重组藻胆蛋白及其制备方法和应用.pdf

本发明涉及基因工程领域，具体化地说是一种利用基因工程技术生产的重组藻胆蛋白及其制备方法和应用。基因重组藻胆蛋白是含有藻胆蛋白亚基氨基酸序列的多肽或其衍生物。制备方法是使用分子克隆手段从藻类中克隆藻胆蛋白基因；利用基因工程技术，构建含藻胆蛋白亚基基因的表达载体并转入各类表达体系中异源表达；运用层析技术生产含有藻胆蛋白亚基氨基酸序列的多肽或其衍生物。本发明结构单一多肽与天然藻胆蛋白(色素蛋白复合体)相比，结构稳定，从而活性稳定，可建立统一质量标准，适于大规模应用，特别是应用于药物、保健或功能食品、食品添加剂或试剂目的。

权利要求书
1.  一种基因重组藻胆蛋白，其特征在于：含有藻胆蛋白亚基氨基酸序列的多肽或其衍生物。

2.  根据权利要求1所述的基因重组藻胆蛋白，其特征在于：所述多肽为含有一种或几种藻胆蛋白亚基的氨基酸序列。

3.  根据权利要求1所述的基因重组藻胆蛋白，其特征在于：所述多肽含有的藻胆蛋白亚基氨基酸序列包含藻胆蛋白亚基全氨基酸序列，或该序列的片段、或与其有基本序列同源性的氨基酸序列。

4.  一种基因重组藻胆蛋白的制备方法，其特征在于：使用分子克隆方法从藻类中克隆藻胆蛋白基因；利用基因工程技术，构建含藻胆蛋白亚基基因的表达载体并转入各类表达体系中异源表达；运用层析技术生产含有藻胆蛋白亚基氨基酸序列的多肽或其衍生物。

5.  根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述藻类为蓝藻、红藻、隐藻、甲藻或原绿球藻。

6.  一种基因重组藻胆蛋白的应用，其特征在于：用于药物、保健或功能食品、食品添加剂或试剂目的。

说明书重组藻胆蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体化地说是一种利用基因工程技术生产的重组藻胆蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
藻胆蛋白是原核藻类--蓝藻，真核藻类--红藻、隐藻和某些甲藻所特有的光合作用捕光色素蛋白。天然藻胆蛋白是藻胆蛋白亚基与藻胆色素共价结合的化合物，并且形成复杂空间结构--藻胆体。根据与藻胆蛋白亚基相结合的藻胆色素不同，藻胆蛋白主要分为藻红蛋白(phycoerythrin，PE)，藻蓝蛋白(phycocyanin，PC)和别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)。自20世纪80年代以来，人们发现藻胆蛋白具有多种生物活性，有着广阔的运用前景。例如藻胆蛋白能够刺激机体免疫系统产生免疫球蛋白，同时能保持或促进正常的细胞功能，全面增强机体的防病、抗病能力，可防止肿瘤或抑制肿瘤的生长和复发，具有抗肿瘤功效(Schwartz，J.Z.，& Shkiar，G..Growthinhibition and destruction of cancer cells by oral extracts of Spirulina，Proc.Amer.Acad Oral Pathol.1986，40：23；张素萍，姚思德等，用脉冲辐解法研究藻胆蛋白与羟自由基反应动力学，科学通报，2000，45(1)：32)。含有藻胆蛋白的抗肿瘤成分也能用于治疗溃疡和痔疮出血(Dainipponink andChemicals，Antitumoral agents containing phycobilin.J.Phycology 1983，216：58)，能够促进末端供血和骨髓造血功能。藻胆蛋白能选择性地富集于病灶，并且有激光激活的细胞毒作用(Morcos N.C.，Bems M.and HenryW.L.Phycocyanin：laser activation，cytotoxic effects，and uptake in humanatherosclerotic plaque.Lasers Surg Med，1988，8(1)：10)。美国食品医药局(FDA)已批准将藻胆蛋白用于皮肤癌、乳腺癌的光敏治疗(范晓，海藻化学研究的展望，海洋科学，1996，(2)：24)。同时藻胆蛋白于用动脉粥样硬化的光敏治疗也已申请专利(US4886831)。此外藻胆蛋白能够缓解药物和重金属对肾脏的毒害，它的抗病毒活性也得到了多方面证实(CN99110831.0，US6346408)。在食品工程方面，藻胆蛋白的必需氨基酸组成十分理想，是一种理想的食品添加剂。藻胆蛋白荧光特性也可用于荧光探针制作以及免疫分析试剂等。
现有获取藻胆蛋白的技术，是从藻类中直接提取纯化。它主要包括一系列长周期、高成本、复杂的过程。这一过程主要包括：藻体的培养、收集，藻体细胞的破碎和蛋白质多次抽提。其中蛋白质分离纯化方法主要有：碱性磷酸缓冲液抽提、水提法、酸提法、匀浆法、羟基磷灰石柱层析等，具体方法如：藻体细胞用0.05mol/L磷酸钠缓冲液悬浮，超声波处理破碎细胞，离心取上清获得可溶性总蛋白；上清液用硫酸铵分级分离，沉淀物用0.05mol/L磷酸钠缓冲液溶解后，以DEAE-SepharoseCL-6B透析柱(用氯化钠洗脱)纯化，纯化产物用SephadexG-100柱进一步纯化和脱盐，收集得到藻蓝蛋白。利用这种技术得到的藻胆蛋白是色素蛋白复合物，没有统一的质量标准，活性不稳定。目前天然藻胆蛋白纯品的售价为每克20万美元(SIGMA公司)，难以大规模应用。
发明内容
针对上述现有技术的局限性，本发明目的在于提供一种结构单一、活性稳定的重组藻胆蛋白及其制备方法和应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
本发明基因重组藻胆蛋白是含有藻胆蛋白亚基氨基酸序列的多肽或其衍生物；其中所述多肽为含有一种或几种藻胆蛋白亚基的氨基酸序列；所述多肽含有的藻胆蛋白亚基氨基酸序列包含藻胆蛋白亚基全氨基酸序列，或该序列的片段、或与其具有基本序列同源性的氨基酸序列。
其制备方法：是利用基因工程技术，将藻胆蛋白亚基基因转入各类表达体系中异源表达，生产含有藻胆蛋白亚基氨基酸序列的多肽或其衍生物。在本发明中，藻胆蛋白亚基基因的获得是通过分子克隆方法从蓝藻、红藻、隐藻、甲藻和原绿球藻等藻类中克隆得到；而后将藻胆蛋白亚基基因亚克隆到各种载体上，如大肠杆菌(E.coli)的pET、pTrx、pMAL、pGEX等载体系列，芽孢杆菌(Bacillus)pE194Ts等载体系列，酵母pPIC，pMET等载体系列，昆虫细胞pMT，pIB等载体系列，哺乳动物pCDNA，pIND等载体系列；再利用转基因技术中的氯化钙(CaCl2)介导法、聚乙二醇(PEG)法、电激法、超声波导入法、基因枪法、显微注射法、农杆菌Ti质粒转化、植物病毒载体介导等物理、化学或生物的转基因技术等，将藻胆蛋白亚基基因或其重组载体导入各类表达体系中异源表达；运用层析技术生产含有藻胆蛋白亚基氨基酸序列的多肽或其衍生物。获得重组体后，利用快速、简便的生产工艺进行低成本生产，以获得重组藻胆蛋白，一方面可以直接用作药物、保健或功能食品、食品添加剂、试剂等；另一方面可以通过酶解、化学修饰等方式获得衍生物加以应用。
本发明具有如下优点：
1.本发明为运用基因工程技术，将藻胆蛋白亚基基因转入目前较为成熟的各类表达体系(如大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物、高等植物、海洋生物)中高效表达，生产含有藻胆蛋白亚基氨基酸序列的多肽，并利用简便纯化工艺获得大量廉价、稳定的重组蛋白，用作药物、保健或功能食品、食品添加剂、试剂等。与现有技术相比，这一生产过程避免了藻类养殖这一长周期过程，并且能将藻胆蛋白亚基基因与各类亲和标签(如6×his，GST，Trx等)相融合，利用亲和层析减化下游纯化过程，降低成本。
2.运用本发明技术方案得到重组藻胆蛋白不具有天然藻胆蛋白的藻胆色素基团，是结构单一的多肽。
3.本发明结构单一多肽与色素蛋白复合物相比，结构稳定，从而活性稳定，可建立统一质量标准，适于大规模应用。
附图说明
图1为别藻蓝蛋白基因(apc)的克隆及其在大肠杆菌(E.coli)中表达的载体构建示意图。
图2为藻红蛋白基因(pe)在大肠杆菌(E.coli)中表达的载体构建示意图。
图3为别藻蓝蛋白基因α亚基(apca)和β亚基(apcβ)分别在大肠杆菌(Ecoli)中表达的载体构建示意图。
图4为藻胆蛋白基因在毕赤酵母(Pichiapastoris)表达的载体构建示意图。
图5为藻胆蛋白基因在海带中表达的载体构建示意图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例进一步描述本发明，但并不限制本发明的保护范围。
特别应指出的是在下列实施例中，使用的DNA提取，PCR扩增反应，表达载体构建等技术是本领域普通技术人员所熟知的，并可在诸如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，金冬雁等译，科学出版社，1992年第二版)、《PCR技术实验指南》(C.W.迪芬巴赫，GS德维克斯勒等著，黄培堂等译，科学出版社，1998)等参考文献中找到。
实施例1利用聚合酶链式反应(PCR)技术从蓝藻中克隆别藻蓝蛋白基因(apc)
1.模板DNA的提取
100ml组囊藻(Anacystis nidulans)UTEX 625培养液经3,000g离心15min，收集藻体；藻体用250mmol/LTris-HCl，50mmol/LEDTA，25％蔗糖(pH8.0)悬浮，加入蛋白酶K至终浓度5mg/ml，在65℃保温30min。以10,000g，4℃离心10min后，取上清液；用等体积于上清液的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，V∶V∶V)提取两遍，上清液再用氯仿∶异戊醇(24∶1，V∶V)提取一遍，最后上清液用二倍体积的无水乙醇-20℃沉淀过夜；再经13,000g,4℃离心30min，弃上清，沉淀挥干乙醇后溶解于50μlTE缓冲液(10mmol/L Tris-Hcl，1mmol/L EDTA，pH8.0)并加入RNA酶A(终浓度于10μl/ml)37℃保温30min；最后将所得DNA溶液保存于4℃。
2.PCR反应
根据Houmard等(1986)发表的Synechococcus PCC 6301别藻蓝蛋白基因序列设计引物(Genbank X04716)。正向引物P1：5′-GAGGGATCCATTAATGAGTATCG-3′(序列表中SEQ ID NO 12)，反向引物P2：5′-TGGAAGCTTAGCTCAAGCCGGAG-3′(序列表中SEQ ID NO 13)，采用华美生物工程公司DNA扩增系统试剂盒。PCR反应体系如下：2.5μl TaqBuffer(10×)，3μl Mg2+(25mmol/L)，2μl dNTP(2.5mmol/L)，1μl 2P1(10μmol/L)，1μl 2P2(10μmol/L)，1μl DNA模板(20-40ng/μl)，0.2μl TaqDNA聚合酶(5U/μl)，加水至总体积25μl。PCR扩增程序：93℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸3min，重复35个循环。结果用1％琼脂糖电泳鉴定，在琼脂糖凝胶上出一条符合预期大小的约1kb的条带。
3.apc的克隆与测序
PCR扩增条带根据《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，金冬雁等译，科学出版社，1992年第二版)介绍的方法从琼脂糖凝胶上回收后，按美国Invitrogen公司Zero Blunt PCR克隆试剂盒手册要求，与pCR-Blunt载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，经筛选获得阳性克隆，新质粒命名为pCRBapc。按Sanger法进行测序，其核酸序列及其推导的氨基酸序列(序列表中SEQ ID NO 1～3)如下：
ATG AGT ATC GTC TCG AAG TCC ATC GTC AAC GCT GAC GCC GAG GCG CGT TAC
Met Ser Ile Val Ser Lys Ser Ile Val Asn Ala Asp Ala Glu Ala Arg Tyr
CTA AGC CCT GGC GAA CTG GAA CGC ATC AAA ACC TTC GTT GTC GGT GGC GAT
Leu Ser Pro Gly Glu Leu Glu Arg Ile Lys Thr Phe Val Val Gly Gly Asp
CGT CGT CTG CGG ATT GCG CAG ACC ATT GCT GAG TCC CGC GAG CGG ATC GTC
Arg Arg Leu Arg Ile Ala Gln Thr Ile Ala Glu Ser Arg Glu Arg Ile Val
AAG CAA GCT GGC AAC CAA CTT TTC CAA AAG CGT CCT GAC GTG GTT TCG CCC
Lys Gln Ala Gly Asn Gln Leu Phe Gln Lys Arg Pro Asp Val Val Ser Pro
GGT GGC AAT GCC TAC GGT GAA GAC ATG ACG GCC ACC TGC CTG CGT GAC CTC
Gly Gly Asn Ala Tyr Gly Glu Asp Met Thr Ala Thr Cys Leu Arg Asp Leu
GAC TAC TAC CTG CGT CTT GTG ACC TAC GGT GTA GTT TCG GGC GAC ATC ACC
Asp Tyr Tyr Leu Arg Leu Val Thr Tyr Gly Val Val Ser Gly Asp Ile Thr
CCG ATT GAA GAA ATC GGC ATT GTC GGT GTC CGC GAA ATG TAC AAA TCG CTA
Pro Ile Glu Glu Ile Gly Ile Val Gly Val Arg Glu Met Tyr Lys Ser Leu
GGA ACC CCC ATC GAA GCT GTC GCT GAA GGC GTC CGT GAG CTG AAA TCG GCT
Gly Thr Pro Ile Glu Ala Val Ala Glu Gly Val Arg Glu Leu Lys Ser Ala
GCA ACC GCC CTA CTG ACT GGT GAA GAC GCT GAC GAA GCA GGC GCT TAC TTT
Ala Thr Ala Leu Leu Thr Gly Glu Asp Ala Asp Glu Ala Gly Ala Tyr Phe
GAC TAC GTA ATT GGC GCT CTC AGC TAA TTC AGT CTT TTA AGT CCC TTT GAT
Asp Tyr Val Ile Gly Ala Leu Ser Stop
TCG AAC GCG ACT TTT TCA ACG ATT TTA GAA AG ATG CAA GAC GCA ATT ACC
                                           Met Gln Asp Ala Ile Thr
GCT GTC ATC AAT GCT TCT GAC GTC CAA GGT AAG TAC CTG GAC AGC TCA GCC
Ala Val Ile Asn Ala Ser Asp Val Gln Gly Lys Tyr Leu Asp Ser Ser Ala
CTG GAT CGT CTC AAG AGC TAC TTC CAA AGT GGC GAA CTG CGC GTC CGT GCT
Leu Asp Arg Leu Lys Ser Tyr Phe Gln Ser Gly Glu Leu Arg Val Arg Ala
GCA GCC ACC ATC AGT GCC AAG TCG GCT CTG ATC GTC AAA GAA GCA GTG GCT
Ala Ala Thr Ile Ser Ala Lys Ser Ala Leu Ile Val Lys Glu Ala Val Ala
AAA TCG CTG CTC TAC TCA GAC ATC ACC CGT CCC GGC GGC ACC ATG TAC ACC
Lys Ser Leu Leu Tyr Ser Asp Ile Thr Arg Pro Gly Gly Thr Met Tyr Thr
ACC CGT CGC TAT GCT GCT TGC ATC CGG GAC TTG GAG TAC TAC CTG CGC TAC
Thr Arg Arg Tyr Ala Ala Cys Ile Arg Asp Leu Glu Tyr Tyr Leu Arg Tyr
GCC ACC TAT GCC ATG TTG GCT GGC GAT ACC TCG ATC TTG GAT GAG CGC GTG
Ala Thr Tyr Ala Met Leu Ala Gly Asp Thr Ser Ile Leu Asp Glu Arg Val
CTC AAC GGT CTG AAA GAG ACC TAC AAC AGT CTG GGC CTG CCG ATC GGT GCA
Leu Asn Gly Leu Lys Glu Thr Tyr Asn Ser Leu Gly Leu Pro Ile Gly Ala
ACC GTC CAA GCG ATC CAA GCA ATC AAA GAA GTC ACT GCT AGC TTG GTC GGC
Thr Val Gln Ala Ile Gln Ala Ile Lys Glu Val Thr Ala Ser Leu Val Gly
CCC GAC GCT GGT CGC GAA ATG GGT GTC TAC CTC GAG TAC ATC AGC TCC GGC
Pro Asp Ala Gly Arg Glu Met Gly Val Tyr Leu Glu Tyr Ile Ser Ser Gly
TTG AGC TAA
Leu Ser Stop
实施例2利用PCR技术从蓝藻中克隆藻蓝蛋白基因(pc)
1.模板DNA的提取
取0.5g鲜重的椭圆螺旋藻(Spirulina fusiformis)藻体细胞，用250mmol/L Tris-Hcl，50mmol/L EDTA，25％蔗糖(pH8.0)悬浮，加入蛋白酶K至5mg/ml，在65℃保温60min。以10,000g，4℃离心10min后，取上清液；用等体积于上清液的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，V∶V∶V)提取两遍，上清液再用氯仿∶异戊醇(24∶1，V∶V)提取一遍，最后上清液用二倍体积的无水乙醇-20℃沉淀2h；再经13,000g，4℃离心30min，弃上清，沉淀挥干乙醇后溶解于50μl TE缓冲液(10mmol/L Tris-Hcl，1mmol/L  EDTA，pH8.0)并加入RNA酶A(终浓度至10μl/ml)于37℃保温30min；最后将所得DNA溶液保存于4℃。
2.PCR引物及反应
根据Jeamton，W.等发表的钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)藻蓝蛋白基因序列设计引物(Genbank Y09074)。正向引物PPC1：5’-GGAGATAAGTCCATGTTTGA-3′(序列表中SEQ ID NO 14)，反向引物PPC2：5’-TAGCTTAGGGCGTTGATCGC-3′(序列表中SEQ ID NO 15)。于25ul反应体系中加入1ul模板DNA(20ng/ul)，1ul Taq(5U/ul)，0.5ul dNTP(10mmol/L)，4ul Mg2+(25mmol/L)，2.5ul 10×Taq缓冲液，两端引物(10umol/L)各1ul，加超纯水补齐(以上试剂均购自上海生工生物工程有限公司)。反应条件为：93℃预变性5min；然后93℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸3min，共35个循环；最后72℃延伸8min以补齐未端。扩增产物于1.0％琼脂糖(购自Promega公司)凝胶中电泳鉴定，结果扩增出一条大小约1.1kb的条带，与预计值相符。
3.pc的克隆与测序
PCR扩增条带从琼脂糖凝胶上回收后，按美国Invitrogen公司ZeroBlunt PCR克隆试剂盒手册要求，与pCR-Blunt载体连接，转化感受态细菌DH5α。连接、转化以及阳性重组子的筛选和鉴定均参考《分子克隆实验指南)》(J.萨姆布鲁克等著，金冬雁等译，科学出版社，1992年第二版)介绍的方法。将阳性克隆菌落培养后，由上海基康公司从正反两个方向分别进行测序。其核酸序列及其推导的氨基酸序列(序列表中SEQ ID NO 4～6)如下：
ATG TTT GAT GCC TTC ACT AAG GTG GTT TCT CAG GCT GAT ACT CGC GGC GAA
Met Phe Asp Ala Phe Thr Lys Val Val Ser Gln Ala Asp Thr Arg Gly Glu
ATG CTG AGT ACA GCT CAA ATC GAT GCT CTG AGC CAA ATG GTT GCT GAA AGC
Met Leu Ser Thr Ala Gln Ile Asp Ala Leu Ser Gln Met Val Ala Glu Ser
AAC AAA CGT TTG GAT GCC GTT AAC CGC ATT ACT AGC AAC GCT TCC ACC ATC
Asn Lys Arg Leu Asp Ala Val Asn Arg Ile Thr Ser Asn Ala Ser Thr Ile
GTT TCT AAT GCT GCT CGT TCT TTG TTT GCA GAG CAG CCC CAA CTG ATT GCT
Val Ser Asn Ala Ala Arg Ser Leu Phe Ala Glu Gln Pro Gln Leu Ile Ala
CCC GGA GGA AAC GCC TAC ACC AAC CGT CGT ATG GCT GCT TGC TTG CGT GAC
Pro Gly Gly Asn Ala Tyr Thr Asn Arg Arg Met Ala Ala Cys Leu Arg Asp
ATG GAA ATC ATC CTG CGT TAT GTT ACC TAC GCT GTG TTC GCT GGC GAC GCA
Met Glu Ile Ile Leu Arg Tyr Val Thr Tyr Ala Val Phe Ala Gly Asp Ala
AGT GTT CTC GAA GAT CGT TGC TTG AAC GGT TTG CGT GAA ACT TAC CTG GCT
Ser Val Leu Glu Asp Arg Cys Leu Asn Gly Leu Arg Glu Thr Tyr Leu Ala
TTG GGA ACT CCC GGT TCC TCC GTT GCT GTC GGT GTT GGC AAA ATG AAA GAA
Leu Gly Thr Pro Gly Ser Ser Val Ala Val Gly Val Gly Lys Met Lys Glu
GCT GCT CTG GCG ATC GTA AAC GAT CCC GCA GGT ATC ACT CCT GGC GAT TGT
Ala Ala Leu Ala Ile Val Asn Asp Pro Ala Gly Ile Thr Pro Gly Asp Cys
AGC GCT TTG GCT TCA GAA ATC GCT AGT TAC TTT GAT CGT GCA TGT GCT GCA
Ser Ala Leu Ala Ser Glu Ile Ala Ser Tyr Phe Asp Arg Ala Cys Ala Ala
GTT TCC TAA TCA AGC AGA TCC ATA GCA TAT AAC AAT TGA
Val Ser Stop
AAC AGT TTA GCT GAA GTC TAA GTG ACT GGA CTT CTG TTT GTT ACC TAA TTT
TTT GTA AAC CAA TCG GGA GAT AAC TCG AGA ATG AAA ACC CCC CTA ACC
Met Lys Thr Pro Leu Thr
GAA GCA GTT TCT ATC GCT GAT TCC CAA GGT CGT TTC CTA AGC AGC ACC GAA GluAla Val Ser Ile Ala Asp Ser Gln Gly Arg Phe Leu Ser Ser Thr Glu
ATC CAA GTG GCT TTT GGC CGT TTT CGT CAA GCC AAA GCT GGT CTG GAA GCT IleGln Val Ala Phe Gly Arg Phe Arg Gln Ala Lys Ala Gly Leu Glu Ala
GCT AAA GCT TTG ACC TCT AAA GCT GAT AGT CGT ATC AGT GGT GCT GCC CAA AlaLys Ala Leu Thr Ser Lys Ala Asp Ser Arg Ile Ser Gly Ala Ala Gln
GCA GTG TAC AAC AAG TTC CCC TAC ACC ACC CAA ATG CAG GGA CCT AAC TAC AlaVal Tyr Asn Lys Phe Pro Tyr Thr Thr Gln Met Gln Gly Pro Asn Tyr
GCG GCA GAC CAA CGC GGT AAG GAC AAA TGT GCT CGT GAC ATA GGC TAC TAC AlaAla Asp Gln Arg Gly Lys Asp Lys Cys Ala Arg Asp Ile Gly Tyr Tyr
CTG AGG ATG GTA ACT TAT TGC CTG ATT GCT GGT GGA ACT GGC CCC ATG GAT LeuArg Met Val Thr Tyr Cys Leu Ile Ala Gly Gly Thr Gly Pro Met Asp
GAG TAC CTG ATT GCC GGT ATT GAT GAA ATC AAC CGG ACT TTC GAG CTT TCT GluTyr Leu Ile Ala Gly Ile Asp Glu Ile Asn Arg Thr Phe Glu Leu Ser
CCA AGC TGG TAC ATT GAA GCC CTG AAA TAC ATC AAA GCT AAC CAC GGT TTG ProSer Trp Tyr Ile Glu Ala Leu Lys Tyr Ile Lys Ala Asn His Gly Leu
TCT GGT GAC GCT GCT GGT GAA GCT AAC TCC TAC CTC GAC TAC GCG ATC AAC SerGly Asp Ala Ala Gly Glu Ala Asn Ser Tyr Leu Asp Tyr Ala Ile Asn
GCC CTA AGC TAG
Ala Leu Ser Stop
实施例3利用PCR技术从红藻波登仙菜(Ceramium boydenn)中克隆藻红蛋白基因(pe)
1.模板DNA地提取
取0.2g新鲜波登仙菜(Ceramium boydenn)放于研钵中，加入液氮研磨后转移至5ml离心管中；再加入1.5ml裂解液(1.36ml抽提缓冲液，0.136ml 20％SDS，2.5μl蛋白酶K(20mg/ml)；抽提缓冲液：100mmol/LTris-HCl，50mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，pH8.0)，混合均匀；37℃保温30min，其间多次颠倒管子，充分混匀；而后13000g离心15min，取上清，再加入RNA酶A(终浓度至10μl/ml)于37℃保温30min；加入1/4体积的无水乙醇，将管子置于冰上，冰浴30min；13000g 4℃离心15min后，取上清，再加入700μl-20℃冷藏的异丙醇，-20℃过夜；再后13000g 4℃离心20min，弃上清，用-20℃冷藏的70％乙醇洗涤2次；挥干乙醇后溶解于100μl TE缓冲液(10mmol/L Tris-Hcl，1mmol/L EDTA，pH8.0)。最后将所得DNA溶液保存于4℃。
2.PCR引物及反应
根据已知藻红蛋白基因序列设计简并性引物。正向引物PPE1：5’-AGAATTCAATGCTTGAYGCW-3′(序列表中SEQ ID NO 16)，反向引物PPE2：5’-CCGTTAGSDTARDGMRTTD-3′(序列表中SEQ ID NO 17)。于25ul反应体系中加入1ul模板DNA(20ng/ul)，1ul Taq(5U/ul)，0.5ul dNTP(10mmol/L)，2ul Mg2+(25mmol/L)，2.5ul 10×Taq缓冲液，两端引物(10umol/L)各1ul，余下体积加超纯水补齐(以上试剂均购自上海生工生物工程有限公司)。反应条件为：94℃预变性5min；然后94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1.5min，共30个循环；最后72℃延伸10min以补齐未端。扩增产物于1.0％琼脂糖(购自Promega公司)凝胶中电泳鉴定，结果扩增出一条大小约1.1kb的条带，与预计值相符。
3.pe的克隆与测序
PCR扩增条带从琼脂糖凝胶上回收后，按宝生物工程(大连)有限公司pMD18-T克隆试剂盒手册要求，与pMD18-T载体连接，转化感受态细菌DH5α。连接、转化以及阳性重组子的筛选和鉴定均参考《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，金冬雁等译，科学出版社，1992年第二版)介绍的方法。将阳性克隆菌落培养后，由上海基康公司从正反两个方向分别进行测序。其核酸序列及其推导的氨基酸序列(序列表中SEQ ID NO 7～9)如下：
ATG CTT GAC GCA TTT TCT AGA GTT GTA GTG AAT TCA GAC GCA AAA GCT GCT
Met Leu Asp Ala Phe Ser Arg Val Val Val Asn Ser Asp Ala Lys Ala Ala
TAT GTA AGT GGC AGT GAT TTA CAA GCT CTT AAA ACA TTC ATT TCT GAA GGA
Tyr Val Ser Gly Ser Asp Leu Gln Ala Leu Lys Thr Phe Ile Ser Glu Gly
AAC AAA CGT TTA GAT TCA GTA AAC TAT ATC GTA TCT AAC GCA AGC TGC ATC
Asn Lys Arg Leu Asp Ser Val Asn Tyr Ile Val Ser Asn Ala Ser Cys Ile
GTT TCA GAT GCA GTA TCT GGC ATG ATT TGT GAA AAT CCA GGC TTG ATT GCA
Val Ser Asp Ala Val Ser Glyr Met Ile Cys Glu Asn Pro Gly Leu Ile Ala
CCA GGT GGA AAT TGC TAT ACA AAT CGT AGA ATG GCT GCT TGT TTA CGC GAT
Pro Gly Gly Asn Cys Tyr Thr Asn Arg Arg Met Ala Ala Cys Leu Arg Asp
GGT GAA ATT ATC TTA CGT TAT GTA TCT TAT GCT TTA CTA TCT GGC GAT GCT
Gly Glu Ile Ile Leu Arg Tyr Val Ser Tyr Ala Leu Leu Ser Gly Asp Ala
TCT GTA TTA GAA GAT CGT TGC TTA AAT GGA CTA AAA GAA ACT TAT ATT GCA
Ser Val Leu Glu Asp Arg Cys Leu Asn Gly Leu Lys Glu Thr Tyr Ile Ala
CTT GGT GTA CCA ACT AAT TCA ACA GTA AGA GCA GTA AGC ATT ATG AAA GCG
Leu Gly Val Pro Thr Asn Ser Thr Val Arg Ala Val Ser Ile Met Lys Ala
GCT GCT GTT GCA TTT GTA ACT AAT ACA GCA TCA CAA CGT ACA GTA GAA GTT
Ala Ala Val Ala Phe Val Thr Asn Thr Ala Ser Gln Arg Thr Val Glu Val
GCT GCT GGA GAT TGT AGT GCA ATC GCT TCT GAA GTT GGC GCA TAT TGT GAT
Ala Ala Gly Asp Cys Ser Ala Ile Ala Ser Glu Val Gly Ala Tyr Cys Asp
AGA GTA GCT GCT GCT GTT TCT TAA TCA ATT TGC AGA GAA CAA TCT ACA AAG
Arg Val Ala Ala Ala Val Ser Stop
TAT TGA TAA GCA AAA TAC TTA AAA TTA TTC CTT AAG GAG AAA TATA ATG
Met
AAA TCA GTT ATT ACT ACT ACT ATC AGT GCT GCT GAT GCT GCT GGT CGT TTT
Lys Ser Val Ile Thr Thr Thr Ile Ser Ala Ala Asp Ala Ala Gly Arg Phe
CCT TCA AGC TCT GAT CTA GAA TCA GTA CAA GGC AAC ATC CAA CGT TCT AGT
Pro Ser Ser Ser Asp Leu Glu Ser Val Gln Gly Asn Ile Gln Arg Ser Ser
GCA AGA TTA GAA GCG GCT GAA AAA TTA GGA TAC AAC CAT GAA GCA GTT GTA
Ala Arg Leu Glu Ala Ala Glu Lys Leu Glyr Tyr Asn His Glu Ala Val Val
AAA GAA GGC GGA GAT GCT TGT TTT GCA AAA TAT TCT TAC TTA AAA AAC CCA
Lys Glu Gly Gly Asp Ala Cys Phe Ala Lys Tyr Ser Tyr Leu Lys Asn Pro
GGA GAA GCT GGT GAC AGC ACA GAA AAA ATC AAT AAA TGC TAT AGA GAT GTT
Gly Glu Ala Gly Asp Ser Thr Glu Lys Ile Asn Lys Cys Tyr Arg Asp Val
GAT CAC TAC ATG CGT TTA ATC AAC TAC TCA CTT GTA GTT GGT GGT ACT GGT
Asp His Tyr Met Arg Leu Ile Asn Tyr Ser Leu Val Val Gly Gly Thr Gly
CCT CTT GAT GAA TGG GGA ATT GCT GGT TCA CGT GAA GTA TAT AGA GCT TTA
Pro Leu Asp Glu Trp Gly Ile Ala Gly Ser Arg Glu Val Tyr Arg Ala Leu
AAT CTT CCT AGT GCT GCT TAT ATT GCT TCT TTT GTA TTT ACT AGA GAT AGA
Asn Leu Pro Ser Ala Ala Tyr Ile Ala Ser Phe Val Phe Thr Arg Asp Arg
TTA TGT GTA CCT CGT GAT ATG AGC GCT CAA GCT GGA GTA GAA TAC TTA GCT
Leu Cys Val Pro Arg Asp Met Ser Ala Gln Ala Gly Val Glu Tyr Leu Ala GCTTTA GAC TAT GTA ATC AAC GCA CTA AGC TAA
Ala Leu Asp Tyr Val Ile Asn Ala Leu Ser Stop
实施例4利用PCR技术从原绿球藻(Prochlorococcus sp.)中克隆藻红蛋白基因β亚基基因
1.模板DNA的提取
取0.05g鲜重的原绿球藻(Prochlorococcus sp.)置于1.5ml离心管中；加入0.5ml缓冲液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-Hcl，10mmol/LEDTA，pH8.0)，混合均匀；10,000g离心15min后，弃上清；再依次加入0.5ml缓冲液I和5μl蛋白酶K(20mg/ml)，混匀后于37℃温育1h，其间多次颠倒管子，充分混匀；而后加入0.5ml的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，V∶V∶V)并充分混匀，10,000g离心10min后，取上清；再用等体积于上清的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，V∶V∶V)提取一遍，再取上清，上清液加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静置2h；13,000g 4℃离心15min后，弃上清，用70％乙醇洗涤2次；挥干乙醇后溶解于20μl TE缓冲液(10mmol/L Tris-Hcl，1mmol/L EDTA，pH8.0)；最后将所得DNA溶液保存于4℃。
2.PCR引物及反应
根据已知藻红蛋白β亚基基因序列设计引物。正向引物PPE3：5’-AAGCATTGCGTTCTTAGGTCTC-3’(序列表中SEQ ID NO 18)，PPE4：5’-CATCTAAAGGACCAGTCCCAC-3’(序列表中SEQ ID NO 19)。于25ul反应体系中加入1ul模板DNA(20ng/ul)，1ul Taq(5U/ul)，0.5ul dNTP(10mmol/L)，3ul Mg2+(25mmol/L)，2.5ul 10×Taq缓冲液，两端引物(10umol/L)各1ul，余下体积加超纯水补齐(以上试剂均购自上海生工生物工程有限公司)。反应条件为：94℃预变性2min；然后94℃变性40s，48℃复性40s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min以补齐未端。扩增产物于1.0％琼脂糖(购自Promega公司)凝胶中电泳鉴定，结果扩增出一条大小约500bp的条带，与预计值相符。
3.pe基因β亚基的克隆与测序
PCR扩增条带从琼脂糖凝胶上回收后，按上海Promega公司pGEM-T克隆试剂盒手册要求，与pGEM-T载体连接，转化感受态细菌DH5α。连接、转化以及阳性重组子的筛选和鉴定均参考《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，金冬雁等译，科学出版社，1992年第二版)介绍的方法。将阳性克隆菌落培养后，由上海基康公司从正反两个方向分别进行测序。其核酸序列及其推导的氨基酸序列(序列表中SEQ ID NO 10～11)如下：
ATG CTT GAT GCG TTC TCT AGA ACA GTT GTA AGT GCT GAC GCC AAG GGT GCC
Met Leu Asp Ala Phe Ser Arg Thr Val Val Ser Ala Asp Ala Lys Gly Ala
GCA ATT GGC AGT GAG GAT CTT GCA GAT TTA AGA AAG TAC GTA GCA GAT
Ala Ile Gly Ser Glu Asp Leu Ala Asp Leu Arg Lys Tyr Val Ala Asp
GCA AAT AAA AGA ATT GAT GCA ACC CTT GCA ATA ACT CAA AAT GTT TCT TGC
Ala Asn Lys Arg Ile Asp Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gln Asn Val Ser Cys
ATA GCT GCA GAT GCT GTA GCA GGA ATG GTT TGC GAA AAT ACT GGA CTT ACA
Ile Ala Ala Asp Ala Val Ala Gly Met Val Cys Glu Asn Thr Gly Leu Thr
CAG CCA GGA GGA CAT TGT TAT CCA ACT CGT CGC ATG GCA GCT TGT TTA AGG
Gln Pro Gly Gly His Cys Tyr Pro Thr Arg Arg Met Ala Ala Cys Leu Arg
GAT GGA GAA ATT ATT TTG AGA TAT GTA AGC TAC GCT CTT CTT GCT GGG GAT
Asp Gly Glu Ile Ile Leu Arg Tyr Val Ser Tyr Ala Leu Leu Ala Gly Asp
TCT TCT GTC CTT GAA GAT AGA TGT CTA AAT GGA TTA AAA GAA ACT TAT TTA
Ser Ser Val Leu Glu Asp Arg Cys Leu Asn Gly Leu Lys Glu Thr Tyr Leu
GCT CTT GGA GTT CCA ACT TCT AAT GCT ATT CGG GCA GTT GAA ATA ATG AAA
Ala Leu Gly Val Pro Thr Ser Asn Ala Ile Arg Ala Val Glu Ile Met Lys
ATT GCC ACA GTT GCA ATT ATG ACT GAG ACA AAT ACA GGA AGA AAA ATG TTT
Ile Ala Thr Val Ala Ile Met Thr Glu Thr Asn Thr Gly Arg Lys Met Phe
AAG GGA ATT AAT TCT GGC TCA GGA GCT CAG TGT CAA GAT ATA GCG GCG GAG
Lys Gly Ile Asn Ser Gly Ser Gly Ala Gln Cys Gln Asp Ile Ala Ala Glu
GCA GCA TCA TAT TTT GAC CTT GTA ATA GAG GCT TTG AGT TGA
Ala Ala Ser Tyr Phe Asp Leu Val Ile Glu Ala Leu Ser Stop
实施例5重组藻胆蛋白在大肠杆菌(E.coli)中的表达
1.表达麦芽糖结合蛋白与藻胆蛋白融合蛋白(MBP-APC，镭普克)载体的构建
如图1所示的设计将apc基因用限制性内切酶EcoR I从质粒pCRBapc中切下，按美国New England Biolabs蛋白融合及表达系统试剂盒要求，接到pMAL-p2X载体麦芽糖结合蛋白(MBP)基因下游EcoR I位点中，并转化大肠杆菌TB1。按照《分子克隆实验指南》第二版所述方法，进行筛选找到一个apc方向正确，读码框也正确的表达质粒pMAL-apc，同时获得可生产MBP-APC的基因工程菌菌株P1。基因工程菌菌株P1生产的MBP-APC命名为镭普克。
2.镭普克的生产
从LB固体(含1.5％琼脂的LB培养基)平板上挑选基因工程菌菌株P1单菌落，转接到5ml含100mg/L氨苄青霉素(Amp)的LB(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L；NaCl 10g/L；pH7.2～7.4)培养基中，于37℃恒温摇床，220r/min培养过夜；然后将活化的菌液转入1L含100mg/L氨苄青霉素(Amp)2-YT(葡萄糖5g/L，蛋白胨16g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，MgSO4 5g/L；pH7.0)培养基中，于37℃恒温摇床，220r/min培养8h，作为20L规模发酵的种子液。
将制备好的种子液接入16L含100mg/L氨苄青霉素(Amp)2-YT培养基中，在20L发酵罐中以温度37℃、转速700r/min和溶解氧为100％的培养条件下发酵13h，而后温度降为28℃，通过控制转速和通气量将溶解氧维持在30％左右，继续发酵7h后收获菌体。发酵过程中在开始发酵5h后补料，补料培养基为葡萄糖400g/L，蛋白胨16g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，MgSO4 5g/L，pH7.0；补料速率为0.054g(L·min)-1，持续8h后停止。发酵开始10h后，加入终浓度为0.3mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)进行诱导，表达镭普克。
收获的菌液在5,000g，4℃条件下离心收集菌体；收集的菌体用CBBuffer(10mmol/L Tris·Cl，200mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，pH7.4)洗涤2次后，再用1L CB Buffer重悬；重悬的菌体进行超声波破碎，具体参数为：功率30W，每破碎15s后间隔5s，共破碎6min 15s；破碎后10,000g，4℃离心取上清。而后根据美国New England Biolabs蛋白融合及表达系统说明书的说明进行亲和层析一步纯化，得到电泳级纯度的镭普克。经SDS-PAGE电泳，为一条约60kD的单一条带，每升菌液约能得到镭普克纯品100mg。
这种方法得到的镭普克，纯度大于90％(用SDS-PAGE、PAGE及HPLC法鉴定)，镭普克在SDS-PAGE上的迁移率为0.452，在HPLC上的保留时间为31min，最大紫外吸收波长：240nm(200-900nm全波长扫描)。不同生产批次之间镭普克性质一致，质量稳定。
3.表达6×His tag-APC(HAPC)载体的构建
按图1所示的设计，将apc用限制性内切酶EcoR I从质粒pCRBapc中切下，按Novagen公司的pET蛋白表达系统试剂盒要求，插入pET-28a(+)载体多克隆位点中的EcoR I位点上，并转化感受态大肠杆菌DH5α。通过筛选找到一个含有正确apc方向，正确读码框表达质粒pET-apc的菌株，用碱变性法提取出构建好的表达质粒，再转化感受态大肠杆菌JM109(DE3)，得到能在T7启动子驱动下高效表达活性藻胆蛋白的基因工程菌菌株J1。上述连接、转化以及阳性重组子的筛选和鉴定均参考《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，金冬雁等译，科学出版社，1992年第二版)介绍的方法。
4.6×His tag-APC(HAPC)的生产
从LB固体(含1.5％琼脂的LB培养基)平板上挑取基因工程菌菌株J1单菌落于5ml含50μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中，在恒温振荡培养箱中培养(温度：37℃，转速：200r/min左右)。将过夜培养物以1∶100的比例接种于5L的2YT培养基(含卡那霉素50μg/ml)中。在恒温振荡培养箱中以温度37℃、转速200r/min的培养条件下培养至OD600＝0.5～0.7时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)至终浓度为0.4mmol/L进行诱导。加入诱导剂后，在温度25℃、转速200r/min的培养条件继续培养10h后停止。
将收获的菌液5,000g，离心10min，弃上清液。收集的菌体以SB buffer(20mmol/L磷酸氢二钠，500mmol/L NaCl，pH7.8)洗涤2次后，将菌体重悬于相当于原培养物1/50体积冰冷的SB buffer。超声波破碎细胞，功率30W，每破碎15s后间隔5s，总计10min，破碎过程中保持细胞低温(0℃)。破碎后于4℃以12,000g离心30min，上清液用0.45μm硝酸纤维素膜过滤后，滤液用于上柱纯化。
将上述处理获得的滤液上柱，柱料为预先用SB buffer平衡的固化Ni2+层析树脂(Pharmacia公司)，上样量约为8-12mg目的蛋白/ml树脂，流速为10个柱体积/h；然后依次用10个柱体积的SB buffer，6个柱体积的洗涤缓冲液(20mmol/L磷酸氢二钠，500mmol/L NaCl，pH6.0)洗柱，直至流过液A280＜0.01；再用10mmol/L咪唑洗脱液洗柱(20mmol/L磷酸氢二钠，500mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑，pH7.0)，直至流过液A280＜0.01；最后用150mmol/L咪唑洗脱液(20mmol/L磷酸钠，500mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑，pH7.0)洗脱目的蛋白，洗脱时监测A280，收集洗脱峰，从而得到电泳级纯度的HAPC。经SDS-PAGE电泳，为二条分别约为21kD与18kD的条带，即别藻蓝蛋白的α与β亚基。该法生产的藻胆蛋白为无色蛋白，溶于水，分子量约为39kD。
5.表达6×His tag-PE载体的构建与重组蛋白的生产
按图2所示的设计将pe用限制性内切酶BamH I和Hind III从质粒pMD-pe中切下，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，从胶上回收。按Novagen公司的pET蛋白表达系统试剂盒要求，连接到经同样内切酶处理过的pET-28a(+)载体上，16℃连接16h，然后转化感受态大肠杆菌DH5α。由于pMD-pe质粒中，pe基因5′端位于BamH I下游，3′端位于Hind III上游，这样pe基因定向插入pET-28a(+)的BamH I和Hind III两位点间。经核苷酸测序，表明构建成插入序列与已知pe基因序列相同，并且阅读框正确的表达质粒pET-pe。用碱变性法提取出构建好的表达质粒，转化感受态大肠杆菌JM109(DE3)，得到能在T7启动子驱动下高效表达活性藻胆蛋白的基因工程菌菌株JME1。上述连接、转化以及阳性重组子的筛选和鉴定均参考《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，金冬雁等译，科学出版社，1992年第二版)介绍的方法。
从LB固体(含1.5％琼脂的LB培养基)平板上挑选基因工程菌菌株JME1单菌落于5ml含50μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中，在恒温振荡培养箱中培养(温度：37℃，转速：200r/min左右)。将过夜培养物以1∶100的比例接种于5L含1％葡萄糖LB培养基(含卡那霉素50μg/mL)中。于37℃，220r/min振荡培养，OD600＝0.6时加入IPTG至终浓度0.4mmol/L，再振荡培养4h。离心收集菌体，超声波破碎，亲和层析一步纯化，得到电泳级纯度的藻胆蛋白(分离纯化方法同“6×His tag-APC(HAPC)的生产”所述)。经SDS-PAGE电泳，为二条分别约为23kD与19kD的条带，即藻红蛋白的β与α亚基。该法生产的藻胆蛋白为无色蛋白，溶于水，分子量约为41kD。
实施例6重组藻胆蛋白α亚基在大肠杆菌(E.coli)中的表达
1.表达麦芽糖结合蛋白和藻胆蛋白α亚基融合蛋白表达载体的构建及重组蛋白的生产
根据实施例1的所获得的apc基因序列设计引物。正向引物PAP3：5’-CTGGATCCTTAATGAGTATCG-3’(序列表中SEQ ID NO 20)，反向引物PAP4：5’-ACGCTGCAGAAAGACTGAAT-3’(序列表中SEQ ID NO 21)。其中正向引物5′端加上了BamH I酶切位点，反向引物5′端加上了Pst I酶切位点(分别以下划线表示)。以质粒pMAL-apc作为PCR反应扩增模板。于25ul反应体系中加入1ul质粒pMAL-apc(20ng/ul)，0.2ul Taq(5U/ul)，0.5ul dNTP(10mmol/L)，3ul Mg2+(25mmol/L)，2.5ul 10×反应缓冲液，两端引物(10umol/L)各1ul，余下体积加超纯水补齐(以上试剂均购自上海Promega公司)。反应条件为：94℃预变性3min；然后94℃变性40s，50℃复性40s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸8min以补齐未端。扩增产物于1.2％琼脂糖(购自北京鼎国生物公司)凝胶中电泳鉴定，结果扩增出一条大小约500bp的条带，与预计值相符。
按图3所示设计，PCR扩增条带从琼脂糖凝胶上回收后，用内切酶BamH I和Pst I在37℃消化6h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，从胶上回收。连接到经同样酶处理过的pMAL-p2X载体上，16℃连接16h，然后转化感受态大肠杆菌DH5α。由于经过PCR改造后，apcα亚基基因5′端加上了BamH I酶切位点，3′端加上了Pst I酶切位点，这样apcα亚基基因定向插入pMAL-p2X的BamH I和Pst I两位点间。经核苷酸测序，表明所克隆apcα亚基基因序列与已知序列相同，并且阅读框正确，从而得到了表达质粒pMAL-apcα。用碱变性法提取出构建好的表达质粒，按美国NewEngland Biolabs蛋白融合及表达系统试剂盒说明书要求转化感受态大肠杆菌JM109(DE3)，得到能高效表达活性重组藻胆蛋白α亚基的基因工程菌菌株Pα1。上述连接、转化以及阳性重组子的筛选和鉴定均参考《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，金冬雁等译，科学出版社，1992年第二版)介绍的方法。
MBP-APCα的生产方法同实施例1中镭普克的生产。具体方法参见实施例1相关步骤。该法得到的重组藻胆蛋白α亚基(MBP-APCα)为电泳纯无色蛋白，溶于水，分子量约为60kD。
2.表达6×His tag-APCα(HAPCα)载体的构建及重组藻胆蛋白的生产
按图3所示的设计，用碱变性法从大肠杆菌菌株Pα1中提取质粒pMAL-apcα。所提取的质粒用内切酶BamH I和HindIII在37℃消化6h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，从胶上回收500bp的小片段。而后按Novagen公司的pET蛋白表达系统试剂盒要求，将回收的500bp的小片段与同样经过内切酶BamH I和HindIII酶切的pET-28a(+)载体相连接，16℃连接16h，然后转化感受态大肠杆菌DH5α。通过筛选找到一个含有正确apcα方向，正确读码框表达质粒pET-apcα的菌株。用碱变性法提取出构建好的表达质粒，转化感受态大肠杆菌JM109(DE3)，得到能在T7启动子驱动下高效表达活性藻胆蛋白α亚基的基因工程菌菌株Jα1。上述质粒提取、连接、转化以及阳性重组子的筛选和鉴定均参考《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，金冬雁等译，科学出版社，1992年第二版)介绍的方法。
6×His tag-APCα的生产方法同实施例1中HAPC的生产。具体方法参见实施例1相关步骤。该法得到的重组藻胆蛋白α亚基(6×His tag-APCα)为电泳纯无色蛋白，溶于水，分子量约为21kD。
实施例7重组藻胆蛋白β亚基在大肠杆菌(E.coli)中的表达
1.藻胆蛋白β亚基基因的克隆
根据实施例1的所获得的apc基因序列设计引物。正向引物PAP5：5’-TAGGATCCATGCAAGACGC-3’(序列表中SEQ ID NO 22)，反向引物PAP6：5’-ATTCGGCTTGGAAGCTTAG-3’(序列表中SEQ ID NO 23)。其中正向引物5′端加上了BamH I酶切位点，反向引物则通过点突变在3′端加上了Hind III酶切位点(分别以下划线表示)。以质粒pMAL-apc作为PCR反应扩增模板。于25ul反应体系中加入1ul质粒pMAL-apc(20ng/ul)，0.1ulTaq(5U/ul)，0.5ul dNTP(10mmol/L)，4ul Mg2+(25mmol/L)，2.5ul 10×反应缓冲液，两端引物(10umol/L)各1ul，余下体积加超纯水补齐(以上试剂均购自上海Promega公司)。反应条件为：94℃预变性3min；然后94℃变性40s，55℃复性40s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸8min以补齐未端。扩增产物于1.2％琼脂糖凝胶中电泳鉴定，结果扩增出一条大小约500bp的条带，与预计值相符。PCR扩增条带从琼脂糖凝胶上回收后，用内切酶BamH I和HindIII在37℃消化6h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，从胶上回收，溶于30ul无菌超纯水，4℃保存备用。
2.表达麦芽糖结合蛋白和藻胆蛋白β亚基融合蛋白载体的构建及重组蛋白的生产
按图3所示的设计，pMAL-p2X载体DNA用内切酶BamH I和HindIII在37℃消化6h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，从胶上回收。与经同样内切酶处理过的藻胆蛋白β亚基基因连接，16℃连接16h，然后转化感受态大肠杆菌DH5α。由于经过PCR改造后，apcβ亚基基因5′端加上了BamHI酶切位点，3′端加上了Hind III酶切位点，这样apcβ亚基基因定向插入pMAL-p2X的BamH I和HindIII两位点间。经核苷酸测序，表明所克隆apcβ亚基基因序列与已知序列相同，并且阅读框正确，从而得到了表达质粒pMAL-apcβ。用碱变性法提取出构建好的表达质粒，按美国New EnglandBiolabs蛋白融合及表达系统试剂盒说明书要求转化感受态大肠杆菌JM109(DE3)，得到能高效表达活性重组藻胆蛋白β亚基的大肠杆菌菌株Pβ1。上述连接、转化以及阳性重组子的筛选和鉴定均参考《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，金冬雁等译，科学出版社，1992年第二版)介绍的方法。
MBP-APCβ的生产方法同实施例1中镭普克的生产。具体方法参见实施例1相关步骤。该法得到的重组藻胆蛋白β亚基(MBP-APCβ)为电泳纯无色蛋白，溶于水，分子量约为58kD。
3.表达6×His tag-APCβ(HAPCβ)载体的构建及重组蛋白的生产
按图3所示的设计，pET-28a(+)载体DNA用内切酶BamH I和HindIII在37℃消化6h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，从胶上回收。与经同样内切酶处理过的藻胆蛋白β亚基基因连接，16℃连接16h，然后转化感受态大肠杆菌DH5α。经过筛选得到表达质粒pET-apcβ。用碱变性法提取出构建好的表达质粒，转化感受态大肠杆菌JM109(DE3)，得到能在T7启动子驱动下高效表达活性藻胆蛋白β亚基的大肠杆菌菌株Jβ1。上述质粒提取、连接、转化以及阳性重组子的筛选和鉴定均参考《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，金冬雁等译，科学出版社，1992年第二版)介绍的方法。
6×His tag-APCβ的生产方法同实施例1中HAPC的生产。具体方法参见实施例1相关步骤。该法得到的重组藻胆蛋白β亚基(6×His tag-APCβ)为电泳纯无色蛋白，溶于水，分子量约为19kD。
实施例8藻胆蛋白在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高效表达
1.apc的定点突变
根据实施例1所获得apc基因序列设计引物。正向引物PAP7：5′-GGAGAGAATTCCATGTTTGA-3’(序列表中SEQ ID NO 24)，反向引物PAP8：5′-ATTGGTACCGGTAGGGCGTTGATCG-3′(序列表中SEQ ID NO25)。其中正向引物5′端加上了EcoR I酶切位点，反向引物5′端加上了KpnI酶切位点(分别以下划线表示)。以质粒pCRBapc作为PCR反应扩增模板。于25ul反应体系中加入1ul质粒pCRBapc(20ng/ul)，1ul Taq(5U/ul)，0.5ul dNTP(10mmol/L)，2ul Mg2+(25mmol/L)，2.5ul 10×反应缓冲液，两端引物(10umol/L)各1ul，余下体积加超纯水补齐(以上试剂均购自上海生工生物工程有限公司)。反应条件为：93℃预变性5min；然后93℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸3min，共35个循环；最后72℃延伸8min以补齐未端。扩增产物于1.0％琼脂糖(购自Promega公司)凝胶中电泳鉴定，结果扩增出一条大小约1kb的条带，与预计值相符。PCR扩增条带从琼脂糖凝胶上回收后，用内切酶EcoR I和Kpn I在37℃消化4h，然后75℃反应10min以失活内切酶。1.2％琼脂糖凝胶电泳后回收，连接到经同样酶处理过的pBluescriptSK(+)，16℃连接16h，然后转化感受态大肠杆菌DH5α。由于经过PCR改造后，apc基因5′端加上了EcoR I酶切位点，3′端加上了KpnI酶切位点，这样apc定向插入pBluescriptSK(+)的EcoRI和Kpn I两位点间。经核苷酸测序和序列比对分析，表明所克隆apc序列与已知序列相同，且达到终止子失活突变的目的。
2.apc的毕赤酵母(Pichiapastoris)表达载体的构建
按图4所示设计，用内切酶EcoR I和Kpn I双酶切消化已插入大小约1040bp apc的pBluescriptSK(+)载体(pBS-apc)。回收apc片段，连接到用同样内切酶处理过的毕赤酵母表达载体pPIC6αc(美国Invitrogen公司)上，然后转化感受态大肠杆菌DH5α。挑选若干转化子，运用碱变性法提取出质粒，用内切酶EcoR I和Kpn I双酶切鉴定apc的插入，并用没有插入apc的pPIC6αc载体作对照。构建的载体切出了1kb左右的片段，说明apc基因已正确插入到pPIC6αc的EcoR I和Kpn I位点处。该表达载体命名为pPIC-apc。
3.重组藻胆蛋白在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的小规模表达
将pPIC-apc质粒用限制性内切酶Sac I消化后，回收线性DNA片段，电激法转化毕赤酵母细胞X-33，筛选出具有正确的Blasticidin抗性的转化子。分别提取各转化子基因组DNA，进行PCR鉴定，判断apc是否整合入Pichia pastoris X-33基因组。将鉴定正确的重组酵母细胞株进行诱导，离心收集甲醇诱导2d的培养上清，亲和层析一步纯化，得到电泳级纯度的重组藻胆蛋白。以上过程具体操作均根据美国Invitrogen公司pPICα6.Starter Kit使用手册所述。
实施例9藻胆蛋白基因在海带中的表达
1.表达载体构建
根据实施例1所获得apc基因序列设计引物。正向引物PAP9：5′-GACGAATTC ATT AAT GAGTATCG-3′(序列表中SEQ ID NO26)，反向引物PAP10：5′-TGGTCGACTAGCTCAAGCCGGAG-3′(序列表中SEQ IDNO27)。其中正向引物5′端加上了EcoR I酶切位点，反向引物在5′端加上了Sal I酶切位点(分别以下划线表示)。以质粒pMAL-apc作为PCR反应扩增模板。于25ul反应体系中加入0.5ul质粒pMAL-apc(40ng/ul)，0.2ul Taq(5U/ul)，0.5ul dNTP(10mmol/L0，2ul Mg2+(25mmol/L)，2.5ul 10×反应缓冲液，两端引物(10umol/L)各1ul，余下体积加超纯水补齐(以上试剂均购自上海Promega公司)。反应条件为：94℃预变性3min；然后94℃变性1min，58℃复性1min，72℃延伸1.5min，共35个循环；最后72℃延伸8min以补齐未端。扩增产物于1.2％琼脂糖凝胶中电泳鉴定，结果扩增出一条大小约1kb的条带，与预计值相符。按图5所示设计，PCR扩增条带从琼脂糖凝胶上回收后，用内切酶EcoR I和Sal I在37℃消化6h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，从胶上回收，与经同样酶处理过的pSI载体连接，16℃连接16h，然后转化感受态大肠杆菌DH5α。由于经过PCR改造后，apc基因5′端加上了EcoR I酶切位点，3′端加上了Sal I酶切位点，这样apc基因定向插入pSI(购自Promega Cat.#E 1721)多克隆位点的EcoR I和SalI两位点间。筛选得到阳性克隆子后，阳性克隆子经核苷酸测序验证，表明所克隆apc基因序列与已知序列相同，且并阅读框正确，从而得到了表达质粒pSI-apc及含有该质粒的菌株L1。由于pSI载体EcoR I位点上游为SV40增强子与SV40启动子，Sal I位点下游为SV40 late polyA，而SV40启动子可在海带中驱动外源基因表达(姜鹏、秦松等，乙肝病毒表面抗原(HbsAg)基因在海带中的表达，科学通报，2002，47(14)：1095)，因此构建成功的pSI-apc可在海带中表达。
2.转化海带
从LB固体(含1.5％琼脂的LB培养基)平板上挑选含有表达质粒pSI-apc的菌株L1单菌落于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，在恒温振荡培养箱中培养(温度：37℃，转速：200r/min左右)培养12h。5,000g，5min离心收集菌体后，采用碱裂解法(《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，金冬雁等译，科学出版社，1992年第二版)提取质粒。取0.5μl质粒溶液稀释200倍，用紫外分光光度计测定OD260/OD280值检验纯度，如果低于1.7或高于1.8，则重新用苯酚、氯仿纯化。最后根据DNA含量用适量无菌超纯水调整浓度至1μg/μl。获得质粒后，参照Heiser W(Heiser W.Optimization of boilistic transformation using thehelium-driven PDS-1000/He system.1992，US/EG Bull，1688.BioRad.Hercules，CA，USA，8)制作基因枪子弹。
基因枪轰击前一天，取2片无菌载玻片轻柔对磨海带丝状雄配子体，使其松动散开并断裂。显微镜镜检并用血球计数板计数处理后的配子体，每段配子体不超过5个细胞。遮光恢复性培养24h。转化时圆形无菌筛绢(400目，直径4cm)做为靶细胞的承载体，将配子体均匀平铺于中央，形成直径约2cm的圆形有效轰击范围。每次轰击约用1.0×106雄配子体细胞。
整个轰击过程为无菌操作，超净工作台、基因枪(Bio-Rad产品，称为PDS-1000/He Biolistic particle delivery system，型号：PDS-1000/He)。内部用70％酒精灭菌，轰击用可裂膜、DNA载片、阻挡网均用70％酒精浸泡20min，于紫外灯下晾干待用。轰击参数：样品室真空度为28(英寸汞柱)，可裂膜为1100psi(pound per square inch)，受体细胞与阻挡网之间距离为6cm，每次轰击用1.0μg质粒DNA。取不进行轰击雄配子体细胞作为空白对照。用不加质粒DNA的金粉分别轰击雄配子体作为阴性对照。对照组和处理组的群体数皆约为1×106个细胞。
轰击后各组加入灭菌含铁诱导培养基(0.71mmol/L NaNO3，0.032mmol/L KH2PO4，0.0019mmol/L柠檬酸铁，0.5μg/L VB12)，弱光培养，24h后恢复正常光照(光暗周期为10h/14h，光强为50uE/m2s)。一周后混入相同数量的雌性配子体，采用含铁诱导培养基，在光暗周期为10h/14h，光强为50uE/m2s，温度12.0℃+0.5℃培养条件下诱导雌雄配子受精。二倍体幼孢子体出苗后培养基每周更换1次。
3.apc基因在海带孢子体中的稳定表达
转化后3个月对海带孢子体进行稳定表达检测。转化组随机挑取100株海带孢子体，阴性对照组和空白对照组各随机挑取5株，研磨提取总DNA。具体方法如下：每株孢子体取部分组织，用煮沸过的海水洗净表面粘液，加少量灭菌石英砂分别研磨后，加适量裂解缓冲液(100mmol/LTris-HCl，EDTA 50mmol/L，NaCl 100mmol/L，Tween-201％，KAC 2.5mol/L，蛋白酶K 0.1mg/ml，pH8.0)于室温下裂解1h，不时轻微颠倒混匀；而后室温下10,000g离心10min，取上清；各管加与上清等体积的饱和酚(pH8.0)，颠倒混匀，抽提10min，室温下12,000g离心10min，取上清液；各管再加1/3V无水乙醇，颠倒混匀以沉淀多糖，室温下12,000g离心15min，取上清；最后各管加2/3V异丙醇，混匀后于-20℃沉淀DNA过夜，于4℃12,000g离心20min，真空抽干乙醇后，用30μl TE溶解DNA。以0.8％琼脂糖凝胶电泳检验并从凝胶上回收海带孢子体总DNA，用于PCR检测。
分别以所提取各株海带孢子体总DNA为模板，以PAP9和PAP10为检测引物。于25ul反应体系中加入1ul DNA(20ng/ul)，0.2ul Taq(5U/ul)，0.5ul dNTP(10mmol/L)，2ul Mg2+(25mmol/L)，2.5ul 10×反应缓冲液，两端引物(10umol/L)各1ul，余下体积加超纯水补齐(以上试剂均购自上海Promega公司)。反应条件为：94℃预变性3min；然后94℃变性1min，58℃复性1min，72℃延伸1.5min，共35个循环；最后72℃延伸8min以补齐未端。除扩增海带DNA样品外，同时设立系统空白对照(不加模板)与阳性对照(以转化质粒pSI-apc为模板)。扩增产物于1.2％琼脂糖凝胶中电泳鉴定，结果阳性对照扩增出一条大小约1kb的条带，空白对照、空白组与阴性对照组海带DNA样品均无扩增条带出现。而100个处理组样品中则有16个样品出现阳性条带，转化率为16％，提示apc基因已整合到这些海带基因组中。
实施例10重组藻胆蛋白(MBP-APC，镭普克)的抗肿瘤作用
选用18-22克雌性KM小鼠及生长良好的7-11天的S-180瘤种和H22肝癌，分别将瘤组织制成细胞悬液，接种于小鼠右侧腋部皮下，约1-2.5×106细胞/只，接种24h后随机分笼。第二天开始给药7天，空白对照组不给药，阳性对照组给予5-氟尿嘧碇(5-FU)30mg/kg·d(腹腔注射，ip)，处理组给药方式为口服给药(p.o.)、腹腔注射(ip)和静脉注射给药(i.v.)3种方式，每种方式设3个剂量给药组，分别给予镭普克4.65mg/kg·d、9.3mg/kg·d、18.9mg/kg·d。各组给药剂量的设置如表1所示。停药后24h处死动物，称体重、瘤重，计算各组平均瘤重，按下列公式求出肿瘤抑制率并进行显著性检验(t检验)。

表1表明静脉注射镭普克能显著抑制S-180实体瘤的的生长，剂量变化从4.65到18.6mg/kg·d时，其抑瘤率从7.9％到61.9％。
表1镭普克对小鼠S-180瘤重的影响
             剂量
组别        (mg/kg      给药   小鼠数        鼠重(g)         瘤重      抑瘤率   P值
            ·d)
                        途径    开始   结束    开始    结束    (g，x±SD)    ％
空白         ----                16     16     22.4    26.9    1.26±0.73    ----   ----
MBP-
             4.65       p.o      8      8      22.4    26.9    1.16±0.58    7.9    ＞0.05
APC
MBP-
             9.3        p.o      8      8      22.4    25.5    0.79±0.30    37.3   ＜0.01
APC
MBP-
             18.6       p.o      8      8      22.4    25.0    1.35±0.56    ＞NS
APC
MBP-
             4.65       i.p      8      8      22.3    25.9    1.12±0.49    11.1   ＞0.05
APC
MBP-
             9.3        i.p      8      8      22.1    26.3    1.50±0.54    ＞NS
APC
MBP-
             18.6       i.p      8      8      22.3    25.0    1.05±0.41    16.7   ＞0.05
APC
MBP-
             4.65       i.v      8      8      22.4    24.1    0.75±0.43    40.5   ＜0.01
APC
MBP-
             9.3        i.v      8      8      22.4    23.9    0.58±0.23    54.0   ＜0.01
APC
MBP-
             18.6       i.v      8      8      22.4    25.0    0.48±0.16    61.9   ＜0.01
APC
5-FU         30         i.p      8      8      22.3    24.9    0.83±0.24    34.1   ＜0.05
在测试MBP-APC对小鼠H22肝癌的实验性治疗作用中，静脉注射的剂量为50mg/kg·d时，抑瘤率达62.2％，参见表2。
表2MBP-APC对小鼠H22肝癌的影响
组别      剂量       给药  小鼠数        鼠重(g)         瘤重      抑瘤率    P值
        (mg/kg·d)   途径  开始  结束   开始     结束    (g，x±SD)    (％)
空白      ----              20    20    21.4     32.1    2.30±0.70    ----    ----
MBP-
          6.25        Iv    10    10    21.4     29.4    1.46±0.39    36.5    ＜0.01
APC
MBP-
          12.5        Iv    10    10    21.3     27.0    1.23±0.50    46.5    ＜0.01
APC
MBP-
          25          Iv    10    10    21.4     28.2    1.23±0.50    41.7    ＜0.01
APC
MBP-
          50          Iv    10    10    21.3     22.9    1.34±0.26    62.2    ＜0.01
APC
5-FU
          75          Iv    10    10    21.5     29.9    0.71±0.10    69.1    ＜0.01
实施例11重组藻胆蛋白(His tag-APC，HAPC)提高白细胞数量作用
1.HAPC对S-180荷瘤小鼠的升白作用
ICR小鼠，雄性，18～22g。取腹腔接种S-180瘤株8天的荷瘤小鼠，无菌操作下抽取腹腔瘤液，以灭菌生理盐水稀释至镜检含瘤细胞数为6×107个/ml的瘤细胞液，于小鼠右前肢腋部皮下接种0.2ml/鼠。接种后24h称重，随机分为4组，空白对照组给予生理盐水(NS)，阳性对照组给予环磷酰胺(CY)25mg/kg·d，2个剂量给药组分别给予HAPC 1.5mg/kg·d、4.5mg/kg·d，容积均为0.1ml/10g体重，连续10d，给药方式为灌胃给药(ig)。末次给药后24h，小鼠称重，眼眶取血作白细胞记数，脱颈椎处死，摘取胸腺、脾脏，剥离肉瘤，电子天平称重。计算各组小鼠瘤重平均值及其标准差，以给药组与空白对照组比较，计算瘤重抑制率(％)＝(给药组平均瘤重-对照组平均瘤重)g/对照线平均瘤重g×100，并作显著性检验(t检验，下同)结果见表3。
表3HPAC对S180荷瘤小鼠的影响(x±SD)
            鼠       给药      瘤重    抑瘤率  白细胞      体重       胸腺指数    脾指数
组别
            数    (mg/kg·d)   (g)      (％)   (109/L)    (g)       (mg/g)      (mg/g)
空白                          1.67±                        13.41±           26.54±          33.16±           64.59±
            9       -
对照                          0.58             2.78        3.61       11.32       13.31
阳性                          0.21±                       2.84±              21.54±          0.01±              40.45±
            8       CY 25              87.43
对照                          0.12***         1.69***    3.68**     0.01***    12.39***
                              1.58±                       17.56±           25.67±            31.29±           84.72±
HAPC        9       HAPC1.5            5.39
                              0.83*           2.49***   3.40*      16.43*     20.48*
                              1.06±                       18.30±          27.36±             32.33±            63.53±
HAPC        8       HAPC4.5            36.53
                              0.68*           2.87***   4.22*      11.02*     12.08*
t检验，与空白对照组比，*p＞0.05，**p＜0.05，***p＜0.01
由表3可见HAPC对荷瘤小鼠血液白细胞数有显著增加作用，对体重、胸腺及脾脏重量无明显影响。
3.HAPC对环磷酰胺(CY)抑制白细胞数量的对抗作用试验
ICR小鼠，雄性，18～22g。称重后随机分为4组：正常对照组灌胃给药(ig)无菌生理盐水，造型对照组灌胃给药(ig)CY 25mg/kg·d，给药组除灌胃给药(ig)CY外，同时灌胃给药(ig)HAPC 1.5mg/kg·d、4.5mg/kg·d，连续5d。末次给药后24h眼眶取血，作白细胞计数。结果见表4。
表4HAPC对CY抑制白细胞数量的影响(x±SD)
组别         给药(mg/kg·d)          鼠数    白细胞计数(×109/L)
正常对照         -                    11       9.55±2.47
造型对照         CY 25                11       1.82±1.05***
给药             CY 25+HAPC 1.5       9        2.01±1.16***△
给药             CY 25+HAPC 4.5       9        2.58±0.49***△△
t检验，与空白对照组比，***p＜0.01；与造型对照组比，△p＞0.05，△△p＜0.05
由表4可见，CY使小鼠血液白细胞数量显著减少，HAPC可对抗CY抑制白细胞的作用，对CY抑制体重及胸腺、脾重量亦有不同程度的对抗作用，4.5mg/kg·d作用显著。
从上述实施例可以看出，利用基因重组技术构建含有藻胆蛋白亚基氨基酸序列的多肽是本发明的基本特点。另外重组藻胆蛋白，与天然藻胆蛋白相比，不含有色素基，为新化合物；该重组蛋白及其衍生物可用作药物、保健或功能食品、食品添加剂、试剂等目的。
                               SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院海洋研究所
<120>重组藻胆蛋白及其制备方法和应用
<130>
<160>27
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1028
<212>DNA
<213>Anacystis nidulans
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(486)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(543)..(1028)
<223>
<400>1
atg agt atc gtc tcg aag tcc atc gtc aac gct gac gcc gag gcg cgt    48
Met Ser Ile Val Ser Lys Ser Ile Val Asn Ala Asp Ala Glu Ala Arg
1               5                   10                  15
tac cta agc cct ggc gaa ctg gaa cgc atc aaa acc ttc gtt gtc ggt    96
Tyr Leu Ser Pro Gly Glu Leu Glu Arg Ile Lys Thr Phe Val Val Gly
            20                  25                  30
ggc gat cgt cgt ctg cgg att gcg cag acc att gct gag tcc cgc gag    144
Gly Asp Arg Arg Leu Arg Ile Ala Gln Thr Ile Ala Glu Ser Arg Glu
        35                  40                  45
cgg atc gtc aag caa gct ggc aac caa ctt ttc caa aag cgt cct gac    192
Arg Ile Val Lys Gln Ala Gly Ash Gln Leu Phe Gln Lys Arg Pro Asp
    50                  55                  60
gtg gtt tcg ccc ggt ggc aat gcc tac ggt gaa gac atg acg gcc acc    240
Val Val Ser Pro Gly Gly Asn Ala Tyr Gly Glu Asp Met Thr Ala Thr
65                  70                  75                  80
tgc ctg cgt gac ctc gac tac tac ctg cgt ctt gtg acc tac ggt gta    288
Cys Leu Arg Asp Leu Asp Tyr Tyr Leu Arg Leu Val Thr Tyr Gly Val
                85                  90                  95
gtt tcg ggc gac atc acc ccg att gaa gaa atc ggc att gtc ggt gtc    336
Val Ser Gly Asp Ile Thr Pro Ile Glu Glu Ile Gly Ile Val Gly Val
            100                 105                 110
cgc gaa atg tac aaa tcg cta gga acc ccc atc gaa gct gtc gct gaa    384
Arg Glu Met Tyr Lys Ser Leu Gly Thr Pro Ile Glu Ala Val Ala Glu
        115                 120                 125
ggc gtc cgt gag ctg aaa tcg gct gca acc gcc cta ctg act ggt gaa    432
Gly Val Arg Glu Leu Lys Ser Ala Ala Thr Ala Leu Leu Thr Gly Glu
    130                 135                 140
gac gct gac gaa gca ggc gct tac ttt gac tac gta att ggc gct ctc    480
Asp Ala Asp Glu Ala Gly Ala Tyr Phe Asp Tyr Val Ile Gly Ala Leu
145                 150                 155                 160
agc taa ttcagtcttt taagtccctt tgattcgaac gcgacttttt caacgatttt     536
Ser
agaaag atg caa gac gca att acc gct gtc atc aat gct tct gac gtc     584
       Met Gln Asp Ala Ile Thr Ala Val Ile Asn Ala Ser Asp Val
                   165                 170                 175
caa ggt aag tac ctg gac agc tca gcc ctg gat cgt ctc aag agc tac    632
Gln Gly Lys Tyr Leu Asp Ser Ser Ala Leu Asp Arg Leu Lys Ser Tyr
                180                 185                 190
ttc caa agt ggc gaa ctg cgc gtc cgt gct gca gcc acc atc agt gcc    680
Phe Gln Ser Gly Glu Leu Arg Val Arg Ala Ala Ala Thr Ile Ser Ala
            195                 200                 205
aag tcg gct ctg atc gtc aaa gaa gca gtg gct aaa tcg ctg ctc tac    728
Lys Ser Ala Leu Ile Val Lys Glu Ala Val Ala Lys Ser Leu Leu Tyr
        210                 215                 220
tca gac atc acc cgt ccc ggc ggc acc atg tac acc acc cgt cgc tat    776
Ser Asp Ile Thr Arg Pro Gly Gly Thr Met Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr
    225                 230                 235
gct gct tgc atc cgg gac ttg gag tac tac ctg cgc tac gcc acc tat    824
Ala Ala Cys Ile Arg Asp Leu Glu Tyr Tyr Leu Arg Tyr Ala Thr Tyr
240                 245                 250                 255
gcc atg ttg gct ggc gat acc tcg atc ttg gat gag cgc gtg ctc aac    872
Ala Met Leu Ala Gly Asp Thr Ser Ile Leu Asp Glu Arg Val Leu Asn
                260                 265                 270
ggt ctg aaa gag acc tac aac agt ctg ggc ctg ccg atc ggt gca acc    920
Gly Leu Lys Glu Thr Tyr Asn Ser Leu Gly Leu Pro Ile Gly Ala Thr
            275                 280                 285
gtc caa gcg atc caa gca atc aaa gaa gtc act gct agc ttg gtc ggc    968
Val Gln Ala Ile Gln Ala Ile Lys Glu Val Thr Ala Ser Leu Val Gly
        290                 295                 300
ccc gac gct ggt cgc gaa atg ggt gtc tac ctc gag tac atc agc tcc    1016
Pro Asp Ala Gly Arg Glu Met Gly Val Tyr Leu Glu Tyr Ile Ser Ser
    305                 310                 315
ggc ttg agc taa                                                    1028
Gly Leu Ser
320
<210>2
<211>161
<212>PRT
<213>Anacystis nidulans
<400>2
Met Ser Ile Val Ser Lys Ser Ile Val Asn Ala Asp Ala Glu Ala Arg
1               5                   10                  15
Tyr Leu Ser Pro Gly Glu Leu Glu Arg Ile Lys Thr Phe Val Val Gly
            20                  25                  30
Gly Asp Arg Arg Leu Arg Ile Ala Gln Thr Ile Ala Glu Ser Arg Glu
        35                  40                  45
Arg Ile Val Lys Gln Ala Gly Asn Gln Leu Phe Gln Lys Arg Pro Asp
    50                  55                  60
Val Val Ser Pro Gly Gly Asn Ala Tyr Gly Glu Asp Met Thr Ala Thr
65                  70                  75                  80
Cys Leu Arg Asp Leu Asp Tyr Tyr Leu Arg Leu Val Thr Tyr Gly Val
                85                  90                  95
Val Ser Gly Asp Ile Thr Pro Ile Glu Glu Ile GlyIle Val Gly Val
            100                 105                110
Arg Glu Met Tyr Lys Ser Leu Gly Thr Pro Ile Glu Ala Val Ala Glu
        115                 120                 125
Gly Val Arg Glu Leu Lys Ser Ala Ala Thr Ala Leu Leu Thr Gly Glu
    130                 135                 140
Asp Ala Asp Glu Ala Gly Ala Tyr Phe Asp Tyr Val Ile Gly Ala Leu
145                 150                 155                 160
Ser
<210>3
<211>161
<212>PRT
<213>Anacystis nidulans
<400>3
Met Gln Asp Ala Ile Thr Ala Val Ile Asn Ala Ser Asp Val Gln Gly
1               5                   10                  15
Lys Tyr Leu Asp Ser Ser Ala Leu Asp Arg Leu Lys Ser Tyr Phe Gln
            20                  25                  30
Ser Gly Glu Leu Arg Val Arg Ala Ala Ala Thr Ile Ser Ala Lys Ser
        35                  40                  45
Ala Leu Ile Val Lys Glu Ala Val Ala Lys Ser Leu Leu Tyr Ser Asp
    50                  55                  60
Ile Thr Arg Pro Gly Gly Thr Met Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr Ala Ala
65                  70                  75                  80
Cys Ile Arg Asp Leu Glu Tyr Tyr Leu Arg Tyr Ala Thr Tyr Ala Met
                85                  90                  95
Leu Ala Gly Asp Thr Ser Ile Leu Asp Glu Arg Val Leu Asn Gly Leu
            100                 105                 110
Lys Glu Thr Tyr Asn Ser Leu Gly Leu Pro Ile Gly Ala Thr Val Gln
        115                 120                 125
Ala Ile Gln Ala Ile Lys Glu Val Thr Ala Ser Leu Val Gly Pro Asp
    130                 135                 140
Ala Gly Arg Glu Met Gly Val Tyr Leu Glu Tyr Ile Ser Ser Gly Leu
145                 150                 155                 160
Ser
<210>4
<211>1119
<212>DNA
<213>Spirulina fusiformis
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(519)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(631)..(1119)
<223>
<400>4
atg ttt gat gcc ttc act aag gtg gtt tct cag gct gat act cgc ggc    48
Met Phe Asp Ala Phe Thr Lys Val Val Ser Gln Ala Asp Thr Arg Gly
1               5                   10                  15
gaa atg ctg agt aca gct caa atc gat gct ctg agc caa atg gtt gct    96
Glu Met Leu Ser Thr Ala Gln Ile Asp Ala Leu Ser Gln Met Val Ala
            20                  25                  30
gaa agc aac aaa cgt ttg gat gcc gtt aac cgc att act agc aac gct    144
Glu Ser Asn Lys Arg Leu Asp Ala Val Asn Arg Ile Thr Ser Asn Ala
        35                  40                  45
tcc acc atc gtt tct aat gct gct cgt tct ttg ttt gca gag cag ccc    192
Ser Thr Ile Val Ser Asn Ala Ala Arg Ser Leu Phe Ala Glu Gln Pro
    50                  55                  60
caa ctg att gct ccc gga gga aac gcc tac acc aac cgt cgt atg gct    240
Gln Leu Ile Ala Pro Gly Gly Asn Ala Tyr Thr Asn Arg Arg Met Ala
65                  70                  75                  80
gct tgc ttg cgt gac atg gaa atc atc ctg cgt tat gtt acc tac gct    288
Ala Cys Leu Arg Asp Met Glu Ile Ile Leu Arg Tyr Val Thr Tyr Ala
                85                  90                  95
gtg ttc gct ggc gac gca agt gtt ctc gaa gat cgt tgc ttg aac ggt    336
Val Phe Ala Gly Asp Ala Ser Val Leu Glu Asp Arg Cys Leu Asn Gly
            100                 105                 110
ttg cgt gaa act tac ctg gct ttg gga act ccc ggt tcc tcc gtt gct    384
Leu Arg Glu Thr Tyr Leu Ala Leu Gly Thr Pro Gly Ser Ser Val Ala
        115                 120                 125
gtc ggt gtt ggc aaa atg aaa gaa gct gct ctg gcg atc gta aac gat    432
Val Gly Val Gly Lys Met Lys Glu Ala Ala Leu Ala Ile Val Asn Asp
    130                 135                 140
ccc gca ggt atc act cct ggc gat tgt agc gct ttg gct tca gaa atc    480
Pro Ala Gly Ile Thr Pro Gly Asp Cys Ser Ala Leu Ala Ser Glu Ile
145                 150                 155                 160
gct agt tac ttt gat cgt gca tgt gct gca gtt tcc taa tcaagcagat     529
Ala Ser Tyr Phe Asp Arg Ala Cys Ala Ala Val Ser
                165                 170
ccatagcata taacaattga aacagtttag ctgaagtcta agtgactgga cttctgtttg  589
ttacctaatt ttttgtaaac caatcgggag ataactcgag a atg aaa acc ccc cta  645
                                              Met Lys Thr Pro Leu
                                                      175
acc gaa gca gtt tct atc gct gat tcc caa ggt cgt ttc cta agc agc    693
Thr Glu Ala Val Ser Ile Ala Asp Ser Gln Gly Arg Phe Leu Ser Ser
        180                 185                 190
acc gaa atc caa gtg gct ttt ggc cgt ttt cgt caa gcc aaa gct ggt    741
Thr Glu Ile Gln Val Ala Phe Gly Arg Phe Arg Gln Ala Lys Ala Gly
    195                 200                 205
ctg gaa gct gct aaa gct ttg acc tct aaa gct gat agt cgt atc agt    789
Leu Glu Ala Ala Lys Ala Leu Thr Ser Lys Ala Asp Ser Arg Ile Ser
210                 215                 220                 225
ggt gct gcc caa gca gtg tac aac aag ttc ccc tac acc acc caa atg    837
Gly Ala Ala Gln Ala Val Tyr Asn Lys Phe Pro Tyr Thr Thr Gln Met
                230                 235                 240
cag gga cct aac tac gcg gca gac caa cgc ggt aag gac aaa tgt gct    885
Gln Gly Pro Asn Tyr Ala Ala Asp Gln Arg Gly Lys Asp Lys Cys Ala
            245                 250                 255
cgt gac ata ggc tac tac ctg agg atg gta act tat tgc ctg att gct    933
Arg Asp Ile Gly Tyr Tyr Leu Arg Met Val Thr Tyr Cys Leu Ile Ala
        260                 265                 270
ggt gga act ggc ccc atg gat gag tac ctg att gcc ggt att gat gaa    981
Gly Gly Thr Gly Pro Met Asp Glu Tyr Leu Ile Ala Gly Ile Asp Glu
    275                 280                 285
atc aac cgg act ttc gag ctt tct cca agc tgg tac att gaa gcc ctg    1029
Ile Asn Arg Thr Phe Glu Leu Ser Pro Ser Trp Tyr Ile Glu Ala Leu
290                 295                 300                 305
aaa tac atc aaa gct aac cac ggt ttg tct ggt gac gct gct ggt gaa    1077
Lys Tyr Ile Lys Ala Asn His Gly Leu Ser Gly Asp Ala Ala Gly Glu
                310                 315                 320
gct aac tcc tac ctc gac tac gcg atc aac gcc cta agc tag            1119
Ala Asn Ser Tyr Leu Asp Tyr Ala Ile Asn Ala Leu Ser
            325                 330
<210>5
<211>172
<212>PRT
<213>Spirulina fusiformis
<400>5
Met Phe Asp Ala Phe Thr Lys Val Val Ser Gln Ala Asp Thr Arg Gly
1               5                   10                  15
Glu Met Leu Ser Thr Ala Gln Ile Asp Ala Leu Ser Gln Met Val Ala
            20                  25                  30
Glu Ser Asn Lys Arg Leu Asp Ala Val Asn Arg Ile Thr Ser Asn Ala
        35                  40                  45
Ser Thr Ile Val Ser Asn Ala Ala Arg Ser Leu Phe Ala Glu Gln Pro
    50                  55                  60
Gln Leu Ile Ala Pro Gly Gly Asn Ala Tyr Thr Asn Arg Arg Met Ala
65                  70                  75                  80
Ala Cys Leu Arg Asp Met Glu Ile Ile Leu Arg Tyr Val Thr Tyr Ala
                85                  90                  95
Val Phe Ala Gly Asp Ala Ser Val Leu Glu Asp Arg Cys Leu Asn Gly
            100                 105                 110
Leu Arg Glu Thr Tyr Leu Ala Leu Gly Thr Pro Gly Ser Ser Val Ala
        115                 120                 125
Val Gly Val Gly Lys Met Lys Glu Ala Ala Leu Ala Ile Val Asn Asp
    130                 135                 140
Pro Ala Gly Ile Thr Pro Gly Asp Cys Ser Ala Leu Ala Ser Glu Ile
145                 150                 155                 160
Ala Ser Tyr Phe Asp Arg Ala Cys Ala Ala Val Ser
                165                 170
<210>6
<211>162
<212>PRT
<213>Spirulina fusiformis
<400>6
Met Lys Thr Pro Leu Thr Glu Ala Val Ser Ile Ala Asp Ser Gln Gly
1               5                   10                  15
Arg Phe Leu Ser Ser Thr Glu Ile Gln Val Ala Phe Gly Arg Phe Arg
            20                  25                  30
Gln Ala Lys Ala Gly Leu Glu Ala Ala Lys Ala Leu Thr Ser Lys Ala
        35                  40                  45
Asp Ser Arg Ile Ser Gly Ala Ala Gln Ala Val Tyr Asn Lys Phe Pro
    50                  55                  60
Tyr Thr Thr Gln Met Gln Gly Pro Asn Tyr Ala Ala Asp Gln Arg Gly
65                  70                  75                  80
Lys Asp Lys Cys Ala Arg Asp Ile Gly Tyr Tyr Leu Arg Met Val Thr
                85                  90                  95
Tyr Cys Leu Ile Ala Gly Gly Thr Gly Pro Met Asp Glu Tyr Leu Ile
            100                 105                 110
Ala Gly Ile Asp Glu Ile Asn Arg Thr Phe Glu Leu Ser Pro Ser Trp
        115                 120                 125
Tyr Ile Glu Ala Leu Lys Tyr Ile Lys Ala Asn His Gly Leu Ser Gly
    130                 135                 140
Asp Ala Ala Gly Glu Ala Asn Ser Tyr Leu Asp Tyr Ala Ile Asn Ala
145                 150                 155                 160
Leu Ser
<210>7
<211>1102
<212>DNA
<213>Ceramium boydenn
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(534)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(608)..(1102)
<223>
<400>7
atg ctt gac gca ttt tct aga gtt gta gtg aat tca gac gca aaa gct    48
Met Leu Asp Ala Phe Ser Arg Val Val Val Asn Ser Asp Ala Lys Ala
1               5                   10                  15
gct tat gta agt ggc agt gat tta caa gct ctt aaa aca ttc att tct    96
Ala Tyr Val Ser Gly Ser Asp Leu Gln Ala Leu Lys Thr Phe Ile Ser
            20                  25                  30
gaa gga aac aaa cgt tta gat tca gta aac tat atc gta tct aac gca    144
Glu Gly Asn Lys Arg Leu Asp Ser Val Asn Tyr Ile Val Ser Asn Ala
        35                  40                  45
agc tgc atc gtt tca gat gca gta tct ggc atg att tgt gaa aat cca    192
Ser Cys Ile Val Ser Asp Ala Val Ser Gly Met Ile Cys Glu Asn Pro
    50                  55                  60
ggc ttg att gca cca ggt gga aat tgc tat aca aat cgt aga atg gct    240
Gly Leu Ile Ala Pro Gly Gly Asn Cys Tyr Thr Asn Arg Arg Met Ala
65                  70                  75                  80
gct tgt tta cgc gat ggt gaa att atc tta cgt tat gta tct tat gct    288
Ala Cys Leu Arg Asp Gly Glu Ile Ile Leu Arg Tyr Val Ser Tyr Ala
                85                  90                  95
tta cta tct ggc gat gct tct gta tta gaa gat cgt tgc tta aat gga    336
Leu Leu Ser Gly Asp Ala Ser Val Leu Glu Asp Arg Cys Leu Asn Gly
            100                 105                 110
cta aaa gaa act tat att gca ctt ggt gta cca act aat tca aca gta    384
Leu Lys Glu Thr Tyr Ile Ala Leu Gly Val Pro Thr Asn Ser Thr Val
        115                 120                 125
aga gca gta agc att atg aaa gcg gct gct gtt gca ttt gta act aat    432
Arg Ala Val Ser Ile Met Lys Ala Ala Ala Val Ala Phe Val Thr Asn
    130                 135                 140
aca gca tca caa cgt aca gta gaa gtt gct gct gga gat tgt agt gca    480
Thr Ala Ser Gln Arg Thr Val Glu Val Ala Ala Gly Asp Cys Ser Ala
145                 150                 155                 160
atc gct tct gaa gtt ggc gca tat tgt gat aga gta gct gct gct gtt    528
Ile Ala Ser Glu Val Gly Ala Tyr Cys Asp Arg Val Ala Ala Ala Val
                165                 170                 175
tct taa tcaatttgca gagaacaatc tacaaagtat tgataagcaa aatacttaaa     584
Ser
attattcctt aaggagaaat ata atg aaa tca gtt att act act act atc agt  637
                          Met Lys Ser Val Ile Thr Thr Thr Ile Ser
                                  180                 185
gct gct gat gct gct ggt cgt ttt cct tca agc tct gat cta gaa tca    685
Ala Ala Asp Ala Ala Gly Arg Phe Pro Ser Ser Ser Asp Leu Glu Ser
        190                 195                 200
gta caa ggc aac atc caa cgt tct agt gca aga tta gaa gcg gct gaa    733
Val Gln Gly Asn Ile Gln Arg Ser Ser Ala Arg Leu Glu Ala Ala Glu
    205                 210                 215
aaa tta gga tac aac cat gaa gca gtt gta aaa gaa ggc gga gat gct    781
Lys Leu Gly Tyr Asn His Glu Ala Val Val Lys Glu Gly Gly Asp Ala
220                 225                 230                 235
tgt ttt gca aaa tat tct tac tta aaa aac cca gga gaa gct ggt gac    829
Cys Phe Ala Lys Tyr Ser Tyr Leu Lys Asn Pro Gly Glu Ala Gly Asp
                240                 245                 250
agc aca gaa aaa atc aat aaa tgc tat aga gat gtt gat cac tac atg    877
Ser Thr Glu Lys Ile Asn Lys Cys Tyr Arg Asp Val Asp His Tyr Met
            255                 260                 265
cgt tta atc aac tac tca ctt gta gtt ggt ggt act ggt cct ctt gat    925
Arg Leu Ile Asn Tyr Ser Leu Val Val Gly Gly Thr Gly Pro Leu Asp
        270                 275                 280
gaa tgg gga att gct ggt tca cgt gaa gta tat aga gct tta aat ctt    973
Glu Trp Gly Ile Ala Gly Ser Arg Glu Val Tyr Arg Ala Leu Asn Leu
    285                 290                 295
cct agt gct gct tat att gct tct ttt gta ttt act aga gat aga tta    1021
Pro Ser Ala Ala Tyr Ile Ala Ser Phe Val Phe Thr Arg Asp Arg Leu
300                 305                 310                 315
tgt gta cct cgt gat atg agc gct caa gct gga gta gaa tac tta gct    1069
Cys Val Pro Arg Asp Met Ser Ala Gln Ala Gly Val Glu Tyr Leu Ala
                320                 325                 330
gct tta gac tat gta atc aac gca cta agc taa                        1102
Ala Leu Asp Tyr Val Ile Asn Ala Leu Ser
            335                 340
<210>8
<211>177
<212>PRT
<213>Ceramium boydenn
<400>8
Met Leu Asp Ala Phe Ser Arg Val Val Val Asn Ser Asp Ala Lys Ala
1               5                   10                  15
Ala Tyr Val Ser Gly Ser Asp Leu Gln Ala Leu Lys Thr Phe Ile Ser
            20                  25                  30
Glu Gly Asn Lys Arg Leu Asp Ser Val Asn Tyr Ile Val Ser Asn Ala
        35                  40                  45
Ser Cys Ile Val Ser Asp Ala Val Ser Gly Met Ile Cys Glu Asn Pro
    50                  55                  60
Gly Leu Ile Ala Pro Gly Gly Asn Cys Tyr Thr Asn Arg Arg Met Ala
65                  70                  75                  80
Ala Cys Leu Arg Asp Gly Glu Ile Ile Leu Arg Tyr Val Ser Tyr Ala
                85                  90                  95
Leu Leu Ser Gly Asp Ala Ser Val Leu Glu Asp Arg Cys Leu Asn Gly
            100                 105                 110
Leu Lys Glu Thr Tyr Ile Ala Leu Gly Val Pro Thr Asn Ser Thr Val
        115                 120                 125
Arg Ala Val Ser Ile Met Lys Ala Ala Ala Val Ala Phe Val Thr Asn
    130                 135                 140
Thr Ala Ser Gln Arg Thr Val Glu Val Ala Ala Gly Asp Cys Ser Ala
145                 150                 155                 160
Ile Ala Ser Glu Val Gly Ala Tyr Cys Asp Arg Val Ala Ala Ala Val
                165                 170                 175
Ser
<210>9
<211>164
<212>PRT
<213>Ceramium boydenn
<400>9
Met Lys Ser Val Ile Thr Thr Thr Ile Ser Ala Ala Asp Ala Ala Gly
1               5                   10                  15
Arg Phe Pro Ser Ser Ser Asp Leu Glu Ser Val Gln Gly Asn Ile Gln
            20                  25                  30
Arg Ser Ser Ala Arg Leu Glu Ala Ala Glu Lys Leu Gly Tyr Asn His
        35                  40                  45
Glu Ala Val Val Lys Glu Gly Gly Asp Ala Cys Phe Ala Lys Tyr Ser
    50                  55                  60
Tyr Leu Lys Asn Pro Gly Glu Ala Gly Asp Ser Thr Glu Lys Ile Asn
65                  70                  75                  80
Lys Cys Tyr Arg Asp Val Asp His Tyr Met Arg Leu Ile Asn Tyr Ser
                85                  90                  95
Leu Val Val Gly Gly Thr Gly Pro Leu Asp Glu Trp Gly Ile Ala Gly
            100                 105                 110
Ser Arg Glu Val Tyr Arg Ala Leu Asn Leu Pro Ser Ala Ala Tyr Ile
        115                 120                 125
Ala Ser Phe Val Phe Thr Arg Asp Arg Leu Cys Val Pro Arg Asp Met
    130                 135                 140
Ser Ala Gln Ala Gly Val Glu Tyr Leu Ala Ala Leu Asp Tyr Val Ile
145                 150                 155                 160
Asn Ala Leu Ser
<210>10
<211>549
<212>DNA
<213>Prochlorococcus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(549)
<223>
<400>10
atg ctt gat gcg ttc tct aga aca gtt gta agt gct gac gcc aag ggt    48
Met Leu Asp Ala Phe Ser Arg Thr Val Val Ser Ala Asp Ala Lys Gly
1               5                   10                  15
gcc gca att ggc agt gag gat ctt gca gat tta aga aag tac gta gca    96
Ala Ala Ile Gly Ser Glu Asp Leu Ala Asp Leu Arg Lys Tyr Val Ala
            20                  25                  30
gat gca aat aaa aga att gat gca acc ctt gca ata act caa aat gtt    144
Asp Ala Asn Lys Arg Ile Asp Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gln Asn Val
        35                  40                  45
tct tgc ata gct gca gat gct gta gca gga atg gtt tgc gaa aat act    192
Ser Cys Ile Ala Ala Asp Ala Val Ala Gly Met Val Cys Glu Asn Thr
    50                  55                  60
gga ctt aca cag cca gga gga cat tgt tat cca act cgt cgc atg gca    240
Gly Leu Thr Gln Pro Gly Gly His Cys Tyr Pro Thr Arg Arg Met Ala
65                  70                  75                  80
gct tgt tta agg gat gga gaa att att ttg aga tat gta agc tac gct    288
Ala Cys Leu Arg Asp Gly Glu Ile Ile Leu Arg Tyr Val Ser Tyr Ala
                85                  90                  95
ctt ctt gct ggg gat tct tct gtc ctt gaa gat aga tgt cta aat gga    336
Leu Leu Ala Gly Asp Ser Ser Val Leu Glu Asp Arg Cys Leu Asn Gly
            100                 105                 110
tta aaa gaa act tat tta gct ctt gga gtt cca act tct aat gct att    384
Leu Lys Glu Thr Tyr Leu Ala Leu Gly Val Pro Thr Ser Asn Ala Ile
        115                 120                 125
cgg gca gtt gaa ata atg aaa att gcc aca gtt gca att atg act gag    432
Arg Ala Val Glu Ile Met Lys Ile Ala Thr Val Ala Ile Met Thr Glu
    130                 135                 140
aca aat aca gga aga aaa atg ttt aag gga att aat tct ggc tca gga    480
Thr Asn Thr Gly Arg Lys Met Phe Lys Gly Ile Asn Ser Gly Ser Gly
145                 150                 155                 160
gct cag tgt caa gat ata gcg gcg gag gca gca tca tat ttt gac ctt    528
Ala Gln Cys Gln Asp Ile Ala Ala Glu Ala Ala Ser Tyr Phe Asp Leu
                165                 170                 175
gta ata gag gct ttg agt tga                                        549
Val Ile Glu Ala Leu Ser
            180
<210>11
<211>182
<212>PRT
<213>Prochlorococcus sp.
<400>11
Met Leu Asp Ala Phe Ser Arg Thr Val Val Ser Ala Asp Ala Lys Gly
1               5                   10                  15
Ala Ala Ile Gly Ser Glu Asp Leu Ala Asp Leu Arg Lys Tyr Val Ala
            20                  25                  30
Asp Ala Asn Lys Arg Ile Asp Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gln Asn Val
        35                  40                  45
Ser Cys Ile Ala Ala Asp Ala Val Ala Gly Met Val Cys Glu Asn Thr
    50                  55                  60
Gly Leu Thr Gln Pro Gly Gly His Cys Tyr Pro Thr Arg Arg Met Ala
65                  70                  75                  80
Ala Cys Leu Arg Asp Gly Glu Ile Ile Leu Arg Tyr Val Ser Tyr Ala
                85                  90                  95
Leu Leu Ala Gly Asp Ser Ser Val Leu Glu Asp Arg Cys Leu Asn Gly
            100                 105                 110
Leu Lys Glu Thr Tyr Leu Ala Leu Gly Val Pro Thr Ser Asn Ala Ile
        115                 120                 125
Arg Ala Val Glu Ile Met Lys Ile Ala Thr Val Ala Ile Met Thr Glu
    130                 135                 140
Thr Asn Thr Gly Arg Lys Met Phe Lys Gly Ile Asn Ser Gly Ser Gly
145                 150                 155                 160
Ala Gln Cys Gln Asp Ile Ala Ala Glu Ala Ala Ser Tyr Phe Asp Leu
                165                 170                 175
Val Ile Glu Ala Leu Ser
            180
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
gagggatcca ttaatgagta tcg                                          23
<210>13
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
tggaagctta gctcaagccg gag                                          23
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
ggagataagt ccatgtttga                                              20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
tagcttaggg cgttgatcgc                                              20
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
agaattcaat gcttgaygcw                                              20
<210>17
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
ccgttagsdt ardgmrttd                                               19
<210>18
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
aagcattgcg ttcttaggtc tc                                           22
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
catctaaagg accagtccca c                                            21
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
ctggatcctt aatgagtatc g                                            21
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
acgctgcaga aagactgaat                                              20
<210>22
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
taggatccat gcaagacgc                                               19
<210>23
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
attcggcttg gaagcttag                                               19
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
ggagagaatt ccatgtttga                                              20
<210>25
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
attggtaccg gtagggcgtt gatcg                                        25
<210>26
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
gacgaattca ttaatgagta tcg                                          23
<210>27
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
tggtcgacta gctcaagccg gag                                          23