抗原特异性细胞毒性T细胞的扩大培养方法 【技术领域】
本发明涉及诱导、维持及扩大培养(expanding)医疗领域中有用的具有抗原特异性细胞杀伤活性的细胞毒性T细胞的方法。
背景技术
活的生命体主要通过免疫应答排除异物，而免疫系统由各式各样的细胞及其产生的可溶性因子构成。其中起关键作用的为白细胞，尤其是淋巴细胞。淋巴细胞主要分为B淋巴细胞(以后称作B细胞)和T淋巴细胞(以后称作T细胞)两种，二者均能特异性识别抗原，与之作用，从而保护生命体。
T细胞分为具有CD(Cluster Designation)4标志，主要与辅助抗体的产生和诱导各种免疫应答有关的辅助性T细胞(TH)，以及具有CD8标志，主要显示细胞杀伤活性的细胞毒性T细胞(Tc，细胞毒性T淋巴细胞，亦叫做杀伤性T细胞，以后记作CTL)两个亚类。CTL对识别、破坏、消除肿瘤细胞和病毒感染的细胞等起着最重要的作用，它不像B细胞那样对抗原产生特异性反应，产生抗体，而是直接识别并作用于与靶细胞膜表面上的主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC；在人类中也称作人白细胞抗原(HLA))I类分子结合的靶细胞来源的抗原(抗原肽)。该情况下，CTL膜表面地T细胞受体(以后称作TCR)特异性识别前面所述的抗原肽及MHC I类分子，判断抗原肽是自身来源的还是非自身来源的。所判断出的非自身来源的靶细胞就被CTL特异性破坏、除去。
近年来，人们开始重新看待如药物疗法和放射疗法这样对患者造成沉重的身体负担的治疗方法，提高了对减轻患者身体负担的免疫治疗方法的关注。尤其是使来源于免疫功能正常的人的CTL或T细胞体外(in vitro)诱导产生对抗原产生特异性反应的CTL后，将其移入患者的免疫过继疗法(adoptive immunotherapy)的有效性备受瞩目。例如，应用动物模型显示免疫过继疗法对病毒感染及肿瘤是有效的治疗方法[Greenberg，P.D.著，免疫学进展(Advances in Immunology)，1992年出版]。再者，基于给免疫缺陷患者施用CTL能导致快速且持续地消除巨细胞病毒而不显现毒性的特异性CTL应答的重构，将CTL应用于先天性、后天性及医原性T细胞免疫功能不全患者也受到关注[Reusser P.等，Blood，第78卷，第5期，第1373-1380页(1991)]。这种治疗方法，要在维持或增强CTL的抗原特异性细胞杀伤活性的状态下进行，所以维持或增加其细胞数目非常重要。
对于维持或增加CTL的细胞数而言，根据动物模型的研究可推算在人类的免疫过继疗法中所需的有效细胞数，109-1010个抗原特异性T细胞是必须的(Greenberg，P.D.著，Advances in Immunology，1992年出版)。也就是说，免疫过继疗法中最大的问题是短时间内在体外获得这些数目的细胞。
对于维持或增强CTL的抗原特异性细胞杀伤活性而言，诱导CTL的抗原特异性应答时，一般的方法是用目的抗原反复刺激。但是，该方法有时暂时地增加细胞数目，而最终细胞数减少，得不到必要的细胞数目。目前，相应的对策只有在反复进行抗原刺激的初期阶段冻存细胞，或克隆到抗原特异性CTL克隆，冻存一部分后，当长期培养过程中出现细胞数或抗原特异性杀伤活性降低时，融解冻存的细胞，再度进行抗原刺激。
应用小鼠T细胞进行长期培养来建立T细胞的方法已有报道[PaulW.E.等，自然(Nature)，第294卷，第5843期，第697-699页(1981)]，该方法是分离T细胞建株的方法，它不能使T细胞增殖到109-1010个细胞。美国专利第5057423号中公开了大量使用高浓度的白细胞介素2(IL-2)诱导淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)，3-4天使细胞增加100倍的方法。考虑到通常1个细胞分裂生成2个细胞大约需24小时，细胞数发生了飞跃式变化。另外，尝试了应用同样高浓度的IL-2诱导肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的过继性免疫疗法[RosenbergS.A.等，N.Engl.J.Med.，第313卷，第23期，第1485-1492(1985)；Rosenberg S.A.等，N.Engl.J.Med.，第319卷，第25期，第1676-1680(1988)；Ho M.等，Blood，第81卷，第8期，第2093-2101页(1993)]。但是，前者是抗原非特异性T细胞的获得方法，后者由于应用了活化的多克隆的淋巴细胞群，所以即便有特异性也是有限的。况且，上述方法中均为了促进细胞增殖而应用了高浓度的IL-2。有报道说用高浓度的IL-2处理过的T细胞在IL-2不存在的情况下接受特异性抗原刺激时，有时会引起细胞凋亡(细胞死亡)[Lenardo M.J.等，Nature，第353卷，第6347期，第858-861页(1991)；Boehme S.A.等，Eur.J.Immunol.，第23卷，第7期，第1552-1560页(1993)]。所以，上述方法中所得LAK细胞或TIL的有效性是有问题的。
用T细胞生长因子和IL-2以低密度(5×103-1×104个/ml)培养T细胞，经过7天，细胞可快速增殖，最终增殖到细胞数达3-5×105个/ml的饱和密度。但是，有报道说，细胞一旦达到饱和密度，通常会死亡[Gillis S.等，Immunol.Rev.，第54卷，第81-109页(1981)]。因此，LAK细胞、TIL及低密度的T细胞培养方法，无论是实用性还是有用性均存在问题。
关于抗原特异性CTL的报道有，体外培养同种异体的巨细胞病毒(CMV)特异性的CTL 5-12周，使CTL增殖后，静脉内施用给免疫功能不全的患者的过继性免疫疗法[Riddell S.A.等，Science，第257卷，第5067期，第238-240页(1992)]；用自身CMV感染成纤维细胞和IL-2[Riddell S.A.等，J.Immunol.，第146卷，第8期，第2795-2804页(1991)]及用抗CD3单克隆抗体(抗CD3mAb)和IL-2[Riddell S.A.等，J.Immunol.Methods，第128卷，第2期，第189-201页(1990)]分离及大量培养CMV特异的CTL克隆的方法。但是，这些方法存在大的问题。即，获得1×109个/ml的抗原特异性CTL大约需要3个月，其间患者的症状仍在发展，很难按照患者状况进行处理。
作为解决这些问题的方法，WO96/06929公开了REM法(Rapidexpansion method)。REM法是短期内增殖(expand)包含抗原特异性CTL和TH的T细胞初期群的方法。该方法的特征在于使各T细胞克隆增殖，提供大量的T细胞，但存在如下的问题。在REM方法中，应用抗CD3抗体、IL-2及经放射线照射而不增殖的PBMC(外周血单核细胞)和非洲淋巴细胞瘤病毒(Epstein-Barr virus，以后略作EBV)感染的细胞使抗原特异性CTL数目增殖，然而存在如下问题：不能排除T细胞内混入EBV转染的B细胞(EBV-B细胞)(安全性问题)；有必要使用大量的PBMC(必要时至少约为抗原特异性CTL数的40倍)作为饲养细胞(feeder cell)；所增殖的CTL的抗原特异性细胞杀伤活性不能充分满足要求；应用T细胞克隆以外的T细胞群进行增殖时，T细胞具有的抗原特异性杀伤活性与细胞的增殖一起降低等。
也就是说，目前存在的抗原特异性CTL的制备方法，其现状是，短期内制备足量有效的用于治疗的具有抗原特异性细胞杀伤活性的CTL这样的过继性免疫疗法中，必要的不可欠缺的问题尚未解决。
发明公开
本发明的目的是提供诱导、维持及扩大培养适用于过继性免疫疗法的保持高水平抗原特异性细胞杀伤活性的CTL的方法，即本发明涉及：
(1)一种诱导具有抗原特异性细胞杀伤活性的细胞毒性T细胞的方法，其特征在于，该方法包括在选自下面(A)-(E)的至少一种物质存在下，将具有细胞毒性T细胞分化能力的前体细胞与抗原呈递细胞一起培养的步骤：(A)具有CD44结合活性的物质；(B)能调控由CD44配体与CD44结合而激发的信号的物质；(C)能抑制生长因子与生长因子受体结合的物质；(D)能调控由生长因子与生长因子受体结合而激发的信号的物质；(E)纤粘连蛋白、其片断或它们的混合物；
(2)上面(1)的方法，其中具有CD44结合活性的物质为CD44配体和/或抗CD44抗体；
(3)上面(2)的方法，其中CD44配体为透明质酸；
(4)上面(1)的方法，其中能抑制生长因子与生长因子受体结合的物质为具有生长因子结合活性的物质；
(5)上面(4)的方法，其中具有生长因子结合活性的物质为抗生长因子抗体；
(6)上面(1)、(4)和(5)任一项的方法，其中生长因子为选自肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1和胰岛素样生长因子-2的至少一种生长因子；
(7)上面(1)的方法，其中纤粘连蛋白的片断为具有至少一种选自下列结构域的片断：(a)VLA-4结合结构域，(b)VLA-5结合结构域，及(c)肝素结合结构域；
(8)一种维持具有抗原特异性细胞杀伤活性的细胞毒性T细胞的方法，其特征在于，该方法包括在选自上面(1)中(A)-(E)的至少一种物质存在下，连续培养细胞毒性T细胞的步骤；
(9)上面(8)的方法，其中具有CD44结合活性的物质为CD44配体和/或抗CD44抗体；
(10)上面(9)的方法，其中CD44配体为透明质酸；
(11)上面(8)的方法，其中能抑制生长因子与生长因子受体结合的物质为具有生长因子结合活性的物质；
(12)上面(11)的方法，其中具有生长因子结合活性的物质为抗生长因子抗体；
(13)上面(8)、(11)和(12)任一项的方法，其中生长因子为选自肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1和胰岛素样生长因子-2的至少一种生长因子；
(14)上面(8)的方法，其中纤粘连蛋白的片断为具有至少一种选自下列结构域的片断：(a)VLA-4结合结构域，(b)VLA-5结合结构域，及(c)肝素结合结构域；
(15)一种扩大培养具有抗原特异性细胞杀伤活性的细胞毒性T细胞的方法，其特征在于，该方法包括在选自上面(1)中(A)-(E)的至少一种物质存在下培养细胞毒性T细胞的步骤；
(16)上面(15)的方法，其步骤中还包括在抗CD3抗体的存在下培养细胞毒性T细胞；
(17)上面(15)或(16)的方法，其步骤中细胞毒性T细胞与饲养细胞一起培养；
(18)上面(17)的方法，其中饲养细胞为非病毒感染细胞；
(19)上面(15)-(18)任一项的方法，其中具有CD44结合活性的物质为CD44配体和/或抗CD44抗体；
(20)上面(19)的方法，其中CD44配体为透明质酸；
(21)上面(15)-(18)任一项的方法，其中能抑制生长因子与生长因子受体结合的物质为具有生长因子结合活性的物质；
(22)上面(21)的方法，其中具有生长因子结合活性的物质为抗生长因子抗体；
(23)上面(15)、(18)、(21)和(22)任一项的方法，其中生长因子为选自肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1和胰岛素样生长因子-2的至少一种生长因子；
(24)上面(15)的方法，其中纤粘连蛋白的片断为具有至少一种选自下列结构域的片断：(a)VLA-4结合结构域，(b)VLA-5结合结构域，及(c)肝素结合结构域；
(25)一种细胞毒性T细胞的回收方法，它包括从用上述(1)-(24)任一项中的方法所得的含细胞毒性T细胞的培养物中，选择富含具有抗原特异性细胞杀伤活性的细胞毒性T细胞的细胞团的步骤；
(26)用上述(1)-(25)任一项中的方法制备的具有抗原特异性细胞杀伤活性的细胞毒性T细胞，及
(27)一种治疗剂，其特征在于，它含有上述(26)的细胞毒性T细胞作为有效成分。
附图简述
图1表示透明质酸对可溶生CD44与可溶性CD44识别抗体结合的抑制活性。
图2表示FL标记的透明质酸与CTL细胞表面上CD44的结合活性。
图3表示可溶性CD44识别抗体与培养基中的可溶性CD44的结合活性。
图4表示HA非阻断(Non-Blocking)抗CD44抗体与培养基中的可溶性CD44的结合活性。
图5表示HA非阻断抗CD44抗体与CTL细胞表面上CD44的结合活性。
图6表示培养基中添加了HA非阻断抗CD44抗体的CTL扩大培养后，CTL细胞表面上该抗体的结合。
本发明的最佳实施方式
本发明发现至少一种选自下面(A)-(E)的物质(本发明中把该物质作为有效成分使用)能意外地发挥维持或增强CTL的抗原特异性细胞杀伤活性的能力，由此完成了本发明：(A)具有CD44结合活性的物质；(B)能调控由CD44配体与CD44结合而激发的信号的物质；(C)能抑制生长因子与生长因子受体结合的物质；(D)能调控由生长因子与生长因子受体结合而激发的信号的物质；(E)纤粘连蛋白、其片断或它们的混合物。
因此，本发明提供诱导、维持及扩大培养适用于过继性免疫疗法的保持高水平抗原特异性细胞杀伤活性的CTL的方法。
以下，具体说明本发明。
(1)本发明的细胞毒性T细胞的诱导方法
已知，通常由抗原呈递细胞诱导的CTL在维持、增殖期间，其抗原特异性细胞杀伤活性降低。本发明提供即便长时间维持诱导后的细胞或使之增殖，不出现以往观察到的抗原特异性细胞杀伤活性显著降低的抗原特异性CTL的诱导方法。
本发明的CTL的诱导方法把在上述有效成分的存在下诱导CTL作为其一个显著特征。在上述有效成分的存在下，为了使所得CTL对所希望的抗原产生识别能力，将优选的抗原呈递细胞与具有CTL分化潜能的前体细胞一起培养，由此实施CTL的诱导。对前体细胞无特殊限制，只要是成为CTL的前阶段且其命运是分化成CTL的细胞即可，例如外周血单核细胞(PBMC)、ナイ-ブ细胞、记忆细胞等。抗原呈递细胞无特殊限制，只要是能呈递T细胞所识别的所有抗原即可。例如，呈递所希望的抗原的单核细胞、B细胞、T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、成纤维细胞等，可用于本发明。
抗原呈递细胞是通过给具有抗原呈递能力的细胞加载抗原肽，使抗原肽呈递到细胞表面进行制备的[例如，参照Bednarek M.A.等，J.Immunol.，第147卷，第12期，第4047-4053页(1991)]。另外，当具有抗原呈递能力的细胞具有加工(process)抗原的能力时，通过给该细胞加载抗原，抗原被摄取到细胞内，接受加工、处理，细胞将片断化的抗原肽呈递到细胞表面。给具有抗原呈递能力的细胞加载抗原肽时，所使用的抗原肽和所使用的抗原呈递细胞与所要诱导的CTL的HLA限制性相匹配。
本发明中所使用的抗原无特殊限制，例如包括细菌、病毒等外源性抗原及肿瘤相关抗原(癌抗原)等内源性抗原等。
本发明中优选抗原呈递细胞为非增殖性细胞。为了使细胞成为非增殖性，可进行入X线等放射线照射或丝裂霉素(mitomycin)等药物处理。
本发明的CTL诱导方法中所使用的培养基无特殊限制，可使用众所周知的混合了CTL、其前体细胞及抗原呈递细胞的维持、生长发育所必需的成分的培养基，例如市场上销售的培养基。除其自身的成分以外，这些培养基中可包含适当的蛋白质、细胞因子类、其它成分。合适地，含有白细胞介素2(IL-2)的培养基可用于本发明。另外，这些蛋白质、细胞因子类、其它成分可固定化到本发明的方法中所使用的培养器材和微粒等基体中。可通过后述的众所周知的固定化方法，将这些成分按获得所希望效果的量固定化到培养器材等中。
CD44是广泛存在于造血细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等的细胞表面受体，已有报道透明质酸、硫酸肝素、硫酸软骨素、骨桥蛋白(osteopontin)、I型胶原、4型胶原、纤粘连蛋白、serglycin等为其配体。已知，其功能是通过借助细胞-细胞间、细胞-细胞外基质间的粘附向细胞内传递信号，活化其它粘附分子，产生细胞因子等。CTL中也存在CD44，CD44一旦与透明质酸和抗CD44抗体结合，CD44的胞内区存在的酪氨酸激酶结构域活化，使细胞内基质蛋白质的酪氨酸磷酸化，从而进行细胞内的信号传递。也就是说，CD44通过与其配体和抗CD44抗体结合而启动信号，从而涉及各种功能。
本发明中具有CD44结合活性的物质，无特殊限制，只要是显示能维持或增强CTL的特异性细胞杀伤活性即可，例如CD44配体和/或抗CD44抗体。作为CD44配体无特殊限制，只要是显示能维持或增强CTL的特异性细胞杀伤活性即可，例如包括透明质酸、硫酸肝素、硫酸软骨素、骨桥蛋白、I型胶原、4型胶原、纤粘连蛋白、serglycin等，透明质酸特别优选。作为抗CD44抗体无特殊限制，只要是显示能维持或增强CTL的特异性细胞杀伤活性即可，例如可使用市售的抗CD44抗体。对衍生物，如荧光标记的衍生物等无特殊限制，只要是显示能维持或增强CTL的特异性细胞杀伤活性即可。
本发明中，不管CD44与具有CD44结合活性的物质间有无结合，通过调控CD44配体与CD44结合而启动的信号，可获得期待的效果。也就是说，取代具有CD44结合活性的物质，以能调控CD44配体与CD44结合而启动的信号的物质作有效成分，也可实施本发明。这里作为CD44配体与CD44结合而启动的信号也包含接受该信号后生物体所表达的信号。也就是说，该信号包括CD44的胞内区存在的酪氨酸激酶结构域活化，活化的酪氨酸激酶使细胞内基质蛋白质的酪氨酸磷酸化等。作为调控这些信号的物质包括如各种磷酸化酶等。本说明书中的调控是指能信号传导通路中活化的信号向下游传递，或抑制活化的信号向下游传递。
生长因子是各种促进细胞分裂和表达的多肽的总称，通过细胞膜上特异性受体作用于靶细胞，受体中多数能将胞内区存在的酪氨酸激酶结构域活化，将信号传递给靶细胞。
本发明中，作为生长因子无特殊限制，只要是通过抑制生长因子与生长因子受体的结合，或通过调控生长因子与生长因子受体结合而启动的信号显示能维持或增强CTL的特异性细胞杀伤活性即可。例如包括肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、神经生长因子(NGF)、神经营养性因子、上皮生长因子、奶来源的生长因子、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、脑来源的成纤维细胞生长因子、酸性纤维细胞生长因子、角化细胞生长因子、血小板来源的生长因子(PDGF)、血小板碱性蛋白质、血小板第4因子、结合组织活化肽、集落刺激因子、红细胞生成素、血小板生成素、T细胞生长因子、B细胞生长因子、软骨来源的因子、软骨来源的生长因子、骨来源的因子、骨来源的生长因子、内皮细胞生长因子、内皮细胞来源的生长因子、眼来源的生长因子、精囊来源的生长因子、塞儿托利(支持)细胞来源的生长因子、乳腺刺激因子、骨髓来源的生长因子、巨噬细胞来源的生长因子、循环间叶的生长因子、转化生长因子-α、转化生长因子-β、肝素结合性EGF样生长因子、amphyllegrin、平滑肌细胞来源的的生长因子(SDGF)、batacellulin、表皮调节素(epiregulin)、neuregulin-1，-2，-3、血管内皮生长因子、神经营养素(neurotrophin，NT)-3，4，5，6，7，胶质细胞株来源的神经营养性因子、干细胞因子、中期因子(midkine)、pleiotrophin、ephrin、血管生成素、活化素(activin)、肿瘤坏死因子等。根据本发明，优选的生长因子为肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1和胰岛素样生长因子-2。
HGF是具有肝细胞增殖作用、蛋白质合成促进作用、胆汁淤滞改善作用、及预防药物引起的肾功能损害作用等的生长因子。已知HGF的受体是c-Met，HGF的多种生理作用均通过c-Met进行。c-Met的胞内区具有酪氨酸激酶结构域。
胰岛素样生长因子(IGF)是用胰岛素样生长因子抗体不能中和的胰岛素样活性物质。已知IGF存在IGF-1和IGF-2两种。IGF结合的受体有胰岛素受体、IGF-1受体、IGF-2受体，尤其是胰岛素受体、IGF-1受体的胞内区具有酪氨酸激酶结构域。
本发明中能够抑制生长因子和生长因子受体结合的物质无特殊限制，只要能维持或增强CTL的特异性细胞杀伤活性即可，包括具有生长因子结合活性、通过与生长因子形成复合物而抑制生长因子与生长因子受体结合的物质，或者具有生长因子受体结合活性而抑制生长因子与生长因子受体结合的物质。前者包括，如抗生长因子抗体，优选的抗体有抗HGF抗体、抗IGF-1抗体、抗IGF-2抗体。后者包括，如抗生长因子受体抗体，优选的有抗c-Met抗体、抗胰岛素受体抗体、抗IGF-1受体抗体、抗IGF-2受体抗体。
另外，本发明与生长因子与生长因子受体有无结合无关，而是通过调控因生长因子与生长因子受体结合而启动的信号获得所期望的结果。即，本发明取代抑制生长因子与生长因子受体结合的物质，以调控生长因子与生长因子受体结合而启动的信号的物质为有效成分进行实施。这里因生长因子与生长因子受体结合而启动的信号也包括接受该信号后生物体发出的信号。该信号包括，如生长因子的胞内区存在的酪氨酸激酶结构域活化，从而使细胞内基质蛋白质的酪氨酸磷酸化等，调控这些信号的物质包括，如激酶抑制物等。
本说明书中的纤粘连蛋白及其片断既可是天然产物，亦可是应用常用的基因组重组技术等人为合成。纤粘连蛋白及其片断可以[Ruoslahti E.等J.Biol.Chem.，第256卷，第14期，第7277-7281页(1981)]的公开为基础，从天然起源的物质以基本上纯的状态进行制备。本说明书中的基本上纯的纤粘连蛋白或纤粘连蛋白片断，它们与天然的纤粘连蛋白一起存在基本上不含有供给源来源的其它蛋白质等。本发明中上述纤粘连蛋白及其片断可各自单独或多种混合使用。
可用于本发明的与纤粘连蛋白片断及该片断的制备相关的有用信息可从[Kimizuka F.，等，J.Biochem，第110卷，第2期，第284-291页(1991)]，[Kornblihtt A.R.等，EMBO J.第4卷，第7期，第1755-1759页(1985)]，[Sekiguchi K.等，Biochemistry，第25卷，第17期，第4936-4941页(1986)]等获得。
纤粘连蛋白物是一种大的糖蛋白，分子量为220至250kD，能与许多生物大分子、细胞和微生物结合，所述生物大分子例如胶原、肝素、纤维蛋白、整合素家族VLA-4和VLA-5。另外，纤粘连蛋白分子的结构域分为几个结构域结构(代谢，Vol.23，No.11(1986))。结构域1的分子量约30000，与肝素、纤维蛋白、金黄色葡萄球菌等结合。结构域2分子量约40000，与胶原结合。结构域3分子量约20000，与纤维蛋白弱结合。结构域4分子量约75000，为细胞结合结构域。结构域5(肝素结合结构域)分子量约35000，与肝素强结合。结构域6分子量约30000，与纤维蛋白结合。结构域7羧基末端的分子量约3000。结构域4中包含VLA-5结合结构域，结构域5和6之间含有VLA-4结合结构域。已知纤粘连蛋白有ED-A、ED-B、IIICS3种模型，进行选择性剪接。IIICS有具有细胞粘附活性的CS-1和CS-5(FIBRONECTIN，Deane F.Mosher，ACADEMIC PRESS，(1989))。
本发明中对纤粘连蛋白片断无特殊限制，但优选具有选自其结构域1-7、VLA-4结合结构域、VLA-5结合结构域、ED-A、ED-B、IIICS、CS-1和CS-5区域的片断。另外，对本发明中使用的纤粘连蛋白片断的分子量无特殊限制，但优选使用1-200kD，较优选5-190kD，更优选10-180kD的片断。
本发明中特别优选的纤粘连蛋白片断，优选使用具有选自(a)作为纤粘连蛋白来源的细胞结合结构域的整合素α5β1(VLA-5)结合结构域；(b)整合素α4β1(VLA-4)结合结构域，及(c)肝素结合结构域的至少一种结构域的片断。包含VLA-5结合结构域的片断具有SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列；包含VLA-4结合结构域的片断具有SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列；包含肝素结合结构域的片断具有SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列。
作为本发明中优选使用的纤粘连蛋白，在具有上述结合活性的范围内纤粘连蛋白来源的氨基酸序列中可有1个或更多的氨基酸发生置换、缺失、插入、添加。例如，2个不同的结构域间插入1个或更多的氨基酸作为连接的片断也可用于本发明。
本说明书中基本上纯的纤粘连蛋白片断，可用如美国专利第5198423号中记载的基因重组体进行制备。特别是，实施例中H-271(SEQ ID NO：3)、H-296(SEQ ID NO：4)、CH-271(SEQ ID NO：5)及CH-296(SEQ ID NO：6)重组片断及其获得方法详细记载于该专利中。另外，实施例中所使用的C-274片断(SEQ ID NO：1)是根据美国第5102988号专利中记载的方法获得的。C-CS1片断(SEQ ID NO：7)是根据日本第3104178号专利中记载的方法获得的。
上述CH-271、CH-296、C-274、C-CS1的各片断是具有VLA-5结合活性的细胞结合结构域的多肽。另外，C-CS1、H-296、CH-296是具有VLA-4结合活性的细胞结合结构域的多肽。H-271、H-296、CH-271及CH-296是具有肝素结合结构域的多肽。
上述各结构域修饰了的片断也可用于本发明。纤粘连蛋白的肝素结合部位是由3个III型类似序列(III-12、III-13、III-14)构成的。含有缺失上述III型类似序列中1个或2个的肝素结合部位的片断也可用于本发明。如，片段可以是纤粘连蛋白的细胞结合部位(VLA-5结合结构域，Pro1239-Ser1515)与1个III型类似序列结合的片断：CHV-89(SEQ ID NO：8)、CHV-90(SEQ ID NO：9)、CHV-92(SEQ ID NO：10)；或与2个III型类似序列结合的片断：CHV-179(SEQ ID N0：11)、CHV-181(SEQ ID N0：12)。CHV-89、CHV-90、CHV-92分别含有III-13、III-14、III-12。CHV-179含有III-13和III-14，CHV-181含有III-12和III-13。CHV-89、CHV-90、CHV-179是根据日本第2729712号专利中记载的方法获得的。CHV-181是根据WO97/18318中记载的方法获得的。CHV-92是以上述文献中的质粒为基础定向构建质粒，应用该质粒通过基因工程学方法获得的。
另外，下述实施例中使用的H-275-Cys(SEQ ID NO：13)是具有纤粘连蛋白的肝素结合结构域，且C末端具有半胱氨酸残基的片断。该片断也可用于本发明。
这些片断或从这些片断定向诱导的片断可用305-8566日本国茨城县つくば市东1丁目1番地1中央第6独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(旧通商产业省工业技术院微生物工业技术研究所)以下述保藏号保藏的微生物制备的，或根据公知的方法(例如，定点诱变等)改变各微生物携带的质粒而制备的。
FERM BP-2799(携带编码H-271的质粒的大肠杆菌)，国际保藏日：1989年5月12日
FERM BP-2800(携带编码CH-296的质粒的大肠杆菌)，国际保藏日：1989年5月12日
FERM BP-5723(携带编码C-CS1的质粒的大肠杆菌)，原保藏日：1990年3月5目，移交国际保藏的请求日：1996年10月23日
FERM P-10721(携带编码H-296的质粒的大肠杆菌)，日本国内保藏日：1989年5月12日
FERM P-12182(携带编码CHV-89的质粒的大肠杆菌)，日本国内保藏日：1991年4月8日
FERM P-12183(携带编码CHV-179的质粒的大肠杆菌)，日本国内保藏日：1991年4月8日
本发明中可使用的片断的细胞结合结构域与细胞的结合可使用常规的方法进行测定。例如，这些方法中包含Williams D.A.的方法[Williams D.A.等，Nature，第352卷，第6334期，第438-441页(1991)]。该方法是针对固定化到培养皿上的片断进行细胞结合的测定方法。
上述方法中，可替换细胞，使用肝素，如用标记的肝素，用同样的方法评价片断的肝素结合结构域。
如前所述，纤粘连蛋白是一巨大的分子，有其便利点，本发明中优选使用纤粘连蛋白片断。另外，本发明中所使用的纤粘连蛋白或其片断，使用动物来源的血浆和脏器来源的产物时，有必要注意动物来源的病毒(HCV、HIV等)的污染、纯度、均一性等，所以特别优选用上述基因工程学方法获得的纤粘连蛋白或其片断。
本发明中所使用的有效成分可单独使用或2种或2种以上混合使用。
本发明中具有CTL分化潜能的前体细胞与抗原呈递细胞一起培养(共培养)诱导CTL时，可按照常规的众所周知的条件[例如，参照Bednarek M.A.，J.Immunol.，第147卷，第12期，第4047-4054页(1991)]。对共培养条件无特殊限制，可使用常规细胞培养时所使用的条件，例如，在37℃、5％CO2等条件下进行培养。该共培养通常进行约2-15天，其间用新制备的抗原呈递细胞替换旧的，进行再刺激。另外，在适当的时间间隔内换成新鲜的培养基。
进行共培养的培养基中本发明的有效成分的有效量无特殊限制，只要能获得所期望的效果即可，例如优选0.001-1000μg/ml，更优选0.01-100μg/ml。本说明书中，培养基中含有有效成分等成分包含这样的实施方案：将该成分固定化到细胞培养时加入培养基所使用的培养器材和加入到培养基中使用的微粒等基体上，使基体与培养基接触(与培养基接触后，不管是否固定化到基体上)，该成分包含到培养基中。也就是说，希望有效成分溶解到培养基中或固定化到培养器材和微粒等基体上存在。作为上述有效成分，至少一种选自透明质酸、抗CD44抗体、抗HGF抗体、抗IGF-1抗体、抗IGF-2抗体及纤粘连蛋白片断的成分较优选。
如此诱导的CTL具有特异性识别目的抗原的能力，例如通过细胞杀伤活性特异性破坏具有该抗原的细胞。用细胞众所周知的方法评价CTL的细胞杀伤活性。例如，对抗原呈递细胞呈递的肽和用放射性物质、荧光物质等标记的靶细胞的杀伤性，可通过摄取放射性物质的能力来测定CTL增殖的抗原特异性增加，或通过测定从CTL和靶细胞抗原特异性释放的GM-CSF、IFN-γ等细胞因子的量来进行评价(参照后面的实施例1-1-(3)。此外，也可通过荧光素等标记的抗原肽和复合物的使用进行直接确认。例如，将CTL与与CTL特异性抗体偶联的第一荧光标记物接触，然后与与第二荧光标记物偶联的抗原肽-MHC复合物接触，然后用FACS(fluorescence-activated cellsorting)分析双重标记细胞的存在，通过该方法进行评价。
用本发明的方法诱导的CTL具有这样的优点，即，即便长时间维持诱导后的细胞或使之快速增加，也不会象以往观察到的那样其抗原特异性的细胞杀伤活性降低。因此，通过将诱导的CTL克隆化，可作为具有稳定细胞杀伤活性的淋巴细胞维持。例如，用抗原、各种细胞因子、抗CD3抗体刺激所诱导的CTL，可使之增殖，进行扩大培养。对该CTL的维持、扩大培养无特殊限制，可用众知的方法，例如后面所述本发明的细胞毒性T细胞的维持方法、扩大培养方法的使用较优选。
(2)本发明的细胞毒性T细胞的维持方法
本发明的细胞毒性T细胞的维持方法是始终保持CTL的抗原特异性杀伤活性的维持方法。该方法的一显著特征是在含有本发明的有效成分的培养基中连续培养CTL，能连续维持该细胞的抗原特异性细胞杀伤活性。
对适于该方法的CTL无限定，用本发明的方法可维持用众知的方法所得的CTL，使之始终维持其抗原特异性细胞杀伤活性。另外，也适用于用上面(1)中本发明的细胞毒性T细胞的诱导方法所得的CTL的维持。
本发明中CTL连续培养的常规条件可按众所周知的条件[例如，参照Carter J.等，Immunology，第57卷，第1期，第123-129页(1986)]。对本发明的细胞毒性T细胞的维持方法中所使用的培养基无特殊限制，例如可使用上述CTL诱导方法中所使用的培养基。
本发明的方法通过含有前述有效成分的培养基进行实施。进行培养的培养基中，本发明的有效成分的含有量无特殊限制，只要能获得预期结构即可。但，优选0.001-1000μg/ml，更优选0.01-100μg/ml。希望有效成分溶解到培养基中或固定化到培养器材和微粒等基体上存在。作为上述有效成分，至少一种选自透明质酸、抗CD44抗体、抗HGF抗体、抗IGF-1抗体、抗IGF-2抗体及纤粘连蛋白片断的成分较优选。再者，培养基中可添加细胞因子和其它众知的成分。本发明优选应用含IL-2的培养基。与前面同样，这些细胞因子和其它众知的成分固定化到培养器材和微粒等基体上使用。对培养条件无特殊限制，可使用常规细胞培养时所使用的条件，例如，在37℃、5％CO2等条件下进行培养。可在适当的时间间隔内换成新鲜的培养基。
如上所述，通过在含有本发明的有效成分的培养基中连续培养CTL，能抑制其特异性细胞杀伤活性的降低，维持CTL。本发明的效果可通过实施例1-1-(3)中的方法测定、确认用本发明的方法维持的CTL的细胞杀伤活性。另外，用众所周知的扩大培养方法可使用该方法维持的CTL增殖，增殖的CTL也保持特异性细胞杀伤活性。作为CTL的扩大培养方法优选应用后述的本发明的CTL的扩大培养方法。
(3)本发明的细胞毒性T细胞的扩大培养方法
在适当的条件下培养细胞毒性T细胞可增加细胞数目(扩大培养)。以往，已开发出几种CTL的扩大培养方法，但作为短期内可使CTL高效增殖的方法，已知有Riddell等开发出的前面所述的REM法。该方法是使用经X线照射的非增殖性PBMC(作为饲养细胞使用)和用EBV转化的B细胞(EBV-B细胞)，在IL-2、抗CD3抗体的存在下培养CTL的方法。但该方法不能否定EBV-B细胞混入T细胞的危险性，这一点是问题所在。
本发明的细胞毒性T细胞的扩大培养方法是可始终保持抗原特异性细胞杀伤活性而使细胞数增加的方法。该方法的特征是在本发明的有效成分的存在下进行培养。
本发明的方法中对适用的CTL没有限定，从生物体所得的具有细胞损伤活性的CTL、用众所周知的方法诱导的CTL、用上述(1)中本发明的CTL的诱导方法诱导的CTL、用上述(2)中本发明的CTL的维持方法所维持的CTL均适用于本发明的CTL的扩大培养。本发明中CTL的扩大培养的常规条件可依照众所周知的条件[例如，参照Uberti J.P.等，Clin.Immunol.Immunopathol.，第70卷，第3期，第234-240页(1994)]。
本发明的细胞毒性T细胞的扩大培养方法中，希望用加入上述有效成分，还含有抗CD3抗体、优选抗CD3单抗的培养基共培养CTL。更优选的是，CTL与适当的饲养细胞共培养。
对上述方法中使用的培养基无特殊限制，可使用混合了CTL培养、发育所必需的成分的众所周知的培养基，如市售的培养基。当与饲养细胞一起共培养CTL时，希望使用适于CTL、饲养细胞二者的维持、发育的培养基。这些培养基除包含其原来的构成成分以外，可包含适当的蛋白质、细胞因子类、其它众知的成分，例如含有IL-2的培养基适于在本发明中应用。添加抗CD3抗体、尤其是抗CD3单抗的目的是活化CTL上的T细胞受体。按众知的条件决定培养基中抗CD3抗体的含有量的话，0.01-400μg/ml合适。这些蛋白质、细胞因子类、其它众知的成分可溶解到培养基中或固定化到培养器材和微粒等基体上。
本发明的CTL的扩大培养方法，以培养基中含有上述有效成分进行实施。作为上述有效成分，至少一种选自透明质酸、抗CD44抗体、抗HGF抗体、抗IGF-1抗体、抗IGF-2抗体及纤粘连蛋白片断的成分合适。另外，进行培养的培养基中对本发明的有效成分的含有量无特殊限制，只要能获得预期结果即可，但优选0.001-1000μg/ml，更优选0.01-100μg/ml。优选有效成分以溶解到培养基中或固定化到培养器材和微粒等基体上的形式存在。
本发明的方法中使用的饲养细胞无特殊限制，只要是与抗CD3抗体，尤其是与抗CD3单抗协同刺激CTL，使T细胞受体或共刺激信号受体(costimulatory signal receptor)活化即可。本发明中可使用，如PBMV和EBV-B细胞。通常，饲养细胞在用放射线照射等手段夺去其增殖能力后使用。按照众所周知的方法决定培养基中饲养细胞的含有量，例如1×105-1×107细胞/ml较合适。
本发明的特殊优选实施方案中饲养细胞是非病毒感染的细胞，例如是EBV-B细胞以外的细胞，具体而言，可使用自身或非自身来源的PBMC等。这样的话，可排除扩大培养的CTL中混在EBV-B细胞的可能性，象过继性免疫疗法那样利用CTL时可提高其医疗的安全性。
本发明的CTL的扩大培养方法中，对其培养条件无特殊限制，可使用常规细胞培养所使用的条件，例如，在37℃、5％CO2等条件下进行培养。可在适当的时间间隔内换成新鲜的培养基。
对本发明的CTL的扩大培养方法无特殊限制，只要是所使用的培养基中含有上述有效成分即可，上述方法之外的以往的CTL扩大培养方法中，培养基中包含本发明的有效成分的实施方案也包含在本发明内。
根据本发明的扩大培养方法，例如通过14天的扩大培养，可得到细胞数增加102-103倍的CTL。与以往的CTL扩大培养方法相比，例如与用REM法得到的细胞相比，这样得到的CTL保持更高的抗原特异性细胞杀伤活性。
本发明的效果的判定可通过实施例1-1-(3)中的方法测定、确认用本发明的方法扩大培养的CTL具有的细胞杀伤活性。
本发明中使用的有效成分具有维持或增强CTL的抗原特异性细胞杀伤活性的，可作为CTL诱导剂、CTL维持剂或CTL扩大培养剂(以后叫做CTL培养剂)使用。该CTL诱导剂由有效成分物质、或其它任意成分，如CTL的诱导方法中使用的培养基、CTL的维持方法中使用的培养基或CTL的扩大培养方法中使用的培养基中包含的，CTL和饲养细胞等的培养、发育所必需的成分及适当的蛋白质、细胞因子类(优选地IL-2)、所需的其它成分构成。含有这些CTL培养剂的培养剂可作为CTL诱导用、维持用或扩大培养用培养基(CTL培养基)使用。这些CTL培养剂可混合(包括溶解)到培养基中或固定化到培养器材和微珠等基体上。这些培养基可任意包含用于细胞培养的基本成分。可根据众知的方法将所需的成分适当混合，制备上述CTL培养剂及CTL用培养基。
本发明还提供将有效成分固定化到如培养板、培养皿、培养瓶、培养袋等任意的培养器材(容器)或珠粒、膜等支持载体等基体(具体地说，细胞培养时培养基接触的基体部分)上的CTL诱导用、维持用或扩大培养用的基体。对有效成分固定化到基体上的固定化量无特殊限制，只要能达到预期效果即可，但使用基体诱导CTL时，基体中使用的任意培养基中有效成分的含有量要在本发明的CTL诱导方法、维持方法或扩大培养方法的说明中阐述的有效成分的优选培养基含有量范围内。另外，有效成分中也可任意固定化蛋白质、细胞因子类、其它成分。作为固定化方法无特殊限制，例如可使用蛋白质吸附、生物素与亲和素或抗生蛋白链菌素结合、化学固定法等众所周知的固定化方法。所述器材适用于本发明的CTL诱导方法、维持方法或扩大培养方法。
用上述CTL诱导方法、维持方法或扩大培养方法而得的CTL含有培养物中通常混有辅助性T细胞等CTL以外的细胞。本发明中，可通过离心从该培养物中回收培养物中的细胞，直接作为用本发明的方法获得的CTL使用。
另外，可用众所周知的方法从该培养物中分离出富含具有抗原特异性细胞杀伤活性的CTL的细胞团(或培养物)，作为用本发明的方法获得的CTL使用。也就是说，本发明中可通过实施将CTL含有培养物中CTL以外的细胞(例如，辅助性T细胞等)与CTL分离的操作，制备与抗原特异性细胞杀伤活性相关的浓缩的细胞团使用。通过如此分离细胞团，使抗原特异性细胞杀伤活性浓缩，这在REM法中是未涉及的。由此，作为本发明的一实施方案，本发明提供细胞毒性细胞的回收方法，它包括从用本发明的CTL诱导方法、维持方法或扩大培养方法中的任一方法制备的CTL含有培养物中选择富含具有抗原特异性细胞杀伤活性的细胞毒性T细胞的细胞团工程。本发明的CTL回收方法，可以说是一个选择性获得具有高度抗原特异性细胞杀伤活性的CTL细胞团的方法，广义地说，是生产或获得所述CTL细胞团的方法。对细胞团的选择方法无特殊限制，例如，用与针对CTL细胞表面上表达的细胞表面抗原的抗体，如抗CD8抗体结合的磁珠或柱子，从用上述CTL诱导方法、维持方法或扩大培养方法制备的CTL含有培养物中，只选择性回收CTL，得到富含CTL的细胞团。另外，可用流式细胞仪选择性分离CTL。另外，可通过从用本发明的CTL诱导方法、维持方法或扩大培养方法制备的CTL含有培养物中去除CTL以外的细胞而获得富含CTL的细胞团。例如，为了除去辅助性T细胞，用与针对辅助性T细胞表面上表达的细胞表面抗原的抗体，如抗CD4抗体结合的磁珠或柱子，从培养物中选择性除去辅助性T细胞，而获得富含CTL的细胞团。如此所得富含CTL的细胞团，与从CTL含有培养物中非选择性回收的细胞团相比，具有更高效细胞杀伤活性，更适于作为用本发明的方法获得的CTL使用。另外，本发明中富含CTL的细胞团包含只有CTL的细胞团。
应用用本发明的CTL维持方法或扩大培养方法制备的CTL，再通过进行本发明的CTL维持方法或扩大培养方法来进行CTL的维持或扩大培养。例如，应用上述方法，从用本发明的扩大培养方法获得的CTL中获得富含CTL的级分，用该级分再度进行本发明的扩大培养方法，获得细胞杀伤活性高的CTL。另外，用本发明的维持方法可维持用本发明的扩大培养方法得到的CTL的细胞杀伤活性。
本发明还提供用本发明的CTL诱导方法、维持方法或扩大培养方法而得的CTL(包括用上述回收方法从用这些方法所得的CTL含有培养物中回收)。所得CTL均具有抗原特异性的细胞杀伤活性，具有即便进行长时间的连续培养和扩大培养其细胞杀伤活性也不降低的特性。另外，本发明提供以含有该CTL，以之作有效成分的治疗剂。该治疗剂特别适于过继性免疫疗法使用。在过继性免疫疗法中，将适于患者治疗的具有抗原特异性细胞杀伤活性的CTL通过如静脉施用给患者。该治疗剂的制备可按照制药领域内众知的方法，例如以用本发明的方法制备的CTL为有效成分，与例如适于非经口途径施用的众知的有机或无机载体、赋形剂、稳定剂等混合进行。作为CTL，用本发明的CTL扩大培养方方法不使用EBV感染细胞而制备的CTL特别适用于该目的。治疗剂中CTL的含有量，治疗剂的施用量，与该治疗剂相关的诸多条件均可按照众所周知的过继性免疫疗法适当确定。
以下列举实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明并不限于此。
实施例1应用透明质酸扩大培养具有特异性细胞杀伤活性的CTL的方法
实施例1-1
(1)PBMC的分离及保存
从具有HLA-A2.1的健康供者实施成分采血后，用PBS(-)2倍稀释所采血液，Ficoll-paque[Pharmacia]上分层后，500g离心20分钟。离心后，用吸管回收中间层的外周血单核细胞(PBMC)，洗涤。将采集的PBMC悬浮于由90％FBS[Bio Whittaker]/10％DMSO[Sigma]构成的保存液中，液氮中保存。诱导CTL时，37℃水浴中迅速融解保存的PBMC，用含10μg/ml DNase[Calbiochem]的RPMI1640培养基(Bio Whittaker)洗涤后，用苔盼蓝染色法算出细胞数供给各实验。
(2)抗流感病毒记忆性CTL的诱导
部分改变Bednarek等的方法[BednarekM.A.等，J.Immunology.，第147卷，第4047-4053页(1991)]进行抗流感病毒记忆性CTL的诱导。即，将在实施例1-1-(1)中制备的PBMC悬浮到含有5％人AB型血清、0.1mM非必须氨基酸、1mM丙酮酸钠、2mML-谷氨酰胺(均为Bio Whittaker公司产品)、10mM HEPES(ナカライテスク)、1％链霉素-青霉素(Gibcol)的RPMI1640培养基(BioWhittaker)(以下略作5HRPMI)中，使之达到1-4×105细胞/ml，然后接种到24孔培养板中，1ml/孔，在5％CO2湿式培养箱中37℃培养1.5个小时，分离出塑料吸附性的单核细胞。然后，用RPMI1640培养基回收非粘附性细胞，作为应答细胞冰上保存。向分离出的单核细胞中加入含5μg/ml的流感病毒蛋白质来源的表位肽(序列表中SEQID NO：18中记载的基质蛋白来源的HLA-A2.1结合性肽)和1μg/ml的β2微球蛋白[Scrips]抗原肽的5HRPMI，每孔0.5ml，室温培养2小时，然后经X线照射(5500R)，作为抗原呈递细胞。从各孔吸去肽，用RPMI1640培养基洗涤各孔，将冰上保存的应答细胞悬浮到5HRPMI中，使之达到0.5.2×106细胞/ml，然后添加抗原呈递细胞，1ml/孔。此时，添加终浓度为10μg/ml的透明质酸(Calbiochem)。设定不添加样品的组作为对照。在5％CO2、37℃条件下培养培养板。培养开始后第2天，向各孔添加1ml含60U/ml IL-2(盐野义制药公司)和10μg/ml透明质酸的5HRPMI(对照组只含有IL-2)，第5天半量去除培养上清，然后添加1ml含同样IL-2和透明质酸的培养基(对照组只含有IL-2)。第7日，与说明同样制备抗原呈递细胞，将培养了1周的应答细胞悬浮到5HRPMI中，使其浓度达0.5-2×106细胞/ml，以1ml/孔添加到制备的抗原呈递细胞上进行再刺激。此时，添加终浓度为10μg/ml的透明质酸(对照组不添加)。再刺激后第2天向各孔添加1ml含60U/ml IL-2和10μg/ml透明质酸的5HRPMI(对照组只含有IL-2)，第5天半量去除培养上清，然后添加1ml与去除前同样内容的培养基，再继续培养2天，诱导CTL。
(3)CTL细胞杀伤活性的测定
通过应用Calcein-AM的细胞杀伤活性测定方法[Lichtenfels R.等，J.Immunol.Methods，第172卷，第2期，第227-239页(1994)]来评价实施例1-1-(2)中制备的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性。与表位肽共培养1晚，或将表位肽不存在下培养的保持HLA-A2.1的EBV转化的B细胞(细胞名：221 A2.1)悬浮到含5％FBS(胎牛血清，Bio Whittaker)的RPMI1640培养基中，使之达1×106细胞/ml，然后添加终浓度为25μM的Calcein-AM[Dotite]，37℃培养1小时。用不含Calcein-AM的培养基洗涤细胞后，与20倍量的K562细胞(ATCC CCL-243)混合，作为Calcein标记的靶细胞。应用K562细胞是为了排除混入应答细胞中的NK细胞的非特异性杀伤活性。
将在实施例1-1-(2)中制备的记忆性CTL作为效应细胞，用5HRPMI梯度稀释成1×105-9×106细胞/ml后，以100μl/孔加到96孔细胞培养板的各孔中，向其中添加1×105/ml的Calcein标记的靶细胞，100μl/孔。将加入上述细胞悬液的培养板在400g离心1分钟后，在37℃的湿式培养箱中培养4小时。4小时后，从各孔吸上清100μl，用荧光板读数仪(485nm/538nm)测定培养上清中释放出的Calcein量。按下式1计算出“特异性细胞杀伤活性(％)”。
式1：特异性细胞杀伤活性(％)＝{(各孔的测定量-最小释放量)/(最大释放量-最小释放量)}×100
上式中，最小释放量是指只含靶细胞和K562细胞的孔的Calcein释放量，表示靶细胞的Calcein自然释放量。最大释放量是指向靶细胞中加入0.1％Triton X-100(ナカライテスク)使细胞完全破裂时释放的Calcein量。其结果是，诱导后可诱导出特异性细胞杀伤活性，但诱导时有无添加透明质酸其细胞杀伤活性几乎无差异。
(4)CTL的扩大培养
用5HRPMI洗涤在实施例1-1-(2)中制备的CTL后，制备成3×104细胞/ml。X线照射(3300R)用工与实施例1-1-(1)同样的方法采集的HLA-A2.1非保持allogenic PBMC，用培养基洗涤后，制备成2-5×106细胞/ml。将该3×104细胞/ml的CTL及4-10×106细胞/ml的allogenic PBMC悬浮到10ml 5HRPMI中，再加入终浓度为50ng/ml的抗CD3抗体(Janssen Kyowa)，加到12.5cm2的培养瓶(Falcon)中，37℃湿式CO2培养箱中培养14天。此时，设定添加实施例1-1-(2)中诱导CTL时添加的透明质酸的组(终浓度10μg/ml)和不添加的组。此间，用肽进行刺激或完全不进行，培养开始第1天添加终浓度120U/ml的IL-2，再开始培养后第4天以后每2-3天半量去除培养上清，向各培养瓶添加5ml含60U/ml IL-2的5HRPMI。此时，透明质酸添加组的培养基中添加同浓度的样品。扩大培养开始后，第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL的特异性细胞杀伤活性。测定结果如表1所示。表中E/T是效应细胞数(E)与靶细胞数(T)的比，肽添加表示对靶细胞有无添加肽。扩大增殖率是以扩大培养结束时的细胞数对扩大培养开始时的细胞数的比值作为增殖率求出的。
表1
样品 添加样品* 扩大增 附加 细胞杀伤活性(％)
CTL诱 扩大培 殖率 肽 E/T比
导时 养时 (倍) 1 3 10 30
对照 - - 547 - 7.3 8.4 9.1 12.7
- - 547 + 8.1 11.2 21.5 45.9
透明 + + 493 - 7.3 8.6 13.1 17.0
质酸 + + 493 + 31.1 49.8 90.8 105.6
*：+：添加样品；-：未添加样品
+：附加肽；-：未附加肽
结果是，CTL诱导时及扩大培养时添加透明质酸的组中，在扩大培养后的第14天，CTL保持有高特异性的细胞杀伤活性。另一方面，无论CTL诱导时还是扩大培养时，未添加样品的组中其活性明显降低。总而言之，结果表明在CTL诱导时及扩大培养时添加透明质酸，可在长期保持高特异性的细胞杀伤活性状态下进行CTL的扩大培养。
实施例1-2
(1)抗流感病毒记忆性CTL的诱导
应用用实施例1-1-(1)中的方法分离、保存的PBMC，用与实施例1-1-(2)同样的方法，诱导抗流感病毒记忆性CTL。此时，添加终浓度达10μg/ml的透明质酸。并设定不添加样品的组。
用与实施例1-1-(3)同样的方法评价如此制备的诱导开始后第14天的CTL的特异性细胞杀伤活性。结果是，诱导后可诱导出特异性细胞杀伤活性，但诱导时有无添加抗体其细胞杀伤活性几乎无差异。
(2)CTL的扩大培养
应用实施例1-2-(1)中制备的CTL，用与实施例1-1-(4)同样的方法，进行CTL的扩大培养。此时，不添加实施例1-2-(1)中诱导CTL时添加的透明质酸的组。此间，不用肽进行刺激，培养开始第1天添加终浓度120U/ml的IL-2，再开始培养后第4天以后每2-3天半量去除培养上清，向各培养瓶添加5ml含60U/ml IL-2的5HRPMI。扩大培养开始后，第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL的特异性细胞杀伤活性。测定结果如表2所示。
表2
样品 添加样品* 扩大增 附加 细胞杀伤活性(％)
CTL诱 扩大培 殖率 肽 E/T比
导时 养时 (倍) 1 3 10 30
对照 - - 480 - 0 0 0.4 6.8
- - 480 + 4 11.2 29.3 59.7
透明 + + 423 - 0 0 1.9 14.3
质酸 + + 423 + 7.2 23.3 59.6 85.1
+ - 393 - 3.0 1.4 4.7 9.3
+ - 393 + 9.9 22.1 47.7 78.0
*：+：添加样品；-：未添加样品
+：附加肽；-：未附加肽
其结果是，仅在CTL诱导时添加透明质酸的组中，即便在扩大培养时未添加样品，14天的扩大培养后保持有高特异性的细胞杀伤活性。另一方面，无论CTL诱导时还是扩大培养时，未添加样品的组中其活性明显降低。总而言之，结果表明尽管只在CTL诱导时添加透明质酸，可在长期保持高特异性的细胞杀伤活性状态下进行CTL的扩大培养。
实施例1-3
(1)抗流感病毒记忆性CTL的诱导
应用用实施例1-1-(1)中的方法分离、保存的PBMC，用与实施例1-1-(2)同样的方法，诱导抗流感病毒记忆性CTL。此时设定添加透明质酸(表3中称作HA)(10μg/ml)的组和完全不添加样品的组。涉及透明质酸添加组的，设定同时共添加终浓度0.2μg/ml的抗CD44抗体(透明质酸结合阻断(Blocking)抗体；表中称作HA阻断抗CD44抗体)或抗CD44抗体(透明质酸结合非阻断(Non-Blocking)抗体；表中称作HA非阻断抗CD44抗体)(均为Ancell公司，单抗)的组，研究抗体的阻断效果。
用与实施例1-1-(3)同样的方法评价如此制备的诱导开始后第14天的CTL的特异性细胞杀伤活性。结果是，诱导后可诱导出特异性细胞杀伤活性，但诱导时有无添加抗体其细胞杀伤活性几乎无差异。
(2)CTL的扩大培养
应用实施例1-3-(1)中制备的CTL，用与实施例1-1-(4)同样的方法，进行CTL的扩大培养。此时，设定添加实施例1-3-(1)中诱导CTL时添加的终浓度lOμg/ml透明质酸的组和诱导时完全不添加透明质酸的组。另外，涉及到诱导时共添加透明质酸和抗CD44抗体的组，扩大培养时添加同样的样品和抗体。此间，不用肽进行刺激，培养开始第1天添加终浓度120U/ml的IL-2，再开始培养后第4天以后每2-3天半量去除培养上清，向各培养瓶添加5ml含60U/ml IL-2的5HRPMI。扩大培养开始后，第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL的特异性细胞杀伤活性。测定结果如表3所示。
表3
样品 添加样品* 扩大增 附加 细胞杀伤活性(％)
CTL 扩大培 殖率 肽 E/T比
诱导时 养时 (倍) 1 3 10 30
对照 - - 330 - 2.4 6.2 7.4 9.6
- - 330 + 3.9 5.8 7.2 10.9
HA + + 350 - 0 0 1.9 5.3
+ + 350 + 4.8 15.3 35.3 70.2
HA+HA阻 + + 357 - 5.9 4.7 15.0 14.9
断抗CD44 + + 357 + 10.9 11.8 19.5 17.5
抗体
HA+HA非 + + 413 - 6 4.7 5 7.6
阻断抗 + + 413 + 12.2 17.5 34.9 69.9
CD44抗体
*：+：添加样品；-：未添加样品
+：附加肽；-：未附加肽
其结果是，在CTL诱导时和扩大培养时添加透明质酸的组中，即便在14天的扩大培养后CTL保持有高特异性的细胞杀伤活性。另一方面，无论CTL诱导时还是扩大培养时，未添加样品的组中其活性明显降低。另外，在共添加透明质酸和抗CD44抗体(透明质酸结合阻断抗体)的组中，完全阻断了透明质酸的CTL活性维持效果。另一方面，共添加透明质酸和抗CD44抗体(透明质酸结合非阻断抗体)的组中，未阻断透明质酸的CTL活性维持效果。总而言之，透明质酸对细胞杀伤活性的维持效果是通过透明质酸与细胞表面上的CD44抗原结合而发挥作用的。
实施例2应用抗人CD44抗体扩大培养具有特异性细胞杀伤活性的CTL的方法
(1)抗流感病毒记忆性CTL的诱导
应用用实施例1-1-(1)中的方法分离、保存的PBMC，用与实施例1-1-(2)同样的方法，诱导抗流感病毒记忆性CTL。此时，添加终浓度为0.2μg/ml的纯化小鼠IgG1[Genzyme/Techne公司]或实施例1-3-(1)中使用的2种抗人CD44抗体。并设定未添加抗体的组。
用与实施例1-1-(3)同样的方法评价如此制备的诱导开始后第14天的CTL的特异性细胞杀伤活性。结果是，诱导后可诱导出特异性细胞杀伤活性，但诱导时有无添加抗体其细胞杀伤活性几乎无差异。
(2)CTL的扩大培养
应用实施例2-(1)中制备的CTL，用与实施例1-1-(4)同样的方法，进行CTL的扩大培养。此时，设定添加实施例2-(1)中诱导CTL时添加的终浓度0.2μg/ml小鼠IgG1或2种抗人CD44抗体的组和诱导时完全不添加抗体的组。此间，不用肽进行刺激，培养开始第1天添加终浓度120U/ml的IL-2，再开始培养后第4天以后每2-3天半量去除培养上清，向各培养瓶添加5ml含60U/ml IL-2及O.2μg/ml小鼠IgG1或2种抗人CD44抗体的5HRPMI。但，不添加抗体的组中在换培养基时不添加抗体。扩大培养开始后，第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL的特异性细胞杀伤活性。测定结果如表4所示。
表4
样品 添加样品* 扩大增 附加 细胞杀伤活性(％)
CTL 扩大培 殖率 肽 E/T比
诱导时 养时 (倍) 3 10 30
对照 - - 413 - 5.9 10.5 12.8
- - 413 + 4.0 14.8 48.9
小鼠IgG1 + + 357 - 5.6 0 2
+ + 357 + 6.2 6.8 13.3
HA非阻断 + + 357 - 10.3 14.2 21.2
抗CD44抗 + + 357 + 32.4 60.1 104.8
体
HA阻断抗 + + 420 - 1.6 1.3 3.5
CD44抗体 + + 420 + 9.5 9.8 17.7
*：+：添加样品；-：未添加样品
+：附加肽：-：未附加肽
其结果是，在CTL诱导时和扩大培养时添加抗人CD44抗体(透明质酸结合非阻断抗体)的组中，即便在14天的扩大培养后CTL保持有高特异性的细胞杀伤活性。另一方面，无论CTL诱导时还是扩大培养时，未添加这些抗体及添加抗人CD44抗体(透明质酸结合阻断抗体)的组中其活性明显降低。总之，CTL诱导时及扩大培养时添加抗人CD44抗体中不抑制透明质酸结合的抗体，可在长期保持高特异性的细胞杀伤活性状态下进行CTL的扩大培养。
实施例3透明质酸及抗人CD44抗体与可溶性或细胞表面上CD44抗原的结合性
CD44有2种存在方式，即在培养上清中以可溶性方式存在(以后称作可溶性CD44)和细胞膜表面上的存在方式(以后称作细胞表面上CD44)。CD44是透明质酸的受体，CTL扩大培养时通过添加透明质酸可起到维持细胞杀伤活性的效果，所以想检测这种活性维持效果依赖于哪一种CD44抗原。
实施例3-1
(1)可溶性CD44与透明质酸的结合性评价
用以下的方法评价透明质酸与可溶性CD44的结合性。即，将含5μg/ml抗人CD44抗体(可溶性CD44识别抗体，Ancell)的PBS(ニツスイ)加入到Nunc-Immuno板(Nunc)中，100μl/孔，室温过夜，用0.025％Tween20(SIGMA)/PBS洗涤3次后，添加封闭液(大日本制药公司)，300μl/孔，室温培养1小时以上。另一方面，在含有可溶性CD44(15ng/ml)的RPMI培养基中添加透明质酸，使之终浓度分别达0，0.25，0.5，1μg/ml，37℃培养1小时。再次用0.025％Tween20/PBS将封闭后培养板的各孔洗涤3次后，添加预培养的含有透明质酸或不含有透明质酸的含可溶性CD44(15ng/ml)的RPMI培养基，100μl/孔。再向各孔添加HRP标记的Conjugate[BenderMed，可溶性CD44测定用ELISA系统中附属的试剂]，50μl/孔，室温培养3小时。培养后，用0.025％Tween20/PBS将各孔洗涤3次，添加TMB(3，3’，5，5’-tetramethylbenzidine)溶液(SIGMA)，100μl/孔，室温培养15分钟后，添加2N硫酸，50μl/孔，终止反应。用酶标仪测定各孔的吸光度(450nm)。测定结果如图1所示。
结果是，即便在含可溶性CD44的培养基中添加透明质酸一点也不抑制可溶性CD44识别抗体的识别效果。这说明，透明质酸与培养基中存在的可溶性CD44不结合。由此表明，透明质酸对CTL的特异性细胞杀伤活性的维持效果与培养基中的可溶性CD44完全不相关。
(2)抗流感病毒记忆性CTL的诱导
应用按实施例1-1-(1)中描述的方法分离、保存的PBMC，用与实施例1-1-(2)同样的方法进行抗流感病毒记忆性CTL的诱导。
用实施例1-1-(3)同样的方法评价如此制备的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性。结果是，诱导开始后，可诱导出特异性细胞杀伤活性。
(3)CTL的扩大培养
用实施例3-1-(2)中制备的CTL，用与实施例1-1-(4)同样的方法，进行CTL的扩大培养。此间，不用肽进行刺激，培养开始第1天添加终浓度120U/ml的IL-2，再开始培养后第4天以后每2-3天半量去除培养上清，向各培养瓶添加5ml含60U/ml IL-2的5HRPMI。扩大培养开始后，第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL的特异性细胞杀伤活性，可以确认这些CTL具有特异性细胞杀伤活性。
(4)透明质酸与细胞表面上CD44的结合性评价
用含1％多聚甲醛(ナカライ)的PBS(ニツスイ)固定实施例3-1-(3)中制备的2×105细胞的CTL后，用PBS洗涤。将固定的细胞悬浮到含10μg/ml FL标记的透明质酸[Molecular Probes]的PBS中，37℃培养30分钟。以在不含FL标记的透明质酸(FL-HA)的PBS中进行培养的组作为阴性对照。培养后，用PBS洗涤，再次悬浮到含1％多聚甲醛的PBS中。将制备的CTL上FACS Vantage[Becton，Dickinson]，测定细胞表面上的荧光强度。结果示于图2中。
结果显示，FL标记的透明质酸结合到CTL的细胞表面上。这表明透明质酸通过与存在于CTL细胞表面上的CD44结合而发挥其CTL特异性细胞杀伤活性的维持效果。
实施例3-2
(1)抗人CD44抗体(HA非阻断抗CD44抗体)与可溶性CD44的结合性评价
用以下方法评价HA非阻断抗CD44抗体与可溶性CD44的结合性。即，将含5μg/ml HA非阻断抗CD44抗体或抗人CD44抗体(可溶性CD44识别抗体，Ancell)的PBS(ニツスイ)作为1抗加入到Nunc-Immuno板(Nunc)中，100μl/孔，室温过夜，用0.025％Tween20(SIGMA)/PBS洗涤3次后，添加封闭液(大日本制药公司)，300μl/孔，室温培养1小时以上。再次用0.025％Tween20/PBS将封闭后培养板的各孔洗涤3次后，添加含可溶性CD44(15ng/ml)的RPMI培养基，100μl/孔。再向各孔添加HRP标记的Conjugate[BenderMed，可溶性CD44测定用ELISA系统中附属的试剂]，50μl/孔，室温培养3小时。培养后，用0.025％Tween20/PBS将各孔洗涤3次，添加TMB溶液(SIGMA)，100μl/孔，室温培养15分钟后，添加2N硫酸，50μl/孔，终止反应。用酶标仪测定各孔的吸光度(450nm)。实验进行2次，取其平均值，结果如图3、图4所示。作为初级抗体应用的可溶性CD44识别抗体以抗体浓度依赖性方式识别培养基中的可溶性CD44。另一方面，HA非阻断抗CD44抗体完全不识别培养基中的可溶性CD44。总之，HA非阻断抗CD44抗体不结合培养基中存在的可溶性CD44。这表明HA非阻断抗CD44抗体对CTL特异性细胞杀伤活性的维持效果与培养基中的可溶性CD44完全不相干。
(2)抗流感病毒记忆性CTL的诱导
应用按实施例1-1-(1)中描述的方法分离、保存的PBMC，用与实施例1-1-(2)同样的方法进行抗流感病毒记忆性CTL的诱导。
用实施例1-1-(3)同样的方法评价如此制备的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性。结果是，诱导开始后，可诱导出特异性细胞杀伤活性。
(3)CTL的扩大培养
用实施例3-2-(2)中制备的CTL，用与实施例1-1-(4)同样的方法，进行CTL的扩大培养。此间，不用肽进行刺激，培养开始第1天添加终浓度120U/ml的IL-2，再开始培养后第4天以后每2-3天半量去除培养上清，向各培养瓶添加5ml含60U/ml IL-2的5HRPMI。扩大培养开始后，第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL的特异性细胞杀伤活性，可以确认这些CTL具有特异性细胞杀伤活性。
(4)抗人CD44抗体(HA非阻断抗CD44抗体)与可溶性CD44的结合性评价
用含1％多聚甲醛(ナカライ)的PBS(ニツスイ)固定实施例3-2-(3)中制备的2×105细胞的CTL后，用PBS洗涤。将固定的细胞悬浮到含1μg/ml抗CD44/FITC(FITC标记的HA非阻断抗CD44抗体(CD44-FITC)，Ancell)的1％BSA(SIGMA)PBS中，冰上放置30分钟。以在含1μg/ml小鼠IgG1/FITC(FITC标记的小鼠IgG1抗体(IgG1-FITC)，DAKO)的PBS中进行培养的组作为阴性对照。培养后，用PBS洗涤，再次悬浮到含1％多聚甲醛的PBS中。将制备的CTL上FACS Vantage，测定细胞表面上的荧光强度。结果示于图5中。
结果显示，FL标记的非阻断抗CD44抗体结合到CTL的细胞表面上。这表明透明质酸通过与存在于CTL细胞表面上的CD44结合而发挥抗人非阻断抗CD44抗体对CTL特异性细胞杀伤活性的维持效果。
实施例3-3
(1)抗流感病毒记忆性CTL的诱导
应用按实施例1-1-(1)中描述的方法分离、保存的PBMC，用与实施例1-1-(2)同样的方法进行抗流感病毒记忆性CTL的诱导。此时，添加终浓度为0.2μg/ml的HA非阻断抗CD44抗体。还设定未添加抗体组。
用实施例1-1-(3)同样的方法评价如此制备的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性。结果是，诱导开始后，可诱导出特异性细胞杀伤活性，但诱导时有无添加抗体，其细胞杀伤活性几乎无差异。
(2)CTL的扩大培养
用实施例3-3-(1)中制备的CTL，用与实施例1-1-(4)同样的方法，进行CTL的扩大培养。此时，添加实施例3-3-(1)中诱导CTL时添加的HA非阻断抗CD44抗体，使其终浓度为0.2μg/ml。另外，诱导时不添加抗体的组中此时也不添加抗体。此间，不用肽进行刺激，培养开始第1天添加终浓度120U/ml的IL-2，再开始培养后第4天以后每2-3天半量去除培养上清，向各培养瓶添加5ml含60U/ml IL-2及0.2μg/ml HA非阻断抗CD44抗体的5HRPMI。但，未添加抗体的组中，换培养基时不添加抗体。扩大培养开始后，第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL的特异性细胞杀伤活性。结果确认，CTL诱导时和扩大培养时添加HA非阻断抗CD44抗体的组中，即便在14天的扩大培养后，CTL维持高特异性的细胞杀伤活性，另一方面，无论CTL诱导时还是扩大培养时，未添加抗体的组中，其活性明显降低。
(3)HA非阻断抗CD44抗体添加扩大培养后CTL细胞表面上抗体结合性评价
用含1％多聚甲醛(ナカライ)的PBS(ニツスイ)固定实施例3-3-(1)中制备的2×105细胞的CTL(在添加HA非阻断抗CD44抗体的条件下进行培养的CTL)后，用PBS洗涤。将固定的细胞悬浮到含1μg/ml FITC标记的小鼠IgG或FITC标记的小鼠IgG抗体的1％BSA(SIGMA)PBS中，冰上放置30分钟。培养后，用PBS洗涤，再次悬浮到含1％多聚甲醛的PBS中。将制备的CTL上FACSVantage，测定细胞表面上的荧光强度。结果示于图6中。
结果显示，在非阻断抗CD44抗体添加的条件下扩大培养的CTL的细胞表面上结合有该抗体。这表明HA非阻断抗CD44抗体对CTL特异性细胞杀伤活性的维持效果是通过该抗体与CTL细胞表面上存在的CD44结合而发挥的。
实施例4应用抗人HGF抗体扩大培养保持特异性细胞杀伤活性的CTL
实施例4-1
(1)抗流感病毒记忆性CTL的诱导
应用按实施例1-1-(1)中描述的方法分离、保存的PBMC，用与实施例1-1-(2)同样的方法进行抗流感病毒记忆性CTL的诱导。此时，添加终浓度为0.2μg/ml的纯化小鼠IgG(Genzyme/Techne)或抗人HGF抗体(小鼠单克隆抗体，Genzyme/Techne)。还设定未添加抗体组。
用实施例1-1-(3)同样的方法评价如此制备的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性。结果是，诱导开始后，可诱导出特异性细胞杀伤活性，但诱导时有无添加抗体，其细胞杀伤活性几乎无差异。
(2)CTL的扩大培养
用实施例4-1-(1)中制备的CTL，用与实施例1-1-(4)同样的方法，进行CTL的扩大培养。此时，设定添加实施例4-1-(1)中诱导CTL时添加的终浓度为2μg/ml的小鼠IgG1或抗人HGF抗体的组别，和诱导时不添加抗体的组别。此间，不用肽进行刺激，培养开始第1天添加终浓度120U/ml的IL-2，再开始培养后第4天以后每2-3天半量去除培养上清，向各培养瓶添加5ml含60U/ml IL-2及2μg/ml小鼠IgG1或抗人HGF抗体的5HRPMI。但，未添加抗体的组中，换培养基时不添加抗体。扩大培养开始后，第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL的特异性细胞杀伤活性。测定结果如表5所示。
表5
样品 添加样品* 扩大增 附加 细胞杀伤活性(％)
CTL诱 扩大培 殖率 肽 E/T比
导时 养时 (倍) 1 3 10 30
对照 - - 340 - 0.6 0.6 1.5 19.4
- - 340 + 0 3.2 6.8 21.3
小鼠 + + 207 - 0 0 0.1 3.9
IgG1 + + 207 + 0 4.1 9.3 30.3
抗 + + 435 - 1.2 3.1 0 4.0
HGF + + 435 + 7.2 19.5 39.6 74.5
抗体
*：+：添加样品；-：未添加样品
+：附加肽；-：未附加肽
结果，CTL诱导时和扩大培养时添加抗人HGF抗体的组中，即便在14天的扩大培养后，CTL维持高特异性的细胞杀伤活性。另一方面，无论CTL诱导时还是扩大培养时，未添加抗体的组中，其活性明显降低。总之，通过CTL诱导时及扩大培养时添加抗人HGF抗体，可在长期保持特异的高效细胞杀伤活性的状态下进行CTL的扩大培养。
实施例4-2
(1)抗流感病毒记忆性CTL的诱导
应用按实施例1-1-(1)中描述的方法分离、保存的PBMC，用与实施例1-1-(2)同样的方法进行抗流感病毒记忆性CTL的诱导。此时，添加终浓度为2μg/ml的抗人HGF抗体(小鼠单克隆抗体，Genzyme/Techne)。还设定未添加抗体组。
用实施例1-1-(3)同样的方法评价如此制备的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性。结果是，诱导开始后，可诱导出特异性细胞杀伤活性，但诱导时有无添加抗体，其细胞杀伤活性几乎无差异。
(2)CTL的扩大培养
用实施例4-2-(1)中制备的CTL，用与实施例1-1-(4)同样的方法，进行CTL的扩大培养。此时，不添加实施例4-2-(1)中诱导CTL时添加的抗人HGF抗体。此间，不用肽进行刺激，培养开始第1天添加终浓度120U/ml的IL-2，再开始培养后第4天以后每2-3天半量去除培养上清，向各培养瓶添加5ml含60U/ml IL-2的5HRPMI。扩大培养开始后，第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL的特异性细胞杀伤活性。测定结果如表6所示。
表6
样品 添加样品* 扩大增 附加 细胞杀伤活性(％)
CTL诱 扩大培 殖率 肽 E/T比
导时 养时 (倍) 1 3 10 30
对照 - - 547 - 7.3 8.4 9.1 12.7
- - 547 + 8.1 11.2 21.5 45.9
抗 + + 540 - 6.8 7.3 8.5 10.2
HGF + + 540 + 23.3 40.8 72.4 103.4
抗体 + - 463 - 7.4 7.9 10.5 14.4
+ - 463 + 22.2 38.1 70.4 94.5
*：+：添加样品；-：未添加样品
+：附加肽；-：未附加肽
结果，仅在CTL诱导时添加抗人HGF抗体的组中，即便在扩大培养时不添加该抗体，14天的扩大培养后，CTL维持高特异性的细胞杀伤活性。另一方面，无论CTL诱导时还是扩大培养时，未添加抗体的组中，其活性明显降低。结果表明，即便仅在CTL诱导时添加抗人HGF抗体，也可在长期保持特异的高效细胞杀伤活性的状态下进行CTL的扩大培养。
实施例5应用抗人IGF-1抗体扩大培养保持特异性细胞杀伤活性的CTL
实施例5-1
(1)抗流感病毒记忆性CTL的诱导
应用按实施例1-1-(1)中描述的方法分离、保存的PBMC，用与实施例1-1-(2)同样的方法进行抗流感病毒记忆性CTL的诱导。此时，添加终浓度为2μg/ml的纯化羊IgG(CHEMICONInternational)或抗人IGF-1抗体(羊多克隆抗体，Genzyme/Techne)。还设定未添加抗体组。
用实施例1-1-(3)同样的方法评价如此制备的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性。结果是，诱导开始后，可诱导出特异性细胞杀伤活性，但诱导时有无添加抗体，其细胞杀伤活性几乎无差异。
(2)CTL的扩大培养
用实施例5-1-(1)中制备的CTL，用与实施例1-1-(4)同样的方法，进行CTL的扩大培养。此时，设定添加实施例5-1-(1)中诱导CTL时添加的终浓度为2μg/ml的羊IgG或抗人IGF-1抗体的组别，和诱导时不添加抗体的组别。此间，不用肽进行刺激，培养开始第1天添加终浓度120U/ml的IL-2，再开始培养后第4天以后每2-3天半量去除培养上清，向各培养瓶添加5ml含60U/ml IL-2及2μg/ml羊IgG或抗人IGF-1抗体的5HRPMI。但，未添加抗体的组中，换培养基时不添加抗体。扩大培养开始后，第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL的特异性细胞杀伤活性。测定结果如表7所示。
表7
样品 添加样品* 扩大增 附加 细胞杀伤活性(％)
CTL诱 扩大培 殖率 肽 E/T比
导时 养时 (倍) 1 3 10 30
对照 - - 340 - 0.8 0.6 1.5 19.4
- - 340 + 0 3.2 6.8 21.3
羊IgG + + 463 - 0 0 1.6 5.6
+ + 463 + 0.7 2.1 6.6 18.9
抗 + + 368 - 0 0 0.4 3.4
IGF-1 + + 368 + 13.0 40.2 80.4 90.9
抗体
*：+：添加样品；-：未添加样品
+：附加肽；-：未附加肽
结果，CTL诱导时和扩大培养时添加抗人IGF-1抗体的组中，即便在14天的扩大培养后，CTL维持高特异性的细胞杀伤活性。另一方面，无论CTL诱导时还是扩大培养时，未添加抗体的组中，其活性明显降低。总之，通过CTL诱导时及扩大培养时添加抗人IGF-1抗体，可在长期保持特异的高效细胞杀伤活性的状态下进行CTL的扩大培养。
实施例5-2
(1)抗流感病毒记忆性CTL的诱导
应用按实施例1-1-(1)中描述的方法分离、保存的PBMC，用与实施例1-1-(2)同样的方法进行抗流感病毒记忆性CTL的诱导。此时，添加终浓度为2μg/ml的抗人IGF-1抗体(羊多克隆抗体，Genzyme/Techne)。还设定未添加抗体组。
用实施例1-1-(3)同样的方法评价如此制备的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性。结果是，诱导开始后，可诱导出特异性细胞杀伤活性，但诱导时有无添加抗体，其细胞杀伤活性几乎无差异。
(2)CTL的扩大培养
用实施例5-2-(1)中制备的CTL，用与实施例1-1-(4)同样的方法，进行CTL的扩大培养。此时，不添加实施例5-2-(1)中诱导CTL时添加的抗人IGF-1抗体。此间，不用肽进行刺激，培养开始第1天添加终浓度120U/ml的IL-2，再开始培养后第4天以后每2-3天半量去除培养上清，向各培养瓶添加5ml含60U/ml IL-2的5HRPMI。扩大培养开始后，第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL的特异性细胞杀伤活性。测定结果如表8所示。
表8
样品 添加样品* 扩大增 附加 细胞杀伤活性(％)
CTL诱 扩大培 殖率 肽 E/T比
导时 养时 (倍) 1 3 10
对照 - - 547 - 7.3 8.4 9.1
- - 547 + 8.1 11.2 21.5
抗 + + 637 - 3.8 3.2 7.5
IGF-1 + + 637 + 20.8 47.4 69.0
抗体 + - 553 - 9.4 11.6 15.0
+ - 553 + 49.6 82.6 111.0
*：+：添加样品；-：未添加样品
+：附加肽；-：未附加肽
结果，在CTL诱导时添加抗人IGF-1抗体的组中，即便在扩大培养时不添加该抗体，14天的扩大培养后，CTL维持高特异性的细胞杀伤活性。另一方面，无论CTL诱导时还是扩大培养时，未添加抗体的组中，其活性明显降低。结果表明，即便仅在CTL诱导时添加抗人IGF-1抗体，也可在长期保持特异的高效细胞杀伤活性的状态下进行CTL的扩大培养。
实施例6应用抗人IGF-2抗体扩大培养保持特异性细胞杀伤活性的CTL
(1)抗流感病毒记忆性CTL的诱导
应用按实施例1-1-(1)中描述的方法分离、保存的PBMC，用与实施例1-1-(2)同样的方法进行抗流感病毒记忆性CTL的诱导。此时，添加终浓度为2μg/ml的纯化小鼠IgG1(Genzyme/Techne)或抗人IGF-2抗体(小鼠单克隆抗体，Genzyme/Techne)。还设定未添加抗体组。
用实施例1-1-(3)同样的方法评价如此制备的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性。结果是，诱导开始后，可诱导出特异性细胞杀伤活性，但诱导时有无添加抗体，其细胞杀伤活性几乎无差异。
(2)CTL的扩大培养
用实施例6-(1)中制备的CTL，用与实施例1-1-(4)同样的方法，进行CTL的扩大培养。此时，设定添加实施例6-(1)中诱导CTL时添加的终浓度为2μg/ml的小鼠IgG1或抗人IGF-2抗体的组别，和从诱导时开始不添加抗体的组别。此间，不用肽进行刺激，培养开始第1天添加终浓度120U/ml的IL-2，再开始培养后第4天以后每2-3天半量去除培养上清，向各培养瓶添加5ml含60U/ml IL-2及2μg/ml小鼠IgG1或抗人IGF-2抗体的5HRPMI。但，未添加抗体的组中，换培养基时不添加抗体。扩大培养开始后，第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL的特异性细胞杀伤活性。测定结果如表9所示。
表9
样品 添加样品* 扩大增 附加 细胞杀伤活性(％)
CTL诱 扩大培 殖率 肽 E/T比
导时 养时 (倍) 1 3 10 30
对照 - - 237 - 2.1 3.9 5.6 9.7
- - 237 + 0 4.1 6.9 12.4
小鼠 + + 370 - 0 0 0 0
IgG1 + + 370 + 0 0 0 3.1
抗 + + 225 - 3.9 5.0 5.8 10.2
IGF-2 + + 225 + 7.1 16.5 37.7 71.5
抗体
*：+：添加样品：-：未添加样品
+：附加肽；-：未附加肽
结果，CTL诱导时和扩大培养时添加抗人IGF-2抗体的组中，即便在14天的扩大培养后，CTL维持高特异性的细胞杀伤活性。另一方面，无论CTL诱导时还是扩大培养时，未添加抗体的组中，其活性明显降低。这表明即便仅在CTL诱导时添加抗人IGF-2抗体，也可在长期保持特异的高效细胞杀伤活性的状态下进行CTL的扩大培养。
实施例7维持肿瘤相关抗原特异性细胞杀伤活性的CTL的扩大培养
实施例7-1
(1)肿瘤相关抗原(MAG3)特异的CTL的诱导
应用用实施例1-1-(1)中的方法分离、保存的PBMC进行肿瘤相关抗原(melanoma-associated antigen 3，MAG3)特异的CTL的诱导。部分改变Plebanski M.等的方法[Plebanski M.等，Eur.J.Immunol.，第25卷，第6期，第1783-1787页(1995)]进行肿瘤相关抗原(MAG3)特异的CTL的诱导。即，将实施例1-1-(1)中制备的PBMC悬浮到5HRPMI中，浓度达2-4×107细胞/ml，等量分为两份。一半作为应答细胞冰上保存，一半作为抗原呈递细胞，等量添加含80μg/ml黑色素瘤抗原MAG3来源的表位肽(序列表的SEQ ID NO：19中的黑色素瘤抗原MAG3来源的HLA-A2.1结合性肽)及6μg/ml β2微球蛋白(Scrips)抗原肽的5HRPMI，5％CO2湿式培养箱中37℃培养2小时。其后，用5HRPMI洗涤，与冰上保存的应答细胞混合，制备成2×106细胞/ml。分别添加终浓度为25ng/ml、5μg/ml的IL-7和KLH，24孔培养板(Falcon)中，2ml/孔。此时，添加终浓度10μg/ml的透明质酸(Calbiochem)。另外，设定不添加样品的组别作对照。5％CO2、37℃培养培养板。培养开始后第4天半量换液，各孔添加1ml含60U/ml IL-2和10μg/ml透明质酸的5HRPMI(对照只含有IL-2)。第7日，同样制备抗原呈递细胞后，X线照射(5500R)，调配成4×106细胞/ml。将培养了1周的应答细胞悬浮到5HRPMI中，浓度达2×106细胞/ml，与制备的抗原呈递细胞等量混合，添加到24孔培养板中，1ml/孔，再添加终浓度25ng/ml的IL-7，进行再刺激。此时，添加终浓度10μg/ml的透明质酸(对照不添加)。再刺激后第1天向各孔添加1ml含60U/ml IL-2和10μg/ml透明质酸的5HRPMI(对照只含有IL-2)，第3天半量换液后，添加1ml与换液前相同内容的培养基。1周间再实施同样的再刺激1次，共4次，诱导CTL。
(2)CTL细胞杀伤活性的测定
用与实施例1-1-(3)同样的方法评价实施例7-1-(1)中制备的诱导开始后第35天的CTL的细胞杀伤活性。但此时，用与表位肽共培养一晚或在表位肽不存在的条件下培养的HLA-A2.1 EBV转染的B细胞(细胞名221A2.1)作为靶细胞。结果，诱导之后可诱导出特异性细胞杀伤活性，但诱导时有无添加透明质酸其细胞杀伤活性几乎无差异。
(3)CTL的扩大培养
用实施例7-1-(1)中制备的CTL，用与实施例1-1-(4)同样的方法，进行CTL的扩大培养。此时，设定添加实施例7-1-(1)中诱导CTL时添加的10μg/ml透明质酸的组别，和从诱导时开始不添加样品的组别。此间，不用肽进行刺激，培养开始第1天添加终浓度120U/ml的IL-2，再开始培养后第4天以后每2-3天半量去除培养上清，向各培养瓶添加5ml含60U/ml IL-2及10μg/ml透明质酸的5HRPMI。但，未添加抗体的组中，换培养基时不添加样品。扩大培养开始后，第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL的特异性细胞杀伤活性。测定结果如表10所示。
表10
样品 添加样品* 扩大增 附加 细胞杀伤活性(％)
CTL诱 扩大培 殖率 肽 E/T比
导时 养时 (倍) 2 6
对照 - - 237 - 0 0
- - 237 + 29.8 56.0
透明 + + 217 - 3.6 0
质酸 + + 217 + 50.3 67.7
*”+：添加样品；-：未添加样品
+：附加肽；-：未附加肽
结果，CTL诱导时和扩大培养时添加透明质酸的组中，即便在14天的扩大培养后，CTL维持高特异性的细胞杀伤活性。另一方面，无论CTL诱导时还是扩大培养时，未添加样品的组中，其活性明显降低。这表明抗肿瘤相关抗原(MAGE3)CTL的扩大培养时，通过在诱导时及扩大培养时添加透明质酸，可在长期保持特异的高效细胞杀伤活性的状态下进行CTL的扩大培养。
实施例7-2
(1)肿瘤相关抗原(MART1)特异性CTL的诱导
应用用实施例1-1-(1)中的方法分离、保存的PBMC，用与实施例7-1-(1)同样的方法进行肿瘤相关抗原(melanoma antigen recognizedby T cell，MART1)特异的CTL的诱导。用黑色素瘤抗原MART1来源的表位肽(序列表的SEQ ID NO：20中的MART1来源的HLA-A2.1结合性肽)作抗原肽。此时，添加终浓度10μg/ml的透明质酸(Calbiochem)。另外，设定不添加样品的组别作对照。
用与实施例1-1-(3)同样的方法评价如此制备的诱导开始后第35天的CTL的细胞杀伤活性。但此时，用与表位肽共培养一晚或在表位肽不存在的条件下培养的HLA-A2.1 EBV转染的B细胞(细胞名221A2.1)、100U/mlIFN-γ存在下培养两晚的HLA-A2.1癌细胞株(细胞名624mel，保持HLA-A2.1的MART1表达细胞)或HLA-A2.1非保持细胞株(细胞名888mel，不保持HLA-A2.1的MART1表达细胞)作为靶细胞。
结果，诱导之后可诱导出特异性细胞杀伤活性，但诱导时有无添加样品其细胞杀伤活性几乎无差异。
(2)CTL的扩大培养
用实施例7-2-(1)中制备的CTL，用与实施例1-1-(4)同样的方法，进行CTL的扩大培养。此时，设定添加实施例7-2-(1)中诱导CTL时添加的10μg/ml透明质酸的组别，和从诱导时开始不添加样品的组别。此间，不用肽进行刺激，培养开始第1天添加终浓度120U/ml的IL-2，再开始培养后第4天以后每2-3天半量去除培养上清，向各培养瓶添加5ml含60U/ml IL-2及10μg/ml透明质酸的5HRPMI。但，未添加抗体的组中，换培养基时不添加样品。扩大培养开始后，第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL的特异性细胞杀伤活性。测定结果如表11所示。
表11
样品 添加样品* 扩大增 附加 靶细胞 细胞伤害活性(％)
CTL诱 扩大培 殖率 肽 E/T比
导时 养时 (倍) 2 7 20
对照 - - 287 - 221A2.1 0 3.8 4.1
- - 287 + 221A2.1 8.1 27.5 43.5
- - 287 - 888mel 32.5 44.8 43.7
- - 287 - 624mel 27.4 55.8 81.6
E/T比
2 6 17
透明 + + 217 - 221A2.1 0 0 0
质酸 + + 217 + 221A2.1 9.1 52.8 74.4
+ + 217 - 888mel 0 0 0
+ + 217 - 624mel 29.6 73.8 90.6
*：+：添加样品：-：未添加样品
+：附加肽；-：未附加肽
结果，CTL诱导时和扩大培养时添加透明质酸的组中，即便在14天的扩大培养后，CTL维持高特异性的细胞杀伤活性。另一方面，无论CTL诱导时还是扩大培养时，未添加样品的组中，其活性明显降低。另外，对于对于肿瘤细胞株特异的细胞杀伤活性而言，CTL诱导时和扩大培养时添加透明质酸的组中，即便在14天的扩大培养后，CTL维持高特异性的细胞杀伤活性。这表明抗肿瘤相关抗原(MART1)CTL的扩大培养时，通过在诱导时及扩大培养时添加透明质酸，可在长期保持特异的高效细胞杀伤活性的状态下进行CTL的扩大培养。
实施例8与REM法的比较及与REM法的组合
(1)抗流感病毒记忆性CTL的诱导
应用用实施例1-1-(1)中的方法分离、保存的PBMC，用与实施例1-1-(2)同样的方法进行抗流感病毒记忆性CTL的诱导。此时，添加终浓度10μg/ml的透明质酸作样品。另外，设定不添加样品的组别作对照。
用与实施例1-1-(3)同样的方法评价如此制备的诱导开始后第4天的CTL的细胞杀伤活性。应用5μg/ml的实施例1-(2)中描述的流感病毒蛋白质来源的表位肽作抗原肽。
(2)通过抗CD3抗体进行的保持特异性活性的CTL的扩大培养
用5HRPMI洗涤实施例8-(1)中制备的CTL后，制备成5×104细胞/ml。另一方面，X线照射(3300R)与实施例1-1-(1)同样采集的HLA-A24及A2.1非保持allogenic PBMC，用培养基洗涤后，制备成5×106细胞/ml。将3×104细胞的CTL及4-10×106细胞的allogenic PBMC悬浮到10ml 5HRPMI中，再加入终浓度50ng/ml的抗CD3抗体(ヤンセン协和)，加到12.5cm2的培养瓶(Falcon)中，37℃的湿式CO2培养箱中培养14天。此时，设定添加透明质酸样品(终浓度10μg/ml)的组，及不添加的组。此间，不用肽进行刺激，培养开始第1天添加终浓度120U/ml的IL-2，再开始培养后第4天以后每2-3天半量去除培养上清，向各培养瓶添加5ml含60U/ml IL-2的5HRPMI。此时，样品添加组的培养基中添加终浓度10μg/ml的透明质酸。扩大培养开始后，第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL的特异性细胞杀伤活性。测定结果如表12所示。
另一方面，如下实施用REM法进行的扩大培养。X线照射(3300R)HLA-A24及A2.1非保持allogenic PBMC，用培养基洗涤后，制备成5×106细胞/ml。另外，X线照射(8000R)EBV-B细胞，用培养基洗涤后，制备成1×106细胞/ml。将实施例8-1-(1)中制备的3×104细胞的CTL及4-10×106细胞的allogenic PBMC即2.5×106细胞的EBV-B细胞悬浮到10ml 5HRPMI中，再加入终浓度50ng/ml的抗CD3抗体(ヤンセン协和)，加到12.5cm2的培养瓶(Falcon)中，37℃的湿式CO2培养箱中培养1 4天。此时，设定添加透明质酸样品(终浓度10μg/ml)的组，及不添加的组。此间，不用肽进行刺激，培养开始第1天添加终浓度120U/ml的IL-2，再开始培养后第4天以后每2-3天半量去除培养上清，向各培养瓶添加5ml含60U/mlIL-2的5HRPMI。此时，样品添加组的培养基中添加终浓度10μg/ml的透明质酸。扩大培养开始后，第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL的特异性细胞杀伤活性。测定结果如表12所示。
表12
样品 添加样品* 添加 扩大增 附加 细胞伤害活性
EBV-B 殖率 肽 (％)
CTL 扩大培 细胞 (倍) E/T比
诱导时 养时 10
对照 - - - 392 - 6.2
- - - 392 + 10.6
透明质酸 + + - 335 - 2.3
+ + - 335 + 60.0
REM法 - - + 427 - 11.5
- - + 427 + 52.8
REM法+ + + + 587 - 8.1
透明质酸 + + + 587 + 95.5
*：+：添加样品；-：未添加样品
+：添加EMV-B病毒；-：未添加EMV-B病毒
+：附加肽；-：未附加肽
结果，未添加透明质酸诱导的CTL(未添加CTL活性维持物)用REM法扩大培养时维持高效细胞杀伤活性。但用不使用EBV-B细胞的方法进行扩大培养时，细胞杀伤活性显著降低。
另一方面，CTL诱导时和扩大培养时两发明添加透明质酸，即便不添加EBV-B细胞，在14天的扩大培养后可维持相当高的CTL细胞杀伤活性。况且，根据本发明进行扩大培养后，其抗原特异性细胞杀伤活性也比REM法高。
另外，用REM法进行扩大培养时，在扩大培养前，从诱导时开始，若添加本发明方法的具有CTL活性维持效果的物质之一-透明质酸，与单独用REM法扩大培养用以往的技术诱导的CTL相比，可高度维持细胞杀伤活性。
总而言之，本发明的CTL的扩大培养方法中，不必要使用REM法中所必需的EBV-B细胞，可避免应用EBV-B细胞的危险性。还可维持比REM法高的CTL活性。由此表明，本发明的CTL的扩大培养方法是比REM法安全的方法。
此外，将透明质酸引入REM法可维持高活性，所以透明质酸可能适于所有的CTL细胞的扩大培养方法。也就是说，通过在各种CTL扩大培养方法中利用本发明中使用的物质，可在长期保持特异的高效细胞杀伤活性的状态下，进行CTL的扩大培养。
实施例9纤粘连蛋白片段的制备
(1)纤粘连蛋白片段的制备
按照美国专利第5198423号公报，从大肠杆菌HB101/pHD101(FERM BP-2264)制备纤粘连蛋白来源的片段。
另外，分别用大肠杆菌HB101/pHD102(FERM P-10721)、大肠杆菌HB101/pCH101(FERM BP-2799)、大肠杆菌HB101/pCH102(FERMBP-2800)，用上述公报中的方法培养，从培养物中制备出纤粘连蛋白来源的片段H-296、CH-271、CH-296。
应用大肠杆菌JM109/pTF7221(FERM BP-1915)，按照美国专利第5102988号公报中的方法培养，从培养物中制备出纤粘连蛋白来源的片段C-274。
应用大肠杆菌HB101/pCS25(FERM BP-5723)，按日本专利第3104178号公报中的方法培养，从培养物中制备出纤粘连蛋白来源的片段C-CS1。
分别应用大肠杆菌HB101/pCHV89(FERM P-12182)、HB101/pCHV179(FERM P-12183)，按日本专利第2729712号公报中的方法培养，从培养物中制备出纤粘连蛋白来源的片段CHV-89/CHV-179。
另外，用上述公报中的方法制备纤粘连蛋白来源的片段CHV-90。即，按照该公报中的操作构建质粒pCHV90，培养携带该质粒的转化体，从培养物中制备CHV-90。
按WO97/18318的方法构建含有编码CHV-181的DNA的质粒(pCHV181)后，培养插入了该质粒的大肠杆菌(E.coliHB101/pCHV181)，用与上面CHV-179同样的方法，从培养物中制备纤粘连蛋白来源的片段CHV-181。
(2)CHV-92的制备
质粒pCHV181是用于表达上述多肽CHV-181的，用它构建缺失了编码CHV-181的区域中编码III-13的区域的质粒CHV92。缺失体的操作按日本专利第2729712号公报中记载的从质粒pCHV179制备III-14编码区域的缺失操作进行。
培养用上述质粒pCHV92转化的大肠杆菌HB101(E.coliHB101/pCHV92)，按日本专利第2729712号公报中记载的CHV-89多肽的纯化方法进行纯化，得到纯化的CHV-92标本。
(3)H-275-Cys的制备
按如下操作构建表达多肽H-275-Cys的质粒。即，从大肠杆菌HB101/pCH102(FERM BP-2800)制备质粒pCH102。以该质粒为模板，用序列表的SEQ ID NO：14中所示引物碱基序列12S和序列表的SEQ ID NO：15中所示引物碱基序列14A进行PCR，得到约0.8kb的编码纤粘连蛋白肝素结合多肽的DNA片段。用NcoI、BamHI(均为宝酒造制备)消化所得DNA片段，然后与用NcoI、BamHI消化的pTV118N(宝酒造)连接，构建质粒pRH1。
用BamHI和HincII(宝酒造)消化质粒载体pINIII-ompA1[Ghrayeb J.等，EMBO J.，第3卷，第10期，第2437-2442页(1984)]，回收含脂蛋白终止子区域的约0.9kb的DNA片段。将之与用BamHI和HincII消化的上述质粒pRH1混合，进行连接，得到依次含lac启动子、编码肝素结合多肽的DNA片段及脂蛋白终止子的质粒pRH1-T。
以质粒pRH1-T为模板，用引物Cys-A(序列表的SEQ ID NO：16中所示碱基序列)和引物Cys-S(序列表的SEQ ID NO：17中所示碱基序列)进行PCR后，用Not I(宝酒造)消化回收的扩增片段，再将该片段进行自身连接。用SpeI和ScaI(宝酒造)消化所得环状DNA，得到2.3kb的DNA片段，然后将该片段与用SpeI和ScaI(宝酒造)消化质粒pRH1-T而得的2.5kb的DNA片段混合，进行连接，得到质粒pRH-Cys。该质粒中，H-271的N末端附加了Met-Ala-Ala-Ser 4个氨基酸，并且可编码C末端附加了Cys的多肽(H-275-Cys)。
根据以下方法制备多肽H-275-Cys。在120ml LB培养基中培养用质粒pRH-Cys转化的大肠杆菌HB101(E.coli HB101/pRH-Cys)，37℃培养一晚。将从培养液中回收的菌体悬浮到40ml破碎用缓冲液(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，150mM NaCl，1mM DTT，1mM PMSF，pH7.5)中，进行超声波处理，破坏菌体。将离心所得上清过用纯化用缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5)平衡过的HiTrap-肝素柱(Pharmacia)。用同一缓冲液洗涤柱内的非吸附级分后，用具有0-1MNaCl浓度梯度的纯化缓冲液进行洗脱。通过SDS-PAGE分析洗脱液，收集与H-275-Cys分子量相对应的级分，得到纯化的H-275-Cys样品。
实施例10应用纤粘连蛋白片段(FNfr)扩大培养具有特异性细胞杀伤活性的CTL
(1)抗流感病毒记忆性CTL的诱导
应用按实施例1-1-(1)中描述的方法分离、保存的PBMC，用与实施例1-1-(2)同样的方法进行抗流感病毒记忆性CTL的诱导。此时，添加终浓度为10μg/ml的实施例9中的各纤粘连蛋白片段(以后记作FNfr)。设定未添加Fnfr的组作对照。
用实施例1-1-(3)同样的方法评价如此制备的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性。结果是，诱导开始后，可诱导出特异性细胞杀伤活性，但诱导时有无添加FNfr，其细胞杀伤活性几乎无差异。
(2)CTL的扩大培养
用实施例10-(1)中制备的CTL，用与实施例1-1-(4)同样的方法，进行CTL的扩大培养。此时，添加诱导CTL时所添加的FNfr，使其终浓度为10μg/ml。另外，不添加FNfr进行诱导的对照组中不添加FNfr。此间，不用肽进行刺激，培养开始第1天添加终浓度120U/ml的IL-2，再开始培养后第4天以后每2-3天半量去除培养上清，向各培养瓶添加5ml含60U/ml IL-25HRPMI或含10％Hyclone FBS、0.1mM非必须氨基酸、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺(均为Bio Whittaker)、10mM HEPES(ナカライテスク)、1％链霉素-青霉素(Gibcol BRL)的RPMI1640培养基(Bio Whittaker)(以下略作10 Hyclone RPMI)。此时，FNfr添加组的培养基中添加同浓度的FNfr。扩大培养开始后，第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL的特异性细胞杀伤活性。以“特异性细胞杀伤活性维持(％)”算出能将扩大培养前的特异性细胞杀伤活性维持到何等程度。按下式2计算特异性细胞杀伤活性维持(％)。测定结果如表13所示。
式2：特异性细胞杀伤活性维持(％)＝{扩大培养后的特异性细胞杀伤活性(％)/扩大培养前的特异性细胞杀伤活性(％)}
表13
培养基 纤粘连蛋白片 扩大增殖率 细胞杀伤活性
段 (倍) 维持(％)
E/T比＝3
5HRPMI 对照(未添加 417 17.3
FNfr)
CH-271 397 53.5
H-296 413 49.3
C-CS1 393 49.3
CHV-92 370 66.2
10HycloneRPMI 对照(未添加 130 48.1
FNfr)
CH-271 132 250.8
H-296 75 162.3
H-271 52 72.2
C-CS1 130 100.2
CHV-92 35 157.8
培养基 纤粘连蛋白片 扩大增殖率 细胞杀伤活性
段 (倍) 维持(％)
E/T比＝10
10HycloneRPMI 对照(未添加 42 46.3
FNfr)
CHV-89 35 69.0
CHV-90 36 75.6
如表13所示，与不添加纤粘连蛋白片段的对照组相比，诱导时及扩大培养时添加各种纤粘连蛋白片段的组中的CTL，在14天的扩大培养后保持有特异的高效细胞杀伤活性。总之，在纤粘连蛋白片段片段的共存下进行诱导、扩大培养，可在长期保持高效细胞杀伤活性的状态下进行CTL的扩大培养。
实施例11纤粘连蛋白存在下进行CTL诱导、扩大培养
(1)抗流感病毒记忆性CTL的诱导
应用按实施例1-1-(1)中描述的方法分离、保存的PBMC，用与实施例1-1-(2)同样的方法进行抗流感病毒记忆性CTL的诱导。此时，添加FNfr时添加终浓度为10μg/ml的纤粘连蛋白(Galbiochem)(对照组未添加)。用实施例1-1-(3)同样的方法评价如此制备的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性。诱导时有无添加FNff，其细胞杀伤活性几乎无差异。
(2)CTL的扩大培养
用与实施例10-(2)同样的方法，对实施例11-(1)中制备的CTL进行C扩大培养。此时，诱导时添加纤粘连蛋白的添加终浓度为10μg/ml的纤粘连蛋白(Galbiochem)(对照组未添加)。用与实施例1-1-(3)同样的方法测定所得CTL的特异性细胞杀伤活性，以“特异性细胞杀伤活性维持(％)”算出能将扩大培养前的特异性细胞杀伤活性维持到何等程度。测定结果如表14所示。
表14
扩大增殖率(倍) 细胞杀伤活性维持(％)
E/T比＝3
对照(未添加FNfr) 130 48.1
纤粘连蛋白 157 148.9
如表14所示，纤粘连蛋白存在下进行CTL诱导及扩大培养的组中，保持高效的细胞杀伤活性。另一方面，CTL诱导时及扩大培养时无论哪种未添加纤粘连蛋白的对照的细胞杀伤活性明显降低。总之，CTL诱导时及扩大培养时添加纤粘连蛋白，可在长期保持特异的高效细胞杀伤活性的状态下进行CTL的扩大培养。
实施例12固定化的纤粘连蛋白(FN)片段存在下进行的CTL的扩大培养
(1)固定化FN片段
将纤粘连蛋白片段固定化到以后的实验中使用的培养器材(容器)上。即，将含各种纤粘连蛋白片段(终浓度10μg/ml)的PBS添加到24孔培养板、12.5cm2培养瓶中，各1-2ml，室温孵育2小时后，4℃保存，直到使用。使用前，用PBS将上述培养板、培养瓶洗涤2次。
(2)抗流感病毒记忆性CTL的诱导
用与实施例1-1-(2)同样的方法，用按实施例1-1-(1)的方法分离、保存的PBMC，进行抗流感病毒记忆性CTL的诱导。此时，使用固定化了FNfr的培养板作培养器材(对照组中使用未进行固定化处理的培养板)。用实施例1-1-(3)的方法评价诱导后的CTL的细胞杀伤活性，诱导时有无使用固定化了FNfr的培养板对细胞杀伤活性的差异几乎无影响。
(3)CTL的扩大培养
用与实施例10-(2)同样的方法扩大培养实施例12-(2)中制备的CTL。此时，使用固定化了各种FNfr的培养瓶作培养器材(对照组中使用未进行固定化处理的培养瓶)。另外，培养基中应用10Hyclone/RPMI。
以“特异性细胞杀伤活性维持(％)”评价如此扩大培养的CTL的细胞杀伤活性与扩大培养前相比能维持到何等程度。按上式2计算“特异性细胞杀伤活性维持(％)”。测定结果如表15所示。
表15
纤粘连蛋白片段 扩大增殖率(倍) 细胞杀伤活性维持(％)
E/T比＝3
对照(FNfr非固定) 130 48.1
CH-271 128 95.4
H-296 27 95.0
H-271 40 133.9
C-CS1 130 73.8
H-275-Cys 87 137.7
CHV-92 122 92.7
如表15所示，CTL诱导时及扩大培养时使用固定化了纤粘连蛋白片段的培养器材(培养板、培养瓶)的组CTL，扩大培养后保持特异的高效细胞杀伤活性。另一方面，CTL诱导时及扩大培养时无论哪个使用未固定化纤粘连蛋白片段的培养器材的对照中，细胞杀伤活性明显降低。总之，通过使用固定化的纤粘连蛋白片段，可与溶解到培养基中的片段同样用于长期保持高效细胞杀伤活性的CTL的扩大培养。
实施例13维持肿瘤相关抗原特异的细胞杀伤活性的CTL的扩大培养
(1)肿瘤相关抗原(MART1)特异的CTL的诱导
应用按实施例1-1-(1)中的方法分离、保存的PBMC，用与实施例7-1-(1)同样的方法进行肿瘤相关抗原(melanoma antigen recognizedby T cell，MART1)特异的CTL的诱导。此时，添加终浓度2μg/ml的抗HGF抗体。另外，设定不添加样品的组别作对照。
用与实施例1-1-(3)同样的方法评价如此制备的诱导开始后第35天的CTL的细胞杀伤活性。但此时，用与表位肽共培养一晚或在表位肽不存在的条件下培养的HLA-A2.1 EBV转染的B细胞(细胞名221A2.1)、100U/ml IFN-γ存在下培养两晚的HLA-A2.1癌细胞株(细胞名624mel，保持HLA-A2.1的MART1表达细胞)或HLA-A2.1非保持细胞株(细胞名938mel，不保持HLA-A2.1的MART1表达细胞)作为靶细胞。
结果，诱导之后可诱导出特异性细胞杀伤活性，但诱导时有无添加样品其细胞杀伤活性几乎无差异。
(2)CTL的扩大培养
用实施例13-(1)中制备的CTL，用与实施例1-1-(4)同样的方法，进行CTL的扩大培养。此时，设定添加实施例13-(1)中诱导CTL时添加的2μg/ml抗HGF抗体的组别，和从诱导时开始不添加样品的组别。此间，不用肽进行刺激，培养开始第1天添加终浓度120U/ml的IL-2，再开始培养后第4天以后每2-3天半量去除培养上清，向各培养瓶添加5ml含60U/ml IL-2及2μg/ml抗HGF抗体的5HRPMI。但，未添加抗体的组中，换培养基时不添加样品。扩大培养开始后，第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL的特异性细胞杀伤活性。测定结果如表16所示。
表16
样品 添加样品* 扩大增 附加 靶细胞 细胞伤害活性
殖率 肽 (％)
CTL诱 扩大培 (倍) E/T比
导时 养时 3
对照 - - 83 - 221A2.1 0
- - 83 + 221A2.1 31.7
- - 83 - 938mel 2.3
- - 83 - 624mel 60.0
E/T比
3
抗HGF + + 107 - 221A2.1 0
抗体 + + 107 + 221A2.1 59.1
+ + 107 - 938mel 0
+ + 107 - 624mel 81.2
*：+：添加样品；-：未添加样品
+：附加肽；-：未附加肽
结果，CTL诱导时和扩大培养时添加抗HGF抗体的组中，即便在14天的扩大培养后，CTL维持高特异性的细胞杀伤活性。另一方面，无论CTL诱导时还是扩大培养时，未添加样品的组中，其活性明显降低。另外，对于对于肿瘤细胞株特异的细胞杀伤活性而言，CTL诱导时和扩大培养时添加抗HGF抗体的组中，即便在14天的扩大培养后，CTL维持高特异性的细胞杀伤活性。这表明抗肿瘤相关抗原(MART1)CTL的扩大培养时，通过在诱导时及扩大培养时添加抗HGF抗体，可在长期保持特异的高效细胞杀伤活性的状态下进行CTL的扩大培养。
序列表说明
SEQ ID NO：1是命名为C-274的人纤粘连蛋白来源的肽片断的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是命名为H-271的人纤粘连蛋白来源的肽片断的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4是命名为H-296的人纤粘连蛋白来源的肽片断的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5是命名为CH-271的人纤粘连蛋白来源的肽片断的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6是命名为CH-296的人纤粘连蛋白来源的肽片断的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7是命名为C-CS1的人纤粘连蛋白来源的肽片断的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8是命名为CHV-89的人纤粘连蛋白来源的肽片断的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9是命名为CHV-90的人纤粘连蛋白来源的肽片断的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10是命名为CHV-92的人纤粘连蛋白来源的肽片断的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11是命名为CHV-179的人纤粘连蛋白来源的肽片断的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12是命名为CHV-181的人纤粘连蛋白来源的肽片断的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13是命名为H-275-Cys的人纤粘连蛋白来源的肽片断的氨基酸序列。
SEQ ID NO：14是引物12S的碱基序列。
SEQ ID NO：15是引物14A的碱基序列。
SEQ ID NO：16是引物Cys-A的碱基序列。
SEQ ID NO：17是引物Cys-S的碱基序列。
SEQ ID NO：18是以流感病毒的基质(matrix)蛋白来源的HLA-A2.1结合性肽为基础设计的肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：19是以黑色素瘤抗原MAGE3来源的HLA-A2.1结合性肽为基础设计的肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：20是以黑色素瘤抗原MART1来源的HLA-A2.1结合性肽为基础设计的肽的氨基酸序列。
产业上利用的可能性
本发明提供CTL的诱导方法、维持方法和扩大培养方法，它能在维持和/或扩大培养时保持高活性的抗原特异性细胞杀伤活性。
该方法在有必要使用大量CTL的过继性免疫疗法等细胞医疗领域内极其有用。另外，由于根据本发明的方法而制备的CTL是用安全的方法制备的，所以是安全性极高的细胞医药。
序列表
<110>TAKARA BIO INC.
<120>抗原特异性细胞毒性T细胞的扩大培养方法
<130>02-050-PCT
<150>JP 2001-246747
<151>2001-08-15
<150>JP 2001-376966
<151>2001-12-11
<150>JP 2002-084428
<151>2002-03-25
<160>20
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>274
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：命名为C-274的纤粘连蛋白片段
<400>1
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg Val
1 5 10 15
Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu Val Arg
20 25 30
Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu Ser Ile Ser
35 40 45
Pro Ser Asp Asn AlaVal Val Leu Thr Asn Leu Leu Pro Gly Thr Glu
50 55 60
Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln His Glu Ser Thr Pro
65 70 75 80
Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile Asp
85 90 95
Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala Pro
100 105 110
Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Arg His His Pro Glu His Phe
115 120 125
Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile
130 135 140
Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val
145 150 155 160
Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser
165 170 175
Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro
180 185 190
Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr
195 200 205
Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu
210 215 220
Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
225 230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly
245 250 255
Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu
260 265 270
Ile Asp
<210>2
<211>25
<212>PRT
<213>人
<400>2
Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly
1 5 10 15
Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr
20 25
<210>3
<211>271
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：命名为H-271的纤粘连蛋白片段
<400>3
Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr
20 25 30
Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile
35 40 45
Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val
50 55 60
Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro
85 90 95
Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile
100 105 110
Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala
115 120 125
Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp
130 135 140
Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys
145 150 155 160
Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val
165 170 175
Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu
180 185 190
Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala
195 200 205
Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro
210 215 220
Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile
225 230 235 240
Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu
245 250 255
Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr
260 265 270
<210>4
<211>296
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：命名为H-296的纤粘连蛋白片段
<400>4
Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr
20 25 30
Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile
35 40 45
Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val
50 55 60
Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro
85 90 95
Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile
100 105 110
Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala
115 120 125
Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp
130 135 140
Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys
145 150 155 160
Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val
165 170 175
Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu
180 185 190
Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala
195 200 205
Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro
210 215 220
Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile
225 230 235 240
Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu
245 250 255
Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr Asp
260 265 270
Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro
275 280 285
Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr
290 295
<210>5
<211>549
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：命名为CH-271纤粘连蛋白片段
<400>5
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg Val
1 5 10 15
Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu Val Arg
20 25 30
Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu Ser Ile Ser
35 40 45
Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu Pro Gly Thr Glu
50 55 60
Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln His Glu Ser Thr Pro
65 70 75 80
Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile Asp
85 90 95
Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala Pro
100 105 110
Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Arg His His Pro Glu His Phe
115 120 125
Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile
130 135 140
Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val
145 150 155 160
Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser
165 170 175
Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro
180 185 190
Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr
195 200 205
Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu
210 215 220
Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
225 230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly
245 250 255
Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu
260 265 270
Ile Asp Lys Pro Ser Met Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe
275 280 285
Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn
290 295 300
Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr
305 310 315 320
Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val
325 330 335
Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr
355 360 365
Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr
370 375 380
Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr
385 390 395 400
Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln
405 410 415
Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln
420 425 430
Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala
435 440 445
Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro
450 455 460
Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser
465 470 475 480
Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu
485 490 495
Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly
500 505 510
Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr
515 520 525
Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile
530 535 540
Gly Arg Lys Lys Thr
545
<210>6
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：命名为CH-296的纤粘连蛋白片段
<400>6
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg Val
1 5 10 15
Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu Val Arg
20 25 30
Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu Ser Ile Ser
35 40 45
Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu Pro Gly Thr Glu
50 55 60
Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln His Glu Ser Thr Pro
65 70 75 80
Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile Asp
85 90 95
Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala Pro
100 105 110
Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Arg His His Pro Glu His Phe
115 120 125
Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile
130 135 140
Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val
145 150 155 160
Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser
165 170 175
Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro
180 185 190
Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr
195 200 205
Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu
210 215 220
Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
225 230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly
245 250 255
Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu
260 265 270
Ile Asp Lys Pro Ser Met Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe
275 280 285
Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn
290 295 300
Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr
305 310 315 320
Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val
325 330 335
Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr
355 360 365
Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr
370 375 380
Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr
385 390 395 400
Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln
405 410 415
Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln
420 425 430
Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala
435 440 445
Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro
450 455 460
Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser
465 470 475 480
Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu
485 490 495
Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly
500 505 510
Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr
515 520 525
Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile
530 535 540
Gly Arg Lys Lys Thr Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His
545 550 555 560
Pro Asn Leu His Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr
565 570
<210>7
<211>302
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：命名为C-CS1的纤粘连蛋白片段
<400>7
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg Val
1 5 10 15
Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu Val Arg
20 25 30
Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu Ser Ile Ser
35 40 45
Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu Pro Gly Thr Glu
50 55 60
Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln His Glu Ser Thr Pro
65 70 75 80
Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile Asp
85 90 95
Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala Pro
100 105 110
Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Arg His His Pro Glu His Phe
115 120 125
Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile
130 135 140
Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val
145 150 155 160
Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser
165 170 175
Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro
180 185 190
Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr
195 200 205
Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu
210 215 220
Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
225 230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly
245 250 255
Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu
260 265 270
Ile Asp Lys Pro Ser Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His
275 280 285
Pro Asn Leu His Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr
290 295 300
<210>8
<211>367
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：命名为CHV-89的纤粘连蛋白片段
<400>8
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg Val
1 5 10 15
Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu Val Arg
20 25 30
Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu Ser Ile Ser
35 40 45
Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu Pro Gly Thr Glu
50 55 60
Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln His Glu Ser Thr Pro
65 70 75 80
Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile Asp
85 90 95
Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala Pro
100 105 110
Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Arg His His Pro Glu His Phe
115 120 125
Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile
130 135 140
Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val
145 150 155 160
Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser
165 170 175
Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro
180 185 190
Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr
195 200 205
Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu
210 215 220
Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
225 230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly
245 250 255
Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu
260 265 270
Ile Asp Lys Pro Ser Met Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val
275 280 285
Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr
290 295 300
Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln
305 310 315 320
Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile
325 330 335
Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu
340 345 350
Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr
355 360 365
<210>9
<211>368
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：命名为CHV-90的纤粘连蛋白片段
<400>9
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg Val
1 5 10 15
Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu Val Arg
20 25 30
Tyr Ser Pro Val Lys Ash Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu Ser Ile Ser
35 40 45
Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu Pro Gly Thr Glu
50 55 60
Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln His Glu Ser Thr Pro
65 70 75 80
Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile Asp
85 90 95
Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala Pro
100 105 110
Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Arg His His Pro Glu His Phe
115 120 125
Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile
130 135 140
Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val
145 150 155 160
Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser
165 170 175
Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro
180 185 190
Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr
195 200 205
Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu
210 215 220
Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
225 230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly
245 250 255
Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu
260 265 270
Ile Asp Lys Pro Ser Mer Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe
275 280 285
Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg
290 295 300
Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro
305 310 315 320
Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr
325 330 335
Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala
340 345 350
Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr
355 360 365
<210>10
<211>370
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：命名为CHV-92的纤粘连蛋白片段
<400>10
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg Val
1 5 10 15
Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu Val Arg
20 25 30
Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu Ser Ile Ser
35 40 45
Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu Pro Gly Thr Glu
50 55 60
Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln His Glu Ser Thr Pro
65 70 75 80
Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile Asp
85 90 95
Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala Pro
100 105 110
Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Arg His His Pro Glu His Phe
115 120 125
Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile
130 135 140
Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val
145 150 155 160
Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser
165 170 175
Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro
180 185 190
Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr
195 200 205
Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu
210 215 220
Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
225 230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly
245 250 255
Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu
260 265 270
Ile Asp Lys Pro Ser Met Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe
275 280 285
Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn
290 295 300
Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr
305 310 315 320
Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val
325 330 335
Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr
355 360 365
Leu Glu
370
<210>11
<211>457
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：命名为CHV-179的纤粘连蛋白片段
<400>11
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg Val
1 5 10 15
Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu Val Arg
20 25 30
Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu Ser Ile Ser
35 40 45
Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu Pro Gly Thr Glu
50 55 60
Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln His Glu Ser Thr Pro
65 70 75 80
Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile Asp
85 90 95
Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala Pro
100 105 110
Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Arg His His Pro Glu His Phe
115 120 125
Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile
130 135 140
Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val
145 150 155 160
Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser
165 170 175
Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro
180 185 190
Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr
195 200 205
Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu
210 215 220
Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
225 230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly
245 250 255
Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu
260 265 270
Ile Asp Lys Pro Ser Met Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val
275 280 285
Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr
290 295 300
Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln
305 310 315 320
Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile
325 330 335
Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu
340 345 350
Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala
355 360 365
Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser
370 375 380
Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile
385 390 395 400
Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg
405 410 415
Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly
420 425 430
Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser
435 440 445
Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr
450 455
<210>12
<211>472
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：命名为CHV-181的纤粘连蛋白片段
<400>12
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg Val
1 5 10 15
Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu Val Arg
20 25 30
Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu Ser Ile Ser
35 40 45
Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu Pro Gly Thr Glu
50 55 60
Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln His Glu Ser Thr Pro
65 70 75 80
Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile Asp
85 90 95
Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala Pro
l00 105 110
Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Arg His His Pro Glu His Phe
115 120 125
Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile
130 135 140
Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val
145 150 155 160
Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser
165 170 175
Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro
180 185 190
Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr
195 200 205
Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu
210 215 220
Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
225 230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly
245 250 255
Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu
260 265 270
Ile Asp Lys Pro Ser Met Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe
275 280 285
Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn
290 295 300
Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr
305 310 315 320
Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val
325 330 335
Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr
355 360 365
Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr
370 375 380
Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr
385 390 395 400
Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln
405 410 415
Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln
420 425 430
Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala
435 440 445
Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro
450 455 460
Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr
465 470
<210>13
<211>276
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：命名为H-275-Cys的纤粘连蛋白片段
<400>13
Met Ala Ala Ser Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln
1 5 10 15
Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln
20 25 30
Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro
35 40 45
Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser
50 55 60
Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys
65 70 75 80
Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu
85 90 95
Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr
100 105 110
Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe
115 120 125
Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr
130 135 140
Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly
145 150 155 160
Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser
165 170 175
Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn
180 185 190
Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln
195 200 205
Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro
210 215 220
Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr
225 230 235 240
Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr
245 250 255
Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg
260 265 270
Lys Lys Thr Cys
275
<210>14
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物12S
<400>14
aaaccatggc agctagcgct attcctgcac caactgac 38
<210>15
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物14A
<400>15
aaaggatccc taactagtct ttttccttcc aatcag 36
<210>16
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物Cys-A
<400>16
aaaagcggcc gctagcgcaa gccatggtct gtttcctgtg 40
<210>17
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物Cys-S
<400>17
aaaagcggcc gcactagtgc atagggatcc ggctgagcaa c 41
<210>18
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：基于来源于流感病毒基质蛋白而设计的肽
<400>18
Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
1 5
<210>19
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：基于来源于黑色素瘤抗原MAGE3的HLA A2.1结合性肽而设计的肽
<400>19
Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val
1 5
<210>20
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：基于来源于黑色素瘤抗原MART1的HLA A2.1结合性肽而设计的肽
<400>20
Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
1 5
1
38