高稳定性的抗幽门螺杆菌重组VACA特异性卵黄抗体及其应用.pdf

本发明的目的是提供一种取材方便、简单、经济的高稳定性抗幽门螺杆菌重组VacA特异性卵黄抗体。该抗体中加入了体积百分比浓度是30～50％的硫糖铝做为保护剂，提高了特异性卵黄抗体对酸和胃蛋白酶的稳定性，增强了抗冻融的能力，在室温下能保持卵黄抗体的活性；还可发挥硫糖铝本身对胃粘膜的保护作用；并可用于其它特异性卵黄抗体。在制备上取材方便、简单、经济，将两种液体按所述比例简单进行混合即可直接服用，可用于治疗幽门螺杆菌感染。

权利要求书
1、  一种高稳定性的抗幽门螺杆菌重组VacA特异性卵黄抗体，其特征是在pH值7.0～7.2的抗幽门螺杆菌重组VacA特异性卵黄抗体中加入了硫糖铝，且硫糖铝的体积百分比浓度为30％～50％。

2、  如权利要求1所述的高稳定性的抗幽门螺杆菌重组VacA特异性卵黄抗体在制备治疗幽门螺杆菌感染的口服制剂中的应用。

说明书高稳定性的抗幽门螺杆菌重组VacA特异性卵黄抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗幽门螺杆菌重组VacA特异性卵黄抗体，特别涉及一种加入了保护剂的高稳定性的抗幽门螺杆菌重组VacA特异性卵黄抗体及其应用。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是世界上感染率较高的细菌之一，儿童易感，出现症状就诊时才发现，与慢性胃炎，消化性溃疡，胃腺癌和粘膜相关性淋巴样组织淋巴瘤密切相关，世界卫生组织已将其列为第一类致癌因子，对Hp感染的防治已引起国内外学者的高度关注。临床上现多用抗生素治疗Hp感染，但存在患者依从性差，耐药菌株产生和反复感染等问题，寻找新的防治Hp感染的有效措施来替代抗生素疗法具有重要的临床意义。近年来国内外许多研究已经证实口服卵黄抗体IgY(Immunoglobulinyolk，IgY)可通过被动免疫有效防治消化道感染性疾病。细胞空泡毒素抗原(Vacuolization cytotoxin antigen A，VacA)是Hp引起细胞病变的主要毒力因素，现有技术已能克隆表达Hp的多种毒力因子，如黏附因子、尿素酶、细胞空泡毒素抗原、毒素相关蛋白、中性粒细胞激活蛋白等重组蛋白，制备相应的特异抗体IgY，并通过体内外实验证实了口服特异性IgY防治Hp感染的作用。
但是，口服IgY的应用受到胃肠道内酸和蛋白酶的影响，尤其是胃内高酸和蛋白酶的的生态环境，使IgY的应用受到很大的限制。胃内生态环境最主要的特点是酸性，胃壁细胞，贲门、幽门腺体的分泌液构成胃液，含有盐酸和胃蛋白酶等。Kyong、毛小琴等的研究显示当pH<3时，不加保护剂的IgY液活性显著降低，剩余活性低于50％。当pH＝2时，维持4h，IgY几乎完全失活。由昭红等的研究显示在pH 2.5条件下，IgY对胃蛋白酶非常敏感，活性下降显著。李春晖等的小鼠体内中和试验亦表明胃蛋白酶可影响IgY的中和活性。因此，许多学者对IgY抗酸性和蛋白酶的保护剂进行了探讨。
Shimizu M等通过脱水水化法用脂质体包裹卵黄抗体、Kyong AL等的实验表明高浓度山梨醇(30％以上)在pH3.0条件下可显著提高IgY的稳定性。由昭红等的研究表明10％，30％，50％的蔗糖和30％乳糖均可在胃蛋白酶处理时提高特异性IgY的稳定性。Xiao YL等用pH3.0～6.0壳聚糖-藻酸盐微胶囊包裹口服IgY，将其置于pH1.2的模拟胃液中，IgY释放活性维持于61.36％～74.61％。但这些方法在制作上都较为复杂，且成本较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种取材方便、简单、经济的高稳定性抗幽门螺杆菌重组VacA特异性卵黄抗体。
采用的技术方案如下：
一种高稳定性的抗幽门螺杆菌重组VacA特异性卵黄抗体，其特征是在pH值7.0～7.2的抗幽门螺杆菌重组VacA特异性卵黄抗体中加入了硫糖铝，且硫糖铝的体积百分比浓度为30％～50％。
该产品制备极为简单，仅将两种液态物质按所述的体积百分比浓度进行简单的混合即可直接口服。其中抗幽门螺杆菌重组VacA特异性卵黄抗体应保持pH值7.0～7.2，如果使用纯化的抗幽门螺杆菌重组VacA特异性卵黄抗体则应该用pH7.0的磷酸二氢钠缓冲溶液将其稀释至限定的PH值。
硫糖铝作为保护剂加入到抗幽门螺杆菌重组VacA特异性卵黄抗体中。它是含8个硫酸根的蔗糖硫酸酯铝盐，分子量为2086.74，非结晶形式，弱碱性。化学结构式为C12H30Al8O5lS8xAl(OH)3yH2O，其硫酸蔗糖部分在碱性的氢氧化铝部分的分子之间交联，形成立体结构的桥形复合物，有显著的黏附性，带负电荷，可与许多带正电荷的化学基团、大分子物质如黏液、糖脂蛋白以及其他蛋白、肽、药物、金属等结合；也可与胃十二指肠黏膜表面的黏液结合形成复合的胶状物，起到黏膜保护作用。硫糖铝遇酸解离之后氢氧化铝凝胶发挥抗酸作用，不仅可缓解强酸环境亦可因此而消除胃蛋白酶的最适酸性环境，并且硫糖铝本身可与胃蛋白酶络合，直接、持续地抑制胃蛋白酶的蛋白分解活性。用硫糖铝作为IgY的保护剂不仅可削弱胃酸、胃蛋白酶对IgY活性的破坏，还可发挥硫糖铝本身对胃粘膜的保护作用。除VacA特异性卵黄抗体外，对其它特异性卵黄抗体也应有同样的保护作用，至今国内外未见用硫糖铝作为口服特异性IgY保护剂的报道。
本发明的有益效果是制备过程简单、取材方便、经济，并且产品对酸和胃蛋白酶具有较高的稳定性，还可增强其抗冻融的能力，在室温下能保持稳定性，优于上述学者报道的保护剂。高稳定性的抗幽门螺杆菌重组VacA特异性卵黄抗体可用于治疗幽门螺杆菌感染，使IgY在胃内发挥更加有效的防治幽门螺杆菌作用。
为了进一步证实本发明所加硫糖铝对抗幽门螺杆菌重组VacA特异性卵黄抗体的保护作用，做了以下实验：
(1)酸性条件下的保护作用
健康成人胃内24小时pH值的动态检测得出其变化规律，pH基线为1.63士0.34，随进食而升高，从进餐开始到下降至基线水平为胃内食物的排空过程。模拟胃内酸性环境，以pH 1.0、1.2、1.5、2.0、3.0为观察点，在不同酸性的抗幽门螺杆菌重组VacA IgY液中加入不同体积百分比浓度的硫糖铝，37℃维持2h，以不加入硫糖铝的VacA IgY做对照，测定不同酸性条件下抗体的剩余活性，结果显示：pH 1.5、pH 2.0、pH 3.0酸性条件下，加入硫糖铝的VacA IgY抗体的剩余活性明显高于不加硫糖铝组，并随硫糖铝浓度增加保护作用增强。在pH 1.5条件下，未加硫糖铝的IgY抗体活性仅能保持31.8％，50％硫糖铝可使IgY抗体剩余活性提高到50％。在pH 2.0条件下，未加硫糖铝的IgY抗体剩余活性为36.1％，30％硫糖铝可使IgY抗体剩余活性提高至86.3％，50％的硫糖铝可完全保持IgY抗体活性。在pH 3.0条件下，未加硫糖铝的IgY抗体活性能保持65.2％，30％硫糖铝即可使IgY抗体活性保持84.3％，而40％以上的硫糖铝几乎可完全保持IgY的抗体活性。上述结果表明硫糖铝对IgY活性起到明显的保护作用，提高了IgY对酸的稳定性。
(2)对胃蛋白酶裂解的保护作用
模拟胃内正常或高胃蛋白酶浓度，在不同酸性条件下，加入正常胃内浓度和高于正常胃内浓度的胃蛋白酶，再加入不同浓度的硫糖铝，37℃维持4h后测定IgY的抗体剩余活性。当pH值为1.5～3.0，正常胃蛋白酶浓度下，30％以上硫糖铝可有效保护IgY免受胃蛋白酶的破坏，且随硫糖铝浓度增加保护作用逐渐增强。当pH 2.0时，在正常胃蛋白酶浓度下，含30％、50％硫糖铝的IgY抗体剩余活性分别为62.8％，72.2％，而不加硫糖铝的IgY抗体活性为11.6％；在高胃蛋白酶浓度下，含50％硫糖铝的IgY抗体剩余活性为52.6％，而不加硫糖铝的IgY抗体活性为23.0％；当pH3.0时，在正常胃蛋白酶浓度下，30％硫糖铝可维持IgY活性81.7％达8h。
(3)对反复冻融的保护作用
将抗幽门螺杆菌重组VacA IgY分别加入不同浓度的硫糖铝，反复冻融7次；以同法处理的不加硫糖铝的IgY液为对照。实验结果表明：反复冻融后，不含硫糖铝IgY的相对抗体活性下降至61.9％，加入硫糖铝后，随硫糖铝浓度增高抗体剩余活性也提高。含30％硫糖铝可使IgY抗体的剩余活性提高到83.1％，含50％硫糖铝可使其提高到88.2％。
(4)实验还证明含30％～50％硫糖铝的IgY，在室温放置1月后抗体剩余活性均能保持80％以上。
具体实施例
实施例1
抗幽门螺杆菌重组VacA特异性IgY的制备
用纯化的重组VacA和等量完全弗氏佐剂混合，充分研磨乳化后免疫300日龄洛曼母鸡，采用胸部肌肉多点注射接种。第一次免疫剂量为100ug/只；15天后进行第二次免疫，剂量为200ug/只；此后每隔1个月进行第三次免疫和加强免疫，剂量均为300ug/只。第二次免疫后1周开始收集鸡蛋。取蛋黄液先用水稀释结合氯仿有机沉淀法粗提IgY，然后常规饱和硫酸铵法纯化，0.22μm过滤除菌，12％SDS-PAGE分析纯度，Bradford法测定蛋白含量，-20℃保存。
实施例2 高稳定性抗幽门螺杆菌重组VacA特异性卵黄抗体的制备
取纯化的抗幽门螺杆菌重组VacA特异性卵黄抗体，用pH7.0的磷酸二氢钠缓冲溶液将其稀释至pH7.1，取70毫升备用；另取30毫升硫糖铝，与70毫升稀释后的抗幽门螺杆菌重组VacA特异性卵黄抗体充分混匀，4℃保存。
实施例3 高稳定性抗幽门螺杆菌重组VacA特异性卵黄抗体的制备
取纯化的抗幽门螺杆菌重组VacA特异性卵黄抗体，用pH7.0的磷酸二氢钠缓冲溶液将其稀释至pH7.1，取60毫升备用；另取40毫升硫糖铝，与60毫升稀释后的抗幽门螺杆菌重组VacA特异性卵黄抗体充分混匀，4℃保存。
实施例4 高稳定性抗幽门螺杆菌重组VacA特异性卵黄抗体的制备
取纯化的抗幽门螺杆菌重组VacA特异性卵黄抗体，用PH7.0的磷酸二氢钠缓冲溶液将其稀释至PH7.2，取50毫升备用；另取50毫升硫糖铝，与50毫升稀释后的抗幽门螺杆菌重组VacA特异性卵黄抗体充分混匀，4℃保存。