一种用于生产冠菌素的基因工程菌及其构建方法 【技术领域】
本发明属于微生物技术领域，具体来说，涉及一种用于生产冠菌素的基因工程菌及其构建方法。
背景技术
冠菌素(Coronatine)C18H25NO4，分子量为319(Ichihara etal，1977)，由一个含氨基酸的冠烷酸(coronamic acid)和一个聚酮结构的冠菌酸(coronafacic acid)两个组分以酰氨键连结而成(Mitchell etal，1994)。最初的文献报到它是一种植物毒素。但最近研究发现冠菌素与植物生长调节物质脱落酸、茉莉酸有类似的功能，而且活性是后两者的数千倍，可作为后两者(较为昂贵，生产上很难推广开)的替代物。且冠菌素属纯天然品，在生产上应用不会对环境造成污染，是一种环境友好型生物调节剂。
冠菌素合成有两种方法，一种是化学合成法(市原获民等，1998)，但目前费用较高，不能工业化生产；另一种是生物合成法，即微生物发酵法。最初市原荻民(1998)用发酵法从250L发酵液中仅得冠菌素60mg。随后一些研究者采用基因工程等生物技术手段将其产量提高到20-40mg/L(Bender et.al，1996；Ullrich，2000)。但生产成本还是比较高，一时难以投入大规模农业生产中。限制其产业化的最重要因素就是缺少高产的优良菌株，因而选育高产冠菌素工程菌具有重大意义。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种用于生产冠菌素的基因工程菌株。
本发明的另一目的在于提供该基因工程菌株的构建方法。
本发明的进一步目的在于提供该基因工程菌的应用。
本发明发明人经过深入研究，获得了一种高产冠菌素的丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)菌株，从而完成了本发明。该菌株已于2005年7月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC1412。
本发明所述基因工程菌的构建方法，包括步骤：
(1)将出发菌株用亚硝基胍NTG进行诱变处理；
(2)筛选冠菌素产量高的基因突变菌株。
本发明所述方法，其中将出发菌株用亚硝基胍NTG进行诱变处理包括步骤：
a)以丁香假单胞菌大豆致病变种(P.syringae pv.glycinea)为出发菌株在含有卡那霉素的MG培养基上培养；将培养好的出发菌株在摇床上培养；离心，悬浮菌体，浓度为106-107c.f.u.ml-1；
b)紫外线预处理；
c)亚硝基胍NTG诱变；
d)终止反应，离心，将菌体用MG液体培养基重新悬浮。
本发明所述方法，其中筛选冠菌素产量高的基因突变菌株包括步骤：
a)将步骤(1)所得培养物用无菌水稀释，涂布到含有卡那霉素的MG固体培养基上；将长出的单菌落转接到新的含有卡那霉素的固体培养基上培养；
b)初筛：将步骤a)所得培养物接种到含有卡那霉素的MG液体培养基中，在摇床上培养；再转接到HSC液体培养基中，在温度16℃-20℃下发酵培养，提取冠菌素；以冠菌素产量进行筛选；
c)复筛 将步骤b)所得冠菌素产量高的菌株接种到含有卡那霉素的MG液体培养基中，在摇床上培养，再转接到HSC液体培养基中，在温度18℃发酵培养，提取冠菌素；以冠菌素产量进行筛选。
本发明所述方法详述如下：
(1)将出发菌株用亚硝基胍NTG进行诱变处理；
a)以丁香假单胞菌大豆致病变种(P.syringae pv.glycinea)为出发菌株，在含有卡那霉素的MG培养基上培养；将培养好的出发菌株在摇床上培养，当OD值达到0.7左右；离心，弃去上清液，将所得菌体用pH 7.0的磷酸缓冲液洗4-5遍，悬浮菌体，使浓度为106-107c.f.u.ml-1。
b)紫外线预处理：15W灭菌紫外灯，距离33厘米，照射10秒。
c)亚硝基胍NTG诱变：取步骤a)菌液1.8ml，加0.2ml 0.1mg/mlNTG，反应10分钟。其中亚硝基胍的配制：用少量丙酮助溶后，然后加pH 7.0的磷酸缓冲溶液(缓冲溶液∶NTG丙酮溶液为9∶1，NTG母液浓度1mg/ml)。
d)终止反应：用2ml pH 5.6的柠檬酸缓冲液稀释反应液以终止反应，并洗涤2-3次，离心，将沉淀用等体积MG液体培养基(KeanePJ，Kerr A，New PB.1970)重新悬浮。
(2)筛选冠菌素产量高的基因突变菌株
a)将步骤(1)所得培养物用无菌水稀释80-120倍，涂布到含有卡那霉素的MG固体培养基上(卡那霉素浓度为5-15μg/mL)，在温度28℃-30℃下培养5-10天，将长出的单菌落转接到新的含有卡那霉素的固体培养基上(卡那霉素浓度为5-15μg/mL)，在温度28℃-30℃条件下培养24-36小时；得到的培养物为突变菌株。
优选地，将步骤(1)所得培养物用无菌水稀释100倍，涂布到MG固体培养基(含卡那霉素浓度为10μg/mL)平板上，在温度为28℃条件下培养7-8天，将长出的单菌落转接到新的MG固体培养基(含卡那霉素浓度为10μg/mL)平板上，在温度为30℃条件下培养48小时。
b)初筛：将步骤a)所得培养物接种到MG(卡那霉素浓度为5-15μg/mL)液体培养基中，在摇床上培养，转接到HSC液体培养基(David，1993)中，在温度18℃发酵培养，提取冠菌素，以冠菌素产量进行筛选。
优选地，将步骤a)所得培养物接种到液体MG培养基(卡那霉素浓度为10μg/mL)中，在温度28℃，转速260rpm/min摇床上培养约24小时，到OD值达到0.6时，按2％接种量转接到HSC培养基中，在温度18℃，转速280rpm/min摇床上培养7天，提取冠菌素，用高效液相色谱法(Palmer and Bender，1993)测定冠菌素含量，以冠菌素产量进行筛选。
更优选地，将步骤a)所得培养物接种到HSC液体培养基(卡那霉素浓度为10μg/mL)上，培养条件：在20ml试管中盛5ml HSC培养基，倾斜45°固定在摇床上，温度为18℃，转速280rpm/min，培养7天，提取冠菌素，以冠菌素产量进行筛选。
c)复筛：将步骤b)所得冠菌素产量比出发菌株高1倍以上的菌株接种到MG(卡那霉素浓度为10μg/mL)液体培养基中，在摇床上培养，转接到HSC液体培养基中，在温度18℃发酵培养，提取冠菌素，以冠菌素产量进行筛选。
优选地，将步骤b)所得冠菌素产量比出发菌株高1倍以上的菌株接种到MG(卡那霉素浓度为10μg/mL)液体培养基中，在摇床上培养，在28℃下培养24小时；再按照2％的接种量接入到装有100mlHSC液体培养的500mL三角瓶中，在温度18℃，转速280rpm/min摇床上发酵培养7天，提取冠菌素，以冠菌素产量进行筛选。
本发明所述的基因工程菌的用途，其特征在于将所述菌株用于冠菌素的发酵生产中。
本发明通过亚销基胍处理出发菌株丁香假单胞菌大豆致病变种，获得突变体，突变新菌株丁香假单胞菌大豆致病变种CGMCC 1412可以提高冠菌素产量，并且高产稳产，产量可达100mg/L，比目前文献报道的最高产量(Ullrich，2000)高2.5倍。从而解决了产量低而不稳的问题。
在用本发明提供的基因工程菌株发酵生产冠菌素的不同阶段，采用不同的培养基：MG液体培养基、MG固体培养基、HSC液体培养基，其具体组成如下：
MG液体培养基：
甘露醇 1％
谷氨酸钠 0.2％
KH2PO4 0.05％
NaCl 0.02％
MgSO4·7H2O 0.02％
H2O 余量
pH 7.0
MG固体培养基：
MG液体培养基加1.5％的琼脂。
HSC培养基：
NH4Cl 1.0g
MgSO4·7H2O 0.2g
KH2PO4 4.1g
K2HPO4 3.6g
KNO3 0.3g
2mM FeCl3 10ml
H2O 890ml
pH 6.8
生物材料保藏说明
本发明基因工程菌丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonassyringae pv.glycinea)CGMCC 1412，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市中关村，保藏编号：CGMCC1412，保藏日期：2005年7月12日。
【具体实施方式】
实施例1：
以丁香假单胞菌大豆致病变种(P.syringae pv.glycinea)为出发菌株在含有卡那霉素(10μg/mL)的MG固体培养基上28℃培养48小时；将培养好的出发菌株接种于MG液体培养基(卡那霉素终浓度为10μg/mL)中，28℃、260rpm摇床培养。当OD值达到0.7左右时，离心，弃去上清液，将所得菌体用pH值7.0的磷酸缓冲液洗4-5遍，悬浮菌体，使菌体浓度为107c.f.u.ml-1；
将上述悬浮菌液用15W灭菌紫外灯，距离33厘米，照射10秒；取照射后的菌液1.8ml，加0.2ml 0.1mg/ml NTG，诱变反应10分钟；加入2ml pH 5.6的柠檬酸缓冲液稀释反应液以终止反应，并洗涤2-3次，离心，将沉淀用等体积MG液体培养基重新悬浮；用无菌水稀释100倍，涂布到MG固体培养基(含卡那霉素浓度为10μg/mL)平板上，在温度为28℃条件下培养7-8天，将长出的单菌落转接到新的MG固体培养基(含卡那霉素浓度为10μg/mL)平板上，在温度为30℃条件下培养48小时；得到的即为突变体。
将培养好的菌落接种到MG液体培养基(卡那霉素浓度为10μg/mL)中，在温度为28℃，转速260rpm/min摇床上培养到OD值达到0.7时，按2％接种量转接到HSC培养基中，在温度18℃，转速280rpm/min摇床上培养7天，提取冠菌素；提取出的冠菌素用色谱淋洗剂甲醇溶解，进行高效液相色谱检测；冠菌素产量为112mg/L的新菌株为丁香假单胞菌大豆致病变种CGMCC 1412。
实施例2：
将新菌株丁香假单胞菌大豆致病变种CGMCC 1412接种到MG液体培养基中，在温度为28℃，转速260rpm/min摇床上培养到OD值达到0.7时，再按照2％的接种量接入到装有100ml HSC液体培养的500mL三角瓶中，在温度18℃，转速280rpm/min摇床上发酵培养7天，提取冠菌素，重复三次，冠菌素产量分别为90.1mg/L、84.7mg/L、92.4mg/L。
实施例3：
将本发明丁香假单胞菌大豆致病变种CGMCC 1412的单菌落接种到装有MG液体培养基(卡那霉素浓度为10μg/mL)的试管中，在温度28℃，转速260rpm/min摇床上培养36小时，为一级种子液；
将200ml MG液体培养基(卡那霉素浓度为10μg/mL)分装于三个500ml三角瓶中，将培养好的一级种子液按2％接种量分别接种于上述三个500ml三角瓶中，在温度28℃，转速260rpm/min摇床上培养48小时，为二级种子液；
用7L的发酵罐内装5L的HSC培养基，用常规高压热蒸汽灭菌发灭菌后，按2％接种量接种二级种子液，通气搅拌；发酵温度18℃，发酵pH 6.8；发酵时间达到6天时下罐，下罐发酵液以大网格树脂吸附法回收产品，并用丙酮洗脱，经重结晶，得到无色结晶状冠菌素产品，产量为89.9mg/L。