基因序列(genomic sequence)。在重链恆定区基因序列的下游，插入了一个用SV40启动子表达的gpt选择标记(selection marker)，其结构如图7B所示。从SM03VHpSTAGE用HindIII/BamH1限制性内切核酸酶把IgG启动子/信号肽/SM03 VH序列提取出来，再插入pEgamma1的HindIII/BamH1克隆位点，便成为SM03重链表达载体(SM03 pEgamma1)(如图7B)。
实施例4、嵌合抗体SM03表达细胞的制备及其生产
约10微克被BstXI限制性内切核酸酶线化(linearized)的SM03pEkappa，加上约30微克被PvuI限制性内切核酸酶线化的SM03 pEgamma1，用电穿孔法(electroporation)去转染5×106SP2/0细胞。转染后的细胞，在正常培养液中经过两天的复原期，便开始在培养液中加上0.5g/L的hygromycin(Calbiochem，SanDiego，CA)。受转染而存活的细胞株会于2-3星期后出现。存活的细胞株被分别培养，扩大后，可用酶联免疫吸附试验(ELISA)法去检测培养液中的人源重链Fc段的浓度。阳性结果而Fc浓度最高的三株克隆细胞会被扩增，储存。阳性细胞经过约500毫升的自杀性组培后，可用Protein A层析柱将培养液中的人源化抗体提纯。细胞株的抗体生产量是按照“可提纯抗体量÷用于提纯的培养液的总体积的方式计算”(以下抗体生产量的计算方法均以此为标准)。选择最高生产量，最稳定，生长速率最快的SM03生产细胞株用作生物反应器的生产。采用New Brunswick Scientific的三公升Celligen发酵罐。约2×109的SM03生产细胞株接入发酵罐作为种子培养(seedculture)。严密检测细胞生长情况，如氧气消耗量，pH值，葡萄糖消耗量，抗体浓度等。当培养液里的葡萄糖含量低于1克/升，新鲜的培养液便以灌流的方式输入发酵罐，等量的旧培养液亦会以灌流的方式同时输出。由于Celligen发酵罐是利用纤维小薄片(fiber disc)去锁住细胞，细胞不会随灌流输出的旧培养液大量流失。灌流率的快慢视培养液里的葡萄糖含量而定。目标是要保持培养液里的葡萄糖含量在1克/升左右。图8表示一个标准发酵的抗体生产量。培养好的培养液会以Protein A层析柱的方法提纯。提纯后的抗体用SDS-PAGE电泳法质控，电泳结果如图9所示，图中，泳道1为重量标记，泳道2为人源抗体标准对照，泳道3为SM03试产第一批，泳道4为SM03试产第二批，从图中可以看出，抗体的纯度很高。
实施例5、用流式细胞仪(flow cytometry)分析SM03的稳定性
为保证不同生产批量的SM03仍保持其特异性(specificity)和亲和力(affinity)，将四批不同生产及储存时间(最长一年，最短两星期)的纯化SM03用流式细胞术分析，测试其与Raji人淋巴瘤细胞的特异结合。结果如图10所示，表明四批SM03与Raji人淋巴瘤细胞结合后所产生的荧光强度一致，说明不同生产及储存时间都不会影响SM03的特异性和亲和力。
实施例6、SM03与鼠源母抗体亲和力的比较
本实施例用竞争性流式细胞术去分析比较鼠源母抗体与SM03的亲和力。作法是用固定浓度的FITC-鼠源母抗体偶联物，跟不同浓度的竞争抗体(鼠VS SM03试产第一批抗体)混合后，再与Raji细胞反应。然后，用荧光活化细胞分类扫描器(FACScan)分析在竞争抗体影响下，还有多少残留的FITC-鼠源母抗体能与Raji细胞结合。结果如图11所示，表明鼠源母抗体跟嵌合抗体SM03作为竞争抗体有相近的亲和力，嵌合化后的抗体SM03特异性与亲和力并未因嵌合化的过程中改动V段小量的氨基酸序列(图5A和图5B中的粗体氨基酸残基)而减弱。虽然，嵌合抗体SM03的竞争力看似略高于鼠源母抗体，其分别甚为轻微，在正常实验误差之内，可能源于抗体浓度评估的细微分别。总的来说，嵌合抗体的SM03亲和力并不低于，或基本相同于鼠源母抗体。
实施例7、SM03在玻管实验诱发的细胞毒性/细胞滞生作用(cytostatic effect)
在粘附有SM03或粘附有不相关的对照人源化抗体的96-孔板(96-well plate)内，加入4×105Raji细胞培养，再在不同时段用Trypan Blue色素评估坏死细胞与健康细胞的比率。结果如图12A所示，表明嵌合抗体SM03能诱导细胞毒性，尤以孵化24小时后，细胞的死亡率达百分之三十。同样地，在黏附有嵌合抗体SM03或黏附有不相关的对照人源化抗体的96-孔板(96-well plate)内，加入1×105Ramos人淋巴癌细胞培养，再在不同时段评估细胞的总数量。结果如图12B所示，表明嵌合抗体SM03能抑止细胞生长。
序列表
<160>12
<210>1
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser
20 25 30
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ile Leu His Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
80 85 90
Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
95 100 105
Ile Lys
107
<210>2
<211>123
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser
20 25 30
Ile Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Trp Pro Glu Lys Arg Leu
35 40 45
Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr
50 55 60
Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ser Gly Tyr Gly Ser Ser
95 100 105
Tyr Gly Val Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
110 115 120
Val Ser Ala
123
<210>3
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser
20 25 30
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ile Leu His Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
80 85 90
Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
95 100 105
Ile Lys
107
<210>4
<211>123
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser
20 25 30
Ile Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Trp Pro Glu Lys Arg Leu
35 40 45
Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr
50 55 60
Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ser Gly Tyr Gly Ser Ser
95 100 105
Tyr Gly Val Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
110 115 120
Val Ser Ser
123
<210>5
<211>321
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
gacatccagc tgacccagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
attagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaatat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagattttg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggagatcaa a 321
<210>6
<211>369
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
caggtccaac tgcaggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cgctttcagt atctatgaca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcatac attagtagtg gtggtggtac cacctactat 180
ccagacactg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagacatagt 300
ggctacggta gtagctacgg ggttttgttt gcttactggg gccaagggac tctggtcacc 360
gtctcctca 369
<210>7
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser
20 25 30
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ile Leu His Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
80 85 90
Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
95 100 105
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
110 115 120
Ser Asp Glu Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
125 130 135
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
140 145 150
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Gln Gln
155 160 165
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
170 175 180
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val
185 190 195
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
200 205 210
Gly Glu Cys
213
<210>8
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser
20 25 30
Ile Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Trp Pro Glu Lys Arg Leu
35 40 45
Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr
50 55 60
Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ser Gly Tyr Gly Ser Ser
95 100 105
Tyr Gly Val Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
110 115 120
Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
125 130 135
Pro Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
140 145 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
155 160 165
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
170 175 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
185 180 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
200 205 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys
215 220 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305 310 315
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
320 325 330
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
335 340 345
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
350 355 360
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
365 370 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
380 385 390
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
395 400 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
410 415 420
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
425 430 435
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
440 445 450
Gly Lys
452
<210>9
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>9
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser
20 25 30
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ile Leu His Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
80 85 90
Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
95 100 105
Ile Lys-Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
110 115 120
Ser Asp Glu Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
125 130 135
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
140 145 150
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Gln Gln
155 160 165
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
170 175 180
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val
185 190 195
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
200 205 210
Gly Glu Cys
213
<210>10
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>10
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser
20 25 30
Ile Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Trp Pro Glu Lys Arg Leu
35 40 45
Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr
50 55 60
Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ser Gly Tyr Gly Ser Ser
95 100 105
Tyr Gly Val Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
110 115 120
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
125 130 135
Pro Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
140 145 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
155 160 165
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
170 175 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
185 190 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
200 205 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys
215 220 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305 310 315
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
320 325 330
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
335 340 345
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
350 355 360
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
365 370 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
380 385 390
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
395 400 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
410 415 420
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
425 430 435
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
440 445 450
Gly Lys
452
<210>11
<211>321
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>11
gatatccaga tgacccagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
attagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaatat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagattttg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210>12
<211>369
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>12
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cgctttcagt atctatgaca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcatac attagtagtg gtggtggtac cacctactat 180
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ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagacatagt 300
ggctacggta gtagctacgg ggttttgttt gcttactggg gccaagggac tctggtcact 360
gtctctgca 369