肠球菌属乳酸菌以及乳酸菌死菌体的制造方法 【技术领域】
本发明涉及肠球菌属乳酸菌的培养方法、以及肠球菌属乳酸菌死菌体的制造方法。
【背景技术】
近年来，随着日本人个人对动物性脂肪的摄入量增大，以及饮食生活方式欧美化的演变，患高血脂症以及与此相关的动脉硬化症等生活习惯病、成人病的患者不断增加。
为此，现在已有多种用于治疗高血脂症的药物供应。但是，用于抑制此种疾病的药物中，无论哪一种在服用后均有出现胃部不适、呕吐、肝脏机能异常、急性肾脏不良、四肢无力等副作用的报道，并且对正在施用其他药物的患者还存在必须限制服用上述药物的情况。
根据新的抗动脉硬化剂的研究结果，本申请的发明人发现乳酸菌，特别是肠球菌属的各种微生物的活菌体及死菌体可显著地降低血液中的胆固醇和甘油三酯的数值，并且由于所述的微生物来源是存在于人体内地肠道内细菌，所以服用本发明的药剂不但无毒，而且没有目前治疗动脉硬化和高血脂症的药物(例如，专利文献1)所引起的副作用。
另外，这些微生物具有各种各样的生理活性，不仅上述微生物的活菌体，而且经特定条件处理所得的上述微生物的死菌体也具有作为其生理活性例子的、可使血液中胆固醇和甘油三酯的数值降低的活性。
[专利文献1]日本特许公报第2756778号
但是，即使具有这样的显著降低胆固醇值和甘油三酯值的活性的肠球菌属乳酸菌(乳酸球菌)，也能判断出通过现有的培养方法会降低所述乳酸菌的活性，从而不能得到所期待的效果。另外，肠球菌属乳酸菌死菌体与所述活菌体一样，也能显著降低胆固醇值和甘油三酯值，但是能判断出通过现有的从所述活菌体得到死菌体的处理方法，将会丧失所期待的效果。
【发明内容】
本发明的目的是提供不丧失肠球菌属乳酸菌具有的降低血液中胆固醇值和甘油三酯值的活性的培养方法、以及肠球菌属乳酸菌死菌体的制造方法。
为此，本发明提供肠球菌属乳酸菌的培养方法，包括将肠球菌属的乳酸菌在下述培养条件下进行需氧培养，再从培养物中收集活菌体制成具有降低胆固醇和甘油三酯活性的肠球菌属乳酸菌，所述培养条件为：(i)pH：5.5-7.5、(ii)搅拌方法：平均每分钟5-40次、(iii)温度条件：30-40℃、(iv)培养时间：6-24小时。
此处，上述的培养基成分含有(i)葡萄糖：1-4％、(ii)酵母提取物：0.3-6％、(iii)蛋白胨：0.1-5％，和(iv)磷酸氢二钾：1-5％。
另外，上述属于肠球菌属的乳酸菌是选自由肠球菌属的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、牛肠球菌(Enterococcus bovis)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、耐久肠球菌(Enterococcus durans)、唾液肠球菌(Enterococcus salivarius)、缓症肠球菌(Enterococcus mitis)、和马肠球菌(Enterococcus equinus)所组成的组中的一种或一种以上的活菌体。
本发明还提供肠球菌属乳酸菌死菌体的制造方法，该方法包括：
(1)将肠球菌属乳酸菌在(i)pH：5.5-7.5、(ii)搅拌方法：平均每分钟5-40次、(iii)温度条件：30-40℃、(iv)培养时间：6-24小时的培养条件下需氧培养，(2)将含有上述活菌体的菌液用生理盐水洗净、(3)将用生理盐水悬浮所得的菌液在(i)温度为80-125℃、(ii)压力为5-25磅环境下，(iii)放置时间5-25分钟的条件下放置，得到具有降低胆固醇和甘油三酯活性的肠球菌属乳酸菌死菌体。
此处，上述(1)所述培养的培养基成分含有(i)葡萄糖：1-4％、(ii)酵母提取物：0.3-6％、(iii)蛋白胨：0.1-5％，和(iv)磷酸氢二钾：1-5％。
【具体实施方式】
以下就本发明的肠球菌属乳酸菌的培养方法、以及肠球菌属乳酸菌死菌体的制造方法中所使用的微生物的种类、所述微生物的培养方法、已培养的微生物的死菌体的制备方法以及由此得到的乳酸菌和乳酸菌死菌体的药理作用等进行详细描述。
1.微生物
用于本发明的微生物可以是肠球菌属乳酸菌，特别是其中的，例如，由粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、牛肠球菌(Enterococcus bovis)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、耐久肠球菌(Enterococcus durans)、唾液肠球菌(Enterococcus salivarius)、缓症肠球菌(Enterococcus mitis)，马肠球菌(Enterococcus equinus)所组成的组中的一种或一种以上的活菌体。所述肠球菌属乳酸菌可通过，例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)的保藏号为[ATCC 700802]的微生物保藏得到。
2.活菌体的制备条件
上述活菌体的培养条件如下所示：
(i)培养基成分的氢离子浓度指数(pH)：pH为5.5-7.5的范围内。
(ii)搅拌方法：平均每分钟5-40次缓缓搅拌。
(iii)培养时间：6-24小时的范围内。
(iv)培养基组成：含有1-4％葡萄糖、0.3-6％酵母提取物、0.1-5％蛋白胨、1-5％磷酸氢二钾。
(v)温度：30-45℃的温度环境下。
(vi)需氧性培养，但无需特意添加氧。
3.死菌体的制备条件
将在上述2中所述的条件下培养所得的活菌体培养物进一步用生理盐水洗净1到2次后，将用生理盐水悬浮得到的菌液进行下述条件的加热/加压处理：
(i)温度：80-125℃
(ii)压力：5-25磅
(iii)时间：5-25分钟
经上述加热/高压处理可得到具有上述微生物活性的死菌体。
4.药理作用
如下述各实验例所示，本发明的死菌体制备方法、乳酸菌特别是肠球菌属微生物对降低血液中胆固醇和甘油三酯值非常有效。
(1)实验例1
将上述1中所示的肠球菌属的各种微生物的活菌体，以及经加热、加压处理后所得的菌体施用于小鼠(雄性18周龄、平均体重20g：每组10只)，在4周的时间内经口连续施用，给药量为：活菌体1010个/天、死菌体1010个/天，测定血液中的胆固醇降低率，实验结果如表1所示。
【表1】
活菌体和死菌体对胆固醇降低率的比较(小鼠) 微生物种类 活菌体(％) 死菌体(％)粪肠球菌K-23 19.5 44.0粪肠球菌K-10 17.5 32.2粪肠球菌K-57 18.3 30.4屎肠球菌K-58 19.0 32.5鸟肠球菌K-56 16.4 28.7鸟肠球菌K-57 15.8 23.6鸟肠球菌K-59 16.5 27.3耐久肠球菌K-66 12.7 22.8耐久肠球菌K-67 13.2 21.0牛肠球菌K-76 14.6 22.5
(2)实验例2
用与上述实验例1相同的方式，将肠球菌属的各种微生物的活菌体，以及经加热、加压处理后所得的菌体施用于普通大鼠(雄性18周龄、平均体重250g：每组7只)，在4周的时间内经口连续施用，给药量为：活菌体1010个/天、死菌体1010个/天，测定血液中的胆固醇降低率，实验结果如表2所示。
【表2】 微生物的种类 活菌体(％) 死菌体(％) 普通大鼠 普通大鼠 普通大鼠 普通大鼠 (*1) (*2) 粪肠球菌K-23 13.0 28.1 38.1 29.3 粪肠球菌K-10 11.0 20.0 22.8 18.2 粪肠球菌K-57 11.4 19.6 21.4 19.0 屎肠球菌K-58 9.6 17.5 17.6 15.3 鸟肠球菌K-56 8.4 16.7 17.2 14.8 鸟肠球菌K-57 8.2 16.5 16.8 14.5 鸟肠球菌K-59 8.2 17.3 17.5 13.3 耐久肠球菌K-66 9.5 17.7 18.0 15.1 耐久肠球菌K-67 9.4 17.0 17.8 14.7 牛肠球菌K-76 9.8 17.5 18.2 15.2
(*1)日常饮食中添加有胆固醇的大鼠
(*2)日常饮食中添加有果糖的大鼠
(3)实验例3
比例经调整的上述肠球菌属的各种微生物的活菌体，以及经加热、加压处理后所得的死菌体施用于普通小鼠(雄性18周龄、平均体重20g：每组10只)，在4周的时间内经口连续施用，给药量为：活菌体1010个/天、死菌体1010个/天，测定血液中的甘油三酯降低率，实验结果如表3所示。
【表3】 微生物种类 活菌体(％) 死菌体(％) 粪肠球菌K-23 17.1 76.1 粪肠球菌K-10 19.0 43.2 粪肠球菌K-57 17.3 37.0 屎肠球菌K-58 17.3 66.4 鸟肠球菌K-56 17.9 40.1 鸟肠球菌K-57 15.1 33.2 鸟肠球菌K-59 9.7 30.4 耐久肠球菌K-66 9.8 55.1 耐久肠球菌K-67 9.9 74.2 牛肠球菌K-76 9.5 61.6
(4)实验例4
用与上述实验例3相同的方式将比例经调整的肠球菌属的各种微生物的活菌体，以及经加热、加压处理后所得的死菌体施用于普通大鼠(雄性18周龄、平均体重250g：每组7只)，在4周的时间内经口连续施用，给药量为：活菌体1010个/天、死菌体1010个/天，测定血液中的甘油三酯的降低率，实验结果如表4所示。
【表4】 微生物种类 活菌体(％) 死菌体(％) 普通大鼠 普通大鼠 普通大鼠 普通大鼠 (*1) (*2) 粪肠球菌K-23 34.9 61.7 54.8 69.1 粪肠球菌K-10 25.4 36.5 49.3 62.7 粪肠球菌K-57 34.5 44.3 41.6 47.8 屎肠球菌K-58 18.5 43.5 39.6 46.5 鸟肠球菌K-56 19.0 33.4 34.8 43.5 鸟肠球菌K-57 21.4 32.6 36.5 36.4 鸟肠球菌K-59 13.6 39.7 38.7 31.0 耐久肠球菌K-66 13.3 37.4 43.9 48.7 耐久肠球菌K-67 12.2 22.8 28.6 33.6 牛肠球菌K-76 18.7 37.8 36.3 40.4
(*1)日常饮食中添加有胆固醇的大鼠
(*2)添加有果糖的大鼠
(5)有关肠球菌属微生物的安全性
根据急性毒性试验，将以经口途径可能施用的最大量粪肠球菌K-23经加热、加压处理后所得的菌体施用于普通大鼠(雄性18周龄、平均体重250g：每组7只)(5600mg/kg体重)，未观察到任何异常现象，事实上经口施用是无毒的，并且腹腔内(雄性18周龄小鼠、体重20g：每组10只)的施用量可达802mg/kg体重的高值。与该安全性相关的实验结果如表5所示。
【表5】
粪肠球菌K的安全性 粪肠球菌 死菌体经口施用 ＞5600mg/kg体重 死菌体腹腔内施用 ＞802mg/kg体重
如上所述，本发明的肠球菌属乳酸菌的培养方法中，是将肠球菌属乳酸菌在下述培养条件下需氧培养，再从培养物中收集活菌体：(i)pH5.5-7.5、(ii)搅拌方法：平均每分钟5-40次、(iii)温度条件：30-40℃、(iv)培养时间：6-24小时。
另外，通过将上述方法培养的活菌体再进行培养，即将含有上述活菌体的菌液用生理盐水洗净，将用生理盐水悬浮所得的菌液在下述条件下处理得到所述乳酸菌的死菌体，所述条件是：(i)温度为80-125℃、(ii)压力为5-25磅环境下、(iii)放置5-25分钟。
通过上述方法，本发明确立了具有降低血液中胆固醇值和甘油三酯值的活性的乳酸菌的培养方法、以及肠球菌属乳酸菌死菌体的制造方法。
本发明可提供保持肠球菌属乳酸菌的生理活性的培养方法以及肠球菌属乳酸菌死菌体的制造方法，具有实用性。