一种抗鸡新城疫病毒转移因子的制备方法.pdf

本发明公开了一种天然高效纯生物活性物质抗鸡新城疫病毒转移因子的制备方法。本发明按照以下步骤进行：将鸡新城疫病毒接种于10天龄鸡胚尿囊液制备病毒抗原；提取病毒抗原；用上述提取的病毒抗原免疫猪；从免疫猪中提取抗鸡新城疫病毒转移因子。因此使用本发明的转移因子可以起到预防鸡新城疫病毒感染、能够保护正常机体细胞免受鸡新城疫病毒侵害的作用，从而降低发病率。

权利要求书
1.  一种抗鸡新城疫病毒转移因子的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
(1)制备病毒抗原：将鸡新城疫病毒接种于10天龄鸡胚尿囊液，33℃下48-72小时，取鸡胚尿囊液，装厚壁小瓶子内，超声打碎，5000rpm离心20分钟，弃去沉渣留上清；
(2)提取病毒抗原：取离心上清，然后不连续梯度密度离心纯化提取病毒抗原；将病毒抗原离心后，取上清液装入以15％、30％、45％及60％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，110,000-165,000转/分3小时，根据鸡新城疫病毒所在离心管位置，吸出鸡新城疫病毒备用；
(3)用上述提取的病毒抗原免疫猪：挑选健康的猪，取制备的病毒抗原，用上述提取病毒抗原皮下多点注射免疫猪，共免疫4次，前两次分别以完全佛氏佐剂及不完全佛氏佐剂混合抗原，以高速组织匀浆机打匀，在动物皮内或皮下多点注射免疫，第3次和第4次后在动物的肌肉或静脉注射，每次免疫间隔一周，最后一次免疫7-10天后取动物静脉血，以免疫荧光方法或ELISA方法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀动物，取脾脏和胸腺于冰上，转移至-20℃保存，备用；
(4)从免疫猪中提取抗鸡新城疫病毒转移因子：
①原材料的制备及预处理：将病毒免疫接种猪的脾及淋巴结组织，用冷三蒸水洗净猪脾，去其表面的筋膜、脂肪等组织，再灭菌生理盐水反复冲洗；
②破碎：将洗干净的猪脾脏剪碎，加入2倍体积的冷生理盐水，在冰冻的条件下用高速组织捣碎机以1000r/min捣碎3次，每次3min，制得匀浆液；
③冻融：将匀浆液置于-80℃快速冷冻，水浴30℃中融化，交替冻融4-6次，每次融化后均以组织匀浆机高速匀浆粉碎；
④提取：加入3倍体积的冷生理盐水，置于冰冻离心机于5℃以4000r/min离心30分钟，取上层血红色液体，再用G2砂心漏斗过滤，取滤液；
⑤超滤：将上述滤液用截流值为6000道尔顿的中空纤维超滤膜加压超滤，滤液为分子量小于6000道尔顿的转移因子；
⑥除菌：将超滤得到的滤液用孔径为0.22um的滤膜加压过滤除菌；
⑦分装：4℃密封保存，即得所述的抗鸡新城疫病毒转移因子提取液。

说明书一种抗鸡新城疫病毒转移因子的制备方法
技术领域
本发明涉及药物及其制剂领域，更具体地说，是涉及一种抗鸡新城疫病毒转移因子的制备方法。
背景技术
鸡新城疫是由鸡新城疫病毒引起的急性呼吸道传染病。鸡新城疫病毒的最大特点就是容易发生变异，导致鸡体内已经出现的抗鸡新城疫病毒特异性抗体失去中和病毒的作用，因而使鸡容易感染，甚至造成大规模流行。病鸡受鸡新城疫病毒感染后发生腹泻、呼吸困难等症状，重者可导致死亡。
尽管目前已经有一些抗鸡新城疫病毒的药品或制剂：但是由于现有药品制剂的针对性不强，疗效有限，而且，治疗性制剂多是在发病后才应用的，不能起预防作用。对于新城疫的易感鸡群，每年定期对鸡接种新城疫疫苗是预防新城疫的有效方法。其次应增强营养或药物干预，提高自身免疲力。通过药物提高机体抵杭力或调节免疫力也是一种预防新城疫的有效方法，转移因子可起到此作用。
转移因子(TF，Transfer Factor)是T淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的低分子量多肽-核苷酸复合物，它能将供体的某种特定的细胞免疫功能特异地转移给受体正常的淋巴细胞，参与机体的免疫反应，提高受体机体的细胞免疫功能，抵抗真菌、病毒等非细菌性感染；同时促进B淋巴细胞的抗体分泌作用，能够诱导细胞释放干扰素和白介素，从而增强受体的免疫功能。
目前已报道的转移因子的提取方法都是关于非特异性转移因子的制备方法。例如，中国发明专利申请“制备转移因子的工艺方法——全滤法”(专利申请号：200310118439.6)则公开了采用压滤、超滤、纳滤几种方法连续过滤的制备工艺。另一份中国发明专利申请“制备转移因子的工艺方法——加热法”(专利申请号：200410039444.2)是由同一申请人在前一份申请的基础上加上加热处理的步骤，仍然是连续采用多种过滤法的制备工艺。上述专利申请的内容是对破碎后的组织经冷冻离心后直接进行过滤提取，同样存在细胞破碎不完全的缺陷，而且其工艺烦琐，时间较长，对产物的活性损失也较大，因此得率很难提高。
猪脾脏和胸腺是免疫活性细胞聚集的场所，而且材料来源非常广泛，因此从这类细胞中提取特异性转移因子，有重要的理论意义和现实意义，但目前尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术中存在的不足，提供一种天然高效纯生物活性物质抗鸡新城疫病毒转移因子的制备方法。
本发明抗鸡新城疫病毒转移因子的制备方法，按照以下步骤进行：
(1)制备病毒抗原：将鸡新城疫病毒接种于10天龄鸡胚尿囊液，33℃下48-72小时，取鸡胚尿囊液，装厚壁小瓶子内，超声打碎，5000rpm离心20分钟，弃去沉渣留上清；
(2)提取病毒抗原：取离心上清，然后不连续梯度密度离心纯化提取病毒抗原；将病毒抗原离心后，取上清液装入以15％、30％、45％及60％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，110,000-165,000转/分3小时，根据鸡新城疫病毒所在离心管位置，吸出鸡新城疫病毒备用；
(3)用上述提取的病毒抗原免疫猪：挑选健康的猪，取制备的病毒抗原，用上述提取病毒抗原皮下多点注射免疫猪，共免疫4次，前两次分别以完全佛氏佐剂及不完全佛氏佐剂混合抗原，以高速组织匀浆机打匀，在动物皮内或皮下多点注射免疫，第3次和第4次后在动物的肌肉或静脉注射，每次免疫间隔一周，最后一次免疫7-10天后取动物静脉血，以免疫荧光方法或ELISA方法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀动物，取脾脏和胸腺于冰上，转移至-20℃保存，备用；
(4)从免疫猪中提取抗鸡新城疫病毒转移因子：
①原材料的制备及预处理：将病毒免疫接种猪的脾及淋巴结组织，用冷三蒸水洗净猪脾，去其表面的筋膜、脂肪等组织，再灭菌生理盐水反复冲洗；
②破碎：将洗干净的猪脾脏剪碎，加入2倍体积的冷生理盐水，在冰冻的条件下用高速组织捣碎机以1000r/min捣碎3次，每次3min，制得匀浆液；
③冻融：将匀浆液置于-80℃快速冷冻，水浴30℃中融化，交替冻融4-6次，每次融化后均以组织匀浆机高速匀浆粉碎；
④提取：加入3倍体积的冷生理盐水，置于冰冻离心机于5℃以4000r/min离心30分钟，取上层血红色液体，再用G2砂心漏斗过滤，取滤液；
⑤超滤：将上述滤液用截流值为6000道尔顿的中空纤维超滤膜加压超滤，滤液为分子量小于6000道尔顿的转移因子；
⑥除菌：将超滤得到的滤液用孔径为0.22um的滤膜加压过滤除菌；
⑦分装：4℃密封保存，即得所述的抗鸡新城疫病毒转移因子提取液。
本发明一种抗鸡新城疫病毒转移因子的制备方法，具有以下忧点：
(1)原材料来源容易，无污染，价廉。猪脾脏和胸腺属于屠宰后猪的下脚料。
(2)破碎组织后，加入低温冻融处理的步骤，特别是在30℃下溶解，不使小分子物质活性丧失，并能够使鸡新城疫病毒转移因子得以充分地提取。
(3)工艺采用了比较先进的中空纤维超滤膜超过滤法，从而缩短了制备时间，保证物质分离过程中活性不被破坏。
(4)提取物经生化测定和若干成分分析，是一种低分子量多肽-核苷酸复合物，是一种不含蛋自质、可溶的小分子物质，分子量在6000道尔顿以下。经体内外生物活性试验以及药理、毒性试验等证明，具有纯度高、免疫活性强、起效快而维持时间长、易吸收、无任何不良反应等特点，其疗效确切，安全可靠，既可治疗又可增强抗病能力。该提取物可做成口服液等剂型，便于应用。
本发明的抗鸡新城疫病毒转移因子可以全面或部分抑制鸡新城疫病毒，能保护正常机体细胞免受病毒感染。因此使用本发明的转移因子可以起到预防鸡新城疫病毒感染、能够保护正常机体细胞免受鸡新城疫病毒侵害的作用，从而降低发病率。同时对于遭到鸡新城疫病毒感染的鸡使用转移因子进行治疗，可有效的改善临床症状，提高治愈率、降低死亡率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1：
抗鸡新城疫病毒转移因子的制备
1.制备病毒抗原：将鸡新城疫病毒接种于10天龄鸡胚尿囊液，33℃下48-72小时，取鸡胚尿囊液，装厚壁小瓶子内，超声打碎，5000rpm离心20分钟，弃去沉渣留上清；
2.取离心上清，然后不连续梯度密度离心纯化提取病毒抗原：将病毒抗原离心后，取上清液装入以15％、30％、45％及60％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，165000转/分3小时，根据鸡新城疫病毒所在离心管位置吸出备用；
3.用上述提取的病毒抗原免疫猪：用上述提取病毒抗原皮下多点注射免疫猪，共免疫4次，前两次分别以完全佛氏佐剂及不完全佛氏佐剂混合抗原，以高速组织匀浆机打匀，在动物皮内或皮下多点注射免疫，第3次和第4次后在动物的肌肉或静脉注射，每次免疫间隔一周，最后一次免疫7-10天后取动物静脉血，以免疫荧光方法或ELISA方法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀动物，取脾脏和胸腺于冰上，转移至-20℃保存，备用；
4从免疫猪中提取抗鸡新城疫病毒转移因子：
(1)原材料的制备及预处理：将病毒免疫接种猪的脾及淋巴结组织，用冷三蒸水洗净猪脾，去其表面的筋膜、脂肪等组织，再灭菌生理盐水反复冲洗；
(2)破碎：将洗干净的猪脾脏剪碎，加入2倍体积的冷生理盐水，在冰冻的条件下用高速组织捣碎机以1000r/min捣碎3次，每次3min，制得匀浆液；
(3)冻融：将匀浆液置于-80℃快速冷冻，水浴30℃中融化，交替冻融4-6次，每次融化后均以组织匀浆机高速匀浆粉碎；
(4)提取：加入3倍体积的冷生理盐水，置于冰冻离心机于5℃以4000r/min离心30分钟，取上层血红色液体，再用G2砂心漏斗过滤，取滤液；
(5)超滤：将上述滤液用截流值为6000道尔顿的中空纤维超滤膜加压超滤，滤液为分子量小于6000道尔顿的转移因子；
(6)除菌：将超滤得到的滤液用孔径为0.22um的滤膜加压过滤除菌；
(7)包装：按口服液的要求，加15％的糖浆，加标准防腐剂(笨甲酸钠0.25％)后分装，10ml/瓶.
(8)分装，4℃密封保存，即得所述的抗鸡新城疫病毒转移因子提取液。
实施例2：
抗鸡新城疫病毒转移因子的制备
(1)原材料的制备：选健康无病史的6月龄猪10头，用鸡新城疫病毒疫苗皮下注射免疫，15天后，再免疫一次，方法剂同上。二次免疫后15-20天宰杀，取脾脏和胸腺于冰上，转移置-20℃保存，备用。
(2)预处理：称量猪脾后，用冷三蒸水洗净猪脾，用剪刀剪去其筋膜及脂肪组织，再用冷三蒸水洗涤干净。
(3)破碎：将以上洗干净的猪脾脏剪碎，加入2倍体积的冷生理盐水，在冰冻的条件下用高速组织捣碎机(1000r/min)捣碎3次，每次3min，制得匀浆液。
(4)冻融：将匀浆液(用器皿装)至于超低温冰箱(-80℃)里快速冷冻，水浴30℃中融化，交替冻融10次。
(5)提取：加入3倍体积的冷生理盐水，置于冰冻离心机离心30min(4000r/min，5℃)，取上层液体(血红色)，再用G2砂心漏斗过滤，取滤液.
(6)超滤：将上述滤液用截流值为6000道尔顿的中空纤维超滤膜加压超滤，滤液为分子量小于6000道尔顿的转移因子。
(7)除菌：分别用无菌滤器(滤膜孔径为0.22um)加压过滤。
(8)包装：按注射剂液的要求，加标准防腐剂(苯甲酸钠0.25％)后分装，2ml/瓶.
(9)保存：4℃密封贮存。
实施例3：
对本发明所述工艺制备的抗鸡新城疫病毒转移因子的检测
对实施例1所述工艺制备的抗鸡新城疫病毒转移因子(下称“本品”)进行以下检测：
(1)紫外线分光光度测定：本品在250.0-252.0nm处有一高吸收峰，且ABS260/ABS280＞2.0。
(2)标准液为淡黄色，pH值在6.0-6.5之间。
(3)20％磺基水杨酸检测：本品无浑浊及沉淀现象，说明蛋白反应均为阴性，其不含大分子蛋白质。
(4)多肽含量测定：本品经双缩脲法测定多肽含量为1.260mg/ml。
(5)核酸含量测定：本品经地衣酚法测定核酸含量为631.56ug/ml。
(6)细菌学检测：本品中无需氧、厌氧、腐生菌和真菌存在。
(7)E-玫瑰花结形成率比较：鸡外周血淋巴细胞表面有鼠红细胞受体，并能与之结合形成E-玫瑰花结。而转移因子对淋巴细胞和大鼠红细胞的结合有一定的促进作用。本品的E-玫瑰花结形成率平均为39.4％，比对照组的增加21.7％(P≤0.01)。
(8)取健康小白鼠5只，口服本品浓缩液，相当于正常口服液剂量的50倍，观察小白鼠的生存能力变化，结果：无任何毒性反应，也无死亡现象出现，说明本品是安全的，无任何毒性和副作用。
(9)用PPD做家兔皮试实验，发现本品具有转移免疫活性的功能。
(10)用鸡新城疫病毒抗原做皮试检测，有微弱的阳性反应，说明本品具有良好的转移活性和特异性。
除上述糖浆剂型外，本发明所述的抗鸡新城疫病毒转移因子还可制成其他口服液。
此外，通过常规冻干工艺进一步可得到抗鸡新城疫病毒转移因子的粉末，结合常规辅料，可制成胶囊、片剂等剂型。