羧丁酰基壳聚糖硫酸酯及其制法和用途 【技术领域】
本发明涉及羧丁酰基壳聚糖硫酸酯及其制法和用途。它属于有机化学技术领域，也属于生物化学领域。
背景技术
壳聚糖硫酸酯具有明显的抗凝血活性，有望取代肝素成为一种新型的抗凝血药物(J.Doczi，A.Fishman，amd j.A King，J.Am.chem.Soc.，75(1953)，1521-1513)，而羧基的引入能促进其抗凝血活性。文献报导当羧基/磺酸基约为1∶1时羧甲基壳聚糖硫酸酯对纤维蛋白原向纤维蛋白转化的抑制作用甚至大为增强(S.Nishimura，N.Nishi.S.Tokurn，Carbohydr.Res.，156(1986)：286-292)。目前在壳聚糖硫酸酯中引入羧基的办法有两种：一是壳聚糖在碱性条件下与氯甲酸反应生成羧甲基壳聚糖，再经过硫酸酯化生成羧甲基壳聚糖硫酸酯；二是壳聚糖经过C6位选择性氧化反应生成氧化壳聚糖，再经过硫酸酯化生成羧基壳聚糖硫酸酯。由于硫酸酯化反应为异相反应，反应过程中羧甲基等基团改变了磺化试剂在多糖分子链中的扩散行为，使磺化反应不易进行；同时硫酸酯化反应中还会发生羧基解离现象。
【发明内容】
本发明就是针对上述不足，提供一类新化合物-羧丁酰基壳聚糖硫酸酯及其制备方法和用途，所得羧丁酰基壳聚糖硫酸酯与壳聚糖硫酸酯相比具有更高的抗凝血活性，可用于制备抗凝血药物。
为实现上述目的，本发明所采取的技术措施如下：
羧丁酰基壳聚糖硫酸酯，其结构式为：
式中R1、R2、R3为-COCH2CH2COONa、-SO3Na或-H；其中-SO3Na的取代度≤3且大于0，-COCH2CH2COONa的取代度为0.18-0.77；n为15～50。
其制备方法如下：
均相条件下，将含硫量3～20wt％、分子量5000～20000的壳聚糖硫酸酯溶于蒸馏水中制得5～30wt％的壳聚糖硫酸酯水溶液，加入壳聚糖硫酸酯糖单元与丁二酸酐摩尔比为0.2～0.8的丁二酸酐混合，20～30℃搅拌反应后，经透析冷冻干燥即得到羧丁酰基壳聚糖硫酸酯。
本发明的技术核心是通过均相条件下壳聚糖硫酸酯与正丁二酸酐反应引入羧基。
根据本发明的技术方案，所述的壳聚糖硫酸酯底物包括不同的硫酸基团含量和硫酸基团取代位置，其结构式为
式中R1、R2、R3为-COCH2CH2COONa、-SO3Na或-H；其中-SO3Na的取代度≤3且大于0，-COCH2CH2COONa的取代度为0.18-0.77；n为15～50。
根据本发明的技术方案，具有最佳抗凝血活性的带羧基壳聚糖硫酸酯地制备工艺条件如下：反应温度25℃，壳聚糖硫酸酯含硫量13.82％(重量百分比)，糖单元与正丁二酸酐的摩尔比为0.6，壳聚糖硫酸酯的浓度20％(重量百分比)。
测定得到的羧丁酰基壳聚糖硫酸酯活化部分凝血活酶时间，凝血酶时间以及凝血酶原时间，结果表明其抗凝血活性高于相应壳聚糖硫酸酯，可用于制备抗凝血药物。
本发明有以下技术特点和优点：
1.为国内外首次提出一种新的化合物羧丁酰基壳聚糖硫酸酯。
2.为国内外首次提出均相条件下经壳聚糖硫酸酯经羧丁酰基化引入羧基的新方法。
3.新的化合物羧丁酰基壳聚糖硫酸酯与壳聚糖硫酸酯相比具有更高的抗凝血活性。
4.在壳聚糖硫酸酯中引入羧基的新方法具有反应条件温和，羧基取代度易控制，副反应少，选择性好等优点。
【具体实施方式】
下面结合实施例，对本发明技术作进一步详述。
实施例1
4.20g含硫量为16.87％(重量比)的壳聚糖硫酸酯溶于20ml pH为9.0的NaOH/甘氨酸缓冲液中(I＝1mol/L)，室温搅拌，分二次加入0.6g丁二酸酐(壳聚糖硫酸酯糖单元与丁二酸酐摩尔比0.6)再搅拌24h，调节pH至9.0～10.0；将反应液放入透析袋中透析3天，浓缩得棕色粉末0.5g，为N-羧丁酰基壳聚糖硫酸酯。元素分析取代度为0.77mol/unit，凝胶色谱法证明分子量与壳聚糖硫酸酯差别很小，反应过程中没有降解现象，红外分析出现相应基团特征吸收，羧基(1560cm-1和1414cm-1)和酰氨羰基(1640cm-1)而没有酯羰基吸收(1720cm-1)，核磁分析出现羧基和酰氨羰基化学位移(185和184ppm)，证明酰化反应仅发生在2为N原子上。抗凝血活性测试证明，其在40μg/ml时的活化部分凝血活酶时间，凝血酶时间分别达到相应壳聚糖硫酸酯的6倍和2倍。
实施例2
如实施例1，丁二酸酐用量为0.2g(壳聚糖硫酸酯糖单元与丁二酸酐摩尔比0.2)，元素分析取代度为0.18mol/unit，抗凝血活性测试证明，其在40μg/ml时的活化部分凝血活酶时间，凝血酶时间分别达到相应壳聚糖硫酸酯的1.1倍和2倍。
实施例3
如实施例1，丁二酸酐用量为0.8g(壳聚糖硫酸酯糖单元与丁二酸酐摩尔比0.8)，元素分析取代度为0.77mol/unit，抗凝血活性测试证明，其在40μg/ml时的活化部分凝血活酶时间，凝血酶时间分别达到相应壳聚糖硫酸酯的0.5倍和0.9倍。
实施例4
6-脱硫酸基壳聚糖硫酸酯3.20g，溶于10ml甲磺酸，置于冰盐溶中保持温度0-5℃，分次加入丁二酸酐1.0g，搅拌30min即置于-5～0℃冷冻24～36h，取出解冻，透析3天，浓缩得N，O-羧基化壳聚糖硫酸酯1.2g。元素分析取代度为0.58mol/unit，凝胶色谱法证明分子量与壳聚糖硫酸酯差别很小，反应过程中没有降解现象，红外分析出现相应基团特征吸收，羧基(1560cm-1和1414cm-1)和酰氨羰基(1640cm-1)和酯羰基吸收(1720cm-1)，核磁分析出现羧基和酰氨羰基化学位移(185和184ppm)，证明酰化反应既发生在2为N原子，也发生在3，6为O原子上。抗凝血活性测试证明，虽然缺乏活性基团，仍然表现出微弱的抗凝血活性，其在40μg/ml时的活化部分凝血活酶时间，凝血酶时间分别达到相应6-脱硫酸基壳聚糖硫酸酯的1.5倍和1.9倍。