利用苏云金芽胞杆菌S－层蛋白为载体在细胞表面展示目标蛋白的方法及应用.pdf

本发明属于分子生物学领域，具体涉及利用来源于苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S－层蛋白在细胞表面展示目标蛋白的方法，本发明用以改善细胞表面结构或增强目标蛋白生物学功能，在众多领域都具有应用潜力。发明的具体步骤包括：将所说的目标蛋白基因置于S－层蛋白N－末端第210个氨基酸对应的核苷酸序列下游；融合蛋白基因在宿主菌如苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis B.t中表达，实现方式可以将其置于载体上。与已有技术比较，本发明不仅克服了现有技术安全性方面的隐患，而且拓宽了苏云金芽胞杆菌的应用领域，例如在抗病方面，在重金属的吸附方面，具有重要的研究与应用前景。

权利要求书
1、  一种利用S-层蛋白在细胞表面展示目标蛋白的方法，按如下步骤实现：
1)S-层蛋白来源于苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis，B.t，菌株编号CTC；
2)融合蛋白基因的构建：将所说的目标蛋白基因置于S-层蛋白N-末端第210个氨基酸对应的核苷酸序列下游；
3)融合蛋白基因在宿主菌中表达，实现方式可以将其置于载体上；
4)所说的宿主菌为苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis，B.t。

2、  权利要求1所述方法的应用，其特征在于在抗胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1方面的应用。

3、  权利要求2所述的应用，其特征在于在重金属的吸附方面的应用。

说明书利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白为载体在细胞表面展示目标蛋白的方法及应用
                                技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及利用来源于苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S-层蛋白在细胞表面展示目标蛋白，或改善细胞表面结构或增强目标蛋白生物学功能，在众多领域都具有应用潜力。
                                背景技术
细胞表面展示是指通过遗传操作的手段将外源大分子定位表达在细胞的表面以达到一定的研究和应用目的。多数情况下，表面展示是以构建融合蛋白的方式实现的，即以一定的方式将外源蛋白与菌体的某一表面蛋白相融合，借助后者的表面识别和定位功能将前者携带并定位在细胞的表面。将外源蛋白固定在细胞的表面可以直接用重组微生物进行后续的操作，免去了产物的提取，纯化和重新折叠等一系列的操作。自80年代兴起以来，表面展示工作取得了许多令人瞩目的成绩。
S-层蛋白是位于细胞外壳最外层的一类表面结构，生物圈中有S层的生物体普遍存在，尤其在古细菌和真细菌中，S层是最常见的表面结构之一。S层是由蛋白质或糖蛋白亚基组成的单分子晶体点阵，它们形成有孔的网格结构覆盖在细胞表面。
到目前为止，用于表面展示的载体有很多种，但作为细胞表面蛋白的一个重要组成的S-层蛋白还很少被用于表面展示。直到人们对S-层蛋白的一些特点特别是与分拣锚定密切相关的结构有了较为清楚的认识之后，才有人用S-层作为展示的载体。
以S-层蛋白作为运载蛋白的表面展示工作最初也是在G-细菌中完成的。Bingle等人(2000年)利用无致病性的G-细菌——新月柄杆菌的S-层蛋白RsaA作为载体，在细胞表面成功展示了铜绿假单胞菌的表面抗原(Bingle W H，Elizabeth U-N，John F N，LindaG，Glasier，Randall T I and Smit J.Expression and testing of Pseudomonaaeruginosa vaccine candinate proteins prepared with Caulobacter crescentus S-layer protein expression system.Vaccine，2001，19：1406-1415)。
此外，Bingle等还在新月柄杆菌的S-层蛋白上尝试了多个融合位点，结果表明有11个位点具有表面展示的能力。Mesnage等(1999)利用G+细菌炭疽芽胞杆菌的S-层蛋白在细胞表面展示了果聚糖蔗糖酶(Mesnage S，Tosi-couture E and Fouet A.Production andcell surface anchoring of functional fusion between the SLH motif of theBacillus anthracis S-layer protein and the Bacillus sbutillis levansucrase.MolMicrobiol，1999a，31：927-936)。但由于炭疽芽胞杆菌的致病性限制了其应用，所以开辟一个安全可靠应用领域宽阔的S-层蛋白表面展示系统尤为需要。
孙明等(2001)克隆了世界上首例来自于苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S-层蛋白的基因(孙明，朱晨光，喻子牛.类似S-层蛋白的苏云金芽胞杆伴胞晶体蛋白基因的克隆，微生物学报，2001，41(2)：141-147)，其基因序列已公布在美国国家生物技术信息中心网站上(GeneBank登录，登录号AJ012290)。利用苏云金芽胞杆菌的S-层蛋白进行表面展示有很多优点。首先，S-层蛋白的表达量高，一般可达整个细胞蛋白的10-15％。其次，S-层蛋白具有高效的信号肽和表面定位结构，能够准确的定位在细胞表面。S-层蛋白容许外源序列的插入，重组的S-层蛋白的生物合成和表面定位都没有受到明显的影响。由于苏云金芽胞杆菌作为传统的杀虫生物制剂已在世界各地得到广泛应用，利用其本身的S-层蛋白进行表面展示或改善细胞表面结构或增强目标蛋白生物学功能，不仅克服了现有同类技术安全性方面的隐忧，而且能拓宽苏云金芽胞杆菌的应用领域。
                                发明内容
本发明的目的在于利用苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S-层蛋白作为表面展示载体，并利用S-层蛋白的N-端信号肽以及锚定序列在细胞表面展示目标蛋白，以改善细胞表面结构或增强目标蛋白生物学功能，达到研究和应用的目的。
本发明是这样实现的：
一种利用S-层蛋白在细胞表面展示目标蛋白的方法，按如下步骤实现：
1)S-层蛋白来源于苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis，B.t，菌株编号CTC；
2)溶合蛋白基因的构建：将所说的目标蛋白基因置于S-层蛋白N-末端第210个氨基酸对应的核苷酸序列下游；
3)融合蛋白基因在宿主菌中表达，实现方式可以将其置于载体上；
4)所说的宿主菌为苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis B.t。
利用S-层蛋白在细胞表面展示目标蛋白的方法，该方法可以在抗胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1方面的应用。
利用S-层蛋白在细胞表面展示目标蛋白地方法，该方法还可以在重金属的吸附方面的应用。
更详细技术方案如以下所述：
能产生S-层蛋白的苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis，B.t，菌株编号CTC；它包括以下特征：：
a、幕虫亚种；
b、产生圆形伴胞晶体，伴胞晶体蛋白为100kD
c、能产生S-层蛋白。
苏云金芽胞杆菌CTC菌株S-层蛋白：
a.作为表面展示载体
b、S-层蛋白的分子量大小为83kDa，N-末端第34至210氨基酸依次为：
FPDVPADHWGIDSINYLVEKGAVTGNDKGMFEPGKELTRAEAATMMAQILNLPIDKDAKP
SFADSQGQWYTPFIAAVEKAGVIKGTGNGFEPNGKIDRVSMASLLVEAYKLDTKVNGTPA
TKFKDLETLNWGKEKANILVELGISVGTTADKWEPKKTVTKAEAAQFIAKTDKQFGT
C、融合蛋白基因的构建：将所说的(被研究的)目标基因置于S-层蛋白N-末端第210个氨基酸对应的核苷酸序列下游，并与下游的Xbal酶切位点连接；
d、将融合蛋白基因在宿主菌中表达，实现方式可以将其置于载体上例如pBMB982-304质粒；
e、宿主菌：苏云金芽胞杆菌。
利用苏云金芽胞杆菌的S-层蛋白作为载体，是一种新的表面展示系统，将目标蛋白展示到细胞表面，或优化细胞表面结构或改善和增强目标蛋白生物学功能。本发明与已有技术比较，不仅克服了现有技术安全性方面的隐患，而且拓宽了苏云金芽胞杆菌的应用领域，例如在抗胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1方面和在重金属的吸附等方面的应用。
                              附图说明
图1：质粒ctc片断含有S-层蛋白的N-端第34至第210个氨基酸对应的核苷酸序列，选择上面的Xbal位点为连接位点。目的基因片断在此处与S-层蛋白基因连接。
图2：质粒ctc是将目标基因6His选用Xbal-HincII位点与pBMB982-304质粒“连接的产物”
图3：质粒ctc是将目标基因6His选用Xbal单酶切位点与pBMB982-304质粒[1]正向连接得到的产物。
图4：质粒ctc是将目标基因aii选用Xbal-sphI酶切位点与pBMB982-304质粒[1]连接得到的产物。
图5：是本发明的重组质粒pBMBSM-304的构建流程图。
图6：含质粒pBMBSHI的重组菌与Ni-NTA-琼脂糖微球的吸附作用的示意图。
图中荧光显微照片(左)和相应的光学显微照片(右)。A，171；B，171/pBMBSHI1；C，171/pBMBSHI2；D，171/pBMBSHI3。
图7：显示Ni-NTA-琼脂糖微球对重组菌株BMBSMC的吸附作用。
左图为普通光学显微照片，右图为荧光显微照片。
图8：重组菌BMBSMC对游离Cd2+的吸附。
图9：A，B，C三个平板分别代表SCG1与待测菌株混合培养0.5h、2h、4h。每个平板上1为SCG1+无菌水；2为SCG1+4Q7/pSAII；3为SCG1+4Q7；4为4Q7+无菌水
                          具体实施方式
实施例1
(一)融合蛋白基因的构建：
1、选取要研究的对象即目标基因，
2、回收目标基因片段：
从所要研究的对象上回收目标基因片段，采用Sangon公司的回收试剂盒。琼脂糖凝胶电泳结束后，EB染色，在长波紫外灯上迅速切下目的条带，装入Eppendorf管离心估计体积，加入700μl的solutionI和10μl的silver beads，60℃溶胶10分钟并使silverbeads均匀悬浮，离心(10,000r/min离心10sec)，弃上清，用500μl的solutionII洗涤沉淀3次，离心(10,000rpm离心10sec)，弃上清，用滤纸吸干管壁上残液。加入5-10μl的Elution buffer于37℃解吸2min，10,000r/min离心半分钟，上清即含目的片段。可重复解吸两次，上清合并，电泳检测回收DNA浓度。
3、将目标基因正向与pBMB982-304质粒(孙明，朱晨光，喻子牛.类似S-层蛋白的苏云金芽胞杆伴胞晶体蛋白基因的克隆。微生物学报，2001，41(2)：141-147)，如图1所示，可以采用两种方式：
(1)将pBMB982-304质粒用XbaI-HincII酶切，将目标基因也用这两个酶切，回收纯化得到含有XbaI-HincII位点目标片断，将此片断与切割后的质粒用T4DNA连接酶在37℃连接过夜。
(2)将pBMB982-304质粒用XbaI-sphI酶切，将目标基因也用这两个酶切，回收纯化大片段回收纯化得到含有XbaI-sphI位点目标片断，将此片断与切割后的质粒用T4DNA连接酶在37℃连接过夜。
4、得到苏云金芽胞杆菌重组菌：
接种受体菌于5ml LB培养基1过夜培养，再按1/100转接50mL LB培养液，于30℃以200r/min振荡培养至OD650的值为0.2～0.3时，离心收集菌体，并用SG缓冲液(272mmol/L蔗糖，15％(v/v)甘油)洗涤菌体4次，再用适量(2ml)SG缓冲液悬浮菌体，使其菌液浓度为1×1010个细胞/mL。取200μL菌悬液于一个0.2cm的电转化杯(Bio-Rad公司产品)中，加入一定浓度的供体质粒DNA(一般3～5μL)，混匀后在冰浴上放置10min，用GenepulserTM型电脉冲仪(Bio-Rad公司产品)进行电脉冲。电脉冲参数选定为：脉冲场强V＝1.5kV/cm，电容C＝25μF，阻抗R＝200Ω，脉冲时间G＝4.0～4.8ms。电脉冲完毕后，加入1.0mL LB培养液于电击杯中，并转进1.5ml epp管在30℃以150r/min恢复培养2h后，涂布LB琼脂抗性平板，置30℃培养。红霉素为25ug/ml。
(二)表面展示的检测：
1、将上述步骤得到的含有目标基因的重组菌进行融合蛋白的SDS-PAGE检测菌体蛋白由以下方法制备：BHI培养基(Mesnage S，Tosi-couture E and Fouet A.Production and cell surface anchoring of functional fusion between the SLH motilof the Bacillus anthracis S-layer protein and the Bacillus sbutillislevansucrase.Mol Microbiol，1999a，31：927-936)培养菌体至营养期，取1mL培养物收集菌体，用1mol/LNaCl洗涤菌体3次，再用双蒸水洗涤菌体3次，加入50-100μL双蒸水制成悬液，加等量两倍体积样品缓冲液混匀，沸水中煮2-3min，1000rpm离心2min，上清液上样。
2、SDS-PAGE凝胶的制备：
取30％凝胶母液(29.2％丙烯酰胺，0.8％甲叉双丙烯酰胺)4mL，4倍分离胶缓冲液(1.5mol/L Tris·HCl，pH8.8，0.4％SDS)3mL，ddH2O.5mL，10％过硫酸铵100μL，TEMED 10μL，混匀后注入垂直板电泳槽，加封一层水饱和正丁醇，于室温下聚合3h以上或聚合过夜，即为10％的分离胶。倾去正丁醇，蒸馏水冲洗1-2次，取30％凝胶母液0.5mL，4倍浓缩胶缓冲液(0.5mol/L Tris·HCl，pH6.8，0.4％SDS)1.25mL，ddH2O 3mL，10％过硫酸铵50μL，TEMED 5μL，混匀后注入分离胶上层，插入电泳梳板，于室温下聚合2～3h。
3、染色及脱色：
加入电泳缓冲液(0.192mol/L甘氨酸，25mmol/L Tris·HCl，pH8.3，0.1％SDS)拔出电梳板，上样20-40μL样品，以30-40V电压电泳至溴酚蓝出上样孔后，用100V电压电泳至溴酚蓝带至凝胶底部1cm处停止电泳。卸出凝胶，用染色液(25％(v/v)异丙醇，10％(v/v)冰乙酸，0.1％(w/v)考马斯亮蓝R-250)染色3h以上，用自来水漂洗凝胶1-2次，再用脱色液10％(v/v)冰乙酸和12.5％异丙醇脱色，更换脱色液2～3次，至加入的脱色液脱色后不呈色为止。
4、融合蛋白表面展示的检测：
根据目标蛋白的理化及生物学特性作Ni-NTA-琼脂糖微球吸附实验实验和抗病实验(参见以实施例2)。
实施例2(本发明可应用的领域举例)：
利用苏云金芽胞杆菌的S-层蛋白作为载体，是一种新的表面展示系统，将目标蛋白展示到细胞表面，或优化细胞表面结构或改善和增强目标蛋白生物学功能。本发明与已有技术比较，不仅克服了现有技术安全性方面的隐患，而且拓宽了苏云金芽胞杆菌的应用领域(例如在抗病方面，在重金属的吸附方面)，具有巨大的研究与应用前景。
1)、多聚组氨酸肽的表面展示：
引物设计Hisup：GATATCTCTAGAGTCGACCCAAGCGGAACATCACCATCATCACCATHisdown：AGCCAATCTAGAGTCAGCTGTCTCGAGCCAGAATGGTGATGATGGTGATG
反应条件为：94℃30s，56℃30s，72℃30s，共10个循环；94℃30s，68℃30s，72℃30s，共20个循环；72℃5min。
设计引物，并在引物的两段引入合适的酶切位点。通过交叠PCR扩增得到编码(6His)的寡核苷酸片段命名为6His。本发明采用两种不同的插入位点构建融合基因。第一种方式是选用XbaI-HincII位点去掉pBMB982上S-层基因C-端的一部分，而以编码一个(6His)的寡核苷酸片段取代，构建得到携带一个六聚组氨酸的重组质粒pSHI1P。然后用EcoRI和SphI将pSHI1P上包含S-层与一个(6His)的融合基因部分插入穿梭载体pHT304上，得到重组质粒pBMB-SHAI(图2)，同样的方法依次获得了带有(6His)2，(6His)3的质粒pBMBSHI2，pBMBSHI3。第二种融合方式是将一个6His的寡核苷酸片段从pBMB982-304上S-层基因内的XbaI位点处插入，挑选到一个正向插入的重组质粒pBMB-SHBI(图3)。将这些重组质粒分别导入171/pCSA和4Q7/pCSA中，SDS-PAGE电泳结果表明pSHI1、pSHII1、pSHII2在受体菌中都得到了一定的表达。同时对重组菌进行了Ni-NTA-琼脂糖微球吸附实验(如图6所示)。
2)、Aii抗病蛋白表面展示：
N-乙酰高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones，AHLs)，是一类数量感知(quorum-sensing)系统中的信号分子，它参与诱导调控许多植物病原菌致病基因的表达。2002年Dong等和Lee等相继报道了在苏云金芽胞杆菌中广泛存在着aiiA基因(Dong Y H，Gusti A R，Zhang Q，et al.Identification of Quorum-Quenching N-acyl homoserinelactonases from Bacillus species.Appl Environ Microbiol，2002，68(4)1754-1759；Lee S J，Park S Y，Lee J J，et al.Genes encoding the N-acyl homoserinelactone-degrading enzyme are widespread in many subspecies of Bacillusthuringiensis.Appl Environ Microbiol，2002，68(8)：3919-3924)，其表达蛋白可使AHLs分子失活，从而使胡萝卜软腐欧文氏菌对植物产生的软腐病害得以减弱(MesnageS，Tosi-couture E and Fouet A.Production and cell surface anchoring offunctional fusion between the SLH motif of the Bacillus anthracis S-layerprotein and the Bacillus sbutillis levansucrase.Mol Microbiol，1999a，31：927-936；J萨姆布鲁克，E F弗里奇，T曼尼阿蒂斯著。分子克隆实验指南，第二版，北京，科学出版社，1995年)。但是Aii抗病蛋是一种胞内蛋白不分泌到细胞外，本发明利用利用S-层蛋白将Aii抗菌蛋白带到胞外并锚定在细胞表面，进而有利于与AHLs分子接触，更有效的降解，起到更好的抗病效果(图9)
引物设计：
aii-up：CGGCTGTAGACATGACCGTAAAGAAGCTTTA
aii-down：AGCTGCATGCCTATGTATACTCCGGGAACA
反应条件为：94℃5min；94℃1min，62℃1min，72℃1min，共30个循环；72℃5min
设计引物，以质粒pGEMT-aii为模板，PCR扩增得到了Aii蛋白的编码基因，利用两端的XbaI和SphI位点将它插入pBMB982-304S-层基因C-端的相应位点内，得到重组质粒pBMB-SAII(图4)。将pBMB-SAII转进4Q7/pBMB-CSA中。SDS-PAGE结果显示表达了预期的蛋白条带。在CTC-Aii融合蛋白对蔬菜软腐病的抑制实验中，4Q7/pBMB-SAII与软腐病致病菌胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1混合作用0.5小时，软腐病仍有一定程度的发生；混合作用2小时，能够较好的抑制软腐病的发生，抑菌效果明显优于出发菌株4Q7/pBMB-CSA。
3).金属硫蛋白的表面展示：
金属硫蛋白(Metallothionein)，1957年，美国哈佛大学Margoshes和Vallee首次从马肾中发现了一种能结合Cd2+的小分子量蛋白(Margoshes M，Vallee B.A cadmium proteinfrom equine kidney cortex.J Am Chem Soc，1957，79：4813-4814)，因富含半胱氨酸，有大量能结合重金属离子(如Zn2+，Cd2+，Cu2+，Hg2+和Ag+)的巯基，所以称为金属硫蛋白，简称MT(Dong Y H，Gusti A R，Zhang Q，et al.Identification of Quorum-Quenching N-acyl homoserine lactonases from Bacillus species. Appl EnvironMicrobiol，2002，68(4)1754-1759)。S-层蛋白与MT的融合蛋白在细胞表面展示有望开发全细胞吸附剂，用作矿物质的富集和重金属废水的净化。
引物设计：
smtA的上游引物：5’GAGATCTAGATATGACCTCAACA 3’
smtA的下游引物：T7终止子序列，即5’GCTAGTTATTGCTCAGCGG 3’
以克隆有蓝细菌金属硫蛋白基因smtA(GenBank登录号为X64585)的质粒pET-29a-smtA为模板，PCR扩增引入了XbaI位点的smtA结构基因，获得符合预期大小(0.32Kb)的特异性扩增产物。回收该产物，通过XbaI和HincII位点直接克隆到pBMB982-304上，得到含融合基因slh/smtA的重组质粒pBMBSM-3049(如图5所示)。金属硫蛋白含有丰富的巯基，因而能螯合大量的金属离子。通过MT与Ni2+间的螯合作用，表面展示金属硫蛋白的重组菌就可以被Ni2+标记了的Ni-NTA-琼脂糖微球颗粒所吸附。受体菌BMB171、重组菌BMBSMC分别接种于BHI、BHI+Em/Tc的液体培养基中，30℃摇床培养约12h。样品处理后经荧光染色镜检。结果如图6。受体菌BMB171中，只能看到零散的发光菌体，而无法看到琼脂糖微球；而重组菌BMBSMC的样品中，琼脂糖微球的轮廓依稀可辨，表明绝大部分菌体已被吸附于琼脂糖微球的表面(如图7、8所示)。
为了翔实表现重组菌BMBSMC对重金属离子的吸附能力，又以游离的镉离子为底物进行了测试。结果见表1及图7。表面展示金属硫蛋白的重组菌能吸附6.58×107个镉离子/每个细胞，而受体菌BMB171仅能吸附1.57×107个镉离子/每个细胞，重组菌的吸附能力约为受体菌的4倍(如图8所示)。