一种肽文库、其合成方法及从该文库中筛选的活性片段.pdf

上传人:b*** 文档编号:1621243 上传时间:2018-06-29 格式:PDF 页数:139 大小:3.54MB
返回 下载 相关 举报
摘要
申请专利号:

CN200310101892.6

申请日:

2003.10.23

公开号:

CN1609119A

公开日:

2005.04.27

当前法律状态:

撤回

有效性:

无权

法律详情:

发明专利申请公布后的视为撤回|||实质审查的生效|||公开

IPC分类号:

C07K14/165; A61K38/16; A61P31/14; A61P11/00

主分类号:

C07K14/165; A61K38/16; A61P31/14; A61P11/00

申请人:

中国医学科学院药物研究所;

发明人:

刘刚; 何维; 李莉; 崔莲仙; 寇宾宾; 胡洪波; 王占国; 郝志勇; 张亮; 李旭琴; 倪安平; 刘勇; 孙曼霁; 李前

地址:

100050北京市宣武区先农坛街1号

优先权:

专利代理机构:

北京纪凯知识产权代理有限公司

代理人:

程伟

PDF下载: PDF下载
内容摘要

本发明涉及一种肽文库,其中每一个肽的通式为:Z-XnXn+1Xn+2Xn+3Xn+4Xn+5Xn+6Xn+7Xn+8Xn+9-Y其中X代表任何一种L-构型的天然氨基酸残基,n是指第Xn氨基酸在蛋白质序列中的天然排列位置,n为整数,Y代表NH2或者OH,Z代表氢或者Ac,其中Ac为乙酰基。所述的蛋白质序列的多肽优选为与人类相关的冠状病毒SARS-CoV相关的S、M、E和N蛋白的多肽序列。本发明还涉及具有SARS-CoV抗原决定簇功能的如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:112所示的氨基酸序列。本发明还涉及一种采用“混-分”物理编码法合成含有至少一个具有2~50个氨基酸残基的肽文库的方法。

权利要求书

权利要求书
1.  一种肽文库,其中每一个肽的通式为:
Z-XnXn+1Xn+2Xn+3Xn+4Xn+5Xn+6Xn+7Xn+8Xn+9-Y
其中X代表任何一种L-构型的天然氨基酸残基,n是指第Xn氨基酸在蛋白质序列中的天然排列位置,n为整数,Y代表NH2或者OH,Z代表氢或者Ac,其中Ac为乙酰基。

2.  根据权利要求1所述的肽文库,其特征在于所述的蛋白质序列为与人类相关的冠状病毒SARS-CoV相关的S、M、E和N蛋白的多肽序列。

3.  权利要求2所述的氨基酸序列,其特征在于所述的与人类相关的冠状病毒SARS-CoV为SARS-CoV:BJ01号、SARS-CoV:BJ02号、SARS-CoV:BJ03号、SARS-CoV:BJ04号、SARS-CoV:CUHK-W1、SARS-CoV:GZ01、SARS-CoV:HKU-39849、SARS-CoV:Taiwan、SARS-CoV:Tor2、SARS-CoV:Urbani、SARS-CoV:Vietnam。

4.  权利要求2或3所述的氨基酸序列,其特征在于所述的与人类相关的冠状病毒SARS-CoV为SARS-CoV:BJ01号。

5.  一种选自如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列的任意一种或其结合的氨基酸序列。

6.  一种如SEQ ID NO:102至103所示的氨基酸序列的任意一种或其结合的氨基酸序列。

7.  一种如SEQ ID NO:104所示的氨基酸序列。

8.  一种如SEQ ID NO:105至112所示的氨基酸序列的任意一种或其结合的氨基酸序列。

9.  具有抗SARS-CoV阳性血清抗原决定簇(B-细胞抗原决定簇)、T-细胞抗原决定簇、以及由此发现B-细胞抗原决定簇和T-细胞抗原决定簇作用的、含有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:112任意一种或其结合的共价或者非共价化合物。

10.  含有如SEQ ID NO:1至112所示的氨基酸序列的任意一种或其结合的氨基酸序列在用于制备治疗SARS-CoV引起的疾病的药物中的应用。

11.  通过封闭SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:112所示的氨基酸序列从而阻止SARS-CoV病毒进入宿主的阻断剂。

12.  一种采用“混-分”物理编码法合成含有至少一个具有2~50个氨基酸残基的肽文库的方法,其包括以下步骤:
1)选择合适的射频子编码确定氨基酸序列的多肽片段;
2)混合并对多肽母链氨基端进行脱Fmoc保护;
3)混合并进行充分的洗涤;
4)解码并按所要连接的特定氨基酸进行分组;
5)将特定氨基酸以3~10倍摩尔过量的形式加入到已经分组的反应瓶中,进而连接到步骤2)的多肽母链;以及
6)重复步骤2)和5)直至达到所需长度的片段;
7)最后,进行解码并将多肽化合物从树脂上裂解下来。

13.  根据权利要求9所述的方法,其特征在于所述的氨基酸残基长度为10-34。

14.  根据权利要求9所述的方法,其特征在于所述的保护为Boc/Bzl保护。

说明书

说明书一种肽文库、其合成方法及从该文库中筛选的活性片段
背景技术
与人类相关的冠状病毒(Severe Acute Respiratory SyndromeCoronavirus(SARS-CoV))已经被确认为新的一类病毒,人类以迄今最快的速度测定了其基因序列,主要由RNA-dependent RNApolymerase、Spike(S)、Membrane(M)、Envelope(E)、Nucleocapside(N)、Polymerase(P)等蛋白组成(1、Marra MA et al.,The genome sequence ofthe SARS-associated Coronavirus,Sciencexpress,published online atwww.sciencexpress.org,1 May,2003;2、Rota PA et al.,Characterizationof a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome,Sciencexpress,published online atwww.sciencexpress.org,1 May,2003;3、Qin E’de,et al.,A complete sequence and comparative analysis of aSARS-associated virus(Isolate BJ01),Chinese Science Bulletin 2003,48(10):941-948;4、Peoros JS,et al.,Coronavirus as a possible cause ofsevere acute respiratory syndrome,The Lancet,published online atwww.nejm.org,April 8,2003;5、Ksiazek TG et al.,A novel coronavirusassociated with severe acute respiratory syndrom,N Engl J Med,2003,348(20):1953~1966;6、Dorsten C et al.,Identification of a novelcomavirus in patients with severe acute respiratory syndrome,N Engl JMed,published atwww.nejm.org,on April 10,2003;Anand K et al.,Coronavirus main proteinase(3CLpro)structure:basis for design ofanti-SARS drugs,Sciencexpress,published online atwww.sciencexpress.org,13 May,2003.)。其中Spike(S)蛋白、Membrane(M)蛋白和Envelope(E)蛋白组成了病毒外壳,是病毒识别、结合并进入宿主细胞的蛋白质。尤其是刺突S蛋白是关键性蛋白(图1)。虽然文献研究结果表明HCoV-229E刺突S蛋白的417-546序列是宿主受体结合的部位,但同时也指出不同的冠状病毒通过使用不同的受体进入宿主细胞。这很可能与刺突S蛋白的变异有关(1、Marra MA etal.,The genome sequence of the SARS-associated Coronavirus,Sciencexpress,published online atwww.sciencexpress.org,1 May,2003)。Nucleocapsid(N)蛋白属于胞浆内蛋白,处于病毒颗粒的核心部分,和Genomic RNA以结合的形式存在。病毒RNA在细胞质中复制完成后会和N蛋白结合,结合产物可以被M蛋白识别并被包装到病毒颗粒中。所以N和M蛋白与病毒在宿主细胞中的复制具有明显的关系。N蛋白是宿主T-细胞识别的主要位点之一(见图1)。因而,发展合成病毒蛋白的多肽化合物化学库,对于寻找病毒表面蛋白的多重最小多肽抗原决定簇(包括B-细胞和T-细胞抗原决定簇),进而寻求和发展合成多肽疫苗、临床诊断试剂和血清治疗方案有极其重要的意义。同时,该化学库还可用于筛选并发现病毒结合受体的多重配基,进而阻断冠状病毒进入宿主细胞,发展治疗药物(特别是对于耐药病毒的药物治疗)有极大的参考价值。
目前,寻找抗原决定簇最为常用的方法是利用各种计算机软件,通过已经发表的序列采用亲水性、疏水性、转角结构、HPLC滞留系数、螺旋结构、保守性等参数进行预测。我们的实验结果表明,这种预测方法与实际测得的序列仅有30%~50%的重复性(1、ZHANG XM,LIU G and SUN MJ,Brain Research,2000,868:157-164;2、ZHANGXM,LIU G and SUN MJ,Brain Research,2001,895:277-282.)。另一种方法是采用组合化学技术对蛋白抗原决定簇谱的研究(“交叉重叠”多肽化合物,见表1)。
表1 HR2区的“交叉重叠”多肽
1.DISGINASVV
2. ISGINASVVN
3.  SGINASVVNI
4.   GINASVVNIQ
5.    INASVVNIQK
6.     NASVVNIQKE
7.      ASVVNIQKEI
8.       SVVNIQKEID
9.        VVNIQKEIDR
10.VNIQKEIDRL
11. NIQKEIDRLN
12.  IQKEIDRLNE
13.   QKEIDRLNEV
14.    KEIDRLNEVA
15.     EIDRLNEVAK
16.      IDRLNEVAKN
17.       DRLNEVAKNL
18.        RLNEVAKNLN
19.         LNEVAKNLNE
20.          NEVAKNLNES
21.           EVAKNLNESL
22.            VAKNLNESLI
23.             AKNLNESLID
24.              KNLNESLIDL
25.               NLNESLIDLQ
26.                LNESLIDLQE
27.                 NESLIDLQEL
28.                  ESLIDLQELG
29.                   SLIDLQELGK
30.                    LIDLQELGKY
31.                     IDLQELGKYE
组合化学是用于新药合成和筛选的一种全新的方法,始于90年代初,被誉为是对传统药物化学合成和筛选的一场“革命性突破”。它打破了逐一合成、逐一筛选的模式,以合成和筛选化合物库的形式寻找和优化先导化合物,从而大大加快了发现药物先导化合物的速度。
组合化学把化学合成、电脑设计、计算机技术结为一体,能同时产生许多种结构相关但有序变化的化合物,然后用高度灵敏的生物学方法对这些化合物同时进行筛选,从中确定具有生物活性的物质,再经结构测定,以期找到全新的先导化合物。组合化学以其高效、微量、高度自动化的特点而很快受到世人的瞩目并被许多大的制药公司采纳,成为近年来用以发现新药先导化合物的一种重要手段。该法的特点是以一定数目的氨基酸残基肽(比如1到50个氨基酸残基)为合成“交叉重叠”片段,将蛋白序列通过逐个错位(或者间隔错位,包括从2到合成肽片段的氨基酸的总位数)的方式全部合成出来,然后进行抗原-抗体反应(或者其它生物目的的筛选反应等,如筛选发现T-细胞免疫抗原决定簇,以及SARS-CoV的受体配基等),一次便可以得到所有最短的抗原决定簇,进而绘成抗原决定簇谱,或者其它最小有效活性片段的多肽化合物以及它们的图谱。
目前,通过组合化学技术在化合物合成领域已经成功用于小分子物质的合成,但却没有关于合成大分子物质如肽的报道。
发明内容
本发明人通过应用物理编码法成功合成了一种“交叉重叠”多肽化学库,并使该多肽化学库与SARS-CoV阳性血清反应,成功筛选得到了BJ01号冠状病毒变种的抗原决定簇,从而完成了本发明。
本发明一方面涉及一种“交叉重叠”肽库,其中每一个肽的通式为:
Z-XnXn+1Xn+2Xn+3Xn+4Xn+5Xn+6Xn+7Xn+8Xn+9-Y
其中X代表任何一种L-构型的天然氨基酸残基,n是指第Xn氨基酸在蛋白质序列中的天然排列位置,n为整数,例如第1,2,3,4....n;Y代表NH2或者OH,Z代表氢或者Ac,其中Ac为乙酰基。
所述的蛋白质序列的多肽优选为与人类相关的冠状病毒SARS-CoV相关的S、M、E和N蛋白的多肽序列。
所述的与人类相关的冠状病毒SARS-CoV优选为SARS-CoV:BJ01号、SARS-CoV:BJ02号、SARS-CoV:BJ03号、SARS-CoV:BJ04号、SARS-CoV:CUHK-W1、SARS-CoV:GZ01、SARS-CoV:HKU-39849、SARS-CoV:Taiwan、SARS-CoV:Tor2、SARS-CoV:Urbani、SARS-CoV:Vietnam。所述的与人类相关的冠状病毒SARS-CoV最优选为SARS-CoV:BJ01号。
本发明另一方面涉及一种选自如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列的任意一种或其结合的氨基酸序列。
本发明再一方面涉及一种如SEQ ID NO:102至103所示的氨基酸序列的任意一种或其结合的氨基酸序列。
本发明还涉及一种如SEQ ID NO:104所示地氨基酸序列。
本发明还涉及一种如SEQ ID NO:105至112所示的氨基酸序列的任意一种或其结合的氨基酸序列。
本发明还涉及具有抗SARS-CoV阳性血清抗原决定簇(B-细胞抗原决定簇)、T-细胞抗原决定簇、以及由此发现B-细胞抗原决定簇和T-细胞抗原决定簇作用的、含有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:112任意一种或其结合的共价或者非共价化合物。
本发明还涉及含有如SEQ ID NO:1至112所示的氨基酸序列的任意一种或其结合的氨基酸序列在用于制备治疗SARS-CoV引起的疾病的药物中的应用。
本发明进一步涉及通过封闭SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:112所示的氨基酸序列从而阻止SARS-CoV病毒进入宿主的阻断剂。
本发明还涉及一种采用“混-分”物理编码法合成含有至少一个具有2~50个氨基酸残基的肽文库的方法,其包括以下步骤:
1)选择合适的射频子编码确定氨基酸序列的多肽片段;
2)混合并对多肽母链氨基端进行脱Fmoc保护;
3)混合并进行充分的洗涤;
4)解码并按所要连接的特定氨基酸进行分组;
5)将特定氨基酸以3~10倍摩尔过量的形式加入到已经分组的反应瓶中,进而连接到步骤2)的多肽母链;以及
6)重复步骤2)和5)直至达到所需长度的片段;
7)最后,进行解码并将多肽化合物从树脂上裂解下来。
所述的多肽为具有2~50个、优选3-34个氨基酸残基的多肽。
该方法所述的保护策略包括Fmoc/t-Bu或者Boc/Bz1保护,优选为Fmoc/tBu。
本发明的优点在于采用固相合成技术、射频编码技术在短时间内合成了大量的“交叉重叠”多肽化合物,并首次合成了与SARS-CoV相关的S、M、E和N蛋白的全部“交叉重叠”多肽。发明中,首次使用SARS-CoV感染的人的阳性血清对化学库进行了筛选,并绘制了B-细胞抗原决定簇谱。
附图说明
图1描述了Spike蛋白及其结构。
图2为合成多肽随机抽样LC-MS分析结果。
图3显示合成NH2-NAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVE-CONH2 HPLC-MS的分析结果。
图4显示S蛋白筛选结果。
图5显示M、E和N蛋白筛选结果。
11~30号多肽ELISA筛选抗SARS-CoV阳性血清结果,其中纵坐标代表OD值,横坐标代表合成多肽序列编号。
具体实施方式
组合化学研究分三个阶段:分子多样性化合物库的合成;群集筛选(进行活性检测);活性分子的结构测定。
1、肽库的建立
要建立肽文库必须事先考虑许多方面:如何设计模板分子;选择合适的构建单元;确定何种合成方案;如何完成半自动或者自动合成等。
本发明中的主要目的是寻找针对SARS-CoV病毒的人的B-细胞线型抗原决定簇,并绘制抗原决定簇谱。选择逐位错位的合成方式可以直接找到最小的抗原决定簇。因而,线型10肽被选择为摸板分子。蛋白质以天然L-构型氨基酸组成,因而,本化学库的构建单元自然选择为20种天然L-构型氨基酸。高通量地合成方法一般采用固相合成技术,特点是中间体的纯化仅采用简单的洗涤和过滤操作即可完成。同时,反应中可以使用大大过量的构建单元来保证反应进行完全,并易半自动化或者自动化。因而,我们选择了固相合成技术,在树脂上完成了全部多肽化合物的合成。使用20种天然L-构型氨基酸为构建单元来合成数千个多肽化合物时,相同的反应条件可以在多肽编码的情况下同步进行,如相同的脱保护步骤、不同的多肽序列与相同的保护氨基酸进行反应步骤等。这样就可以完成大规模、快速地合成。其中编码方式有多种,如化学编码、物理编码等。物理编码的特点是无“化学污染”,无须多余的化学解码步骤等。因而,我们选择了IRORI编码-解码的分类技术。一次可操作数千个化合物的合成,本实验中我们选择了一次合成600~700个多肽化合物的规模。
2、群集筛选
总的来讲,筛选可分为随机筛选和定向筛选。但无论是随机筛选还是定向筛选,都要考虑:选定筛选模式为固相筛选或用何法(细胞功能筛选、受体筛选、抗体筛选等)进行筛选,用何种指示剂(同位素标记、荧光标记、染料染色)等。具体的筛选方法有三种:固相筛选、液相筛选和两者的结合。本发明中使用的ELISA筛选方法属于定向液相筛选,生物反应是抗原-抗体结合实验。人抗SARS-CoV阳性血清中含有人抗SARS-CoV多克隆抗体(包括IgG和IgM)。当包被在96孔反应板中的多肽化合物与人抗SARS-CoV多克隆抗体结合后,经过仔细的洗涤即可洗去为结合多余的、甚至是非特异的结合抗体和血清。此时,加入用辣根过氧化酶标记的抗IgG或者抗IgM抗体就会完成二次结合,并将辣根过氧化酶保留在体系内。该辣根过氧化酶在一定的条件下可以催化水解对应的底物,并可以在特定的波长下测得吸收值。此吸收值的大小与人抗SARS-CoV多克隆抗体结合的强弱和多少相关。
3、确认活性分子结构
编码技术已应用于解析组合库中高活性化合物的结构。最早提出此技术的是Brenner和Lemer,Nicolaou等提出了射频编码合成仪突破了以往的编码形式,它是建立在射频信号及应用多功能微反应仪的半导体记忆装置基础上的。
本发明中使用的射频编码技术可以直接将裂解到96孔板中多肽化合物编码对应孔号。因而,筛选得到的活性孔经过与编码子序号对比即可给出多肽的序列。
本实施例中以筛选抗SARS-CoV阳性血清,寻找并绘制B-细胞抗原决定簇谱为目标,筛选了本化学库。筛选并绘制T-细胞抗原决定簇谱和SARS-CoV融合阻断剂正在进行中。本实施例中选择了SARS-CoV的BJ01号序列,其组成成分的氨基酸序列如下:
Spike(S)蛋白:如SEQ ID NO:113所示。
Membrane(M)蛋白:如SEQ ID NO:114所示。
Envelope(E)蛋白:如SEQ ID NO:115所示。
Nucleocapsid(N)蛋白:如SEQ ID NO:116所示。
实施例1
设计合成Spike(S)蛋白从1至600个氨基酸序列中每相邻的10个氨基酸序列的“交叉重叠”序列,如下表所示。从右至左为合成次序,代表合成步骤号码为阿拉伯数字1到10。
         表2  所合成的600个以10个氨基酸为长度的序列
 编号  10    9     8     7     6     5     4     3     2     1
 1)    M     F     I     F     L     L     F     L     T     L
 2)    F     I     F     L     L     F     L     T     L     T
 3)    I     F     L     L     F     L     T     L     T     S
 4)    F     L     L     F     L     T     L     T     S     G
 5)    L     L     F     L     T     L     T     S     G     S
 6)    L     F     L     T     L     T     S     G     S     D
 7)    F     L     T     L     T     S     G     S     D     L
 8)    L     T     L     T     S     G     S     D     L     D
 9)    T     L     T     S     G     S     D     L     D     R
10)    L     T     S     G     S     D     L     D     R     C
11)    T     S     G     S     D     L     D     R     C     T
12)    S    G    S    D    L    D    R    C    T    T
13)    G    S    D    L    D    R    C    T    T    F
14)    S    D    L    D    R    C    T    T    F    D
15)    D    L    D    R    C    T    T    F    D    D
16)    L    D    R    C    T    T    F    D    D    V
17)    D    R    C    T    T    F    D    D    V    Q
18)    R    C    T    T    F    D    D    V    Q    A
19)    C    T    T    F    D    D    V    Q    A    P
20)    T    T    F    D    D    V    Q    A    P    N
21)    T    F    D    D    V    Q    A    P    N    Y
22)    F    D    D    V    Q    A    P    N    Y    T
23)    D    D    V    Q    A    P    N    Y    T    Q
24)    D    V    Q    A    P    N    Y    T    Q    H
25)    V    Q    A    P    N    Y    T    Q    H    T
26)    Q    A    P    N    Y    T    Q    H    T    S
27)    A    P    N    Y    T    Q    H    T    S    S
28)    P    N    Y    T    Q    H    T    S    S    M
29)    N    Y    T    Q    H    T    S    S    M    R
30)    Y    T    Q    H    T    S    S    M    R    G
31)    T    Q    H    T    S    S    M    R    G    V
32)    Q    H    T    S    S    M    R    G    V    Y
33)    H    T    S    S    M    R    G    V    Y    Y
34)    T    S    S    M    R    G    V    Y    Y    P
35)    S    S    M    R    G    V    Y    Y    P    D
36)    S    M    R    G    V    Y    Y    P    D    E
37)    M    R    G    V    Y    Y    P    D    E    I
38)    R    G    V    Y    Y    P    D    E    I    F
39)    G    V    Y    Y    P    D    E    I    F    R
40)    V    Y    Y    P    D    E    I    F    R    S
41)    Y    Y    P    D    E    I    F    R    S    D
42)    Y    P    D    E    I    F    R    S    D    T
43)    P    D    E    I    F    R    S    D    T    L
44)    D    E    I    F    R    S    D    T    L    Y
45)    E    I    F    R    S    D    T    L    Y    L
46)    I    F    R    S    D    T    L    Y    L    T
47)    F    R    S    D    T    L    Y    L    T    Q
48)    R    S    D    T    L    Y    L    T    Q    D
49)    S    D    T    L    Y    L    T    Q    D    L
50)    D    T    L    Y    L    T    Q    D    L    F
51)    T    L    Y    L    T    Q    D    L    F    L
52)    L    Y    L    T    Q    D    L    F    L    P
53)    Y    L    T    Q    D    L    F    L    P    F
54)    L    T    Q    D    L    F    L    P    F    Y
55)    T    Q    D    L    F    L    P    F    Y    S
56)    Q    D    L    F    L    P    F    Y    S    N
57)    D    L    F    L    P    F    Y    S    N    V
58)    L    F    L    P    F    Y    S    N    V    T
59)    F    L    P    F    Y    S    N    V    T    G
60)    L    P    F    Y    S    N    V    T    G    F
61)    P    F    Y    S    N    V    T    G    F    H
 62)    F    Y    S    N    V    T    G    F    H    T
 63)    Y    S    N    V    T    G    F    H    T    I
 64)    S    N    V    T    G    F    H    T    I    N
 65)    N    V    T    G    F    H    T    I    N    H
 66)    V    T    G    F    H    T    I    N    H    T
 67)    T    G    F    H    T    I    N    H    T    F
 68)    G    F    H    T    I    N    H    T    F    D
 69)    F    H    T    I    N    H    T    F    D    N
 70)    H    T    I    N    H    T    F    D    N    P
 71)    T    I    N    H    T    F    D    N    P    V
 72)    I    N    H    T    F    D    N    P    V    I
 73)    N    H    T    F    D    N    P    V    I    P
 74)    H    T    F    D    N    P    V    I    P    F
 75)    T    F    D    N    P    V    I    P    F    K
 76)    F    D    N    P    V    I    P    F    K    D
 77)    D    N    P    V    I    P    F    K    D    G
 78)    N    P    V    I    P    F    K    D    G    I
 79)    P    V    I    P    F    K    D    G    I    Y
 80)    V    I    P    F    K    D    G    I    Y    F
 81)    I    P    F    K    D    G    I    Y    F    A
 82)    P    F    K    D    G    I    Y    F    A    A
 83)    F    K    D    G    I    Y    F    A    A    T
 84)    K    D    G    I    Y    F    A    A    T    E
 85)    D    G    I    Y    F    A    A    T    E    K
 86)    G    I    Y    F    A    A    T    E    K    S
 87)    I    Y    F    A    A    T    E    K    S    N
 88)    Y    F    A    A    T    E    K    S    N    V
 89)    F    A    A    T    E    K    S    N    V    V
 90)    A    A    T    E    K    S    N    V    V    R
 91)    A    T    E    K    S    N    V    V    R    G
 92)    T    E    K    S    N    V    V    R    G    W
 93)    E    K    S    N    V    V    R    G    W    V
 94)    K    S    N    V    V    R    G    W    V    F
 95)    S    N    V    V    R    G    W    V    F    G
 96)    N    V    V    R    G    W    V    F    G    S
 97)    V    V    R    G    W    V    F    G    S    T
 98)    V    R    G    W    V    F    G    S    T    M
 99)    R    G    W    V    F    G    S    T    M    N
100)    G    W    V    F    G    S    T    M    N    N
101)    W    V    F    G    S    T    M    N    N    K
102)    V    F    G    S    T    M    N    N    K    S
103)    F    G    S    T    M    N    N    K    S    Q
104)    G    S    T    M    N    N    K    S    Q    S
105)    S    T    M    N    N    K    S    Q    S    V
106)    T    M    N    N    K    S    Q    S    V    I
107)    M    N    N    K    S    Q    S    V    I    I
108)    N    N    K    S    Q    S    V    I    I    I
109)    N    K    S    Q    S    V    I    I    I    N
110)    K    S    Q    S    V    I    I    I    N    N
111)    S    Q    S    V    I    I    I    N    N    S
112)    Q    S    V    I    I    I    N    N    S    T
113)    S    V    I    I    I    N    N    S    T    N
114)    V    I    I    I    N    N    S    T    N    V
115)    I    I    I    N    N    S    T    N    V    V
116)    I    I    N    N    S    T    N    V    V    I
117)    I    N    N    S    T    N    V    V    I    R
118)    N    N    S    T    N    V    V    I    R    A
119)    N    S    T    N    V    V    I    R    A    C
120)    S    T    N    V    V    I    R    A    C    N
121)    T    N    V    V    I    R    A    C    N    F
122)    N    V    V    I    R    A    C    N    F    E
123)    V    V    I    R    A    C    N    F    E    L
124)    V    I    R    A    C    N    F    E    L    C
125)    I    R    A    C    N    F    E    L    C    D
126)    R    A    C    N    F    E    L    C    D    N
127)    A    C    N    F    E    L    C    D    N    P
128)    C    N    F    E    L    C    D    N    P    F
129)    N    F    E    L    C    D    N    P    F    F
130)    F    E    L    C    D    N    P    F    F    A
131)    E    L    C    D    N    P    F    F    A    V
132)    L    C    D    N    P    F    F    A    V    S
133)    C    D    N    P    F    F    A    V    S    K
134)    D    N    P    F    F    A    V    S    K    P
135)    N    P    F    F    A    V    S    K    P    M
136)    P    F    F    A    V    S    K    P    M    G
137)    F    F    A    V    S    K    P    M    G    T
138)    F    A    V    S    K    P    M    G    T    Q
139)    A    V    S    K    P    M    G    T    Q    T
140)    V    S    K    P    M    G    T    Q    T    H
141)    S    K    P    M    G    T    Q    T    H    T
142)    K    P    M    G    T    Q    T    H    T    M
143)    P    M    G    T    Q    T    H    T    M    I
144)    M    G    T    Q    T    H    T    M    I    F
145)    G    T    Q    T    H    T    M    I    F    D
146)    T    Q    T    H    T    M    I    F    D    N
147)    Q    T    H    T    M    I    F    D    N    A
148)    T    H    T    M    I    F    D    N    A    F
149)    H    T    M    I    F    D    N    A    F    N
150)    T    M    I    F    D    N    A    F    N    C
151)    M    I    F    D    N    A    F    N    C    T
152)    I    F    D    N    A    F    N    C    T    F
153)    F    D    N    A    F    N    C    T    F    E
154)    D    N    A    F    N    C    T    F    E    Y
155)    N    A    F    N    C    T    F    E    Y    I
156)    A    F    N    C    T    F    E    Y    I    S
157)    F    N    C    T    F    E    Y    I    S    D
158)    N    C    T    F    E    Y    I    S    D    A
159)    C    T    F    E    Y    I    S    D    A    F
160)    T    F    E    Y    I    S    D    A    F    S
161)    F    E    Y    I    S    D    A    F    S    L
162)    E    Y    I    S    D    A    F    S    L    D
163)    Y    I    S    D    A    F    S    L    D    V
164)    I    S    D    A    F    S    L    D    V    S
165)    S    D    A    F    S    L    D    V    S    E
166)    D    A    F    S    L    D    V    S    E    K
167)    A    F    S    L    D    V    S    E    K    S
168)    F    S    L    D    V    S    E    K    S    G
169)    S    L    D    V    S    E    K    S    G    N
170)    L    D    V    S    E    K    S    G    N    F
171)    D    V    S    E    K    S    G    N    F    K
172)    V    S    E    K    S    G    N    F    K    H
173)    S    E    K    S    G    N    F    K    H    L
174)    E    K    S    G    N    F    K    H    L    R
175)    K    S    G    N    F    K    H    L    R    E
176)    S    G    N    F    K    H    L    R    E    F
177)    G    N    F    K    H    L    R    E    F    V
178)    N    F    K    H    L    R    E    F    V    F
179)    F    K    H    L    R    E    F    V    F    K
180)    K    H    L    R    E    F    V    F    K    N
181)    H    L    R    E    F    V    F    K    N    K
182)    L    R    E    F    V    F    K    N    K    D
183)    R    E    F    V    F    K    N    K    D    G
184)    E    F    V    F    K    N    K    D    G    F
185)    F    V    F    K    N    K    D    G    F    L
186)    V    F    K    N    K    D    G    F    L    Y
187)    F    K    N    K    D    G    F    L    Y    V
188)    K    N    K    D    G    F    L    Y    V    Y
189)    N    K    D    G    F    L    Y    V    Y    K
190)    K    D    G    F    L    Y    V    Y    K    G
191)    D    G    F    L    Y    V    Y    K    G    Y
192)    G    F    L    Y    V    Y    K    G    Y    Q
193)    F    L    Y    V    Y    K    G    Y    Q    P
194)    L    Y    V    Y    K    G    Y    Q    P    I
195)    Y    V    Y    K    G    Y    Q    P    I    D
196)    V    Y    K    G    Y    Q    P    I    D    V
197)    Y    K    G    Y    Q    P    I    D    V    V
198)    K    G    Y    Q    P    I    D    V    V    R
199)    G    Y    Q    P    I    D    V    V    R    D
200)    Y    Q    P    I    D    V    V    R    D    L
201)    Q    P    I    D    V    V    R    D    L    P
202)    P    I    D    V    V    R    D    L    P    S
203)    I    D    V    V    R    D    L    P    S    G
204)    D    V    V    R    D    L    P    S    G    F
205)    V    V    R    D    L    P    S    G    F    N
206)    V    R    D    L    P    S    G    F    N    T
207)    R    D    L    P    S    G    F    N    T    L
208)    D    L    P    S    G    F    N    T    L    K
209)    L    P    S    G    F    N    T    L    K    P
210)    P    S    G    F    N    T    L    K    P    I
211)    S    G    F    N    T    L    K    P    I    F
212)    G    F    N    T    L    K    P    I    F    K
213)    F    N    T    L    K    P    I    F    K    L
214)    N    T    L    K    P    I    F    K    L    P
215)    T    L    K    P    I    F    K    L    P    L
216)    L    K    P    I    F    K    L    P    L    G
217)    K    P    I    F    K    L    P    L    G    I
218)    P    I    F    K    L    P    L    G    I    N
219)    I    F    K    L    P    L    G    I    N    I
220)    F    K    L    P    L    G    I    N    I    T
221)    K    L    P    L    G    I    N    I    T    N
222)    L    P    L    G    I    N    I    T    N    F
223)    P    L    G    I    N    I    T    N    F    R
224)    L    G    I    N    I    T    N    F    R    A
225)    G    I    N    I    T    N    F    R    A    I
226)    I    N    I    T    N    F    R    A    I    L
227)    N    I    T    N    F    R    A    I    L    T
228)    I    T    N    F    R    A    I    L    T    A
229)    T    N    F    R    A    I    L    T    A    F
230)    N    F    R    A    I    L    T    A    F    S
231)    F    R    A    I    L    T    A    F    S    P
232)    R    A    I    L    T    A    F    S    P    A
233)    A    I    L    T    A    F    S    P    A    Q
234)    I    L    T    A    F    S    P    A    Q    D
235)    L    T    A    F    S    P    A    Q    D    T
236)    T    A    F    S    P    A    Q    D    T    W
237)    A    F    S    P    A    Q    D    T    W    G
238)    F    S    P    A    Q    D    T    W    G    T
239)    S    P    A    Q    D    T    W    G    T    S
240)    P    A    Q    D    T    W    G    T    S    A
241)    A    Q    D    T    W    G    T    S    A    A
242)    Q    D    T    W    G    T    S    A    A    A
243)    D    T    W    G    T    S    A    A    A    Y
244)    T    W    G    T    S    A    A    A    Y    F
245)    W    G    T    S    A    A    A    Y    F    V
246)    G    T    S    A    A    A    Y    F    V    G
247)    T    S    A    A    A    Y    F    V    G    Y
248)    S    A    A    A    Y    F    V    G    Y    L
249)    A    A    A    Y    F    V    G    Y    L    K
250)    A    A    Y    F    V    G    Y    L    K    P
251)    A    Y    F    V    G    Y    L    K    P    T
252)    Y    F    V    G    Y    L    K    P    T    T
253)    F    V    G    Y    L    K    P    T    T    F
254)    V    G    Y    L    K    P    T    T    F    M
255)    G    Y    L    K    P    T    T    F    M    L
256)    Y    L    K    P    T    T    F    M    L    K
257)    L    K    P    T    T    F    M    L    K    Y
258)    K    P    T    T    F    M    L    K    Y    D
259)    P    T    T    F    M    L    K    Y    D    E
260)    T    T    F    M    L    K    Y    D    E    N
261)    T    F    M    L    K    Y    D    E    N    G
262)    F    M    L    K    Y    D    E    N    G    T
263)    M    L    K    Y    D    E    N    G    T    I
264)    L    K    Y    D    E    N    G    T    I    T
265)    K    Y    D    E    N    G    T    I    T    D
266)    Y    D    E    N    G    T    I    T    D    A
267)    D    E    N    G    T    I    T    D    A    V
268)    E    N    G    T    I    T    D    A    V    D
269)    N    G    T    I    T    D    A    V    D    C
270)    G    T    I    T    D    A    V    D    C    S
271)    T    I    T    D    A    V    D    C    S    Q
272)    I    T    D    A    V    D    C    S    Q    N
273)    T    D    A    V    D    C    S    Q    N    P
274)    D    A    V    D    C    S    Q    N    P    L
275)    A    V    D    C    S    Q    N    P    L    A
276)    V    D    C    S    Q    N    P    L    A    E
277)    D    C    S    Q    N    P    L    A    E    L
278)    C    S    Q    N    P    L    A    E    L    K
279)    S    Q    N    P    L    A    E    L    K    C
280)    Q    N    P    L    A    E    L    K    C    S
281)    N    P    L    A    E    L    K    C    S    V
282)    P    L    A    E    L    K    C    S    V    K
283)    L    A    E    L    K    C    S    V    K    S
284)    A    E    L    K    C    S    V    K    S    F
285)    E    L    K    C    S    V    K    S    F    E
286)    L    K    C    S    V    K    S    F    E    I
287)    K    C    S    V    K    S    F    E    I    D
288)    C    S    V    K    S    F    E    I    D    K
289)    S    V    K    S    F    E    I    D    K    G
290)    V    K    S    F    E    I    D    K    G    I
291)    K    S    F    E    I    D    K    G    I    Y
292)    S    F    E    I    D    K    G    I    Y    Q
293)    F    E    I    D    K    G    I    Y    Q    T
294)    E    I    D    K    G    I    Y    Q    T    S
295)    I    D    K    G    I    Y    Q    T    S    N
296)    D    K    G    I    Y    Q    T    S    N    F
297)    K    G    I    Y    Q    T    S    N    F    R
298)    G    I    Y    Q    T    S    N    F    R    V
299)    I    Y    Q    T    S    N    F    R    V    V
300)    Y    Q    T    S    N    F    R    V    V    P
301)    Q    T    S    N    F    R    V    V    P    S
302)    T    S    N    F    R    V    V    P    S    G
303)    S    N    F    R    V    V    P    S    G    D
304)    N    F    R    V    V    P    S    G    D    V
305)    F    R    V    V    P    S    G    D    V    V
306)    R    V    V    P    S    G    D    V    V    R
307)    V    V    P    S    G    D    V    V    R    F
308)    V    P    S    G    D    V    V    R    F    P
309)    P    S    G    D    V    V    R    F    P    N
310)    S    G    D    V    V    R    F    P    N    I
311)    G    D    V    V    R    F    P    N    I    T
312)    D    V    V    R    F    P    N    I    T    N
313)    V    V    R    F    P    N    I    T    N    L
314)    V    R    F    P    N    I    T    N    L    C
315)    R    F    P    N    I    T    N    L    C    P
316)    F    P    N    I    T    N    L    C    P    F
317)    P    N    I    T    N    L    C    P    F    G
318)    N    I    T    N    L    C    P    F    G    E
319)    I    T    N    L    C    P    F    G    E    V
320)    T    N    L    C    P    F    G    E    V    F
321)    N    L    C    P    F    G    E    V    F    N
322)    L    C    P    F    G    E    V    F    N    A
323)    C    P    F    G    E    V    F    N    A    T
324)    P    F    G    E    V    F    N    A    T    K
325)    F    G    E    V    F    N    A    T    K    F
326)    G    E    V    F    N    A    T    K    F    P
327)    E    V    F    N    A    T    K    F    P    S
328)    V    F    N    A    T    K    F    P    S    V
329)    F    N    A    T    K    F    P    S    V    Y
330)    N    A    T    K    F    P    S    V    Y    A
331)    A    T    K    F    P    S    V    Y    A    W
332)    T    K    F    P    S    V    Y    A    W    E
333)    K    F    P    S    V    Y    A    W    E    R
334)    F    P    S    V    Y    A    W    E    R    K
335)    P    S    V    Y    A    W    E    R    K    K
336)    S    V    Y    A    W    E    R    K    K    I
337)    V    Y    A    W    E    R    K    K    I    S
338)    Y    A    W    E    R    K    K    I    S    N
339)    A    W    E    R    K    K    I    S    N    C
340)    W    E    R    K    K    I    S    N    C    V
341)    E    R    K    K    I    S    N    C    V    A
342)    R    K    K    I    S    N    C    V    A    D
343)    K    K    I    S    N    C    V    A    D    Y
344)    K    I    S    N    C    V    A    D    Y    S
345)    I    S    N    C    V    A    D    Y    S    V
346)    S    N    C    V    A    D    Y    S    V    L
347)    N    C    V    A    D    Y    S    V    L    Y
348)    C    V    A    D    Y    S    V    L    Y    N
349)    V    A    D    Y    S    V    L    Y    N    S
350)    A    D    Y    S    V    L    Y    N    S    T
351)    D    Y    S    V    L    Y    N    S    T    F
352)    Y    S    V    L    Y    N    S    T    F    F
353)    S    V    L    Y    N    S    T    F    F    S
354)    V    L    Y    N    S    T    F    F    S    T
355)    L    Y    N    S    T    F    F    S    T    F
356)    Y    N    S    T    F    F    S    T    F    K
357)    N    S    T    F    F    S    T    F    K    C
358)    S    T    F    F    S    T    F    K    C    Y
359)    T    F    F    S    T    F    K    C    Y    G
360)    F    F    S    T    F    K    C    Y    G    V
361)    F    S    T    F    K    C    Y    G    V    S
362)    S    T    F    K    C    Y    G    V    S    A
363)    T    F    K    C    Y    G    V    S    A    T
364)    F    K    C    Y    G    V    S    A    T    K
365)    K    C    Y    G    V    S    A    T    K    L
366)    C    Y    G    V    S    A    T    K    L    N
367)    Y    G    V    S    A    T    K    L    N    D
368)    G    V    S    A    T    K    L    N    D    L
369)    V    S    A    T    K    L    N    D    L    C
370)    S    A    T    K    L    N    D    L    C    F
371)    A    T    K    L    N    D    L    C    F    S
372)    T    K    L    N    D    L    C    F    S    N
373)    K    L    N    D    L    C    F    S    N    V
374)    L    N    D    L    C    F    S    N    V    Y
375)    N    D    L    C    F    S    N    V    Y    A
376)    D    L    C    F    S    N    V    Y    A    D
377)    L    C    F    S    N    V    Y    A    D    S
378)    C    F    S    N    V    Y    A    D    S    F
379)    F    S    N    V    Y    A    D    S    F    V
380)    S    N    V    Y    A    D    S    F    V    V
381)    N    V    Y    A    D    S    F    V    V    K
382)    V    Y    A    D    S    F    V    V    K    G
383)    Y    A    D    S    F    V    V    K    G    D
384)    A    D    S    F    V    V    K    G    D    D
385)    D    S    F    V    V    K    G    D    D    V
386)    S    F    V    V    K    G    D    D    V    R
387)    F    V    V    K    G    D    D    V    R    Q
388)    V    V    K    G    D    D    V    R    Q    I
389)    V    K    G    D    D    V    R    Q    I    A
390)    K    G    D    D    V    R    Q    I    A    P
391)    G    D    D    V    R    Q    I    A    P    G
392)    D    D    V    R    Q    I    A    P    G    Q
393)    D    V    R    Q    I    A    P    G    Q    T
394)    V    R    Q    I    A    P    G    Q    T    G
395)    R    Q    I    A    P    G    Q    T    G    V
396)    Q    I    A    P    G    Q    T    G    V    I
397)    I    A    P    G    Q    T    G    V    I    A
398)    A    P    G    Q    T    G    V    I    A    D
399)    P    G    Q    T    G    V    I    A    D    Y
400)    G    Q    T    G    V    I    A    D    Y    N
401)    Q    T    G    V    I    A    D    Y    N    Y
402)    T    G    V    I    A    D    Y    N    Y    K
403)    G    V    I    A    D    Y    N    Y    K    L
404)    V    I    A    D    Y    N    Y    K    L    P
405)    I    A    D    Y    N    Y    K    L    P    D
406)    A    D    Y    N    Y    K    L    P    D    D
407)    D    Y    N    Y    K    L    P    D    D    F
408)    Y    N    Y    K    L    P    D    D    F    M
409)    N    Y    K    L    P    D    D    F    M    G
410)    Y    K    L    P    D    D    F    M    G    C
411)    K    L    P    D    D    F    M    G    C    V
412)    L    P    D    D    F    M    G    C    V    L
413)    P    D    D    F    M    G    C    V    L    A
414)    D    D    F    M    G    C    V    L    A    W
415)    D    F    M    G    C    V    L    A    W    N
416)    F    M    G    C    V    L    A    W    N    T
417)    M    G    C    V    L    A    W    N    T    R
418)    G    C    V    L    A    W    N    T    R    N
419)    C    V    L    A    W    N    T    R    N    I
420)    V    L    A    W    N    T    R    N    I    D
421)    L    A    W    N    T    R    N    I    D    A
422)    A    W    N    T    R    N    I    D    A    T
423)    W    N    T    R    N    I    D    A    T    S
424)    N    T    R    N    I    D    A    T    S    T
425)    T    R    N    I    D    A    T    S    T    G
426)    R    N    I    D    A    T    S    T    G    N
427)    N    I    D    A    T    S    T    G    N    Y
428)    I    D    A    T    S    T    G    N    Y    N
429)    D    A    T    S    T    G    N    Y    N    Y
430)    A    T    S    T    G    N    Y    N    Y    K
431)    T    S    T    G    N    Y    N    Y    K    Y
432)    S    T    G    N    Y    N    Y    K    Y    R
433)    T    G    N    Y    N    Y    K    Y    R    Y
434)    G    N    Y    N    Y    K    Y    R    Y    L
435)    N    Y    N    Y    K    Y    R    Y    L    R
436)    Y    N    Y    K    Y    R    Y    L    R    H
437)    N    Y    K    Y    R    Y    L    R    H    G
438)    Y    K    Y    R    Y    L    R    H    G    K
439)    K    Y    R    Y    L    R    H    G    K    L
440)    Y    R    Y    L    R    H    G    K    L    R
441)    R    Y    L    R    H    G    K    L    R    P
442)    Y    L    R    H    G    K    L    R    P    F
443)    L    R    H    G    K    L    R    P    F    E
444)    R    H    G    K    L    R    P    F    E    R
445)    H    G    K    L    R    P    F    E    R    D
446)    G    K    L    R    P    F    E    R    D    I
447)    K    L    R    P    F    E    R    D    I    S
448)    L    R    P    F    E    R    D    I    S    N
449)    R    P    F    E    R    D    I    S    N    V
450)    P    F    E    R    D    I    S    N    V    P
451)    F    E    R    D    I    S    N    V    P    F
452)    E    R    D    I    S    N    V    P    F    S
453)    R    D    I    S    N    V    P    F    S    P
454)    D    I    S    N    V    P    F    S    P    D
455)    I    S    N    V    P    F    S    P    D    G
456)    S    N    V    P    F    S    P    D    G    K
457)    N    V    P    F    S    P    D    G    K    P
458)    V    P    F    S    P    D    G    K    P    C
459)    P    F    S    P    D    G    K    P    C    T
460)    F    S    P    D    G    K    P    C    T    P
461)    S    P    D    G    K    P    C    T    P    P
462)    P    D    G    K    P    C    T    P    P    A
463)    D    G    K    P    C    T    P    P    A    L
464)    G    K    P    C    T    P    P    A    L    N
465)    K    P    C    T    P    P    A    L    N    C
466)    P    C    T    P    P    A    L    N    C    Y
467)    C    T    P    P    A    L    N    C    Y    W
468)    T    P    P    A    L    N    C    Y    W    P
469)    P    P    A    L    N    C    Y    W    P    L
470)    P    A    L    N    C    Y    W    P    L    N
471)    A    L    N    C    Y    W    P    L    N    D
472)    L    N    C    Y    W    P    L    N    D    Y
473)    N    C    Y    W    P    L    N    D    Y    G
474)    C    Y    W    P    L    N    D    Y    G    F
475)    Y    W    P    L    N    D    Y    G    F    Y
476)    W    P    L    N    D    Y    G    F    Y    T
477)    P    L    N    D    Y    G    F    Y    T    T
478)    L    N    D    Y    G    F    Y    T    T    T
479)    N    D    Y    G    F    Y    T    T    T    G
480)    D    Y    G    F    Y    T    T    T    G    I
481)    Y    G    F    Y    T    T    T    G    I    G
482)    G    F    Y    T    T    T    G    I    G    Y
483)    F    Y    T    T    T    G    I    G    Y    Q
484)    Y    T    T    T    G    I    G    Y    Q    P
485)    T    T    T    G    I    G    Y    Q    P    Y
486)    T    T    G    I    G    Y    Q    P    Y    R
487)    T    G    I    G    Y    Q    P    Y    R    V
488)    G    I    G    Y    Q    P    Y    R    V    V
489)    I    G    Y    Q    P    Y    R    V    V    V
490)    G    Y    Q    P    Y    R    V    V    V    L
491)    Y    Q    P    Y    R    V    V    V    L    S
492)    Q    P    Y    R    V    V    V    L    S    F
493)    P    Y    R    V    V    V    L    S    F    E
494)    Y    R    V    V    V    L    S    F    E    L
495)    R    V    V    V    L    S    F    E    L    L
496)    V    V    V    L    S    F    E    L    L    N
497)    V    V    L    S    F    E    L    L    N    A
498)    V    L    S    F    E    L    L    N    A    P
499)    L    S    F    E    L    L    N    A    P    A
500)    S    F    E    L    L    N    A    P    A    T
501)    F    E    L    L    N    A    P    A    T    V
502)    E    L    L    N    A    P    A    T    V    C
503)    L    L    N    A    P    A    T    V    C    G
504)    L    N    A    P    A    T    V    C    G    P
505)    N    A    P    A    T    V    C    G    P    K
506)    A    P    A    T    V    C    G    P    K    L
507)    P    A    T    V    C    G    P    K    L    S
508)    A    T    V    C    G    P    K    L    S    T
509)    T    V    C    G    P    K    L    S    T    D
510)    V    C    G    P    K    L    S    T    D    L
511)    C    G    P    K    L    S    T    D    L    I
512)    G    P    K    L    S    T    D    L    I    K
513)    P    K    L    S    T    D    L    I    K    N
514)    K    L    S    T    D    L    I    K    N    Q
515)    L    S    T    D    L    I    K    N    Q    C
516)    S    T    D    L    I    K    N    Q    C    V
517)    T    D    L    I    K    N    Q    C    V    N
518)    D    L    I    K    N    Q    C    V    N    F
519)    L    I    K    N    Q    C    V    N    F    N
520)    I    K    N    Q    C    V    N    F    N    F
521)    K    N    Q    C    V    N    F    N    F    N
522)    N    Q    C    V    N    F    N    F    N    G
523)    Q    C    V    N    F    N    F    N    G    L
524)    C    V    N    F    N    F    N    G    L    T
525)    V    N    F    N    F    N    G    L    T    G
526)    N    F    N    F    N    G    L    T    G    T
527)    F    N    F    N    G    L    T    G    T    G
528)    N    F    N    G    L    T    G    T    G    V
529)    F    N    G    L    T    G    T    G    V    L
530)    N    G    L    T    G    T    G    V    L    T
531)    G    L    T    G    T    G    V    L    T    P
532)    L    T    G    T    G    V    L    T    P    S
533)    T    G    T    G    V    L    T    P    S    S
534)    G    T    G    V    L    T    P    S    S    K
535)    T    G    V    L    T    P    S    S    K    R
536)    G    V    L    T    P    S    S    K    R    F
537)    V    L    T    P    S    S    K    R    F    Q
538)    L    T    P    S    S    K    R    F    Q    P
539)    T    P    S    S    K    R    F    Q    P    F
540)    P    S    S    K    R    F    Q    P    F    Q
541)    S    S    K    R    F    Q    P    F    Q    Q
542)    S    K    R    F    Q    P    F    Q    Q    F
543)    K    R    F    Q    P    F    Q    Q    F    G
544)    R    F    Q    P    F    Q    Q    F    G    R
545)    F    Q    P    F    Q    Q    F    G    R    D
546)    Q    P    F    Q    Q    F    G    R    D    V
547)    P    F    Q    Q    F    G    R    D    V    S
548)    F    Q    Q    F    G    R    D    V    S    D
549)    Q    Q    F    G    R    D    V    S    D    F
550)    Q    F    G    R    D    V    S    D    F    T
551)    F    G    R    D    V    S    D    F    T    D
552)    G    R    D    V    S    D    F    T    D    S
553)    R    D    V    S    D    F    T    D    S    V
554)    D    V    S    D    F    T    D    S    V    R
555)    V    S    D    F    T    D    S    V    R    D
556)    S    D    F    T    D    S    V    R    D    P
557)    D    F    T    D    S    V    R    D    P    K
558)    F    T    D    S    V    R    D    P    K    T
559)    T    D    S    V    R    D    P    K    T    S
560)    D    S    V    R    D    P    K    T    S    E
561)    S    V    R    D    P    K    T    S    E    I
562)    V    R    D    P    K    T    S    E    I    L
563)    R    D    P    K    T    S    E    I    L    D
564)    D    P    K    T    S    E    I    L    D    I
565)    P    K    T    S    E    I    L    D    I    S
566)    K    T    S    E    I    L    D    I    S    P
567)    T    S    E    I    L    D    I    S    P    C
568)    S    E    I    L    D    I    S    P    C    S
569)    E    I    L    D    I    S    P    C    S    F
570)    I    L    D    I    S    P    C    S    F    G
571)    L    D    I    S    P    C    S    F    G    G
572)    D    I    S    P    C    S    F    G    G    V
573)    I    S    P    C    S    F    G    G    V    S
574)    S    P    C    S    F    G    G    V    S    V
575)    P    C    S    F    G    G    V    S    V    I
576)    C    S    F    G    G    V    S    V    I    T
577)    S    F    G    G    V    S    V    I    T    P
578)    F    G    G    V    S    V    I    T    P    G
579)    G    G    V    S    V    I    T    P    G    T
580)    G    V    S    V    I    T    P    G    T    N
581)    V    S    V    I    T    P    G    T    N    A
582)    S    V    I    T    P    G    T    N    A    S
583)    V    I    T    P    G    T    N    A    S    S
584)    I    T    P    G    T    N    A    S    S    E
585)    T    P    G    T    N    A    S    S    E    V
586)    P    G    T    N    A    S    S    E    V    A
587)    G    T    N    A    S    S    E    V    A    V
588)    T    N    A    S    S    E    V    A    V    L
589)    N    A    S    S    E    V    A    V    L    Y
590)    A    S    S    E    V    A    V    L    Y    Q
591)    S    S    E    V    A    V    L    Y    Q    D
592)    S    E    V    A    V    L    Y    Q    D    V
593)    E    V    A    V    L    Y    Q    D    V    N
594)    V    A    V    L    Y    Q    D    V    N    C
595)    A    V    L    Y    Q    D    V    N    C    T
596)    V    L    Y    Q    D    V    N    C    T    D
597)    L    Y    Q    D    V    N    C    T    D    V
598)    Y    Q    D    V    N    C    T    D    V    S
599)    Q    D    V    N    C    T    D    V    S    T
600)    D    V    N    C    T    D    V    S    T    A
Spike(S)蛋白从1至600个氨基酸序列中每相邻的10个氨基酸序列的合成操作步骤如下:
A.多肽脱Fmoc保护/氨基酸残基的连接步骤:
1.均分树脂:采用IRORI均分树脂装置,在每一个Microkan中(共600个)加入15mg Rink Amide树脂;
2.均分IRORI射频子:采用IRORI均分射频子装置,在每一个Microkan中加入一个射频子,并用IRORI加盖器加盖;
3.脱Fmoc保护:集中所有待反应的Microkan,置于一个2L锥形瓶中,加入20%哌啶/DMF振摇,15min×2次;
4.洗涤树脂:DMF 3min×6,DCM 3min×3,晾干;
5.IRORI射频子编码(或解码):采用IRORI Sorting程序及相应配件编码。按照多肽化学库的序列对射频子编码(或解码),每一特定编码代表一个特定序列,并以此将Microkan分配至不同氨基酸反应瓶中;
6.洗涤树脂:用重蒸DMF润洗待反应的树脂;
7.Fmoc-保护氨基酸的连接:准确称取计算量的Fmoc保护氨基酸、HOBt、HBTU(或DIC或BOP),并用重蒸DMF溶解。将Microkan加入特定氨基酸反应瓶中,振摇反应3h;
8.茚三酮检测:取事先设定好的对照组序列,用茚三酮法检测反应情况。如果呈阴性反应,表明反应完全,进行步骤9的操作;如果呈阳性反应,表明反应不完全,需继续反应;如果延长时间或改用缩合能力更强的缩合剂后,仍不能完全反应,则采用步骤11的方法封闭后,进行步骤9的操作;
9.洗涤树脂:DMF 3min×3,DCM 3min×1;
10.脱Fmoc保护/连接:根据序列要求,重复步骤3-9的操作,直至反应结束;
11.封闭:采用乙酰化多肽的氨基端,15%Ac2O/CH2Cl2,30min;
12.洗涤树脂:DCM 3min×2,晾干。
B.多肽裂解步骤:
1.配制裂解液:根据序列特点,从选取并配制适当的裂解液;
2.裂解:每一个Microkan使用1mL裂解液在室温下裂解2h;
3.洗涤:再用1mL裂解液浸泡洗涤Microkan 5min;
4.晾干或离心干燥:合并两次裂解液,离心浓缩至少量;
5.沉淀:将事先用冰水浴充分冷却的甲基叔丁基醚/石油醚(v/v:3/1)加入到残余物中,放入冰水浴中冷却20min使析晶完全;
6.离心:离心沉淀多肽化合物,10min后取出,小心倾去上清夜;
7.洗涤多肽:加入冷却的甲基叔丁基醚/石油醚,充分洗涤后,离心,倾去上清夜;
8.重复步骤7的操作一次;
9.晾干:将多肽残余物在室温下挥干,直至完全干燥;
10.检测:抽检部分多肽样品,用10%HOAc/H2O或30%CH3CN/H2O或60%CH3CN/H2O溶解,并用HPLC-MS检测纯度。
C.以下表3-表12为第1步至第10步的投料:
D.从肽库中随机抽取的多肽化合物的纯度以及正确的分子量见表13:
表3合成1~600号“交叉重叠”多肽第一步投料计算结果:
     S-1-步骤-1       FW       总数    N(mmol)    AA-m(mg)    HBTU(mg)    HOBt(mg)    DIPEA(mmol)   DIPEA(uL)
A    Fmoc-Ala         311.3    30      1.08       336.2       401.4       165.4       2.16          370
C    Fmoc-Cys(Trt)    585.7    17      0.612      358.4       227.5       93.7        1.22          210
D    Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    42      1.512      622.2       562.0       231.5       3.02          518
E    Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    15      0.54       229.8       200.7       82.7        1.08          185
F    Fmoc-Phe         387.4    49      1.764      683.4       655.6       270.1       3.53          604
G    Fmoc-Gly         297.3    37      1.332      396.0       495.1       204.0       2.66          456
H    Fmoc-His(Trt)    619.7    6       0.216      133.9       80.3        33.1        0.43          74
I    Fmoc-Ile         353.4    29      1.044      368.9       388.0       159.9       2.09          357
K    Fmoc-Lys(Boc)    468.5    30      1.08       506.0       401.4       165.4       2.16          370
L    Fmoc-Leu         353.4    38      1.368      483.5       508.4       209.5       2.74          468
M    Fmoc-Met         371.5    6       0.216      80.2        80.3        33.1        0.43          74
N    Fmoc-Asn(Trt)    596.7    44      1.584      945.2       588.7       242.6       3.17          542
P    Fmoc-Pro         337.4    35      1.26       425.1       468.3       192.9       2.52          431
Q    Fmoc-Gln(Trt)    610.7    17      0.612      373.7       227.5       93.7        1.22          210
R    Fmoc-Arg(Pmc)    662.8    21      0.756      501.1       281.0       115.8       1.51          259
S    Fmoc-Ser(tBu)    383.4    48      1.728      662.5       642.2       264.6       3.46          592
T    Fmoc-Thr(tBu)    397.5    51      1.836      729.8       682.4       281.1       3.67          629
V    Fmoc-Val         339.4    49      1.764      598.7       655.6       270.1       3.53          604
W    Fmoc-Trp         426.5    5       0.18       76.8        66.9        27.6        0.36          62
Y    Fmoc-Tyr(tBu)    459.6    31      1.116      512.9       414.8       170.9       2.23          382
表4合成1~600号“交叉重叠”多肽第二步使用试剂投料计算结果:
   S-1-步骤-2       FW       个数    控制组    总数    N(mmol)    AA-m(mg)     DIC(mg)     DIC(uL)    HOBt(mg)
A  Fmoc-Ala         311.3    29      1         30      1.08       336.2        136.3       168        165.4
C  Fmoc-Cys(Trt)    585.7    17      0         17      0.61 2     358.4        77.2        95         93.7
D  Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    42      0         42      1.512      622.2        190.8       236        231.5
E  Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    15      1         16      0.576      245.1        72.7        90         88.2
F  Fmoc-Phe         387.4    49      0         49      1.764      683.4        222.6       275        270.1
G  Fmoc-Gly         297.3    37      2         39      1.404      417.4        177.2       219        215.0
H  Fmoc-His(Trt)    619.7    6       0         6       0.216      133.9        27.3        34         33.1
I  Fmoc-Ile         353.4    29      0         29      1.044      368.9        131.8       163        159.9
K  Fmoc-Lys(Boc)    468.5    30      1         31      1.116      522.8        140.8       174        170.9
L  Fmoc-Leu         353.4    38      1         39      1.404      496.2        177.2       219        215.0
M  Fmoc-Met         371.5    6       0         6       0.216      80.2         27.3        34         33.1
N  Fmoc-Asn(Trt)    596.7    44      1         45      1.62       966.7        204.4       252        248.1
P  Fmoc-Pro         337.4    35      0         35      1.26       425.1        159.0       196        192.9
Q  Fmoc-Gln(Trt)    610.7    17      0         17      0.612      373.7        77.2        95         93.7
R  Fmoc-Arg(Pmc)    662.8    21      0         21      0.756      501.1        95.4        118        115.8
S  Fmoc-Ser(tBu)    383.4    48      1         49      1.764      676.3        222.6       275        270.1
T  Fmoc-Thr(tBu)    397.5    52      1         53      1.908      758.4        240.8       297        292.2
V  Fmoc-Val         339.4    49      1         50      1.8        610.9        227.2       280        275.6
W  Fmoc-Trp         426.5    5       0         5       0.18       76.8         22.7        28         27.6
Y  Fmoc-Tyr(tBu)    459.6    31      1         32      1.152      529.5        145.4       179        176.4
表5合成1~600号“交叉重叠”多肽第三步投料计算结果:
   S-1-步骤3        FW       个数   控制组   总数    N(mmo1)    AA-m(mg)     DIC(mg)    DIC(uL)    HOBt(mg)
A  Fmoc-Ala         311.3    29     0        29      1.044      325.0        131.8      163        159.9
C  Fmoc-Cys(Trt)    585.7    17     1        18      0.648      379.5        81.8       101        99.2
D  Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    42     0        42      1.512      622.2        190.8      236        231.5
E  Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    15     0        15      0.54       229.8        68.1       84         82.7
F  Fmoc-Phe         387.4    49     2        51      1.836      711.3        231.7      286        281.1
G  Fmoc-Gly         297.3    37     1        38      1.368      406.7        172.6      213        209.5
H  Fmoc-His(Trt)    619.7    6      0        6       0.216      133.9        27.3       34         33.1
I  Fmoc-Ile         353.4    29     2        31      1.116      394.4        140.8      174        170.9
K  Fmoc-Lys(Boc)    468.5    30     0        30      1.08       506.0        136.3      168        165.4
L  Fmoc-Leu         353.4    39     1        40      1.44       508.9        181.7      224        220.5
M  Fmoc-Met         371.5    6      0        6       0.216      80.2         27.3       34         33.1
N  Fmoc-Asn(Trt)    596.7    44     0        44      1.584      945.2        199.9      247        242.6
P  Fmoc-Pro         337.4    35     1        36      1.296      437.3        163.6      202        198.5
Q  Fmoc-Gln(Trt)    610.7    17     0        17      0.612      373.7        77.2       95         93.7
R  Fmoc-Arg(Pmc)    662.8    21     0        21      0.756      501.1        95.4       118        115.8
S  Fmoc-Ser(tBu)    383.4    48     2        50      1.8        690.1        227.2      280        275.6
T  Fmoc-Thr(tBu)    397.5    51     1        52      1.872      744.1        236.2      292        286.7
V  Fmoc-Val         339.4    49     0        49      1.764      598.7        222.6      275        270.1
W  Fmoc-Trp         426.5    5      0        5       0.18       76.8         22.7       28         27.6
Y  Fmoc-Tyr(tBu)    459.6    31     0        31      1.116      512.9        140.8      174        170.9
表6合成1~600号“交叉重叠”多肽第四步投料计算结果:
   S-1-步骤-4      FW       个数      控制组   总数    N(mmol)      AA-m(mg)     DIC(mg)    DIC(uL)    HOBt(mg)
A  Fmoc-Ala        311.3    29        0        29      1.044        325.0        131.8      163        159.9
C  Fmoc-Cys(Trt)   585.7    17        0        17      0.612        358.4        77.2       95         93.7
D  Fmoc-Asp(OtBu)  411.5    42        0        42      1.512        622.2        190.8      236        231.5
E  Fmoc-Glu(OtBu)  425.5    15        0        15      0.54         229.8        68.1       84         82.7
F  Fmoc-Phe        387.4    50        0        50      1.8          697.3        227.2      280        275.6
G  Fmoc-Gly        297.3    37        0        37      1.332        396.0        168.1      208        204.0
H  Fmoc-His(Trt)   619.7    6         0        6       0.216        133.9        27.3       34         33.1
I  Fmoc-Ile        353.4    29        1        30      1.08         381.7        136.3      168        165.4
K  Fmoc-Lys(Boc)   468.5    30        0        30      1.08         506.0        136.3      168        165.4
L  Fmoc-Leu        353.4    39        2        41      1.476        521.6        186.3      230        226.0
M  Fmoc-Met        371.5    6         0        6       0.216        80.2         27.3       34         33.1
N  Fmoc-Asn(Trt)   596.7    44        1        45      1.62         966.7        204.4      252        248.1
P  Fmoc-Pro        337.4    35        2        37      1.332        449.4        168.1      208        204.0
Q  Fmoc-Gln(Trt)   610.7    17        0        17      0.612        373.7        77.2       95         93.7
R  Fmoc-Arg(Pmc)   662.8    21        0        21      0.756        501.1        95.4       118        115.8
S  Fmoc-Ser(tBu)   383.4    47        1        48      1.728        662.5        218.1      269        264.6
T  Fmoc-Thr(tBu)   397.5    51        0        51      1.836        729.8        231.7      286        281.1
V  Fmoc-Val        339.4    49        3        52      1.872        635.4        236.2      292        286.7
W  Fmoc-Trp        426.5    5         0        5       0.18         76.8         22.7       28         27.6
Y  Fmoc-Tyr(tBu)   459.6    31        1        32      1.152        529.5        145.4      179        176.4
表7合成1~600号“交叉重叠”多肽第五步投料计算结果:
   S-1-步骤-5       FW       个数    控制组   总数    N(mmo1)    AA-m(mg)    DIC(mg)    DIC(uL)    HOBt(mg)
A  Fmoc-Ala         311.3    29      1        30      1.08       336.2       136.3      168        165.4
C  Fmoc-Cys(Trt)    585.7    17      1        18      0.648      379.5       81.8       101        99.2
D  Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    42      2        44      1.584      651.8       199.9      247        242.6
E  Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    15      0        15      0.54       229.8       68.1       84         82.7
F  Fmoc-Phe         387.4    50      3        53      1.908      739.2       240.8      297        292.2
G  Fmoc-Gly         297.3    37      0        37      1.332      396.0       168.1      208        204.0
H  Fmoc-His(Trt)    619.7    6       0        6       0.216      133.9       27.3       34         33.1
I  Fmoc-Ile         353.4    29      1        30      1.08       381.7       136.3      168        165.4
K  Fmoc-Lys(Boc)    468.5    30      0        30      1.08       506.0       136.3      168        165.4
L  Fmoc-Leu         353.4    40      1        41      1.476      521.6       186.3      230        226.0
M  Fmoc-Met         371.5    6       0        6       0.216      80.2        27.3       34         33.1
N  Fmoc-Asn(Trt)    596.7    44      0        44      1.584      945.2       199.9      247        242.6
P  Fmoc-Pro         337.4    35      0        35      1.26       425.1       159.0      196        192.9
Q  Fmoc-Gln(Trt)    610.7    17      0        17      0.612      373.7       77.2       95         93.7
R  Fmoc-Arg(Pmc)    662.8    21      0        21      0.756      501.1       95.4       118        115.8
S  Fmoc-Ser(tBu)    383.4    47      0        47      1.692      648.7       213.5      264        259.1
T  Fmoc-Thr(tBu)    397.5    51      2        53      1.908      758.4       240.8      297        292.2
V  Fmoc-Val         339.4    48      0        48      1.728      586.5       218.1      269        264.6
W  Fmoc-Trp         426.5    5       0        5       0.18       76.8        22.7       28         27.6
Y  Fmoc-Tyr(tBu)    459.6    31      0        31      1.116      512.9       140.8      174        170.9
表8合成1~600号“交叉重叠”多肽第六步投料计算结果:
   S-1-步骤-6       FW       个数      控制组   总数    N(mmol)    AA-m(mg)     DIC(mg)    DIC(uL)    HOBt(mg)
A  Fmoc-Ala         311.3    29        4        33      1.188      369.8        149.9      185        181.9
C  Fmoc-Cys(Trt)    585.7    17        0        17      0.612      358.4        77.2       95         93.7
D  Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    41        0        41      1.476      607.4        186.3      230        226.0
E  Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    15        0        15      0.54       229.8        68.1       84         82.7
F  Fmoc-Phe         387.4    50        0        50      1.8        697.3        227.2      280        275.6
G  Fmoc-Gly         297.3    37        0        37      1.332      396.0        168.1      208        204.0
H  Fmoc-His(Trt)    619.7    6         0        6       0.216      133.9        27.3       34         33.1
I  Fmoc-Ile         353.4    29        0        29      1.044      368.9        131.8      163        159.9
K  Fmoc-Lys(Boc)    468.5    30        1        31      1.116      522.8        140.8      174        170.9
L  Fmoc-Leu         353.4    41        2        43      1.548      547.1        195.4      241        237.0
M  Fmoc-Met         371.5    6         0        6       0.216      80.2         27.3       34         33.1
N  Fmoc-Asn(Trt)    596.7    44        0        44      1.584      945.2        199.9      247        242.6
P  Fmoc-Pro         337.4    35        0        35      1.26       425.1        159.0      196        192.9
Q  Fmoc-Gln(Trt)    610.7    17        0        17      0.612      373.7        77.2       95         93.7
R  Fmoc-Arg(Pmc)    662.8    21        0        21      0.756      501.1        95.4       118        115.8
S  Fmoc-Ser(tBu)    383.4    47        0        47      1.692      648.7        213.5      264        259.1
T  Fmoc-Thr(tBu)    397.5    51        2        53      1.908      758.4        240.8      297        292.2
V  Fmoc-Val         339.4    48        1        49      1.764      598.7        222.6      275        270.1
W  Fmoc-Tm          426.5    5         0        5       0.18       76.8         22.7       28         27.6
Y  Fmoc-Tyr(tBu)    459.6    31        1        32      1.152      529.5        145.4      179        176.4
表9合成1~600号“交叉重叠”多肽第七步投料计算结果:
   S-1-步骤-7        FW       个数  控制组   总数    N(mmol)    AA-m(mg)    DIC(mg)    DIC(uL)    HOBt(mg)
A  Fmoc-Ala          311.3    29    2        31      1.116      347.4       140.8      174        170.9
C  Fmoc-Cys(Trt)     585.7    17    1        18      0.648      379.5       81.8       101        99.2
D  Fmoc-Asp(OtBu)    411.5    41    0        41      1.476      607.4       186.3      230        226.0
E  Fmoc-Glu(OtBu)    425.5    15    0        15      0.54       229.8       68.1       84         82.7
F  Fmoc-Phe          387.4    51    1        52      1.872      725.2       236.2      292        286.7
G  Fmoc-Gly          297.3    37    0        37      1.332      396.0       168.1      208        204.0
H  Fmoc-His(Trt)     619.7    6     0        6       0.216      133.9       27.3       34         33.1
I  Fmoc-Ile          353.4    29    0        29      1.044      368.9       131.8      163        159.9
K  Fmoc-Lys(Boc)     468.5    30    0        30      1.08       506.0       136.3      168        165.4
L  Fmoc-Leu          353.4    41    1        42      1.512      534.3       190.8      236        231.5
M  Fmoc-Met          371.5    6     0        6       0.216      80.2        27.3       34         33.1
N  Fmoc-Asn(Trt)     596.7    44    0        44      1.584      945.2       199.9      247        242.6
P  Fmoc-Pro          337.4    35    1        36      1.296      437.3       163.6      202        198.5
Q  Fmoc-Gln(Trt)     610.7    17    0        17      0.612      373.7       77.2       95         93.7
R  Fmoc-Arg(Pmc)     662.8    21    1        22      0.792      524.9       100.0      123        121.3
S  Fmoc-Ser(tBu)     383.4    47    2        49      1.764      676.3       222.6      275        270.1
T  Fmoc-Thr(tBu)     397.5    50    1        51      1.836      729.8       231.7      286        281.1
V  Fmoc-Val          339.4    48    1        49      1.764      598.7       222.6      275        270.1
W  Fmoc-Trp          426.5    5     0        5       0.18       76.8        22.7       28         27.6
Y  Fmoc-Tyr(tBu)     459.6    31    0        31      1.116      512.9       140.8      174        170.9
表10合成1~600号“交叉重叠”多肽第八步投料计算结果:
   S-1-步骤-8       FW       个数  控制组   总数    N(mmol)  AA-m(mg)     DIC(mg)   DIC(uL)    HOBt(mg)
A  Fmoc-Ala         311.3    29    2        31      1.116    347.4        140.8     174        170.9
C  Fmoc-Cys(Trt)    585.7    16    0        16      0.576    337.4        72.7      90         88.2
D  Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    41    0        41      1.476    607.4        186.3     230        226.0
E  Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    15    0        15      0.54     229.8        68.1      84         82.7
F  Fmoc-Phe         387.4    51    1        52      1.872    725.2        236.2     292        286.7
G  Fmoc-Gly         297.3    37    1        38      1.368    406.7        172.6     213        209.5
H  Fmoc-His(Trt)    619.7    6     0        6       0.216    133.9        27.3      34         33.1
I  Fmoc-Ile         353.4    30    2        32      1.152    407.1        145.4     179        176.4
K  Fmoc-Lys(Boc)    468.5    30    0        30      1.08     506.0        136.3     168        165.4
L  Fmoc-Leu         353.4    41    2        43      1.548    547.1        195.4     241        237.0
M  Fmoc-Met         371.5    6     0        6       0.216    80.2         27.3      34         33.1
N  Fmoc-Asn(Trt)    596.7    44    1        45      1.62     966.7        204.4     252        248.1
P  Fmoc-Pro         337.4    35    0        35      1.26     425.1        159.0     196        192.9
Q  Fmoc-Gln(Trt)    610.7    17    1        18      0.648    395.7        81.8      101        99.2
R  Fmoc-Arg(Pmc)    662.8    21    0        21      0.756    501.1        95.4      118        115.8
S  Fmoc-Ser(tBu)    383.4    47    1        48      1.728    662.5        218.1     269        264.6
T  Fmoc-Thr(tBu)    397.5    50    0        50      1.8      715.5        227.2     280        275.6
V  Fmoc-Val         339.4    48    0        48      1.728    586.5        218.1     269        264.6
W  Fmoc-Trp         426.5    5     0        5       0.18     76.8         22.7      28         27.6
Y  Fmoc-Tyr(tBu)    459.6    31    0        31      1.116    512.9        140.8     174        170.9
表11合成1~600号“交叉重叠”多肽第九步投料计算结果:
   S-1-步骤-9       FW       个数  控制组   总数  N(mmol)    AA-m(mg)   HOBt(mg)    BOP(mg)    DIPEA(mg)
A  Fmoc-Ala         311.3    29    1        30    1.8        560.3      275.6       780.2      465.3
C  Fmoc-Cys(Trt)    585.7    16    0        16    0.96       562.3      147.0       416.1      248.1
D  Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    41    0        41    2.46       1012.3     376.7       1066.3     635.9
E  Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    15    0        15    0.9        383.0      137.8       390.1      232.6
F  Fmoc-Phe         387.4    52    0        52    3.12       1208.7     477.8       1352.4     806.5
G  Fmoc-Gly         297.3    37    0        37    2.22       660.0      339.9       962.3      573.8
H  Fmoc-His(Trt)    619.7    6     0        6     0.36       223.1      55.1        156.0      93.1
I  Fmoc-Ile         353.4    30    2        32    1.92       678.5      294.0       832.2      496.3
K  Fmoc-Lys(Boc)    468.5    30    1        31    1.86       871.4      284.8       806.2      480.8
L  Fmoc-Leu         353.4    41    0        41    2.46       869.4      376.7       1066.3     635.9
M  Fmoc-Met         371.5    6     0        6     0.36       133.7      55.1        156.0      93.1
N  Fmoc-Asn(Trt)    596.7    43    1        44    2.64       1575.3     404.3       1144.3     682.4
P  Fmoc-Pro         337.4    35    1        36    2.16       728.8      330.8       936.3      558.3
Q  Fmoc-Gln(Trt)    610.7    17    0        17    1.02       622.9      156.2       442.1      263.6
R  Fmoc-Arg(Pmc)    662.8    21    0        21    1.26       835.1      192.9       546.2      325.7
S  Fmoc-Ser(tBu)    383.4    47    1        48    2.88       1104.2     441.0       1248.3     744.4
T  Fmoc-Thr(tBu)    397.5    50    2        52    3.12       1240.2     477.8       1352.4     806.5
V  Fmoc-Val         339.4    48    2        50    3          1018.2     459.4       1300.4     775.4
W  Fmoc-Trp         426.5    5     0        5     0.3        128.0      45.9        130.0      77.5
Y  Fmoc-Tyr(tBu)    459.6    31    0        31    1.86       854.9      284.8       806.2      480.8
表12合成1~600号“交叉重叠”多肽第十步投料计算结果:
   S-1-步骤-10      FW       个数   控制组   总数  N(mmol)    AA-m(mg)     HOBt(mg)    BOP(mg)   DIEA(mg)
A  Fmoc-Ala         311.3    29     1        30    1.8        560.3        275.6       780.2     465.3
C  Fmoc-Cys(Trt)    585.7    16     0        16    0.96       562.3        147.0       416.1     248.1
D  Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    41     1        42    2.52       1037.0       385.9       1092.3    651.4
E  Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    15     0        15    0.9        383.0        137.8       390.1     232.6
F  Fmoc-Phe         387.4    52     1        53    3.18       1231.9       487.0       1378.4    822.0
G  Fmoc-Gly         297.3    37     2        39    2.34       695.7        358.3       1014.3    604.8
H  Fmoc-His(Trt)    619.7    6      0        6     0.36       223.1        55.1        156.0     93.1
I  Fmoc-Ile         353.4    30     0        30    1.8        636.1        275.6       780.2     465.3
K  Fmoc-Lys(Boc)    468.5    30     2        32    1.92       899.5        294.0       832.2     496.3
L  Fmoc-Leu         353.4    41     1        42    2.52       890.6        385.9       1092.3    651.4
M  Fmoc-Met         371.5    7      0        7     0.42       156.0        64.3        182.1     108.6
N  Fmoc-Asn(Trt)    596.7    43     0        43    2.58       1539.5       395.1       1118.3    666.9
P  Fmoc-Pro         337.4    35     1        36    2.16       728.8        330.8       936.3     558.3
Q  Fmoc-Gln(Trt)    610.7    17     0        17    1.02       622.9        156.2       442.1     263.6
R  Fmoc-Arg(Pmc)    662.8    21     0        21    1.26       835.1        192.9       546.2     325.7
S  Fmoc-Ser(tBu)    383.4    47     1        48    2.88       1104.2       441.0       1248.3    744.4
T  Fmoc-Thr(tBu)    397.5    50     0        50    3          1192.5       459.4       1300.4    775.4
V  Fmoc-Val         339.4    47     1        48    2.88       977.5        441.0       1248.3    744.4
W  Fmoc-Trp         426.5    5      0        5     0.3        128.0        45.9        130.0     77.5
Y Fmoc-Tyr(tBu)     459.6    31     0        31    1.86       854.9        284.8       806.2     480.8
   表13:合成肽库中随机抽取的多肽化合物的纯度以及正确的分子量    No.  氨基酸序列  HPLC纯度  (%)                       MS    Calc.    Found    1  TTFDDVQAPN  65.7    1147    1148.5    2  KLPLGINITN  80.8    1122    1123.7    3  FLYVYKGYQP  76.6    1317    1318.7    4  AAYFVGYLKP  83.9    1168    1169.6    5  VYADSFVVKG  78.8    1124    1125.5    6  FGGVSVITPG  65.0    973    974.3    7  IDATSTGNYN  82.4    1095    1096.3
实施例2
设计合成Spike(S)蛋白601至1246位氨基酸的每10位序列的“交叉重叠”序列如下。从右至左为合成次序,代表合成步骤号码为阿拉伯数字1到10。
表14 Spike(S)蛋白中所合成的646个以10个氨基酸为长度的序列
编号    10   9    8    7    6    5    4    3    2    1
601)    V    N    C    T    D    V    S    T    A    I
602)    N    C    T    D    V    S    T    A    I    H
603)    C    T    D    V    S    T    A    I    H    A
604)    T    D    V    S    T    A    I    H    A    D
605)    D    V    S    T    A    I    H    A    D    Q
606)    V    S    T    A    I    H    A    D    Q    L
607)    S    T    A    I    H    A    D    Q    L    T
608)    T    A    I    H    A    D    Q    L    T    P
609)    A    I    H    A    D    Q    L    T    P    A
610)    I    H    A    D    Q    L    T    P    A    W
611)    H    A    D    Q    L    T    P    A    W    R
612)    A    D    Q    L    T    P    A    W    R    I
613)    D    Q    L    T    P    A    W    R    I    Y
614)    Q    L    T    P    A    W    R    I    Y    S
615)    L    T    P    A    W    R    I    Y    S    T
616)    T    P    A    W    R    I    Y    S    T    G
617)    P    A    W    R    I    Y    S    T    G    N
618)    A    W    R    I    Y    S    T    G    N    N
619)    W    R    I    Y    S    T    G    N    N    V
620)    R    I    Y    S    T    G    N    N    V    F
621)    I    Y    S    T    G    N    N    V    F    Q
622)    Y    S    T    G    N    N    V    F    Q    T
623)    S    T    G    N    N    V    F    Q    T    Q
624)    T    G    N    N    V    F    Q    T    Q    A
625)    G    N    N    V    F    Q    T    Q    A    G
626)    N    N    V    F    Q    T    Q    A    G    C
627)    N    V    F    Q    T    Q    A    G    C    L
628)    V    F    Q    T    Q    A    G    C    L    I
629)    F    Q    T    Q    A    G    C    L    I    G
630)    Q    T    Q    A    G    C    L    I    G    A
631)    T    Q    A    G    C    L    I    G    A    E
632)    Q    A    G    C    L    I    G    A    E    H
633)    A    G    C    L    I    G    A    E    H    V
634)    G    C    L    I    G    A    E    H    V    D
635)    C    L    I    G    A    E    H    V    D    T
636)    L    I    G    A    E    H    V    D    T    S
637)    I    G    A    E    H    V    D    T    S    Y
638)    G    A    E    H    V    D    T    S    Y    E
639)    A    E    H    V    D    T    S    Y    E    C
640)    E    H    V    D    T    S    Y    E    C    D
641)    H    V    D    T    S    Y    E    C    D    I
642)    V    D    T    S    Y    E    C    D    I    P
643)    D    T    S    Y    E    C    D    I    P    I
644)    T    S    Y    E    C    D    I    P    I    G
645)    S    Y    E    C    D    I    P    I    G    A
646)    Y    E    C    D    I    P    I    G    A    G
647)    E    C    D    I    P    I    G    A    G    I
648)    C    D    I    P    I    G    A    G    I    C
649)    D    I    P    I    G    A    G    I    C    A
650)    I    P    I    G    A    G    I    C    A    S
651)    P    I    G    A    G    I    C    A    S    Y
652)    I    G    A    G    I    C    A    S    Y    H
653)    G    A    G    I    C    A    S    Y    H    T
654)    A    G    I    C    A    S    Y    H    T    V
655)    G    I    C    A    S    Y    H    T    V    S
656)    I    C    A    S    Y    H    T    V    S    L
657)    C    A    S    Y    H    T    V    S    L    L
658)    A    S    Y    H    T    V    S    L    L    R
659)    S    Y    H    T    V    S    L    L    R    S
660)    Y    H    T    V    S    L    L    R    S    T
661)    H    T    V    S    L    L    R    S    T    S
662)    T    V    S    L    L    R    S    T    S    Q
663)    V    S    L    L    R    S    T    S    Q    K
664)    S    L    L    R    S    T    S    Q    K    S
665)    L    L    R    S    T    S    Q    K    S    I
666)    L    R    S    T    S    Q    K    S    I    V
667)    R    S    T    S    Q    K    S    I    V    A
668)    S    T    S    Q    K    S    I    V    A    Y
669)    T    S    Q    K    S    I    V    A    Y    T
670)    S    Q    K    S    I    V    A    Y    T    M
671)    Q    K    S    I    V    A    Y    T    M    S
672)    K    S    I    V    A    Y    T    M    S    L
673)    S    I    V    A    Y    T    M    S    L    G
674)    I    V    A    Y    T    M    S    L    G    A
675)    V    A    Y    T    M    S    L    G    A    D
676)    A    Y    T    M    S    L    G    A    D    S
677)    Y    T    M    S    L    G    A    D    S    S
678)    T    M    S    L    G    A    D    S    S    I
679)    M    S    L    G    A    D    S    S    I    A
680)    S    L    G    A    D    S    S    I    A    Y
681)    L    G    A    D    S    S    I    A    Y    S
682)    G    A    D    S    S    I    A    Y    S    N
683)    A    D    S    S    I    A    Y    S    N    N
684)    D    S    S    I    A    Y    S    N    N    T
685)    S    S    I    A    Y    S    N    N    T    I
686)    S    I    A    Y    S    N    N    T    I    A
687)    I    A    Y    S    N    N    T    I    A    I
688)    A    Y    S    N    N    T    I    A    I    P
689)    Y    S    N    N    T    I    A    I    P    T
690)    S    N    N    T    I    A    I    P    T    N
691)    N    N    T    I    A    I    P    T    N    F
692)    N    T    I    A    I    P    T    N    F    S
693)    T    I    A    I    P    T    N    F    S    I
694)    I    A    I    P    T    N    F    S    I    S
695)    A    I    P    T    N    F    S    I    S    I
696)    I    P    T    N    F    S    I    S    I    T
697)    P    T    N    F    S    I    S    I    T    T
698)    T    N    F    S    I    S    I    T    T    E
699)    N    F    S    I    S    I    T    T    E    V
700)    F    S    I    S    I    T    T    E    V    M
701)    S    I    S    I    T    T    E    V    M    P
702)    I    S    I    T    T    E    V    M    P    V
703)    S    I    T    T    E    V    M    P    V    S
704)    I    T    T    E    V    M    P    V    S    M
705)    T    T    E    V    M    P    V    S    M    A
706)    T    E    V    M    P    V    S    M    A    K
707)    E    V    M    P    V    S    M    A    K    T
708)    V    M    P    V    S    M    A    K    T    S
709)    M    P    V    S    M    A    K    T    S    V
710)    P    V    S    M    A    K    T    S    V    D
711)    V    S    M    A    K    T    S    V    D    C
712)    S    M    A    K    T    S    V    D    C    N
713)    M    A    K    T    S    V    D    C    N    M
714)    A    K    T    S    V    D    C    N    M    Y
715)    K    T    S    V    D    C    N    M    Y    I
716)    T    S    V    D    C    N    M    Y    I    C
717)    S    V    D    C    N    M    Y    I    C    G
718)    V    D    C    N    M    Y    I    C    G    D
719)    D    C    N    M    Y    I    C    G    D    S
720)    C    N    M    Y    I    C    G    D    S    T
721)    N    M    Y    I    C    G    D    S    T    E
722)    M    Y    I    C    G    D    S    T    E    C
723)    Y    I    C    G    D    S    T    E    C    A
724)    I    C    G    D    S    T    E    C    A    N
725)    C    G    D    S    T    E    C    A    N    L
726)    G    D    S    T    E    C    A    N    L    L
727)    D    S    T    E    C    A    N    L    L    L
728)    S    T    E    C    A    N    L    L    L    Q
729)    T    E    C    A    N    L    L    L    Q    Y
730)    E    C    A    N    L    L    L    Q    Y    G
731)    C    A    N    L    L    L    Q    Y    G    S
732)    A    N    L    L    L    Q    Y    G    S    F
733)    N    L    L    L    Q    Y    G    S    F    C
734)    L    L    L    Q    Y    G    S    F    C    T
735)    L    L    Q    Y    G    S    F    C    T    Q
736)    L    Q    Y    G    S    F    C    T    Q    L
737)    Q    Y    G    S    F    C    T    Q    L    N
738)    Y    G    S    F    C    T    Q    L    N    R
739)    G    S    F    C    T    Q    L    N    R    A
740)    S    F    C    T    Q    L    N    R    A    L
741)    F    C    T    Q    L    N    R    A    L    S
742)    C    T    Q    L    N    R    A    L    S    G
743)    T    Q    L    N    R    A    L    S    G    I
744)    Q    L    N    R    A    L    S    G    I    A
745)    L    N    R    A    L    S    G    I    A    A
746)    N    R    A    L    S    G    I    A    A    E
747)    R    A    L    S    G    I    A    A    E    Q
748)    A    L    S    G    I    A    A    E    Q    D
749)    L    S    G    I    A    A    E    Q    D    R
750)    S    G    I    A    A    E    Q    D    R    N
751)    G    I    A    A    E    Q    D    R    N    T
752)    I    A    A    E    Q    D    R    N    T    R
753)    A    A    E    Q    D    R    N    T    R    E
754)    A    E    Q    D    R    N    T    R    E    V
755)    E    Q    D    R    N    T    R    E    V    F
756)    Q    D    R    N    T    R    E    V    F    A
757)    D    R    N    T    R    E    V    F    A    Q
758)    R    N    T    R    E    V    F    A    Q    V
759)    N    T    R    E    V    F    A    Q    V    K
760)    T    R    E    V    F    A    Q    V    K    Q
761)    R    E    V    F    A    Q    V    K    Q    M
762)    E    V    F    A    Q    V    K    Q    M    Y
763)    V    F    A    Q    V    K    Q    M    Y    K
764)    F    A    Q    V    K    Q    M    Y    K    T
765)    A    Q    V    K    Q    M    Y    K    T    P
766)    Q    V    K    Q    M    Y    K    T    P    T
767)    V    K    Q    M    Y    K    T    P    T    L
768)    K    Q    M    Y    K    T    P    T    L    K
769)    Q    M    Y    K    T    P    T    L    K    Y
770)    M    Y    K    T    P    T    L    K    Y    F
771)    Y    K    T    P    T    L    K    Y    F    G
772)    K    T    P    T    L    K    Y    F    G    G
773)    T    P    T    L    K    Y    F    G    G    F
774)    P    T    L    K    Y    F    G    G    F    N
775)    T    L    K    Y    F    G    G    F    N    F
776)    L    K    Y    F    G    G    F    N    F    S
777)    K    Y    F    G    G    F    N    F    S    Q
778)    Y    F    G    G    F    N    F    S    Q    I
779)    F    G    G    F    N    F    S    Q    I    L
780)    G    G    F    N    F    S    Q    I    L    P
781)    G    F    N    F    S    Q    I    L    P    D
782)    F    N    F    S    Q    I    L    P    D    P
783)    N    F    S    Q    I    L    P    D    P    L
784)    F    S    Q    I    L    P    D    P    L    K
785)    S    Q    I    L    P    D    P    L    K    P
786)    Q    I    L    P    D    P    L    K    P    T
787)    I    L    P    D    P    L    K    P    T    K
788)    L    P    D    P    L    K    P    T    K    R
789)    P    D    P    L    K    P    T    K    R    S
790)    D    P    L    K    P    T    K    R    S    F
791)    P    L    K    P    T    K    R    S    F    I
792)    L    K    P    T    K    R    S    F    I    E
793)    K    P    T    K    R    S    F    I    E    D
794)    P    T    K    R    S    F    I    E    D    L
795)    T    K    R    S    F    I    E    D    L    L
796)    K    R    S    F    I    E    D    L    L    F
797)    R    S    F    I    E    D    L    L    F    N
798)    S    F    I    E    D    L    L    F    N    K
799)    F    I    E    D    L    L    F    N    K    V
800)    I    E    D    L    L    F    N    K    V    T
801)    E    D    L    L    F    N    K    V    T    L
802)    D    L    L    F    N    K    V    T    L    A
803)    L    L    F    N    K    V    T    L    A    D
804)    L    F    N    K    V    T    L    A    D    A
805)    F    N    K    V    T    L    A    D    A    G
806)    N    K    V    T    L    A    D    A    G    F
807)    K    V    T    L    A    D    A    G    F    M
808)    V    T    L    A    D    A    G    F    M    K
809)    T    L    A    D    A    G    F    M    K    Q
810)    L    A    D    A    G    F    M    K    Q    Y
811)    A    D    A    G    F    M    K    Q    Y    G
812)    D    A    G    F    M    K    Q    Y    G    E
813)    A    G    F    M    K    Q    Y    G    E    C
814)    G    F    M    K    Q    Y    G    E    C    L
815)    F    M    K    Q    Y    G    E    C    L    G
816)    M    K    Q    Y    G    E    C    L    G    D
817)    K    Q    Y    G    E    C    L    G    D    I
818)    Q    Y    G    E    C    L    G    D    I    N
819)    Y    G    E    C    L    G    D    I    N    A
820)    G    E    C    L    G    D    I    N    A    R
821)    E    C    L    G    D    I    N    A    R    D
822)    C    L    G    D    I    N    A    R    D    L
823)    L    G    D    I    N    A    R    D    L    I
824)    G    D    I    N    A    R    D    L    I    C
825)    D    I    N    A    R    D    L    I    C    A
826)    I    N    A    R    D    L    I    C    A    Q
827)    N    A    R    D    L    I    C    A    Q    K
828)    A    R    D    L    I    C    A    Q    K    F
829)    R    D    L    I    C    A    Q    K    F    N
830)    D    L    I    C    A    Q    K    F    N    G
831)    L    I    C    A    Q    K    F    N    G    L
832)    I    C    A    Q    K    F    N    G    L    T
833)    C    A    Q    K    F    N    G    L    T    V
834)    A    Q    K    F    N    G    L    T    V    L
835)    Q    K    F    N    G    L    T    V    L    P
836)    K    F    N    G    L    T    V    L    P    P
837)    F    N    G    L    T    V    L    P    P    L
838)    N    G    L    T    V    L    P    P    L    L
839)    G    L    T    V    L    P    P    L    L    T
840)    L    T    V    L    P    P    L    L    T    D
841)    T    V    L    P    P    L    L    T    D    D
842)    V    L    P    P    L    L    T    D    D    M
843)    L    P    P    L    L    T    D    D    M    I
844)    P    P    L    L    T    D    D    M    I    A
845)    P    L    L    T    D    D    M    I    A    A
846)    L    L    T    D    D    M    I    A    A    Y
847)    L    T    D    D    M    I    A    A    Y    T
848)    T    D    D    M    I    A    A    Y    T    A
849)    D    D    M    I    A    A    Y    T    A    A
850)    D    M    I    A    A    Y    T    A    A    L
851)    M    I    A    A    Y    T    A    A    L    V
852)    I    A    A    Y    T    A    A    L    V    S
853)    A    A    Y    T    A    A    L    V    S    G
854)    A    Y    T    A    A    L    V    S    G    T
855)    Y    T    A    A    L    V    S    G    T    A
856)    T    A    A    L    V    S    G    T    A    T
857)    A    A    L    V    S    G    T    A    T    A
858)    A    L    V    S    G    T    A    T    A    G
859)    L    V    S    G    T    A    T    A    G    W
860)    V    S    G    T    A    T    A    G    W    T
861)    S    G    T    A    T    A    G    W    T    F
862)    G    T    A    T    A    G    W    T    F    G
863)    T    A    T    A    G    W    T    F    G    A
864)    A    T    A    G    W    T    F    G    A    G
865)    T    A    G    W    T    F    G    A    G    A
866)    A    G    W    T    F    G    A    G    A    A
867)    G    W    T    F    G    A    G    A    A    L
868)    W    T    F    G    A    G    A    A    L    Q
869)    T    F    G    A    G    A    A    L    Q    I
870)    F    G    A    G    A    A    L    Q    I    P
871)    G    A    G    A    A    L    Q    I    P    F
872)    A    G    A    A    L    Q    I    P    F    A
873)    G    A    A    L    Q    I    P    F    A    M
874)    A    A    L    Q    I    P    F    A    M    Q
875)    A    L    Q    I    P    F    A    M    Q    M
876)    L    Q    I    P    F    A    M    Q    M    A
877)    Q    I    P    F    A    M    Q    M    A    Y
878)    I    P    F    A    M    Q    M    A    Y    R
879)    P    F    A    M    Q    M    A    Y    R    F
880)    F    A    M    Q    M    A    Y    R    F    N
881)    A    M    Q    M    A    Y    R    F    N    G
882)    M    Q    M    A    Y    R    F    N    G    I
883)    Q    M    A    Y    R    F    N    G    I    G
884)    M    A    Y    R    F    N    G    I    G    V
885)    A    Y    R    F    N    G    I    G    V    T
886)    Y    R    F    N    G    I    G    V    T    Q
887)    R    F    N    G    I    G    V    T    Q    N
888)    F    N    G    I    G    V    T    Q    N    V
889)    N    G    I    G    V    T    Q    N    V    L
890)    G    I    G    V    T    Q    N    V    L    Y
891)    I    G    V    T    Q    N    V    L    Y    E
892)    G    V    T    Q    N    V    L    Y    E    N
893)    V    T    Q    N    V    L    Y    E    N    Q
894)    T    Q    N    V    L    Y    E    N    Q    K
895)    Q    N    V    L    Y    E    N    Q    K    Q
896)    N    V    L    Y    E    N    Q    K    Q    I
897)    V    L    Y    E    N    Q    K    Q    I    A
898)    L    Y    E    N    Q    K    Q    I    A    N
899)    Y    E    N    Q    K    Q    I    A    N    Q
900)    E    N    Q    K    Q    I    A    N    Q    F
901)    N    Q    K    Q    I    A    N    Q    F    N
902)    Q    K    Q    I    A    N    Q    F    N    K
903)    K    Q    I    A    N    Q    F    N    K    A
904)    Q    I    A    N    Q    F    N    K    A    I
905)    I    A    N    Q    F    N    K    A    I    S
906)    A    N    Q    F    N    K    A    I    S    Q
907)    N    Q    F    N    K    A    I    S    Q    I
908)    Q    F    N    K    A    I    S    Q    I    Q
909)    F    N    K    A    I    S    Q    I    Q    E
910)    N    K    A    I    S    Q    I    Q    E    S
911)    K    A    I    S    Q    I    Q    E    S    L
912)    A    I    S    Q    I    Q    E    S    L    T
913)    I    S    Q    I    Q    E    S    L    T    T
914)    S    Q    I    Q    E    S    L    T    T    T
915)    Q    I    Q    E    S    L    T    T    T    S
916)    I    Q    E    S    L    T    T    T    S    T
917)    Q    E    S    L    T    T    T    S    T    A
918)    E    S    L    T    T    T    S    T    A    L
919)    S    L    T    T    T    S    T    A    L    G
920)    L    T    T    T    S    T    A    L    G    K
921)    T    T    T    S    T    A    L    G    K    L
922)    T    T    S    T    A    L    G    K    L    Q
923)    T    S    T    A    L    G    K    L    Q    D
924)    S    T    A    L    G    K    L    Q    D    V
925)    T    A    L    G    K    L    Q    D    V    V
926)    A    L    G    K    L    Q    D    V    V    N
927)    L    G    K    L    Q    D    V    V    N    Q
928)    G    K    L    Q    D    V    V    N    Q    N
929)    K    L    Q    D    V    V    N    Q    N    A
930)    L    Q    D    V    V    N    Q    N    A    Q
931)    Q    D    V    V    N    Q    N    A    Q    A
932)    D    V    V    N    Q    N    A    Q    A    L
933)    V    V    N    Q    N    A    Q    A    L    N
934)    V    N    Q    N    A    Q    A    L    N    T
935)    N    Q    N    A    Q    A    L    N    T    L
936)    Q    N    A    Q    A    L    N    T    L    V
937)    N    A    Q    A    L    N    T    L    V    K
938)    A    Q    A    L    N    T    L    V    K    Q
939)    Q    A    L    N    T    L    V    K    Q    L
940)    A    L    N    T    L    V    K    Q    L    S
941)    L    N    T    L    V    K    Q    L    S    S
942)    N    T    L    V    K    Q    L    S    S    N
943)    T    L    V    K    Q    L    S    S    N    F
944)    L    V    K    Q    L    S    S    N    F    G
945)    V    K    Q    L    S    S    N    F    G    A
946)    K    Q    L    S    S    N    F    G    A    I
947)    Q    L    S    S    N    F    G    A    I    S
948)    L    S    S    N    F    G    A    I    S    S
949)    S    S    N    F    G    A    I    S    S    V
950)    S    N    F    G    A    I    S    S    V    L
951)    N    F    G    A    I    S    S    V    L    N
952)    F    G    A    I    S    S    V    L    N    D
953)    G    A    I    S    S    V    L    N    D    I
954)    A    I    S    S    V    L    N    D    I    L
955)    I    S    S    V    L    N    D    I    L    S
956)    S    S    V    L    N    D    I    L    S    R
957)    S    V    L    N    D    I    L    S    R    L
958)    V    L    N    D    I    L    S    R    L    D
959)    L    N    D    I    L    S    R    L    D    K
960)    N    D    I    L    S    R    L    D    K    V
961)    D    I    L    S    R    L    D    K    V    E
962)    I    L    S    R    L    D    K    V    E    A
963)    L    S    R    L    D    K    V    E    A    E
964)    S    R    L    D    K    V    E    A    E    V
965)    R    L    D    K    V    E    A    E    V    Q
966)    L    D    K    V    E    A    E    V    Q    I
967)    D    K    V    E    A    E    V    Q    I    D
968)    K    V    E    A    E    V    Q    I    D    R
969)    V    E    A    E    V    Q    I    D    R    L
970)    E    A    E    V    Q    I    D    R    L    I
971)    A    E    V    Q    I    D    R    L    I    T
972)    E    V    Q    I    D    R    L    I    T    G
973)    V    Q    I    D    R    L    I    T    G    R
974)    Q    I    D    R    L    I    T    G    R    L
975)    I    D    R    L    I    T    G    R    L    Q
976)    D    R    L    I    T    G    R    L    Q    S
977)    R    L    I    T    G    R    L    Q    S    L
 978)    L    I    T    G    R    L    Q    S    L    Q
 979)    I    T    G    R    L    Q    S    L    Q    T
 980)    T    G    R    L    Q    S    L    Q    T    Y
 981)    G    R    L    Q    S    L    Q    T    Y    V
 982)    R    L    Q    S    L    Q    T    Y    V    T
 983)    L    Q    S    L    Q    T    Y    V    T    Q
 984)    Q    S    L    Q    T    Y    V    T    Q    Q
 985)    S    L    Q    T    Y    V    T    Q    Q    L
 986)    L    Q    T    Y    V    T    Q    Q    L    I
 987)    Q    T    Y    V    T    Q    Q    L    I    R
 988)    T    Y    V    T    Q    Q    L    I    R    A
 989)    Y    V    T    Q    Q    L    I    R    A    A
 990)    V    T    Q    Q    L    I    R    A    A    E
 991)    T    Q    Q    L    I    R    A    A    E    I
 992)    Q    Q    L    I    R    A    A    E    I    R
 993)    Q    L    I    R    A    A    E    I    R    A
 994)    L    I    R    A    A    E    I    R    A    S
 995)    I    R    A    A    E    I    R    A    S    A
 996)    R    A    A    E    I    R    A    S    A    N
 997)    A    A    E    I    R    A    S    A    N    L
 998)    A    E    I    R    A    S    A    N    L    A
 999)    E    I    R    A    S    A    N    L    A    A
1000)    I    R    A    S    A    N    L    A    A    T
1001)    R    A    S    A    N    L    A    A    T    K
1002)    A    S    A    N    L    A    A    T    K    M
1003)    S    A    N    L    A    A    T    K    M    S
1004)    A    N    L    A    A    T    K    M    S    E
1005)    N    L    A    A    T    K    M    S    E    C
1006)    L    A    A    T    K    M    S    E    C    V
1007)    A    A    T    K    M    S    E    C    V    L
1008)    A    T    K    M    S    E    C    V    L    G
1009)    T    K    M    S    E    C    V    L    G    Q
1010)    K    M    S    E    C    V    L    G    Q    S
1011)    M    S    E    C    V    L    G    Q    S    K
1012)    S    E    C    V    L    G    Q    S    K    R
1013)    E    C    V    L    G    Q    S    K    R    V
1014)    C    V    L    G    Q    S    K    R    V    D
1015)    V    L    G    Q    S    K    R    V    D    F
1016)    L    G    Q    S    K    R    V    D    F    C
1017)    G    Q    S    K    R    V    D    F    C    G
1018)    Q    S    K    R    V    p    F    C    G    K
1019)    S    K    R    V    D    F    C    G    K    G
1020)    K    R    V    D    F    C    G    K    G    Y
1021)    R    V    D    F    C    G    K    G    Y    H
1022)    V    D    F    C    G    K    G    Y    H    L
1023)    D    F    C    G    K    G    Y    H    L    M
1024)    F    C    G    K    G    Y    H    L    M    S
1025)    C    G    K    G    Y    H    L    M    S    F
1026)    G    K    G    Y    H    L    M    S    F    P
1027)    K    G    Y    H    L    M    S    F    P    Q
1028)    G    Y    H    L    M    S    F    P    Q    A
1029)    Y    H    L    M    S    F    P    Q    A    A
1030)    H    L    M    S    F    P    Q    A    A    P
1031)    L    M    S    F    P    Q    A    A    P    H
1032)    M    S    F    P    Q    A    A    P    H    G
1033)    S    F    P    Q    A    A    P    H    G    V
1034)    F    P    Q    A    A    P    H    G    V    V
1035)    P    Q    A    A    P    H    G    V    V    F
1036)    Q    A    A    P    H    G    V    V    F    L
1037)    A    A    P    H    G    V    V    F    L    H
1038)    A    P    H    G    V    V    F    L    H    V
1039)    P    H    G    V    V    F    L    H    V    T
1040)    H    G    V    V    F    L    H    V    T    Y
1041)    G    V    V    F    L    H    V    T    Y    V
1042)    V    V    F    L    H    V    T    Y    V    P
1043)    V    F    L    H    V    T    Y    V    P    S
1044)    F    L    H    V    T    Y    V    P    S    Q
1045)    L    H    V    T    Y    V    P    S    Q    E
1046)    H    V    T    Y    V    P    S    Q    E    R
1047)    V    T    Y    V    P    S    Q    E    R    N
1048)    T    Y    V    P    S    Q    E    R    N    F
1049)    Y    V    P    S    Q    E    R    N    F    T
1050)    V    P    S    Q    E    R    N    F    T    T
1051)    P    S    Q    E    R    N    F    T    T    A
1052)    S    Q    E    R    N    F    T    T    A    P
1053)    Q    E    R    N    F    T    T    A    P    A
1054)    E    R    N    F    T    T    A    P    A    I
1055)    R    N    F    T    T    A    P    A    I    C
1056)    N    F    T    T    A    P    A    I    C    H
1057)    F    T    T    A    P    A    I    C    H    E
1058)    T    T    A    P    A    I    C    H    E    G
1059)    T    A    P    A    I    C    H    E    G    K
1060)    A    P    A    I    C    H    E    G    K    A
1061)    P    A    I    C    H    E    G    K    A    Y
1062)    A    I    C    H    E    G    K    A    Y    F
1063)    I    C    H    E    G    K    A    Y    F    P
1064)    C    H    E    G    K    A    Y    F    P    R
1065)    H    E    G    K    A    Y    F    P    R    E
1066)    E    G    K    A    Y    F    P    R    E    G
1067)    G    K    A    Y    F    P    R    E    G    V
1068)    K    A    Y    F    P    R    E    G    V    F
1069)    A    Y    F    P    R    E    G    V    F    V
1070)    Y    F    P    R    E    G    V    F    V    F
1071)    F    P    R    E    G    V    F    V    F    N
1072)    P    R    E    G    V    F    V    F    N    G
1073)    R    E    G    V    F    V    F    N    G    T
1074)    E    G    V    F    V    F    N    G    T    S
1075)    G    V    F    V    F    N    G    T    S    W
1076)    V    F    V    F    N    G    T    S    W    F
1077)    F    V    F    N    G    T    S    W    F    I
1078)    V    F    N    G    T    S    W    F    I    T
1079)    F    N    G    T    S    W    F    I    T    Q
1080)    N    G    T    S    W    F    I    T    Q    R
1081)    G    T    S    W    F    I    T    Q    R    N
1082)    T    S    W    F    I    T    Q    R    N    F
1083)    S    W    F    I    T    Q    R    N    F    F
1084)    W    F    I    T    Q    R    N    F    F    S
1085)    F    I    T    Q    R    N    F    F    S    P
1086)    I    T    Q    R    N    F    F    S    P    Q
1087)    T    Q    R    N    F    F    S    P    Q    I
1088)    Q    R    N    F    F    S    P    Q    I    I
1089)    R    N    F    F    S    P    Q    I    I    T
1090)    N    F    F    S    P    Q    I    I    T    T
1091)    F    F    S    P    Q    I    I    T    T    D
1092)    F    S    P    Q    I    I    T    T    D    N
1093)    S    P    Q    I    I    T    T    D    N    T
1094)    P    Q    I    I    T    T    D    N    T    F
1095)    Q    I    I    T    T    D    N    T    F    V
1096)    I    I    T    T    D    N    T    F    V    S
1097)    I    T    T    D    N    T    F    V    S    G
1098)    T    T    D    N    T    F    V    S    G    N
1099)    T    D    N    T    F    V    S    G    N    C
1100)    D    N    T    F    V    S    G    N    C    D
1101)    N    T    F    V    S    G    N    C    D    V
1102)    T    F    V    S    G    N    C    D    V    V
1103)    F    V    S    G    N    C    D    V    V    I
1104)    V    S    G    N    C    D    V    V    I    G
1105)    S    G    N    C    D    V    V    I    G    I
1106)    G    N    C    D    V    V    I    G    I    I
1107)    N    C    D    V    V    I    G    I    I    N
1108)    C    D    V    V    I    G    I    I    N    N
1109)    D    V    V    I    G    I    I    N    N    T
1110)    V    V    I    G    I    I    N    N    T    V
1111)    V    I    G    I    I    N    N    T    V    Y
1112)    I    G    I    I    N    N    T    V    Y    D
1113)    G    I    I    N    N    T    V    Y    D    P
1114)    I    I    N    N    T    V    Y    D    P    L
1115)    I    N    N    T    V    Y    D    P    L    Q
1116)    N    N    T    V    Y    D    P    L    Q    P
1117)    N    T    V    Y    D    P    L    Q    P    E
1118)    T    V    Y    D    P    L    Q    P    E    L
1119)    V    Y    D    P    L    Q    P    E    L    D
1120)    Y    D    P    L    Q    P    E    L    D    S
1121)    D    P    L    Q    P    E    L    D    S    F
1122)    P    L    Q    P    E    L    D    S    F    K
1123)    L    Q    P    E    L    D    S    F    K    E
1124)    Q    P    E    L    D    S    F    K    E    E
1125)    P    E    L    D    S    F    K    E    E    L
1126)    E    L    D    S    F    K    E    E    L    D
1127)    L    D    S    F    K    E    E    L    D    K
1128)    D    S    F    K    E    E    L    D    K    Y
1129)    S    F    K    E    E    L    D    K    Y    F
1130)    F    K    E    E    L    D    K    Y    F    K
1131)    K    E    E    L    D    K    Y    F    K    N
1132)    E    E    L    D    K    Y    F    K    N    H
1133)    E    L    D    K    Y    F    K    N    H    T
1134)    L    D    K    Y    F    K    N    H    T    S
1135)    D    K    Y    F    K    N    H    T    S    P
1136)    K    Y    F    K    N    H    T    S    P    D
1137)    Y    F    K    N    H    T    S    P    D    V
1138)    F    K    N    H    T    S    P    D    V    D
1139)    K    N    H    T    S    P    D    V    D    L
1140)    N    H    T    S    P    D    V    D    L    G
1141)    H    T    S    P    D    V    D    L    G    D
1142)    T    S    P    D    V    D    L    G    D    I
1143)    S    P    D    V    D    L    G    D    I    S
1144)    P    D    V    D    L    G    D    I    S    G
1145)    D    V    D    L    G    D    I    S    G    I
1146)    V    D    L    G    D    I    S    G    I    N
1147)    D    L    G    D    I    S    G    I    N    A
1148)    L    G    D    I    S    G    I    N    A    S
1149)    G    D    I    S    G    I    N    A    S    V
1150)    D    I    S    G    I    N    A    S    V    V
1151)    I    S    G    I    N    A    S    V    V    N
1152)    S    G    I    N    A    S    V    V    N    I
1153)    G    I    N    A    S    V    V    N    I    Q
1154)    I    N    A    S    V    V    N    I    Q    K
1155)    N    A    S    V    V    N    I    Q    K    E
1156)    A    S    V    V    N    I    Q    K    E    I
1157)    S    V    V    N    I    Q    K    E    I    D
1158)    V    V    N    I    Q    K    E    I    D    R
1159)    V    N    I    Q    K    E    I    D    R    L
1160)    N    I    Q    K    E    I    D    R    L    N
1161)    I    Q    K    E    I    D    R    L    N    E
1162)    Q    K    E    I    D    R    L    N    E    V
1163)    K    E    I    D    R    L    N    E    V    A
1164)    E    I    D    R    L    N    E    V    A    K
1165)    I    D    R    L    N    E    V    A    K    N
1166)    D    R    L    N    E    V    A    K    N    L
1167)    R    L    N    E    V    A    K    N    L    N
1168)    L    N    E    V    A    K    N    L    N    E
1169)    N    E    V    A    K    N    L    N    E    S
1170)    E    V    A    K    N    L    N    E    S    L
1171)    V    A    K    N    L    N    E    S    L    I
1172)    A    K    N    L    N    E    S    L    I    D
1173)    K    N    L    N    E    S    L    I    D    L
1174)    N    L    N    E    S    L    I    D    L    Q
1175)    L    N    E    S    L    I    D    L    Q    E
1176)    N    E    S    L    I    D    L    Q    E    L
1177)    E    S    L    I    D    L    Q    E    L    G
1178)    S    L    I    D    L    Q    E    L    G    K
1179)    L    I    D    L    Q    E    L    G    K    Y
1180)    I    D    L    Q    E    L    G    K    Y    E
1181)    D    L    Q    E    L    G    K    Y    E    Q
1182)    L    Q    E    L    G    K    Y    E    Q    Y
1183)    Q    E    L    G    K    Y    E    Q    Y    I
1184)    E    L    G    K    Y    E    Q    Y    I    K
1185)    L    G    K    Y    E    Q    Y    I    K    W
1186)    G    K    Y    E    Q    Y    I    K    W    P
1187)    K    Y    E    Q    Y    I    K    W    P    W
1188)    Y    E    Q    Y    I    K    W    P    W    Y
1189)    E    Q    Y    I    K    W    P    W    Y    V
1190)    Q    Y    I    K    W    P    W    Y    V    W
1191)    Y    I    K    W    P    W    Y    V    W    L
1192)    I    K    W    P    W    Y    V    W    L    G
1193)    K    W    P    W    Y    V    W    L    G    F
1194)    W    P    W    Y    V    W    L    G    F    I
1195)    P    W    Y    V    W    L    G    F    I    A
1196)    W    Y    V    W    L    G    F    I    A    G
1197)    Y    V    W    L    G    F    I    A    G    L
1198)    V    W    L    G    F    I    A    G    L    I
1199)    W    L    G    F    I    A    G    L    I    A
1200)    L    G    F    I    A    G    L    I    A    I
1201)    G    F    I    A    G    L    I    A    I    V
1202)    F    I    A    G    L    I    A    I    V    M
1203)    I    A    G    L    I    A    I    V    M    V
1204)    A    G    L    I    A    I    V    M    V    T
1205)    G    L    I    A    I    V    M    V    T    I
1206)    L    I    A    I    V    M    V    T    I    L
1207)    I    A    I    V    M    V    T    I    L    L
1208)    A    I    V    M    V    T    I    L    L    C
1209)    I    V    M    V    T    I    L    L    C    C
1210)    V    M    V    T    I    L    L    C    C    M
1211)    M    V    T    I    L    L    C    C    M    T
1212)    V    T    I    L    L    C    C    M    T    S
1213)    T    I    L    L    C    C    M    T    S    C
1214)    I    L    L    C    C    M    T    S    C    C
1215)    L    L    C    C    M    T    S    C    C    S
1216)    L    C    C    M    T    S    C    C    S    C
1217)    C    C    M    T    S    C    C    S    C    L
1218)    C    M    T    S    C    C    S    C    L    K
1219)    M    T    S    C    C    S    C    L    K    G
1220)    T    S    C    C    S    C    L    K    G    A
1221)    S    C    C    S    C    L    K    G    A    C
1222)    C    C    S    C    L    K    G    A    C    S
1223)    C    S    C    L    K    G    A    C    S    C
1224)    S    C    L    K    G    A    C    S    C    G
1225)    C    L    K    G    A    C    S    C    G    S
1226)    L    K    G    A    C    S    C    G    S    C
1227)    K    G    A    C    S    C    G    S    C    C
1228)    G    A    C    S    C    G    S    C    C    K
1229)    A    C    S    C    G    S    C    C    K    F
1230)    C    S    C    G    S    C    C    K    F    D
1231)    S    C    G    S    C    C    K    F    D    E
1232)    C    G    S    C    C    K    F    D    E    D
1233)    G    S    C    C    K    F    D    E    D    D
1234)    S    C    C    K    F    D    E    D    D    S
1235)    C    C    K    F    D    E    D    D    S    E
1236)    C    K    F    D    E    D    D    S    E    P
1237)    K    F    D    E    D    D    S    E    P    V
1238)    F    D    E    D    D    S    E    P    V    L
1239)    D    E    D    D    S    E    P    V    L    K
1240)    E    D    D    S    E    P    V    L    K    G
1241)    D    D    S    E    P    V    L    K    G    V
1242)    D    S    E    P    V    L    K    G    V    K
1243)    S    E    P    V    L    K    G    V    K    L
1244)    E    P    V    L    K    G    V    K    L    H
1245)    P    V    L    K    G    V    K    L    H    Y
1246)    V    L    K    G    V    K    L    H    Y    T
其合成方法同实施例1,所不同的是从第1步至第10步的投料。以下表15至表24为第1步至第10步的投料:
表15合成Spike(S)蛋白601~1246号“交叉重叠”多肽第一步时使用试剂投料计算结果:
   S-2-步骤-1        FW       个数  控制组  总数  N(mmol)    AA-m(mg)   HOBt(mg)    BOP(mg)  DIEA(mg)
A  Fmoc-Ala          311.3    55    1       56    2.016      627.6      308.7       847.5    521.1
C  Fmoc-Cys(Trt)     585.7    23    2       25    0.9        527.1      137.8       378.3    232.6
D  Fmoc-Asp(OtBu)    411.5    33    0       33    1.188      488.9      181.9       499.4    307.1
E  Fmoc-Glu(OtBu)    425.5    27    1       28    1.008      428.9      154.4       423.7    260.5
F  Fmoc-Phe          387.4    31    1       32    1.152      446.3      176.4       484.3    297.8
G  Fmoc-Gly          297.3    40    0       40    1.44       428.1      220.5       605.3    372.2
H  Fmoc-His(Trt)     619.7    8     0       8     0.288      178.5      44.1        121.1    74.4
I  Fmoc-Ile          353.4    47    2       49    1.764      623.4      270.1       741.5    456.0
K  Fmoc-Lys(Boc)     468.5    28    0       28    1.008      472.2      154.4       423.7    260.5
L  Fmoc-Leu          353.4    57    1       58    2.088      737.9      319.7       877.7    539.7
M  Fmoc-Met          371.5    13    1       14    0.504      187.2      77.2        211.9    130.3
N  Fmoc-Asn          354.4    38    0       38    1.368      484.8      209.5       575.1    353.6
P  Fmoc-Pro          337.4    22    0       22    0.792      267.2      121.3       332.9    204.7
Q  Fmoc-Gln          368.4    38    0       38    1.368      504.0      209.5       575.1    353.6
R  Fmoc-Arg(Pbf)     648.8    18    2       20    0.72       467.1      110.3       302.7    186.1
S  Fmoc-Ser(tBu)     383.4    49    0       49    1.764      676.3      270.1       741.5    456.0
T  Fmoc-Thr(tBu)     397.5    49    3       52    1.872      744.1      286.7       786.9    483.9
V  Fmoc-Val          339.4    42    0       42    1.512      513.2      231.5       635.6    390.8
W  Fmoc-Trp          426.5    6     0       6     0.216      92.1       33.1        90.8     55.8
Y  Fmoc-Tyr(tBu)     459.6    22    0       22    0.792      364.0      121.3       332.9    204.7
表16合成Spike(S)蛋白601~1246号“交叉重叠”多肽第二步时使用试剂投料计算结果:
     S-2-步骤-2       FW       个数  控制组  总数    N(mmol)    AA-m(mg)    DIC(mg)    HOBt(mg)
A    Fmoc-Ala         311.3    55    2       57      2.052      638.8       259.0      314.2
C    Fmoc-Cys(Trt)    585.7    22    1       23      0.828      485.0       104.5      126.8
D    Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    32    0       32      1.152      474.0       145.4      176.4
E    Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    27    1       28      1.008      428.9       127.2      154.4
F    Fmoc-Phe         387.4    31    1       32      1.152      446.3       145.4      176.4
G    Fmoc-Gly         297.3    41    1       42      1.512      449.5       190.8      231.5
H    Fmoc-His(Trt)    619.7    9     0        9      0.324      200.8       40.9       49.6
I    Fmoc-Ile         353.4    47    1       48      1.728      610.7       218.1      264.6
K    Fmoc-Lys(Boc)    468.5    30    0       30      1.08       506.0       136.3      165.4
L    Fmoc-Leu         353.4    58    2       60      2.16       763.3       272.6      330.8
M    Fmoc-Met         371.5    13    1       14      0.504      187.2       63.6       77.2
N    Fmoc-Asn         354.4    37    0       37      1.332      472.1       168.1      204.0
P    Fmoc-Pro         337.4    22    1       23      0.828      279.4       104.5      126.8
Q    Fmoc-Gln         368.4    38    1       39      1.404      517.2       177.2      215.0
R    Fmoc-Arg(Pbf)    648.8    18    0       18      0.648      420.4       81.8       99.2
S    Fmoc-Ser(tBu)    383.4    48    1       49      1.764      676.3       222.6      270.1
T    Fmoc-Thr(tBu)    397.5    47    0       47      1.692      672.6       213.5      259.1
V    Fmoc-Val         339.4    42    0       42      1.512      513.2       190.8      231.5
W    Fmoc-Trp         426.5    6     0       6       0.216      92.1        27.3       33.1
Y    Fmoc-Tyr(tBu)    459.6    23    1       24      0.864      397.1       109.0      132.3
表17合成Spike(S)蛋白601~1246号“交叉重叠”多肽第三步时使用试剂投料计算结果:
     S-2-步骤-3       FW       个数  控制组  总数  N(mmol)    AA-m(mg)   DIC(mg)  HOBt(mg)
A    Fmoc-Ala         311.3    55    3       58    2.088      650.0      263.5    319.7
C    Fmoc-Cys(Trt)    585.7    22    0       22    0.792      463.9      100.0    121.3
D    Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    32    2       34    1.224      503.7      154.5    187.4
E    Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    27    1       28    1.008      428.9      127.2    154.4
F    Fmoc-Phe         387.4    31    0       31    1.116      432.3      140.8    170.9
G    Fmoc-Gly         297.3    41    0       41    1.476      438.8      186.3    226.0
H    Fmoc-His(Trt)    619.7    9     0       9     0.324      200.8      40.9     49.6
I    Fmoc-Ile         353.4    47    0       47    1.692      598.0      213.5    259.1
K    Fmoc-Lys(Boc)    468.5    30    0       30    1.08       506.0      136.3    165.4
L    Fmoc-Leu         353.4    58    1       59    2.124      750.6      268.0    325.2
M    Fmoc-Met         371.5    13    1       14    0.504      187.2      63.6     77.2
N    Fmoc-Asn         354.4    37    2       39    1.404      497.6      177.2    215.0
P    Fmoc-Pro         337.4    22    0       22    0.792      267.2      100.0    121.3
Q    Fmoc-Gln         368.4    38    1       39    1.404      517.2      177.2    215.0
R    Fmoc-Arg(Pbf)    648.8    18    0       18    0.648      420.4      81.8     99.2
S    Fmoc-Ser(tBu)    383.4    48    2       50    1.8        690.1      227.2    275.6
T    Fmoc-Thu(tBu)    397.5    48    0       48    1.728      686.9      218.1    264.6
V    Fmoc-Val         339.4    42    1       43    1.548      525.4      195.4    237.0
W    Fmoc-Trp         426.5    6     0       6     0.216      92.1       27.3     33.1
Y    Fmoc-Tyt(tBu)    459.6    22    0       22    0.792      364.0      100.0    121.3
表18合成Spike(S)蛋白601~1246号“交叉重叠”多肽第四步时使用试剂投料计算结果:
     S-2-步骤-4        FW       个数  控制组  总数    N(mmol)  AA-m(mg)    DIC(mg)  HOBt(mg)
A    Fmoc-Ala          311.3    55    1       56      2.016    627.6       254.4    308.7
C    Fmoc-Cys(Trt)     585.7    22    0       22      0.792    463.9       100.0    121.3
D    Fmoc-Asp(OtBu)    411.5    32    0       32      1.152    474.0       145.4    176.4
E    Fmoc-Glu(OtBu)    425.5    27    1       28      1.008    428.9       127.2    154.4
F    Fmoc-Phe          387.4    31    0       31      1.116    432.3       140.8    170.9
G    Fmoc-Gly          297.3    41    1       42      1.512    449.5       190.8    231.5
H    Fmoc-His(Trt)     619.7    8     0       8       0.288    178.5       36.3     44.1
I    Fmoc-Ile          353.4    47    3       50      1.8      636.1       227.2    275.6
K    Fmoc-Lys(Boc)     468.5    30    0       30      1.08     506.0       136.3    165.4
L    Fmoc-Leu          353.4    58    3       61      2.196    776.1       277.1    336.3
M    Fmoc-Met          371.5    13    0       13      0.468    173.9       59.1     71.7
N    Fmoc-Asn          354.4    37    0       37      1.332    472.1       168.1    204.0
P    Fmoc-Pro          337.4    22    0       22      0.792    267.2       100.0    121.3
Q    Fmoc-Gln          368.4    38    0       38      1.368    504.0       172.6    209.5
R    Fmoc-Arg(Pbf)     648.8    18    1       19      0.684    443.8       86.3     104.7
S    Fmoc-Ser(tBu)     383.4    49    1       50      1.8      690.1       227.2    275.6
T    Fmoc-Thr(tBu)     397.5    48    2       50      1.8      715.5       227.2    275.6
V    Fmoc-Val          339.4    42    1       43      1.548    525.4       195.4    237.0
W    Fmoc-Trp          426.5    6     0       6       0.216    92.1        27.3     33.1
Y    Fmoc-Tyr(tBu)     459.6    22    0       22      0.792    364.0       100.0    121.3
表19合成Spike(S)蛋白601~1246号“交叉重叠”多肽第五步时使用试剂投料计算结果:
   S-2-步骤-5       FW       个数  控制组  总数  N(mmol)  AA-m(mg)  DIC(mg)  HOBt(mg)
A  Fmoc-Ala         311.3    55    2       57    2.052    638.8     259.0    314.2
C  Fmoc-Cys(Trt)    585.7    22    0       22    0.792    463.9     100.0    121.3
D  Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    32    0       32    1.152    474.0     145.4    176.4
E  Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    27    0       27    0.972    413.6     122.7    148.8
F  Fmoc-Phe         387.4    31    1       32    1.152    446.3     145.4    176.4
G  Fmoc-Gly         297.3    41    1       42    1.512    449.5     190.8    231.5
H  Fmoc-His(Trt)    619.7    8     0       8     0.288    178.5     36.3     44.1
I  Fmoc-Ile         353.4    47    1       48    1.728    610.7     218.1    264.6
K  Fmoc-Lys(Boc)    468.5    30    0       30    1.08     506.0     136.3    165.4
L  Fmoc-Leu         353.4    57    1       58    2.088    737.9     263.5    319.7
M  Fmoc-Met         371.5    13    0       13    0.468    173.9     59.1     71.7
N  Fmoc-Asn         354.4    37    1       38    1.368    484.8     172.6    209.5
P  Fmoc-Pro         337.4    22    1       23    0.828    279.4     104.5    126.8
Q  Fmoc-Gln         368.4    38    2       40    1.44     530.5     181.7    220.5
R  Fmoc-Arg(Pbf)    648.8    18    0       18    0.648    420.4     81.8     99.2
S  Fmoc-Ser(tBu)    383.4    49    0       49    1.764    676.3     222.6    270.1
T  Fmoc-Thr(tBu)    397.5    48    2       50    1.8      715.5     227.2    275.6
V  Fmoc-Val         339.4    43    1       44    1.584    537.6     199.9    242.6
W  Fmoc-Trp         426.5    6     0       6     0.216    92.1      27.3     33.1
Y  Fmoc-Tyr(tBu)    459.6    22    1       23    0.828    380.5     104.5    126.8
表20合成Spike(S)蛋白601~1246号“交叉重叠”多肽第六步时使用试剂投料计算结果:
   S-2-步骤-6       FW       个数  控制组  总数  N(mmol)  AA-m(mg)    HOBt(mg)    HBTu(mg)    DIEA(mg)
A  Fmoc-Ala         311.3    55    1       56    2.016    627.6       308.7       726.3       521.1
C  Fmoc-Cys(Trt)    585.7    22    0       22    0.792    463.9       121.3       285.3       204.7
D  Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    33    1       34    1.224    503.7       187.4       441.0       316.4
E  Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    27    0       27    0.972    413.6       148.8       350.2       251.2
F  Fmoc-Phe         387.4    31    0       31    1.116    432.3       170.9       402.1       288.5
G  Fmoc-Gly         297.3    41    0       41    1.476    438.8       226.0       531.8       381.5
H  Fmoc-His(Trt)    619.7    8     0       8     0.288    178.5       44.1        103.8       74.4
I  Fmoc-Ile         353.4    47    3       50    1.8      636.1       275.6       648.5       465.3
K  Fmoc-Lys(Boc)    468.5    29    3       32    1.152    539.7       176.4       415.1       297.8
L  Fmoc-Leu         353.4    57    1       58    2.088    737.9       319.7       752.3       539.7
M  Fmoc-Met         371.5    13    0       13    0.468    173.9       71.7        168.6       121.0
N  Fmoc-Asn         354.4    37    0       37    1.332    472.1       204.0       479.9       344.3
P  Fmoc-Pro         337.4    22    2       24    0.864    291.5       132.3       311.3       223.3
Q  Fmoc-Gln         368.4    38    0       38    1.368    504.0       209.5       492.9       353.6
R  Fmoc-Arg(Pbf)    648.8    18    0       18    0.648    420.4       99.2        233.5       167.5
S  Fmoc-Ser(tBu)    383.4    49    2       51    1.836    703.9       281.1       661.5       474.6
T  Fmoc-Thr(tBu)    397.5    48    0       48    1.728    686.9       264.6       622.6       446.7
V  Fmoc-Val         339.4    43    1       44    1.584    537.6       242.6       570.7       409.4
W  Fmoc-Trp         426.5    6     0       6     0.216    92.1        33.1        77.8        55.8
Y  Fmoc-Tyr(tBu)    459.6    22    0       22    0.792    364.0       121.3       285.3       204.7
表21合成Spike(S)蛋白601~1246号“交叉重叠”多肽第七步时使用试剂投料计算结果:
   S-2-步骤-7       FW       个数  控制    组总数    N(mmol)  AA-m(mg)  HOBt(mg)  HBTu(mg)   DIEA(mg)
A  Fmoc-Ala         311.3    55    3       58        3.48     1083.3    532.9     1253.8     899.5
C  Fmoc-Cys(Trt)    585.7    22    0       22        1.32     773.1     202.1     475.6      341.2
D  Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    33    1       34        2.04     839.5     312.4     735.0      527.3
E  Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    27    0       27        1.62     689.3     248.1     583.7      418.7
F  Fmoc-Phe         387.4    31    0       31        1.86     720.6     284.8     670.1      480.8
G  Fmoc-Gly         297.3    41    0       41        2.46     731.4     376.7     886.3      635.9
H  Fmoc-His(Trt)    619.7    8     0       8         0.48     297.5     73.5      172.9      124.1
I  Fmoc-Ile         353.4    47    2       49        2.94     1039.0    450.2     1059.2     759.9
K  Fmoc-Lys(Boc)    468.5    29    0       29        1.74     815.2     266.4     626.9      449.8
L  Fmoc-Leu         353.4    57    2       59        3.54     1251.0    542.1     1275.4     915.0
M  Fmoc-Met         371.5    13    1       14        0.84     312.1     128.6     302.6      217.1
N  Fmoc-Ash         354.4    37    1       38        2.28     808.0     349.1     821.5      589.3
P  Fmoc-Pro         337.4    22    1       23        1.38     465.6     211.3     497.2      356.7
Q  Fmoc-Gln         368.4    38    1       39        2.34     862.1     358.3     843.1      604.8
R  Fmoc-Arg(Pbf)    648.8    18    0       18        1.08     700.7     165.4     389.1      279.2
S  Fmoc-Ser(tBu)    383.4    49    0       49        2.94     1127.2    450.2     1059.2     759.9
T  Fmoc-Thr(tBu)    397.5    49    1       50        3        1192.5    459.4     1080.9     775.4
V  Fmoc-Val         339.4    42    1       43        2.58     875.7     395.1     929.5      666.9
W  Fmoc-Trp         426.5    6     0       6         0.36     153.5     55.1      29.7       93.1
Y  Fmoc-Tyr(tBu)    459.6    22    0       22        1.32     606.7     202.1     475.6      341.2
表22合成Spike(S)蛋白601~1246号“交叉重叠”多肽第八步时使用试剂投料计算结果:
   S-2-步骤-8       FW       个数  控制组  总数  N(mmol)   AA-m(mg)    HOBt(mg)    HBTu(mg)    DIEA(mg)
A  Fmoc-Ala         311.3    55    2       57    3.42      1064.6      523.7       1232.2      884.0
C  Fmoc-Cys(Trt)    585.7    23    0       23    1.38      808.3       211.3       497.2       356.7
D  Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    33    2       35    2.1       864.2       321.6       756.6       542.8
E  Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    27    0       27    1.62      689.3       248.1       583.7       418.7
F  Fmoc-Phe         387.4    31    0       31    1.86      720.6       284.8       670.1       480.8
G  Fmoc-Gly         297.3    40    1       41    2.46      731.4       376.7       886.3       635.9
H  Fmoc-His(Trt)    619.7    8     0       8     0.48      297.5       73.5        172.9       124.1
I  Fmoc-Ile         353.4    47    3       50    3         1060.2      459.4       1080.9      775.4
K  Fmoc-Lys(Boc)    468.5    29    0       29    1.74      815.2       266.4       626.9       449.8
L  Fmoc-Leu         353.4    57    1       58    3.48      1229.8      532.9       1253.8      899.5
M  Fmoc-Met         371.5    13    0       13    0.78      289.8       119.4       281.0       201.6
N  Fmoc-Asn         354.4    37    0       37    2.22      786.8       339.9       799.8       573.8
P  Fmoc-Pro         337.4    22    0       22    1.32      445.4       202.1       475.6       341.2
Q  Fmoc-Gln         368.4    38    1       39    2.34      862.1       358.3       843.1       604.8
R  Fmoc-Arg(Pbf)    648.8    18    0       18    1.08      700.7       165.4       389.1       279.2
S  Fmoc-Ser(tBu)    383.4    49    1       50    3         1150.2      459.4       1080.9      775.4
T  Fmoc-Thr(tBu)    397.5    49    1       50    3         1192.5      459.4       1080.9      775.4
V  Fmoc-Val         339.4    42    2       44    2.64      896.0       404.3       951.2       682.4
W  Fmoc-Trp         426.5    6     0       6     0.36      153.5       55.1        129.7       93.1
Y  Fmoc-Tyr(tBu)    459.6    22    0       22    1.32      606.7       202.1       475.6       341.2
表23合成Spike(S)蛋白601~1246号“交叉重叠”多肽第九步时使用试剂投料计算结果:
   S-2-步骤-9       FW       个数  控制组  总数  N(mmol)   AA-m(mg)   HOBt(mg)    HBTu(mg)    DIEA(mg)
A  Fmoc-Ala         311.3    55    1       56    3.36      1046.0     514.5       1210.6      868.5
C  Fmoc-Cys(Trt)    585.7    23    2       25    1.5       878.6      229.7       540.4       387.7
D  Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    33    0       33    1.98      814.8      303.2       713.4       511.8
E  Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    27    1       28    1.68      714.8      257.3       605.3       434.2
F  Fmoc-Phe         387.4    31    1       32    1.92      743.8      294.0       691.8       496.3
G  Fmoc-Gly         297.3    40    0       40    2.4       713.5      367.5       864.7       620.4
H  Fmoc-His(Trt)    619.7    8     0       8     0.48      297.5      73.5        172.9       124.1
I  Fmoc-Ile         353.4    47    2       49    2.94      1039.0     450.2       1059.2      759.9
K  Fmoc-Lys(Boc)    468.5    28    0       28    1.68      787.1      257.3       605.3       434.2
L  Fmoc-Leu         353.4    57    1       58    3.48      1229.8     532.9       1253.8      899.5
M  Fmoc-Met         371.5    13    1       14    0.84      312.1      128.6       302.6       217.1
N  Fmoc-Asn         354.4    38    0       38    2.28      808.0      349.1       821.5       589.3
P  Fmoc-Pro         337.4    22    0       22    1.32      445.4      202.1       475.6       341.2
Q  Fmoc-Gln         368.4    38    0       38    2.28      840.0      349.1       821.5       589.3
R  Fmoc-Arg(Pbf)    648.8    18    2       20    1.2       778.6      183.8       432.3       310.2
S  Fmoc-Ser(tBu)    383.4    49    0       49    2.94      1127.2     450.2       1059.2      759.9
T  Fmoc-Thr(tBu)    397.5    49    3       52    3.12      1240.2     477.8       1124.1      806.5
V  Fmoc-Val         339.4    42    0       42    2.52      855.3      385.9       907.9       651.4
W  Fmoc-Trp         426.5    6     0       6     0.36      153.5      55.1        129.7       93.1
Y  Fmoc-Tyr(tBu)    459.6    22    0       22    1.32      606.7      202.1       475.6       341.2
表24合成Spike(S)蛋白601~1246号“交叉重叠”多肽第十步时使用试剂投料计算结果:
   S-2-步骤-10      FW       个数  控制组  总数  N(mmol)   AA-m(mg)   HOBt(mg)    HBTu(mg)   DIEA(mg)
A  Fmoc-Ala         311.3    55    3       58    3.48      1083.3     532.9       1253.8     899.5
C  Fmoc-Cys(Trt)    585.7    23    0       23    1.38      808.3      211.3       497.2      356.7
D  Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    33    2       35    2.1       864.2      321.6       756.6      542.8
E  Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    27    2       29    1.74      740.4      266.4       626.9      449.8
F  Fmoc-Phe         387.4    31    0       31    1.86      720.6      284.8       670.1      480.8
G  Fmoc-Gly         297.3    40    1       41    2.46      731.4      376.7       886.3      635.9
H  Fmoc-His(Trt)    619.7    8     0       8     0.48      297.5      73.5        172.9      124.1
I  Fmoc-Ile         353.4    47    1       48    2.88      1017.8     441.0       1037.6     744.4
K  Fmoc-Lys(Boc)    468.5    28    0       28    1.68      787.1      257.3       605.3      434.2
L  Fmoc-Leu         353.4    56    0       56    3.36      1187.4     514.5       1210.6     868.5
M  Fmoc-Met         371.5    13    0       13    0.78      289.8      119.4       281.0      201.6
N  Fmoc-Asn         354.4    38    4       42    2.52      893.1      385.9       907.9      651.4
P  Fmoc-Pro         337.4    22    0       22    1.32      445.4      202.1       475.6      341.2
Q  Fmoc-Gln         368.4    38    0       38    2.28      840.0      349.1       821.5      589.3
R  Fmoc-Arg(Pbf)    648.8    18    0       18    1.08      700.7      165.4       389.1      279.2
S  Fmoc-Ser(tBu)    383.4    49    0       49    2.94      1127.2     450.2       1059.2     759.9
T  Fmoc-Thr(tBu)    397.5    49    0       49    2.94      1168.7     450.2       1059.2     759.9
V  Fmoc-Val         339.4    43    1       44    2.64      896.0      404.3       951.2      682.4
W  Fmoc-Trp         426.5    6     0       6     0.36      153.5      55.1        129.7      93.1
Y  Fmoc-Tyr(tBu)    459.6    22    0       22    1.32      606.7      202.1       475.6      341.2
合成Spike(S)蛋白601~1246号合成操作步骤:
多肽脱Fmoc保护/氨基酸残基的连接步骤:
1.均分树脂:采用IRORI均分树脂装置,在每一个Microkan中(共646个)加入15mg Rink Amide树脂;
2.均分IRORI射频子:采用IRORI均分射频子装置,在每一个Microkan中加入一个射频子,并用IRORI加盖器加盖;
3.脱Fmoc保护:集中所有待反应的Microkan,置于一个2L锥形瓶中,加入20%哌啶/DMF振摇,15min×2次;
4.洗涤树脂:DMF 3min×6,DCM 3min×3,晾干;
5.IRORI射频子编码(或解码):采用IRORI Sorting程序及相应配件编码。按照多肽化学库的序列对射频子编码(或解码),每一特定编码代表一个特定序列,并以此将Microkan分配至不同氨基酸反应瓶中;
6.洗涤树脂:用重蒸DMF润洗待反应的树脂;
7.Fmoc-保护氨基酸的连接:准确称取计算量的Fmoc保护氨基酸、HOBt、HBTU(或DIC或BOP),并用重蒸DMF溶解。将Microkan加入特定氨基酸反应瓶中,振摇反应3h;
8.茚三酮检测:取事先设定好的对照组序列,用茚三酮法检测反应情况。如果呈阴性反应,表明反应完全,进行步骤9的操作;如果呈阳性反应,表明反应不完全,需继续反应;如果延长时间或改用缩合能力更强的缩合剂后,仍不能完全反应,则采用步骤11的方法封闭后,进行步骤9的操作;
9.洗涤树脂:DMF 3min×3,DCM 3min×1;
10.脱Fmoc保护/连接:根据序列要求,重复步骤3-9的操作,直至反应结束;
11.封闭:采用乙酰化多肽的氨基端,15%Ac2O/CH2Cl2,30min;
12.洗涤树脂:DCM 3min×2,晾干。
多肽裂解步骤:
1.配制裂解液:根据序列特点,从选取并配制适当的裂解液;
2.裂解:每一个Microkan使用1mL裂解液在室温下裂解2h;
3.洗涤:再用1mL裂解液浸泡洗涤Microkan 5min;
4.晾干或离心干燥:合并两次裂解液,离心浓缩至少量;
5.沉淀:将事先用冰水浴充分冷却的甲基叔丁基醚/石油醚(v/v:3/1)加入到残余物中,放入冰水浴中冷却20min使析晶完全;
6.离心:离心沉淀多肽化合物(3000rpm以上),10min后取出,小心倾去上清夜;
7.洗涤多肽:加入冷却的甲基叔丁基醚/石油醚,充分洗涤后,离心,倾去上清夜;
8.重复步骤7的操作一次;
9.晾干:将多肽残余物在室温下挥干,直至完全干燥;
10.检测:抽检部分多肽样品,用10%HOAc/H2O或30%CH3CN/H2O或60%CH3CN/H2O溶解,并用HPLC-MS检测纯度。
实施例3
设计合成Membrane(M)蛋白、Envelop(E)蛋白和Nucleocapside(N)蛋白全部氨基酸序列的每10位氨基酸“交叉重叠”序列如下。从右至左为合成次序,代表合成步骤号码为阿拉伯数字1到10。
M-蛋白:
   表25  所合成的M-蛋白212个以10个氨基酸为长度的序列
 编号   10    9    8    7    6    5    4    3    2    1
 1.     M     A    D    N    G    T    I    T    V    E
 2.     A     D    N    G    T    I    T    V    E    E
 3.     D     N    G    T    I    T    V    E    E    L
 4.     N     G    T    I    T    V    E    E    L    K
 5.     G     T    I    T    V    E    E    L    K    Q
 6.     T     I    T    V    E    E    L    K    Q    L
 7.     I     T    V    E    E    L    K    Q    L    L
 8.     T     V    E    E    L    K    Q    L    L    E
 9.     V     E    E    L    K    Q    L    L    E    Q
10.     E     E    L    K    Q    L    L    E    Q    W
11.     E     L    K    Q    L    L    E    Q    W    N
12.     L     K    Q    L    L    E    Q    W    N    L
13.     K     Q    L    L    E    Q    W    N    L    V
14.     Q     L    L    E    Q    W    N    L    V    I
15.     L     L    E    Q    W    N    L    V    I    G
16.     L     E    Q    W    N    L    V    I    G    F
17.     E     Q    W    N    L    V    I    G    F    L
18.     Q     W    N    L    V    I    G    F    L    F
19.     W     N    L    V    I    G    F    L    F    L
20.    N    L    V    I    G    F    L    F    L    A
21.    L    V    I    G    F    L    F    L    A    W
22.    V    I    G    F    L    F    L    A    W    I
23.    I    G    F    L    F    L    A    W    I    M
24.    G    F    L    F    L    A    W    I    M    L
25.    F    L    F    L    A    W    I    M    L    L
26.    L    F    L    A    W    I    M    L    L    Q
27.    F    L    A    W    I    M    L    L    Q    F
28.    L    A    W    I    M    L    L    Q    F    A
29.    A    W    I    M    L    L    Q    F    A    Y
30.    W    I    M    L    L    Q    F    A    Y    S
31.    I    M    L    L    Q    F    A    Y    S    N
32.    M    L    L    Q    F    A    Y    S    N    R
33.    L    L    Q    F    A    Y    S    N    R    N
34.    L    Q    F    A    Y    S    N    R    N    R
35.    Q    F    A    Y    S    N    R    N    R    F
36.    F    A    Y    S    N    R    N    R    F    L
37.    A    Y    S    N    R    N    R    F    L    Y
38.    Y    S    N    R    N    R    F    L    Y    I
39.    S    N    R    N    R    F    L    Y    I    I
40.    N    R    N    R    F    L    Y    I    I    K
41.    R    N    R    F    L    Y    I    I    K    L
42.    N    R    F    L    Y    I    I    K    L    V
43.    R    F    L    Y    I    I    K    L    V    F
44.    F    L    Y    I    I    K    L    V    F    L
45.    L    Y    I    I    K    L    V    F    L    W
46.    Y    I    I    K    L    V    F    L    W    L
47.    I    I    K    L    V    F    L    W    L    L
48.    I    K    L    V    F    L    W    L    L    W
49.    K    L    V    F    L    W    L    L    W    P
50.    L    V    F    L    W    L    L    W    P    V
51.    V    F    L    W    L    L    W    P    V    T
52.    F    L    W    L    L    W    P    V    T    L
53.    L    W    L    L    W    P    V    T    L    A
54.    W    L    L    W    P    V    T    L    A    C
55.    L    L    W    P    V    T    L    A    C    F
56.    L    W    P    V    T    L    A    C    F    V
57.    W    P    V    T    L    A    C    F    V    L
58.    P    V    T    L    A    C    F    V    L    A
59.    V    T    L    A    C    F    V    L    A    A
60.    T    L    A    C    F    V    L    A    A    V
61.    L    A    C    F    V    L    A    A    V    Y
62.    A    C    F    V    L    A    A    V    Y    R
63.    C    F    V    L    A    A    V    Y    R    I
64.    F    V    L    A    A    V    Y    R    I    N
65.    V    L    A    A    V    Y    R    I    N    W
66.    L    A    A    V    Y    R    I    N    W    V
67.    A    A    V    Y    R    I    N    W    V    T
68.    A    V    Y    R    I    N    W    V    T    G
69.    V    Y    R    I    N    W    V    T    G    G
 70.    Y    R    I    N    W    V    T    G    G    I
 71.    R    I    N    W    V    T    G    G    I    A
 72.    I    N    W    V    T    G    G    I    A    I
 73.    N    W    V    T    G    G    I    A    I    A
 74.    W    V    T    G    G    I    A    I    A    M
 75.    V    T    G    G    I    A    I    A    M    A
 76.    T    G    G    I    A    I    A    M    A    C
 77.    G    G    I    A    I    A    M    A    C    I
 78.    G    I    A    I    A    M    A    C    I    V
 79.    I    A    I    A    M    A    C    I    V    G
 80.    A    I    A    M    A    C    I    V    G    L
 81.    I    A    M    A    C    I    V    G    L    M
 82.    A    M    A    C    I    V    G    L    M    W
 83.    M    A    C    I    V    G    L    M    W    L
 84.    A    C    I    V    G    L    M    W    L    S
 85.    C    I    V    G    L    M    W    L    S    Y
 86.    I    V    G    L    M    W    L    S    Y    F
 87.    V    G    L    M    W    L    S    Y    F    V
 88.    G    L    M    W    L    S    Y    F    V    A
 89.    L    M    W    L    S    Y    F    V    A    S
 90.    M    W    L    S    Y    F    V    A    S    F
 91.    W    L    S    Y    F    V    A    S    F    R
 92.    L    S    Y    F    V    A    S    F    R    L
 93.    S    Y    F    V    A    S    F    R    L    F
 94.    Y    F    V    A    S    F    R    L    F    A
 95.    F    V    A    S    F    R    L    F    A    R
 96.    V    A    S    F    R    L    F    A    R    T
 97.    A    S    F    R    L    F    A    R    T    R
 98.    S    F    R    L    F    A    R    T    R    S
 99.    F    R    L    F    A    R    T    R    S    M
100.    R    L    F    A    R    T    R    S    M    W
101.    L    F    A    R    T    R    S    M    W    S
102.    F    A    R    T    R    S    M    W    S    F
103.    A    R    T    R    S    M    W    S    F    N
104.    R    T    R    S    M    W    S    F    N    P
105.    T    R    S    M    W    S    F    N    P    E
106.    R    S    M    W    S    F    N    P    E    T
107.    S    M    W    S    F    N    P    E    T    N
108.    M    W    S    F    N    P    E    T    N    I
109.    W    S    F    N    P    E    T    N    I    L
110.    S    F    N    P    E    T    N    I    L    L
111.    F    N    P    E    T    N    I    L    L    N
112.    N    P    E    T    N    I    L    L    N    V
113.    P    E    T    N    I    L    L    N    V    P
114.    E    T    N    I    L    L    N    V    P    L
115.    T    N    I    L    L    N    V    P    L    R
116.    N    I    L    L    N    V    P    L    R    G
117.    I    L    L    N    V    P    L    R    G    T
118.    L    L    N    V    P    L    R    G    T    I
119.    L    N    V    P    L    R    G    T    I    V
120.    N    V    P    L    R    G    T    I    V    T
121.    V    P    L    R    G    T    I    V    T    R
122.    P    L    R    G    T    I    V    T    R    P
123.    L    R    G    T    I    V    T    R    P    L
124.    R    G    T    I    V    T    R    P    L    M
125.    G    T    I    V    T    R    P    L    M    E
126.    T    I    V    T    R    P    L    M    E    S
127.    I    V    T    R    P    L    M    E    S    E
128.    V    T    R    P    L    M    E    S    E    L
129.    T    R    P    L    M    E    S    E    L    V
130.    R    P    L    M    E    S    E    L    V    I
131.    P    L    M    E    S    E    L    V    I    G
132.    L    M    E    S    E    L    V    I    G    A
133.    M    E    S    E    L    V    I    G    A    V
134.    E    S    E    L    V    I    G    A    V    I
135.    S    E    L    V    I    G    A    V    I    I
136.    E    L    V    I    G    A    V    I    I    R
137.    L    V    I    G    A    V    I    I    R    G
138.    V    I    G    A    V    I    I    R    G    H
139.    I    G    A    V    I    I    R    G    H    L
140.    G    A    V    I    I    R    G    H    L    R
141.    A    V    I    I    R    G    H    L    R    M
142.    V    I    I    R    G    H    L    R    M    A
143.    I    I    R    G    H    L    R    M    A    G
144.    I    R    G    H    L    R    M    A    G    H
145.    R    G    H    L    R    M    A    G    H    S
146.    G    H    L    R    M    A    G    H    S    L
147.    H    L    R    M    A    G    H    S    L    G
148.    L    R    M    A    G    H    S    L    G    R
149.    R    M    A    G    H    S    L    G    R    C
150.    M    A    G    H    S    L    G    R    C    D
151.    A    G    H    S    L    G    R    C    D    I
152.    G    H    S    L    G    R    C    D    I    K
153.    H    S    L    G    R    C    D    I    K    D
154.    S    L    G    R    C    D    I    K    D    L
155.    L    G    R    C    D    I    K    D    L    P
156.    G    R    C    D    I    K    D    L    P    K
157.    R    C    D    I    K    D    L    P    K    E
158.    C    D    I    K    D    L    P    K    E    I
159.    D    I    K    D    L    P    K    E    I    T
160.    I    K    D    L    P    K    E    I    T    V
161.    K    D    L    P    K    E    I    T    V    A
162.    D    L    P    K    E    I    T    V    A    T
163.    L    P    K    E    I    T    V    A    T    S
164.    P    K    E    I    T    V    A    T    S    R
165.    K    E    I    T    V    A    T    S    R    T
166.    E    I    T    V    A    T    S    R    T    L
167.    I    T    V    A    T    S    R    T    L    S
168.    T    V    A    T    S    R    T    L    S    Y
169.    V    A    T    S    R    T    L    S    Y    Y
170.    A    T    S    R    T    L    S    Y    Y    K
171.    T    S    R    T    L    S    Y    Y    K    L
172.    S    R    T    L    S    Y    Y    K    L    G
173.    R    T    L    S    Y    Y    K    L    G    A
174.    T    L    S    Y    Y    K    L    G    A    S
175.    L    S    Y    Y    K    L    G    A    S    Q
176.    S    Y    Y    K    L    G    A    S    Q    R
177.    Y    Y    K    L    G    A    S    Q    R    V
178.    Y    K    L    G    A    S    Q    R    V    G
179.    K    L    G    A    S    Q    R    V    G    T
180.    L    G    A    S    Q    R    V    G    T    D
181.    G    A    S    Q    R    V    G    T    D    S
182.    A    S    Q    R    V    G    T    D    S    G
183.    S    Q    R    V    G    T    D    S    G    F
184.    Q    R    V    G    T    D    S    G    F    A
185.    R    V    G    T    D    S    G    F    A    A
186.    V    G    T    D    S    G    F    A    A    Y
187.    G    T    D    S    G    F    A    A    Y    N
188.    T    D    S    G    F    A    A    Y    N    R
189.    D    S    G    F    A    A    Y    N    R    Y
190.    S    G    F    A    A    Y    N    R    Y    R
191.    G    F    A    A    Y    N    R    Y    R    I
192.    F    A    A    Y    N    R    Y    R    I    G
193.    A    A    Y    N    R    Y    R    I    G    N
194.    A    Y    N    R    Y    R    I    G    N    Y
195.    Y    N    R    Y    R    I    G    N    Y    K
196.    N    R    Y    R    I    G    N    Y    K    L
197.    R    Y    R    I    G    N    Y    K    L    N
198.    Y    R    I    G    N    Y    K    L    N    T
199.    R    I    G    N    Y    K    L    N    T    D
200.    I    G    N    Y    K    L    N    T    D    H
201.    G    N    Y    K    L    N    T    D    H    A
202.    N    Y    K    L    N    T    D    H    A    G
203.    Y    K    L    N    T    D    H    A    G    S
204.    K    L    N    T    D    H    A    G    S    N
205.    L    N    T    D    H    A    G    S    N    D
206.    N    T    D    H    A    G    S    N    D    N
207.    T    D    H    A    G    S    N    D    N    I
208.    D    H    A    G    S    N    D    N    I    A
209.    H    A    G    S    N    D    N    I    A    L
210.    A    G    S    N    D    N    I    A    L    L
211.    G    S    N    D    N    I    A    L    L    V
212.    S    N    D    N    I    A    L    L    V    Q
     表26所合成的E-蛋白67个以10个氨基酸为长度的序列
213.    M    Y    S    F    V    S    E    E    T    G
214.    Y    S    F    V    S    E    E    T    G    T
215.    S    F    V    S    E    E    T    G    T    L
216.    F    V    S    E    E    T    G    T    L    I
217.    V    S    E    E    T    G    T    L    I    V
218.    S    E    E    T    G    T    L    I    V    N
219.    E    E    T    G    T    L    I    V    N    S
220.    E    T    G    T    L    I    V    N    S    V
221.    T    G    T    L    I    V    N    S    V    L
222.    G    T    L    I    V    N    S    V    L    L
223.    T    L    I    V    N    S    V    L    L    F
224.    L    I    V    N    S    V    L    L    F    L
225.    I    V    N    S    V    L    L    F    L    A
226.    V    N    S    V    L    L    F    L    A    F
227.    N    S    V    L    L    F    L    A    F    V
228.    S    V    L    L    F    L    A    F    V    V
229.    V    L    L    F    L    A    F    V    V    F
230.    L    L    F    L    A    F    V    V    F    L
231.    L    F    L    A    F    V    V    F    L    L
232.    F    L    A    F    V    V    F    L    L    V
233.    L    A    F    V    V    F    L    L    V    T
234.    A    F    V    V    F    L    L    V    T    L
235.    F    V    V    F    L    L    V    T    L    A
236.    V    V    F    L    L    V    T    L    A    I
237.    V    F    L    L    V    T    L    A    I    L
238.    F    L    L    V    T    L    A    I    L    T
239.    L    L    V    T    L    A    I    L    T    A
240.    L    V    T    L    A    I    L    T    A    L
241.    V    T    L    A    I    L    T    A    L    R
242.    T    L    A    I    L    T    A    L    R    L
243.    L    A    I    L    T    A    L    R    L    C
244.    A    I    L    T    A    L    R    L    C    A
245.    I    L    T    A    L    R    L    C    A    Y
246.    L    T    A    L    R    L    C    A    Y    C
247.    T    A    L    R    L    C    A    Y    C    C
248.    A    L    R    L    C    A    Y    C    C    N
249.    L    R    L    C    A    Y    C    C    N    I
250.    R    L    C    A    Y    C    C    N    I    V
251.    L    C    A    Y    C    C    N    I    V    N
252.    C    A    Y    C    C    N    I    V    N    V
253.    A    Y    C    C    N    I    V    N    V    S
254.    Y    C    C    N    I    V    N    V    S    L
255.    C    C    N    I    V    N    V    S    L    V
256.    C    N    I    V    N    V    S    L    V    K
257.    N    I    V    N    V    S    L    V    K    P
258.    I    V    N    V    S    L    V    K    P    T
259.    V    N    V    S    L    V    K    P    T    V
260.    N    V    S    L    V    K    P    T    V    Y
261.    V    S    L    V    K    P    T    V    Y    V
262.    S    L    V    K    P    T    V    Y    V    Y
263.    L    V    K    P    T    V    Y    V    Y    S
264.    V    K    P    T    V    Y    V    Y    S    R
265.    K    P    T    V    Y    V    Y    S    R    V
266.    P    T    V    Y    V    Y    S    R    V    K
267.    T    V    Y    V    Y    S    R    V    K    N
268.    V    Y    V    Y    S    R    V    K    N    L
269.    Y    V    Y    S    R    V    K    N    L    N
270.    V    Y    S    R    V    K    N    L    N    S
271.    Y    S    R    V    K    N    L    N    S    S
272.    S    R    V    K    N    L    N    S    S    E
273.    R    V    K    N    L    N    S    S    E    G
274.    V    K    N    L    N    S    S    E    G    V
275.    K    N    L    N    S    S    E    G    V    P
276.    N    L    N    S    S    E    G    V    P    D
277.    L    N    S    S    E    G    V    P    D    L
278.    N    S    S    E    G    V    P    D    L    L
279.    S    S    E    G    V    P    D    L    L    V
  表27所合成的N-蛋白的413个以10个氨基酸为长度的序列
280.    M    S    D    N    G    P    Q    S    N    Q
281.    S    D    N    G    P    Q    S    N    Q    R
282.    D    N    G    P    Q    S    N    Q    R    S
283.    N    G    P    Q    S    N    Q    R    S    A
284.    G    P    Q    S    N    Q    R    S    A    P
285.    P    Q    S    N    Q    R    S    A    P    R
286.    Q    S    N    Q    R    S    A    P    R    I
287.    S    N    Q    R    S    A    P    R    I    T
288.    N    Q    R    S    A    P    R    I    T    F
289.    Q    R    S    A    P    R    I    T    F    G
290.    R    S    A    P    R    I    T    F    G    G
291.    S    A    P    R    I    T    F    G    G    P
292.    A    P    R    I    T    F    G    G    P    T
293.    P    R    I    T    F    G    G    P    T    D
294.    R    I    T    F    G    G    P    T    D    S
295.    I    T    F    G    G    P    T    D    S    T
296.    T    F    G    G    P    T    D    S    T    D
297.    F    G    G    P    T    D    S    T    D    N
298.    G    G    P    T    D    S    T    D    N    N
299.    G    P    T    D    S    T    D    N    N    Q
300.    P    T    D    S    T    D    N    N    Q    N
301.    T    D    S    T    D    N    N    Q    N    G
302.    D    S    T    D    N    N    Q    N    G    G
303.    S    T    D    N    N    Q    N    G    G    R
304.    T    D    N    N    Q    N    G    G    R    N
305.    D    N    N    Q    N    G    G    R    N    G
306.    N    N    Q    N    G    G    R    N    G    A
307.    N    Q    N    G    G    R    N    G    A    R
308.    Q    N    G    G    R    N    G    A    R    P
309.    N    G    G    R    N    G    A    R    P    K
310.    G    G    R    N    G    A    R    P    K    Q
311.    G    R    N    G    A    R    P    K    Q    R
312.    R    N    G    A    R    P    K    Q    R    R
313.    N    G    A    R    P    K    Q    R    R    P
314.    G    A    R    P    K    Q    R    R    P    Q
315.    A    R    P    K    Q    R    R    P    Q    G
316.    R    P    K    Q    R    R    P    Q    G    L
317.    P    K    Q    R    R    P    Q    G    L    P
318.    K    Q    R    R    P    Q    G    L    P    N
319.    Q    R    R    P    Q    G    L    P    N    N
320.    R    R    P    Q    G    L    P    N    N    T
321.    R    P    Q    G    L    P    N    N    T    A
322.    P    Q    G    L    P    N    N    T    A    S
323.    Q    G    L    P    N    N    T    A    S    W
324.    G    L    P    N    N    T    A    S    W    F
325.    L    P    N    N    T    A    S    W    F    T
326.    P    N    N    T    A    S    W    F    T    A
327.    N    N    T    A    S    W    F    T    A    L
328.    N    T    A    S    W    F    T    A    L    T
329.    T    A    S    W    F    T    A    L    T    Q
330.    A    S    W    F    T    A    L    T    Q    H
331.    S    W    F    T    A    L    T    Q    H    G
332.    W    F    T    A    L    T    Q    H    G    K
333.    F    T    A    L    T    Q    H    G    K    E
334.    T    A    L    T    Q    H    G    K    E    E
335.    A    L    T    Q    H    G    K    E    E    L
336.    L    T    Q    H    G    K    E    E    L    R
337.    T    Q    H    G    K    E    E    L    R    F
338.    Q    H    G    K    E    E    L    R    F    P
339.    H    G    K    E    E    L    R    F    P    R
340.    G    K    E    E    L    R    F    P    R    G
341.    K    E    E    L    R    F    P    R    G    Q
342.    E    E    L    R    F    P    R    G    Q    G
343.    E    L    R    F    P    R    G    Q    G    V
344.    L    R    F    P    R    G    Q    G    V    P
345.    R    F    P    R    G    Q    G    V    P    I
346.    F    P    R    G    Q    G    V    P    I    N
347.    P    R    G    Q    G    V    P    I    N    T
348.    R    G    Q    G    V    P    I    N    T    N
349.    G    Q    G    V    P    I    N    T    N    S
350.    Q    G    V    P    I    N    T    N    S    G
351.    G    V    P    I    N    T    N    S    G    P
352.    V    P    I    N    T    N    S    G    P    D
353.    P    I    N    T    N    S    G    P    D    D
354.    I    N    T    N    S    G    P    D    D    Q
355.    N    T    N    S    G    P    D    D    Q    I
356.    T    N    S    G    P    D    D    Q    I    G
357.    N    S    G    P    D    D    Q    I    G    Y
358.    S    G    P    D    D    Q    I    G    Y    Y
359.    G    P    D    D    Q    I    G    Y    Y    R
360.    P    D    D    Q    I    G    Y    Y    R    R
361.    D    D    Q    I    G    Y    Y    R    R    A
362.    D    Q    I    G    Y    Y    R    R    A    T
363.    Q    I    G    Y    Y    R    R    A    T    R
364.    I    G    Y    Y    R    R    A    T    R    R
365.    G    Y    Y    R    R    A    T    R    R    V
366.    Y    Y    R    R    A    T    R    R    V    R
367.    Y    R    R    A    T    R    R    V    R    G
368.    R    R    A    T    R    R    V    R    G    G
369.    R    A    T    R    R    V    R    G    G    D
370.    A    T    R    R    V    R    G    G    D    G
371.    T    R    R    V    R    G    G    D    G    K
372.    R    R    V    R    G    G    D    G    K    M
373.    R    V    R    G    G    D    G    K    M    K
374.    V    R    G    G    D    G    K    M    K    E
375.    R    G    G    D    G    K    M    K    E    L
376.    G    G    D    G    K    M    K    E    L    S
377.    G    D    G    K    M    K    E    L    S    P
378.    D    G    K    M    K    E    L    S    P    R
379.    G    K    M    K    E    L    S    P    R    W
380.    K    M    K    E    L    S    P    R    W    Y
381.    M    K    E    L    S    P    R    W    Y    F
382.    K    E    L    S    P    R    W    Y    F    Y
383.    E    L    S    P    R    W    Y    F    Y    Y
384.    L    S    P    R    W    Y    F    Y    Y    L
385.    S    P    R    W    Y    F    Y    Y    L    G
386.    P    R    W    Y    F    Y    Y    L    G    T
387.    R    W    Y    F    Y    Y    L    G    T    G
388.    W    Y    F    Y    Y    L    G    T    G    P
389.    Y    F    Y    Y    L    G    T    G    P    E
390.    F    Y    Y    L    G    T    G    P    E    A
391.    Y    Y    L    G    T    G    P    E    A    S
392.    Y    L    G    T    G    P    E    A    S    L
393.    L    G    T    G    P    E    A    S    L    P
394.    G    T    G    P    E    A    S    L    P    Y
395.    T    G    P    E    A    S    L    P    Y    G
396.    G    P    E    A    S    L    P    Y    G    A
397.    P    E    A    S    L    P    Y    G    A    N
398.    E    A    S    L    P    Y    G    A    N    K
399.    A    S    L    P    Y    G    A    N    K    E
400.    S    L    P    Y    G    A    N    K    E    G
401.    L    P    Y    G    A    N    K    E    G    I
402.    P    Y    G    A    N    K    E    G    I    V
403.    Y    G    A    N    K    E    G    I    V    W
404.    G    A    N    K    E    G    I    V    W    V
405.    A    N    K    E    G    I    V    W    V    A
406.    N    K    E    G    I    V    W    V    A    T
407.    K    E    G    I    V    W    V    A    T    E
408.    E    G    I    V    W    V    A    T    E    G
409.    G    I    V    W    V    A    T    E    G    A
410.    I    V    W    V    A    T    E    G    A    L
411.    V    W    V    A    T    E    G    A    L    N
412.    W    V    A    T    E    G    A    L    N    T
413.    V    A    T    E    G    A    L    N    T    P
414.    A    T    E    G    A    L    N    T    P    K
415.    T    E    G    A    L    N    T    P    K    D
416.    E    G    A    L    N    T    P    K    D    H
417.    G    A    L    N    T    P    K    D    H    I
418.    A    L    N    T    P    K    D    H    I    G
419.    L    N    T    P    K    D    H    I    G    T
420.    N    T    P    K    D    H    I    G    T    R
421.    T    P    K    D    H    I    G    T    R    N
422.    P    K    D    H    I    G    T    R    N    P
423.    K    D    H    I    G    T    R    N    P    N
424.    D    H    I    G    T    R    N    P    N    N
425.    H    I    G    T    R    N    P    N    N    N
426.    I    G    T    R    N    P    N    N    N    A
427.    G    T    R    N    P    N    N    N    A    A
428.    T    R    N    P    N    N    N    A    A    T
429.    R    N    P    N    N    N    A    A    T    V
430.    N    P    N    N    N    A    A    T    V    L
431.    P    N    N    N    A    A    T    V    L    Q
432.    N    N    N    A    A    T    V    L    Q    L
433.    N    N    A    A    T    V    L    Q    L    P
434.    N    A    A    T    V    L    Q    L    P    Q
435.    A    A    T    V    L    Q    L    P    Q    G
436.    A    T    V    L    Q    L    P    Q    G    T
437.    T    V    L    Q    L    P    Q    G    T    T
438.    V    L    Q    L    P    Q    G    T    T    L
439.    L    Q    L    P    Q    G    T    T    L    P
440.    Q    L    P    Q    G    T    T    L    P    K
441.    L    P    Q    G    T    T    L    P    K    G
442.    P    Q    G    T    T    L    P    K    G    F
443.    Q    G    T    T    L    P    K    G    F    Y
444.    G    T    T    L    P    K    G    F    Y    A
445.    T    T    L    P    K    G    F    Y    A    E
446.    T    L    P    K    G    F    Y    A    E    G
447.    L    P    K    G    F    Y    A    E    G    S
448.    P    K    G    F    Y    A    E    G    S    R
449.    K    G    F    Y    A    E    G    S    R    G
450.    G    F    Y    A    E    G    S    R    G    G
451.    F    Y    A    E    G    S    R    G    G    S
452.    Y    A    E    G    S    R    G    G    S    Q
453.    A    E    G    S    R    G    G    S    Q    A
454.    E    G    S    R    G    G    S    Q    A    S
455.    G    S    R    G    G    S    Q    A    S    S
456.    S    R    G    G    S    Q    A    S    S    R
457.    R    G    G    S    Q    A    S    S    R    S
458.    G    G    S    Q    A    S    S    R    S    S
459.    G    S    Q    A    S    S    R    S    S    S
460.    S    Q    A    S    S    R    S    S    S    R
461.    Q    A    S    S    R    S    S    S    R    S
462.    A    S    S    R    S    S    S    R    S    R
463.    S    S    R    S    S    S    R    S    R    G
464.    S    R    S    S    S    R    S    R    G    N
465.    R    S    S    S    R    S    R    G    N    S
466.    S    S    S    R    S    R    G    N    S    R
467.    S    S    R    S    R    G    N    S    R    N
468.    S    R    S    R    G    N    S    R    N    S
469.    R    S    R    G    N    S    R    N    S    T
470.    S    R    G    N    S    R    N    S    T    P
471.    R    G    N    S    R    N    S    T    P    G
472.    G    N    S    R    N    S    T    P    G    S
473.    N    S    R    N    S    T    P    G    S    S
474.    S    R    N    S    T    P    G    S    S    R
475.    R    N    S    T    P    G    S    S    R    G
476.    N    S    T    P    G    S    S    R    G    N
477.    S    T    P    G    S    S    R    G    N    S
478.    T    P    G    S    S    R    G    N    S    P
479.    P    G    S    S    R    G    N    S    P    A
480.    G    S    S    R    G    N    S    P    A    R
481.    S    S    R    G    N    S    P    A    R    M
482.    S    R    G    N    S    P    A    R    M    A
483.    R    G    N    S    P    A    R    M    A    S
484.    G    N    S    P    A    R    M    A    S    G
485.    N    S    P    A    R    M    A    S    G    G
486.    S    P    A    R    M    A    S    G    G    G
487.    P    A    R    M    A    S    G    G    G    E
488.    A    R    M    A    S    G    G    G    E    T
489.    R    M    A    S    G    G    G    E    T    A
490.    M    A    S    G    G    G    E    T    A    L
491.    A    S    G    G    G    E    T    A    L    A
492.    S    G    G    G    E    T    A    L    A    L
493.    G    G    G    E    T    A    L    A    L    L
494.    G    G    E    T    A    L    A    L    L    L
495.    G    E    T    A    L    A    L    L    L    L
496.    E    T    A    L    A    L    L    L    L    D
497.    T    A    L    A    L    L    L    L    D    R
498.    A    L    A    L    L    L    L    D    R    L
499.    L    A    L    L    L    L    D    R    L    N
500.    A    L    L    L    L    D    R    L    N    Q
501.    L    L    L    L    D    R    L    N    Q    L
502.    L    L    L    D    R    L    N    Q    L    E
503.    L    L    D    R    L    N    Q    L    E    S
504.    L    D    R    L    N    Q    L    E    S    K
505.    D    R    L    N    Q    L    E    S    K    V
506.    R    L    N    Q    L    E    S    K    V    S
507.    L    N    Q    L    E    S    K    V    S    G
S08.    N    Q    L    E    S    K    V    S    G    K
509.    Q    L    E    S    K    V    S    G    K    G
510.    L    E    S    K    V    S    G    K    G    Q
511.    E    S    K    V    S    G    K    G    Q    Q
512.    S    K    V    S    G    K    G    Q    Q    Q
513.    K    V    S    G    K    G    Q    Q    Q    Q
514.    V    S    G    K    G    Q    Q    Q    Q    G
515.    S    G    K    G    Q    Q    Q    Q    G    Q
516.    G    K    G    Q    Q    Q    Q    G    Q    T
517.    K    G    Q    Q    Q    Q    G    Q    T    V
518.    G    Q    Q    Q    Q    G    Q    T    V    T
519.    Q    Q    Q    Q    G    Q    T    V    T    K
520.    Q    Q    Q    G    Q    T    V    T    K    K
521.    Q    Q    G    Q    T    V    T    K    K    S
522.    Q    G    Q    T    V    T    K    K    S    A
523.    G    Q    T    V    T    K    K    S    A    A
524.    Q    T    V    T    K    K    S    A    A    E
525.    T    V    T    K    K    S    A    A    E    A
526.    V    T    K    K    S    A    A    E    A    S
527.    T    K    K    S    A    A    E    A    S    K
528.    K    K    S    A    A    E    A    S    K    K
529.    K    S    A    A    E    A    S    K    K    P
530.    S    A    A    E    A    S    K    K    P    R
531.    A    A    E    A    S    K    K    P    R    Q
532.    A    E    A    S    K    K    P    R    Q    K
533.    E    A    S    K    K    P    R    Q    K    R
534.    A    S    K    K    P    R    Q    K    R    T
535.    S    K    K    P    R    Q    K    R    T    A
536.    K    K    P    R    Q    K    R    T    A    T
537.    K    P    R    Q    K    R    T    A    T    K
538.    P    R    Q    K    R    T    A    T    K    Q
539.    R    Q    K    R    T    A    T    K    Q    Y
540.    Q    K    R    T    A    T    K    Q    Y    N
541.    K    R    T    A    T    K    Q    Y    N    V
542.    R    T    A    T    K    Q    Y    N    V    T
543.    T    A    T    K    Q    Y    N    V    T    Q
544.    A    T    K    Q    Y    N    V    T    Q    A
545.    T    K    Q    Y    N    V    T    Q    A    F
546.    K    Q    Y    N    V    T    Q    A    F    G
547.    Q    Y    N    V    T    Q    A    F    G    R
548.    Y    N    V    T    Q    A    F    G    R    R
549.    N    V    T    Q    A    F    G    R    R    G
550.    V    T    Q    A    F    G    R    R    G    P
551.    T    Q    A    F    G    R    R    G    P    E
552.    Q    A    F    G    R    R    G    P    E    Q
553.    A    F    G    R    R    G    P    E    Q    T
554.    F    G    R    R    G    P    E    Q    T    Q
555.    G    R    R    G    P    E    Q    T    Q    G
556.    R    R    G    P    E    Q    T    Q    G    N
557.    R    G    P    E    Q    T    Q    G    N    F
558.    G    P    E    Q    T    Q    G    N    F    G
559.    P    E    Q    T    Q    G    N    F    G    D
560.    E    Q    T    Q    G    N    F    G    D    Q
561.    Q    T    Q    G    N    F    G    D    Q    D
562.    T    Q    G    N    F    G    D    Q    D    L
563.    Q    G    N    F    G    D    Q    D    L    I
564.    G    N    F    G    D    Q    D    L    I    R
565.    N    F    G    D    Q    D    L    I    R    Q
566.    F    G    D    Q    D    L    I    R    Q    G
567.    G    D    Q    D    L    I    R    Q    G    T
568.    D    Q    D    L    I    R    Q    G    T    D
569.    Q    D    L    I    R    Q    G    T    D    Y
570.    D    L    I    R    Q    G    T    D    Y    K
571.    L    I    R    Q    G    T    D    Y    K    H
572.    I    R    Q    G    T    D    Y    K    H    W
573.    R    Q    G    T    D    Y    K    H    W    P
574.    Q    G    T    D    Y    K    H    W    P    Q
575.    G    T    D    Y    K    H    W    P    Q    I
576.    T    D    Y    K    H    W    P    Q    I    A
577.    D    Y    K    H    W    P    Q    I    A    Q
578.    Y    K    H    W    P    Q    I    A    Q    F
579.    K    H    W    P    Q    I    A    Q    F    A
580.    H    W    P    Q    I    A    Q    F    A    P
581.    W    P    Q    I    A    Q    F    A    P    S
582.    P    Q    I    A    Q    F    A    P    S    A
583.    Q    I    A    Q    F    A    P    S    A    S
584.    I    A    Q    F    A    P    S    A    S    A
585.    A    Q    F    A    P    S    A    S    A    F
586.    Q    F    A    P    S    A    S    A    F    F
587.    F    A    P    S    A    S    A    F    F    G
588.    A    P    S    A    S    A    F    F    G    M
589.    P    S    A    S    A    F    F    G    M    S
590.    S    A    S    A    F    F    G    M    S    R
591.    A    S    A    F    F    G    M    S    R    I
592.    S    A    F    F    G    M    S    R    I    G
593.    A    F    F    G    M    S    R    I    G    M
594.    F    F    G    M    S    R    I    G    M    E
595.    F    G    M    S    R    I    G    M    E    V
596.    G    M    S    R    I    G    M    E    V    T
597.    M    S    R    I    G    M    E    V    T    P
598.    S    R    I    G    M    E    V    T    P    S
599.    R    I    G    M    E    V    T    P    S    G
600.    I    G    M    E    V    T    P    S    G    T
601.    G    M    E    V    T    P    S    G    T    W
602.    M    E    V    T    P    S    G    T    W    L
603.    E    V    T    P    S    G    T    W    L    T
604.    V    T    P    S    G    T    W    L    T    Y
605.    T    P    S    G    T    W    L    T    Y    H
606.    P    S    G    T    W    L    T    Y    H    G
607.    S    G    T    W    L    T    Y    H    G    A
608.    G    T    W    L    T    Y    H    G    A    I
609.    T    W    L    T    Y    H    G    A    I    K
610.    W    L    T    Y    H    G    A    I    K    L
611.    L    T    Y    H    G    A    I    K    L    D
612.    T    Y    H    G    A    I    K    L    D    D
613.    Y    H    G    A    I    K    L    D    D    K
614.    H    G    A    I    K    L    D    D    K    D
615.    G    A    I    K    L    D    D    K    D    P
616.    A    I    K    L    D    D    K    D    P    Q
617.    I    K    L    D    D    K    D    P    Q    F
618.    K    L    D    D    K    D    P    Q    F    K
619.    L    D    D    K    D    P    Q    F    K    D
620.    D    D    K    D    P    Q    F    K    D    N
621.    D    K    D    P    Q    F    K    D    N    V
622.    K    D    P    Q    F    K    D    N    V    I
623.    D    P    Q    F    K    D    N    V    I    L
624.    P    Q    F    K    D    N    V    I    L    L
625.    Q    F    K    D    N    V    I    L    L    N
626.    F    K    D    N    V    I    L    L    N    K
627.    K    D    N    V    I    L    L    N    K    H
628.    D    N    V    I    L    L    N    K    H    I
629.    N    V    I    L    L    N    K    H    I    D
630.    V    I    L    L    N    K    H    I    D    A
631.    I    L    L    N    K    H    I    D    A    Y
632.    L    L    N    K    H    I    D    A    Y    K
633.    L    N    K    H    I    D    A    Y    K    T
634.    N    K    H    I    D    A    Y    K    T    F
635.    K    H    I    D    A    Y    K    T    F    P
636.    H    I    D    A    Y    K    T    F    P    P
637.    I    D    A    Y    K    T    F    P    P    T
638.    D    A    Y    K    T    F    P    P    T    E
639.    A    Y    K    T    F    P    P    T    E    P
640.    Y    K    T    F    P    P    T    E    P    K
641.    K    T    F    P    P    T    E    P    K    K
642.    T    F    P    P    T    E    P    K    K    D
643.    F    P    P    T    E    P    K    K    D    K
644.    P    P    T    E    P    K    K    D    K    K
645.    P    T    E    P    K    K    D    K    K    K
646.    T    E    P    K    K    D    K    K    K    K
647.    E    P    K    K    D    K    K    K    K    T
648.    P    K    K    D    K    K    K    K    T    D
649.    K    K    D    K    K    K    K    T    D    E
650.    K    D    K    K    K    K    T    D    E    A
651.    D    K    K    K    K    T    D    E    A    Q
652.    K    K    K    K    T    D    E    A    Q    P
653.    K    K    K    T    D    E    A    Q    P    L
654.    K    K    T    D    E    A    Q    P    L    P
655.    K    T    D    E    A    Q    P    L    P    Q
656.    T    D    E    A    Q    P    L    P    Q    R
657.    D    E    A    Q    P    L    P    Q    R    Q
658.    E    A    Q    P    L    P    Q    R    Q    K
659.    A    Q    P    L    P    Q    R    Q    K    K
660.    Q    P    L    P    Q    R    Q    K    K    Q
661.    P    L    P    Q    R    Q    K    K    Q    P
662.    L    P    Q    R    Q    K    K    Q    P    T
663.    P    Q    R    Q    K    K    Q    P    T    V
664.    Q    R    Q    K    K    Q    P    T    V    T
665.    R    Q    K    K    Q    P    T    V    T    L
666.    Q    K    K    Q    P    T    V    T    L    L
667.    K    K    Q    P    T    V    T    L    L    P
668.    K    Q    P    T    V    T    L    L    P    A
669.    Q    P    T    V    T    L    L    P    A    A
670.    P    T    V    T    L    L    P    A    A    D
671.    T    V    T    L    L    P    A    A    D    M
672.    V    T    L    L    P    A    A    D    M    D
673.    T    L    L    P    A    A    D    M    D    D
674.    L    L    P    A    A    D    M    D    D    F
675.    L    P    A    A    D    M    D    D    F    S
676.    P    A    A    D    M    D    D    F    S    R
677.    A    A    D    M    D    D    F    S    R    Q
678.    A    D    M    D    D    F    S    R    Q    L
679.    D    M    D    D    F    S    R    Q    L    Q
680.    M    D    D    F    S    R    Q    L    Q    N
681.    D    D    F    S    R    Q    L    Q    N    S
682.    D    F    S    R    Q    L    Q    N    S    M
683.    F    S    R    Q    L    Q    N    S    M    S
684.    S    R    Q    L    Q    N    S    M    S    G
685.    R    Q    L    Q    N    S    M    S    G    A
686.    Q    L    Q    N    S    M    S    G    A    S
687.    L    Q    N    S    M    S    G    A    S    A
688.    Q    N    S    M    S    G    A    S    A    D
689.    N    S    M    S    G    A    S    A    D    S
690.    S    M    S    G    A    S    A    D    S    T
691.    M    S    G    A    S    A    D    S    T    Q
692.    S    G    A    S    A    D    S    T    Q    A
以下表28至表37为上述1~692号“交叉重叠”多肽第1-10步使用的试剂投料:
表28合成上述1~692号“交叉重叠”多肽第一步时使用试剂投料计算结果:
     MEN-步骤-1       FW       个数  控制组   总数  N(mmol)  AA-m(mg)   HOBt(mg)    HBTu(mg)   DIEA(mg)
A    Fmoc-Ala         311.3    56    1        57    2.088    650.0      319.7       752.3      539.7
C    Fmoc-Cys(Trt)    585.7    6     0        6     0.216    126.5      33.1        77.8       55.8
D    Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    27    0        27    0.972    400.0      148.8       350.2      251.2
E    Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    22    0        22    0.792    337.0      121.3       285.3      204.7
F    Fmoc-Phe         387.4    27    0        27    0.972    376.6      148.8       350.2      251.2
G    Fmoc-Gly         297.3    60    1        61    2.232    663.6      341.8       804.2      576.9
H    Fmoc-His(Trt)    619.7    8     0        8     0.288    178.5      44.1        103.8      74.4
I    Fmoc-Ile         353.4    31    0        31    1.116    394.4      170.9       402.1      288.5
K    Fmoc-Lys(Boc)    468.5    37    0        37    1.332    624.0      204.0       479.9      344.3
L    Fmoc-Leu         353.4    71    3        74    2.772    979.6      424.5       998.7      716.5
M    Fmoc-Met         371.5    12    2        14    0.576    214.0      88.2        207.5      148.9
N    Fmoc-Asn         354.4    40    1        41    1.512    535.9      231.5       544.8      390.8
P    Fmoc-Pro         337.4    37    1        38    1.404    473.7      215.0       505.8      362.9
Q    Fmoc-Gln         368.4    38    1        39    1.44     530.5      220.5       518.8      372.2
R    Fmoc-Arg(Pbf)    648.8    48    0        48    1.728    1121.1     264.6       622.6      446.7
S    Fmoc-Ser(tBu)    383.4    50    0        50    1.8      690.1      275.6       648.5      465.3
T    Fmoc-Thr(tBu)    397.5    48    1        49    1.8      715.5      275.6       648.5      465.3
V    Fmoc-Val         339.4    39    1        40    1.476    501.0      226.0       531.8      381.5.
W    Fmoc-Trp         426.5    12    0        12    0.432    184.2      66.2        155.6      111.7
Y    Fmoc-Tyr(tBu)    459.6    23    0        23    0.828    380.5      126.8       298.3      214.0
表29合成上述1~692号“交叉重叠”多肽第二步时使用试剂投料计算结果:
   MEN-步骤-2       FW       个数  控制组   总数  N(mmol)    AA-m(mg)   HOBt(mg)  BOP(mg)  DIEA(mg)
A  Fmoc-Ala         311.3    55    1        56    2.052      638.8      314.2     862.6    530.4
C  Fmoc-Cys(Trt)    585.7    6     0        6     0.216      126.5      33.1      90.8     55.8
D  Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    27    0        27    0.972      400.0      148.8     408.6    251.2
E  Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    22    0        22    0.792      337.0      121.3     332.9    204.7
F  Fmoc-Phe         387.4    27    0        27    0.972      376.6      148.8     408.6    251.2
G  Fmoc-Gly         297.3    60    1        61    2.232      663.6      341.8     938.3    576.9
H  Fmoc-His(Trt)    619.7    8     0        8     0.288      178.5      44.1      121.1    74.4
I  Fmoc-Ile         353.4    31    2        33    1.26       445.3      192.9     529.7    325.7
K  Fmoc-Lys(Boc)    468.5    37    1        38    1.404      657.8      215.0     590.2    362.9
L  Fmoc-Leu         353.4    71    2        73    2.7        954.2      413.5     1135.0   697.9
M  Fmoc-Met         371.5    12    1        13    0.504      187.2      77.2      211.9    130.3
N  Fmoc-Asn         354.4    41    1        42    1.548      548.6      237.0     650.7    400.1
P  Fmoc-Pro         337.4    37    0        37    1.332      449.4      204.0     559.9    344.3
Q  Fmoc-Gln         368.4    37    0        37    1.332      490.7      204.0     559.9    344.3
R  Fmoc-Arg(Pbf)    648.8    48    2        50    1.872      1214.6     286.7     786.9    483.9
S  Fmoc-Ser(tBu)    383.4    50    0        50    1.8        690.1      275.6     756.7    465.3
T  Fmoc-Thr(tBu)    397.5    49    0        49    1.764      701.2      270.1     741.5    456.0
V  Fmoc-Val         339.4    39    1        40    1.476      501.0      226.0     620.5    381.5
W  Fmoc-Trp         426.5    12    0        12    0.432      184.2      66.2      181.6    111.7
Y  Fmoc-Tyr(tBu)    459.6    23    0        23    0.828      380.5      126.8     348.1    214.0
表30合成上述1~692号“交叉重叠”多肽第三步时使用试剂投料计算结果:
   MEN-步骤-3       FW       个数  控制组   总数  N(mmol)  AA-m(mg)     HOBt(mg)    BOP(mg)    DIEA(mg)
A  Fmoc-Ala         311.3    55    1        56    2.052    638.8        314.2       862.6      530.4
C  Fmoc-Cys(Trt)    585.7    6     0        6     0.216    126.5        33.1        90.8       55.8
D  Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    27    1        28    1.044    429.6        159.9       438.9      269.9
E  Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    23    0        23    0.828    352.3        126.8       348.1      214.0
F  Fmoc-Phe         387.4    27    1        28    1.044    404.4        159.9       438.9      269.9
G  Fmoc-Gly         297.3    60    0        60    2.16     642.2        330.8       908.0      558.3
H  Fmoc-His(Trt)    619.7    8     0        8     0.288    178.5        44.1        121.1      74.4
I  Fmoc-Ile         353.4    31    3        34    1.332    470.7        204.0       559.9      344.3
K  Fmoc-Lys(Boc)    468.5    37    0        37    1.332    624.0        204.0       559.9      344.3
L  Fmoc-Leu         353.4    70    1        71    2.592    916.0        396.9       1089.6     670.0
M  Fmoc-Met         371.5    12    0        12    0.432    160.5        66.2        181.6      111.7
N  Fmoc-Asn         354.4    41    0        41    1.476    523.1        226.0       620.5      381.5
P  Fmoc-Pro         337.4    37    3        40    1.548    522.3        237.0       650.7      400.1
Q  Fmoc-Gln         368.4    36    0        36    1.296    477.4        198.5       544.8      335.0
R  Fmoc-Arg(Pbf)    648.8    48    1        49    1.8      1167.8       275.6       756.7      465.3
S  Fmoc-Ser(tBu)    383.4    51    0        51    1.836    703.9        281.1       771.8      474.6
T  Fmoc-Thr(tBu)    397.5    50    1        51    1.872    744.1        286.7       786.9      483.9
V  Fmoc-Val         339.4    38    0        38    1.368    464.3        209.5       575.1      353.6
W  Fmoc-Trp         426.5    12    0        12    0.432    184.2        66.2        181.6      111.7
Y  Fmoc-Tyr(tBu)    459.6    23    0        23    0.828    380.5        126.8       348.1      214.0
表31合成上述1~692号“交叉重叠”多肽第四步时使用试剂投料计算结果:
   MEN-步骤-4       FW       个数  控制组   总数  N(mmol)  AA-m(mg)     HOBt(mg)    BOP(mg)  DIEA(mg)
A  Fmoc-Ala         311.3    55    1        56    2.052    638.8        314.2       862.6    530.4
C  Fmoc-Cys(Trt)    585.7    6     0        6     0.216    126.5        33.1        90.8     55.8
D  Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    27    0        27    0.972    400.0        148.8       408.6    251.2
E  Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    24    0        24    0.864    367.6        132.3       363.2    223.3
F  Fmoc-Phe         387.4    27    0        27    0.972    376.6        148.8       408.6    251.2
G  Fmoc-Gly         297.3    60    1        61    2.232    663.6        341.8       938.3    576.9
H  Fmoc-His(Trt)    619.7    8     0        8     0.288    178.5        44.1        121.1    74.4
I  Fmoc-Ile         353.4    32    1        33    1.224    432.6        187.4       514.5    316.4
K  Fmoc-Lys(Boc)    468.5    37    0        37    1.332    624.0        204.0       559.9    344.3
L  Fmoc-Leu         353.4    68    4        72    2.736    966.9        419.0       1150.1   707.2
M  Fmoc-Met         371.5    12    0        12    0.432    160.5        66.2        181.6    111.7
N  Fmoc-Asn         354.4    41    0        41    1.476    523.1        226.0       620.5    381.5
P  Fmoc-Pro         337.4    37    0        37    1.332    449.4        204.0       559.9    344.3
Q  Fmoc-Gln         368.4    37    0        37    1.332    490.7        204.0       559.9    344.3
R  Fmoc-Arg(Pbf)    648.8    48    2        50    1.872    1214.6       286.7       786.9    483.9
S  Fmoc-Ser(tBu)    383.4    51    0        51    1.836    703.9        281.1       771.8    474.6
T  Fmoc-Thr(tBu)    397.5    49    0        49    1.764    701.2        270.1       741.5    456.0
V  Fmoc-Val         339.4    38    0        38    1.368    464.3        209.5       575.1    353.6
W  Fmoc-Trp         426.5    12    2        14    0.576    245.7        88.2        242.1    148.9
Y  Fmoc-Tyr(tBu)    459.6    23    1        24    0.9      413.6        137.8       378.3    232.6
表32合成上述1~692号“交叉重叠”多肽第五步时使用试剂投料计算结果:
   MEN-步骤-5       FW       个数  控制组   总数  N(mmol)  AA-m(mg)     HOBt(mg)    HBTu(mg)   DIEA(mg)
A  Fmoc-Ala         311.3    55    2        57    2.124    661.2        325.2       765.3      549.0
C  Fmoc-Cys(Trt)    585.7    6     0        6     0.216    126.5        33.1        77.8       55.8
D  Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    26    0        26    0.936    385.2        143.3       337.2      241.9
E  Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    24    0        24    0.864    367.6        132.3       311.3      223.3
F  Fmoc-Phe         387.4    27    1        28    1.044    404.4        159.9       376.1      269.9
G  Fmoc-Gly         297.3    60    0        60    2.16     642.2        330.8       778.2      558.3
H  Fmoc-His(Trt)    619.7    8     0        8     0.288    178.5        44.1        103.8      74.4
I  Fmoc-Ile         353.4    32    2        34    1.296    458.0        198.5       466.9      335.0
K  Fmoc-Lys(Boc)    468.5    37    0        37    1.332    624.0        204.0       479.9      344.3
L  Fmoc-Leu         353.4    67    3        70    2.628    928.7        402.4       946.8      679.3
M  Fmoc-Met         371.5    12    0        12    0.432    160.5        66.2        155.6      111.7
N  Fmoc-Asn         354.4    41    0        41    1.476    523.1        226.0       531.8      381.5
P  Fmoc-Pro         337.4    38    0        38    1.368    461.6        209.5       492.9      353.6
Q  Fmoc-Gln         368.4    37    0        37    1.332    490.7        204.0       479.9      344.3
R  Fmoc-Arg(Pbf)    648.8    48    0        48    1.728    1121.1       264.6       622.6      446.7
S  Fmoc-Ser(tBu)    383.4    51    0        51    1.836    703.9        281.1       661.5      474.6
T  Fmoc-Thr(tBu)    397.5    50    2        52    1.944    772.7        297.7       700.4      502.5
V  Fmoc-Val         339.4    38    2        40    1.512    513.2        231.5       544.8      390.8
W  Fmoc-Trp         426.5    12    0        12    0.432    184.2        66.2        155.6      111.7
Y  Fmoc-Tyr(tBu)    459.6    23    0        23    0.828    380.5        126.8       298.3      214.0
表33合成上述1~692号“交叉重叠”多肽第六步时使用试剂投料计算结果:
   MEN-步骤-6        FW       个数  控制组   总数  N(mmol)    AA-m(mg)     HOBt(mg)     HBTu(mg)     DIEA(mg)
A  Fmoc-Ala          311.3    54    2        56    2.088      650.0        319.7        752.3        539.7
C  Fmoc-Cys(Trt)     585.7    6     0        6     0.216      126.5        33.1         77.8         55.8
D  Fmoc-Asp(OtBu)    411.5    25    0        25    0.9        370.4        137.8        324.3        232.6
E  Fmoc-Glu(OtBu)    425.5    24    0        24    0.864      367.6        132.3        311.3        223.3
F  Fmoc-Phe          387.4    27    0        27    0.972      376.6        148.8        350.2        251.2
G  Fmoc-Gly          297.3    62    3        65    2.448      727.8        374.9        882.0        632.8
H  Fmoc-His(Trt)     619.7    8     0        8     0.288      178.5        44.1         103.8        74.4
I  Fmoc-Ile          353.4    32    0        32    1.152      407.1        176.4        415.1        297.8
K  Fmoc-Lys(Boc)     468.5    37    0        37    1.332      624.0        204.0        479.9        344.3
L  Fmoc-Leu          353.4    67    3        70    2.628      928.7        402.4        946.8        679.3
M  Fmoc-Met          371.5    12    0        12    0.432      160.5        66.2         155.6        111.7
N  Fmoc-Asn          354.4    41    1        42    1.548      548.6        237.0        557.7        400.1
P  Fmoc-Pro          337.4    37    0        37    1.332      449.4        204.0        479.9        344.3
Q  Fmoc-Gln          368.4    37    0        37    1.332      490.7        204.0        479.9        344.3
R  Fmoc-Arg(Pbf)     648.8    48    0        48    1.728      1121.1       264.6        622.6        446.7
S  Fmoc-Ser(tBu)     383.4    51    0        51    1.836      703.9        281.1        661.5        474.6
T  Fmoc-Thr(tBu)     397.5    50    0        50    1.8        715.5        275.6        648.5        465.3
V  Fmoc-Val          339.4    39    2        41    1.548      525.4        237.0        557.7        400.1
W  Fmoc-Trp          426.5    12    0        12    0.432      184.2        66.2         155.6        111.7
Y  Fmoc-Tyr(tBu)     459.6    23    1        24    0.9        413.6        137.8        324.3        232.6
表34合成上述1~692号“交叉重叠”多肽第七步时使用试剂投料计算结果:
   MEN-步骤-7       FW       个数  控制组   总数  N(mmol)   AA-m(mg)     HOBt(mg)    HBTu(mg)    DIEA(mg)
A  Fmoc-Ala         311.3    53    1        54    1.98      616.4        303.2       713.4       511.8
C  Fmoc-Cys(Trt)    585.7    6     0        6     0.216     126.5        33.1        77.8        55.8
D  Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    25    0        25    0.9       370.4        137.8       324.3       232.6
E  Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    24    0        24    0.864     367.6        132.3       311.3       223.3
F  Fmoc-Phe         387.4    28    1        29    1.08      418.4        165.4       389.1       279.2
G  Fmoc-Gly         297.3    62    2        64    2.376     706.4        363.8       856.0       614.1
H  Fmoc-His(Trt)    619.7    8     0        8     0.288     178.5        44.1        103.8       74.4
I  Fmoc-Ile         353.4    31    2        33    1.26      445.3        192.9       454.0       325.7
K  Fmoc-Lys(Boc)    468.5    37    0        37    1.332     624.0        204.0       479.9       344.3
L  Fmoc-Leu         353.4    67    2        69    2.556     903.3        391.4       920.9       660.7
M  Fmoc-Met         371.5    12    0        12    0.432     160.5        66.2        155.6       111.7
N  Fmoc-Asn         354.4    43    1        44    1.62      574.1        248.1       583.7       418.7
P  Fmoc-Pro         337.4    37    0        37    1.332     449.4        204.0       479.9       344.3
Q  Fmoc-Gln         368.4    37    0        37    1.332     490.7        204.0       479.9       344.3
R  Fmoc-Arg(Pbf)    648.8    48    0        48    1.728     1121.1       264.6       622.6       446.7
S  Fmoc-Ser(tBu)    383.4    51    0        51    1.836     703.9        281.1       661.5       474.6
T  Fmoc-Thr(tBu)    397.5    50    1        51    1.872     744.1        286.7       674.5       483.9
V  Fmoc-Val         339.4    38    0        38    1.368     464.3        209.5       492.9       353.6
W  Fmoc-Trp         426.5    12    1        13    0.504     215.0        77.2        181.6       130.3
Y  Fmoc-Tyr(tBu)    459.6    23    1        24    0.9       413.6        137.8       324.3       232.6
表35合成上述1~692号“交叉重叠”多肽第八步时使用试剂投料计算结果:
   MEN-步骤-8       FW       个数    控制组   总数  N(mmol)    AA-m(mg)     HOBt(mg)     HBTu(mg)     DIEA(mg)
A  Fmoc-Ala         311.3    53      1        54    1.98       616.4        303.2        713.4        511.8
C  Fmoc-Cys(Trt)    585.7    6       0        6     0.216      126.5        33.1         77.8         55.8
D  Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    27      0        27    0.972      400.0        148.8        350.2        251.2
E  Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    24      1        25    0.936      398.3        143.3        337.2        241.9
F  Fmoc-Phe         387.4    28      1        29    1.08       418.4        165.4        389.1        279.2
G  Fmoc-Gly         297.3    61      0        61    2.196      652.9        336.3        791.2        567.6
H  Fmoc-His(Trt)    619.7    8       0        8     0.288      178.5        44.1         103.8        74.4
I  Fmoc-Ile         353.4    31      1        32    1.188      419.8        181.9        428.0        307.1
K  Fmoc-Lys(Boc)    468.5    37      0        37    1.332      624.0        204.0        479.9        344.3
L  Fmoc-Leu         353.4    67      4        71    2.7        954.2        413.5        972.8        697.9
M  Fmoc-Met         371.5    12      0        12    0.432      160.5        66.2         155.6        111.7
N  Fmoc-Asn         354.4    42      0        42    1.512      535.9        231.5        544.8        390.8
P  Fmoc-Pro         337.4    37      0        37    1.332      449.4        204.0        479.9        344.3
Q  Fmoc-Gln         368.4    37      0        37    1.332      490.7        204.0        479.9        344.3
R  Fmoc-Arg(Pbf)    648.8    48      1        49    1.8        1167.8       275.6        648.5        465.3
S  Fmoc-Ser(tBu)    383.4    51      0        51    1.836      703.9        281.1        661.5        474.6
T  Fmoc-Thr(tBu)    397.5    50      2        52    1.944      772.7        297.7        700.4        502.5
V  Fmoc-Val         339.4    38      1        39    1.44       488.7        220.5        518.8        372.2
W  Fmoc-Trp         426.5    12      0        12    0.432      184.2        66.2         155.6        111.7
Y  Fmoc-Tyr(tBu)    459.6    23      0        23    0.828      380.5        126.8        298.3        214.0
表36合成上述1~692号“交叉重叠”多肽第九步时使用试剂投料计算结果:
   MEN-步骤-9       FW       个数   控制组   总数  N(mmol)  AA-m(mg)   HOBt(mg)   HBTu(mg)  DIEA(mg)
A  Fmoc-Ala         311.3    53     0        53    1.908    594.0      292.2      687.4     493.2
C  Fmoc-Cys(Trt)    585.7    6      0        6     0.216    126.5      33.1       77.8      55.8
D  Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    26     0        26    0.936    385.2      143.3      337.2     241.9
E  Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    23     0        23    0.828    352.3      126.8      298.3     214.0
F  Fmoc-Phe         387.4    28     3        31    1.224    474.2      187.4      441.0     316.4
G  Fmoc-Gly         297.3    61     2        63    2.34     695.7      358.3      843.1     604.8
H  Fmoc-His(Trt)    619.7    8      0        8     0.288    178.5      44.1       103.8     74.4
I  Fmoc-Ile         353.4    31     0        31    1.116    394.4      170.9      402.1     288.5
K  Fmoc-Lys(Boc)    468.5    37     0        37    1.332    624.0      204.0      479.9     344.3
L  Fmoc-Leu         353.4    67     2        69    2.556    903.3      391.4      920.9     660.7
M  Fmoc-Met         371.5    12     0        12    0.432    160.5      66.2       155.6     111.7
N  Fmoc-Asn         354.4    42     0        42    1.512    535.9      231.5      544.8     390.8
P  Fmoc-Pro         337.4    37     1        38    1.404    473.7      215.0      505.8     362.9
Q  Fmoc-Gln         368.4    37     0        37    1.332    490.7      204.0      479.9     344.3
R  Fmoc-Arg(Pbf)    648.8    48     0        48    1.728    1121.1     264.6      622.6     446.7
S  Fmoc-Ser(tBu)    383.4    52     0        52    1.872    717.7      286.7      674.5     483.9
T  Fmoc-Thr(tBu)    397.5    50     0        50    1.8      715.5      275.6      648.5     465.3
V  Fmoc-Val         339.4    38     3        41    1.584    537.6      242.6      570.7     409.4
W  Fmoc-Trp         426.5    12     0        12    0.432    184.2      66.2       155.6     111.7
Y  Fmoc-Tyr(tBu)    459.6    24     1        25    0.936    430.2      143.3      337.2     241.9
表37合成上述1~692号“交叉重叠”多肽第十步时使用试剂投料计算结果:
   MEN-步骤-10      FW       个数  控制组   总数  N(mmol)    AA-m(mg)   HOBt(mg)   HBTu(mg)   DIEA(mg)
A  Fmoc-Ala         311.3    53    1        54    1.98       616.4      303.2      713.4      511.8
C  Fmoc-Cys(Trt)    585.7    6     0        6     0.216      126.5      33.1       77.8       55.8
D  Fmoc-Asp(OtBu)   411.5    26    0        26    0.936      385.2      143.3      337.2      241.9
E  Fmoc-Glu(OtBu)   425.5    23    0        23    0.828      352.3      126.8      298.3      214.0
F  Fmoc-Phe         387.4    28    1        29    1.08       418.4      165.4      389.1      279.2
G  Fmoc-Gly         297.3    60    2        62    2.304      685.0      352.8      830.1      595.5
H  Fmoc-His(Trt)    619.7    8     0        8     0.288      178.5      44.1       103.8      74.4
I  Fmoc-Ile         353.4    31    0        31    1.116      394.4      170.9      402.1      288.5
K  Fmoc-Lys(Boc)    468.5    37    0        37    1.332      624.0      204.0      479.9      344.3
L  Fmoc-Leu         353.4    67    1        68    2.484      877.8      380.4      895.0      642.1
M  Fmoc-Met         371.5    15    0        15    0.54       200.6      82.7       194.6      139.6
N  Fmoc-Asn         354.4    41    2        43    1.62       574.1      248.1      583.7      418.7
P  Fmoc-Pro         337.4    37    0        37    1.332      449.4      204.0      479.9      344.3
Q  Fmoc-Gln         368.4    37    0        37    1.332      490.7      204.0      479.9      344.3
R  Fmoc-Arg(Pbf)    648.8    48    1        49    1.8        1167.8     275.6      648.5      465.3
S  Fmoc-Ser(tBu)    383.4    51    0        51    1.836      703.9      281.1      661.5      474.6
T  Fmoc-Thr(tBu)    397.5    50    0        50    1.8        715.5      275.6      648.5      465.3
V  Fmoc-Val         339.4    38    2        40    1.512      513.2      231.5      544.8      390.8
W  Fmoc-Trp         426.5    12    2        14    0.576      245.7      88.2       207.5      148.9
Y  Fmoc-Tyr(tBu)    459.6    24    0        24    0.864      397.1      132.3      311.3      223.3
上述1~692号“交叉重叠”多肽第一步时使用试剂投料合成操作步骤:
多肽脱Fmoc保护/氨基酶残基的连接步骤:
1.均分树脂:采用IRORI均分树脂装置,在每一个Microkan中(共692个)加入15mg Rink Amide树脂;
2.均分IRORI射频子:采用IRORI均分射频子装置,在每一个Microkan中加入一个射频子,并用IRORI加盖器加盖;
3.脱Fmoc保护:集中所有待反应的Microkan,置于一个2L锥形瓶中,加入20%哌啶/DMF振摇,15min×2次;
4.洗涤树脂:DMF 3min×6,DCM 3min×3,晾干;
5.IRORI射频子编码(或解码):采用IRORI Sorting程序及相应配件编码。按照多肽化学库的序列对射频子编码(或解码),每一特定编码代表一个特定序列,并以此将Microkan分配至不同氨基酸反应瓶中;
6.洗涤树脂:用重蒸DMF润洗待反应的树脂;
7.Fmoc-保护氨基酸的连接:准确称取计算量的Fmoc保护氨基酸、HOBt、HBTU(或DIC或BOP),并用重蒸DMF溶解。将Microkan加入特定氨基酸反应瓶中,振摇反应3h;
8.茚三酮检测:取事先设定好的对照组序列,用茚三酮法检测反应情况。如果呈阴性反应,表明反应完全,进行步骤9的操作;如果呈阳性反应,表明反应不完全,需继续反应;如果延长时间或改用缩合能力更强的缩合剂后,仍不能完全反应,则采用步骤11的方法封闭后,进行步骤9的操作;
9.洗涤树脂:DMF 3min×3,DCM 3min×1;
10.脱Fmoc保护/连接:根据序列要求,重复步骤3-9的操作,直至反应结束;
11.封闭:采用乙酰化多肽的氨基端,15% Ac2O/CH2Cl2,30min;
12.洗涤树脂:DCM 3min×2,晾干。
多肽裂解步骤:
1.配制裂解液:根据序列特点,从选取并配制适当的裂解液;
2.裂解:每一个Microkan使用1mL裂解液在室温下裂解2h;
3.洗涤:再用1mL裂解液浸泡洗涤Microkan 5min;
4.晾干或离心干燥:合并两次裂解液,离心浓缩至少量;
5.沉淀:将事先用冰水浴充分冷却的甲基叔丁基醚/石油醚(v/v:3/1)加入到残余物中,放入冰水浴中冷却20min使析晶完全;
6.离心:离心沉淀多肽化合物(3000rpm以上),10min后取出,小心倾去上清夜;
7.洗涤多肽:加入冷却的甲基叔丁基醚/石油醚,充分洗涤后,离心,倾去上清夜;
8.重复步骤7的操作一次;
9.晾干:将多肽残余物在室温下挥干,直至完全干燥;
10.检测:抽检部分多肽样品,用10%HOAc/H2O或30%CH3CN/H2O或60%CH3CN/H2O溶解,并用HPLC-MS检测纯度。
实施例4:采用此法合成非“交叉重复”多肽化合物。
采用本发明的方法除了能合成如实施例1~3所述的具有10个氨基酸序列长度的氨基酸残基序列,还能合成长度为2~50个氨基酸的氨基酸片段,应用此方法合成了具有如下序列的多肽。
合成多肽序列:
1.Ac-LYENQKQIANQFNKAISQIQ-CONH2
2.Ac-ESLTTTSTALGKLQDVVNQNAQ-CONH2
3.Ac-ALNTLVKQLSSNFGAISSVLND-CONH2
4.Ac-ILSRLDKVEAEVQIDRLITGRL-CONH2
5.Ac-QSLQTYVTQQLIRAAEIRASAN-CONH2
6.Ac-DISGINASVVNIQKEIDRLN-CONH2
7.Ac-EVAKNLNESLIDLQELGKYE-CONH2
8.NH2-NAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVE-CONH2
9.Ac-SSNFGAISSVLNDILSRLDKVE-CONH2
以下本实施例多肽的制备步骤:
1.加树脂及射频子:选取9个Microkan并分别装入15毫克Rink树脂和射频子并盖紧盖子;
2.合并Microkan,在一个适当的容器中用20%哌啶/DMF脱Fmoc保护基15min×2;
3.洗涤树脂:DMF 3min×6,DCM 3min×3,重蒸DMF 3min×3;
4.IRORI射频子编码(或解码):采用IRORI Sorting程序,按照多肽编码次序将Microkan分配至不同氨基酸反应瓶中;
5.在每一个反应瓶中加入溶解于DMF中计算量的Fmoc-保护氨基酸、HOBt、HBTU,振摇反应3h;
6.合并Microkan并洗涤树脂DMF 3min×3次;
7.重复步骤3~7,直至连接全部氨基酸;
8.合并Microkan,重复3~4步;
9.采用15%Ac2O/CH2Cl2乙酰化多肽的氨基端15min;
10.用CH2Cl2 3min×3次后,室温晾干;
11.采用IRORI Sorting解码Microkan并分配到对应的15毫升裂解管中;
12.每一个Microkan用1mL在室温下裂解液裂解2h;
13.再用1mL裂解液浸泡洗涤Microkan 5min;
14.合并裂解液和洗涤液;
15.惰性气体流吹干浓缩至残留少量裂解液;
16.加入事先用冰水浴充分冷却的甲基叔丁基醚/石油醚(v/v:3/1),放入冰水浴中冷却20min;
17.离心沉淀多肽化合物(3000rpm以上),10min后小心倾去上清夜;
18.再加入冷却的甲基叔丁基醚/石油醚,充分洗涤、离心,倾去上清夜,共两次;
19.将多肽残余物置于室温下,直至完全干燥;
20.将多肽化合物用10%HOAc/H2O或30%CH3CN/H2O或60%CH3CN/H2O溶解后,经HPLC-MS检测纯度和正确的分子量。
实施例5:ELISA法筛选发现抗SARS-CoV阳性血清的抗原决定簇(B-细胞抗原决定簇):
将实施例1、2和3获得的分子多样性化合物库与SARS-CoV阳性血清反应,由于SARS-CoV阳性血清中含有SARS-CoV抗体,测定其与分子多样性化合物库中的具有10个氨基酸序列的短肽结合活性,由此测定多重最小多肽抗原决定簇,其具体步骤如下:
1、包被:包被液为0.07M NaHCO3,0.03M Na2CO3(pH=9.6),包被浓度10μg/mL,100μL/孔,4℃过夜或37℃2小时。
2、清洗:PBST(pH=7.4,含0.05%的Tween 20)清洗5遍,拍干。
3、封闭:封闭液为1~3%的BSA,200μL/孔,4℃过夜或37℃2小时。
4、清洗:PBST(pH=7.4,含0.05%的Tween 20)清洗5遍,拍干。
5、加入一抗:病人血清用生理盐水1∶100稀释,100μL/孔,37℃孵育2小时。
6、清洗:PBST(pH=7.4,含0.05%的Tween 20)清洗5遍,拍干。
7、加入二抗:HRP-兔抗人IgG抗体用PBS1∶1000~1∶3000稀释,100μL/孔,37℃孵育2小时。
8、清洗:PBST(pH=7.4,含0.05%的Tween 20)清洗5遍,拍干。
9、加入酶反应底物:酶反应底物为TMB,100μL/孔,37℃孵育15~30分钟。
10、加终止液:2MH2SO4,100μL/孔,37℃孵育5~10分钟。
11、读数:在酶标仪中测量450nm和630nm的OD值。
12、中和实验:筛选得到的阳性多肽化合物与抗SARA-CoV阳性血清混合物在37℃孵育30分钟后重复上述ELISA实验步骤。
13、对照及数据处理:每一个多肽样品取三个抗SARA-CoV阳性血清反应复孔,和三个正常对照血清复孔进行对比实验。三个正常对照血清复孔的OD平均值控制在0.1以下。三个抗SARA-CoV阳性血清反应复孔OD值的平均值减去三个正常对照血清复孔的OD平均值即为最终的结果。阳性多肽化合物经过中和实验确认特异性结果。图4是20个代表性多肽化合物的筛选结果。它们的序列结构如下:
11)TSGSDLDRCT
12)  SGSDLDRCTT
13)    GSDLDRCTTF
14)      SDLDRCTTFD
15)        DLDRCTTFDD
16)          LDRCTTFDDV
17)            DRCTTFDDVQ
18)              RCTTFDDVQA
19)                CTTFDDVQAP
20)                  TTFDDVQAPN
21)                    TFDDVQAPNY
22)                      FDDVQAPNYT
23)                        DDVQAPNYTQ
24)                          DVQAPNYTQH
25)                            VQAPNYTQHT
26)                             QAPNYTQHTS
27)                               APNYTQHTSS
28)                                 PNYTQHTSSM
29)                                   NYTQHTSSMR
30)                                     YTQHTSSMRG
由图4可以看出,在S蛋白中有101个能与SARS-CoV阳性血清结合的多肽序列,分别是:
                1.MFIFLLFLTL(Compd 1)
                2.TSGSDLDRCT(Compd 11)
                3.SGSDLDRCTT(Compd 12)
                4.SDLDRCTTFD(compd 14)
                5.TTFDDVQAPN(Compd 20)
                6.FDDVQAPNYT(Compd 22)
                7.EIFRSDTLYL(Compd 45)
                8.FKDGIYFAAT(Compd 83)
9.NSTNVVIRAC(Compd 119)
10.STNVVIRACN(Compd 120)
11.VSKPMGTQTH(Compd 140)
12.SKPMGTQTHT(Compd 141)
13.PMGTQTHTMI(Compd 143)
14.MIFDNAFNCT(Compd 151)
15.DNAFNCTFEY(Compd 154)
16.KSGNFKHLRE(Compd 175)
17.KNKDGFLYVY(Compd 188)
18.KDGFLYVYKG(Compd 190)
19.KGYQPIDVVR(Compd 198)
20.FKLPLGINIT(Compd 220)
21.INITNFRAIL(Compd 226)
22.VDCSQNPLAE(Compd 276)
23.GIYQTSNFRV(Compd 298)
24.YQTSNFRVVP(Compd 300)
25.ISNCVADYSV(Compd 345)
26.ADYSVLYNST(Compd 350)
27.DYSVLYNSTF(Compd 351)
28.YSVLYNSTFF(Compd 352)
29.SVLYNSTFFS(Compd 353)
30.NSTFFSTFKC(Compd 357)
31.TFFSTFKCYG(Compd 359)
32.GDDVRQIAPG(Compd 391)
33.DDVRQIAPGQ(Compd 392)
34.VRQIAPGQTG(Compd 394)
35.FMGCVLAWNT(Compd 416)
36.VLAWNTRNID(Compd 420)
37.TRNIDATSTG(Compd 425)
38.RNIDATSTGN(Compd 426)
39.YNYKYRYLRH(Compd 436)
40.PFERDISNVP(Compd 450)
41.NCYWPLNDYG(Compd 463)
42.WPLNDYGFYT(Compd 476)
43.YQPYRVVVLS(Compd 491)
44.QPYRVVVLSF(Compd 492)
45.YRVVVLSFEL(Compd 494)
46.NQCVNFNFNG(Compd 522)
47.QCVNFNFNGL(Compd 523)
48.CVNFNFNGLT(Compd 524)
49.NFNFNGLTGT(Compd 526)
50.FNFNGLTGTG(Compd 527)
51.NFNGLTGTGV(Compd 528)
52.TDVSTAIHAD(Compd 604)
53.DVSTAIHADQ(Compd 605)
54.VSTAIHADQL(Compd 606)
55.TPAWRIYSTG(Compd 616)
56.IGAEHVDTSY(Compd 637)
57.SIAYSNNTIA(Compd 686)
58.IAYSNNTIAI(Compd 687)
59.ITTEVMPVSM(Compd 704)
60.AKTSVDCNMY(Compd 714)
61.YGECLGDINA(Compd 819)
62.AQKFNGLTVL(Compd 834)
63.LTVLPPLLTD(Compd 840)
64.TVLPPLLTDD(Compd 841)
65.KQIANQFNKA(Compd 903)
66.TALGKLQDVV(Compd 925)
67.KQLSSNFGAI(Compd 946)
68.NFGAISSVLN(Compd 951)
69.FGAISSVLND(Compd 952)
70.GAISSVLNDI(Compd 953)
71.AISSVLNDIL(Compd 954)
72.RLDKVEAEVQ(Compd 965)
73.RLITGRLQSL(Compd 977)
74.QLIRAAEIRA(Compd 993)
75.SANLAATKMS(Compd 1003)
76.VPSQERNFTT(Compd 1050)
                77.REGVFVFNGT(Compd 1073)
                78.WFITQRNFFS(Compd 1084)
                79.FFSPQIITTD(Compd 1091)
                80.ANLAATKMSE(Compd 1104)
                81.NLAATKMSEC(Compd 1105)
                82.FKNHTSPDVD(Compd 1138)
                83.TSPDVDLGDI(Compd 1142)
                84.DVDLGDISGI(Compd 1145)
                85.VDLGDISGIN(Compd 1146)
                86.NASVVNIQKE(Compd 1155)
                87.ASVVNIQKEI(Compd 1156)
                88.SVVNIQKEID(Compd 1157)
                89.KEIDRLNEVA(Compd 1163)
                90.EIDRLNEVAK(Compd 1164)
                91.LNEVAKNLNE(Compd 1168)
                92.NLNESLIDLQ(Compd 1174)
                93.LQELGKYEQY(Compd 1182)
                94.VMVTILLCCM(Compd 1210)
                95.MVTILLCCMT(Compd 1211)
                96.VTILLCCMTS(Compd 1212)
                97.TILLCCMTSC(Compd 1213)
                98.CSCLKGACSC(Compd 1223)
                99.DDSEPVLKGV(Compd 1241)
                100.DSEPVLKGVK(Compd 1242)
                101.SEPVLKGVKL(Compd 1243)
由图5可以看出,在M蛋白中有2个能与SARS-CoV阳性血清结合的多肽序列,分别是:
筛选得到的M蛋白线性抗原决定簇
1.A W I M L L Q F A Y(Compd 29)
2.S N R N R F L Y I I(Compd 39)
在E蛋白中有1个能与SARS-CoV阳性血清结合的多肽序列,分别是:
筛选得到的E蛋白线性抗原决定簇
1.L T A L R L C A Y C(Compd 246)
在N蛋白中有8个能与SARS-CoV阳性血清结合的多肽序列,分别是:
筛选得到的N蛋白线性抗原决定簇
1.G R N G A R P K Q R(Compd 311)
2.K E E L R F P R G Q(Compd 441)
3.S R G N S P A R M A(Compd 482)
4.E A S K K P R Q K R(Compd 533)
5.K K P R Q K R T A T(Compd 536)
6.T E P K K D K K K K(Compd 646)
7.A Q P L P Q R Q K K(Compd 659)
8.Q P L P Q R Q K K Q(Compd 660)
上述112个序列即为本发明所筛选的SARS-CoV的抗原决定簇。
                    序列表
<110>中国医学科学院药物研究所
<120>一种肽文库、其合成方法及从该文库中筛选的活性片段
<130>
<160>116
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>1
Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu
1               5                   10
<210>2
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>2
Thr Ser Gly Ser Asp Leu Asp Arg Cys Thr
1               5                   10
<210>3
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>3
Ser Gly Ser Asp Leu Asp Arg Cys Thr Thr
1               5                   10
<210>4
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>4
Ser Asp Leu Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp
1               5                   10
<210>5
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>5
Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn
1               5                   10
<210>6
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>6
Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr
1               5                   10
<210>7
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>7
Glu Ile Phe Arg Ser Asp Thr Leu Tyr Leu
1               5                   10
<210>8
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>8
Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr
1               5                   10
<210>9
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>9
Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys
1               5                   10
<210>10
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>10
Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys Asn
1               5                   10
<210>11
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>11
Val Ser Lys Pro Met Gly Thr Gln Thr His
1               5                   10
<210>12
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>12
Ser Lys Pro Met Gly Thr Gln Thr His Thr
1               5                   10
<210>13
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>13
Pro Met Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile
1               5                   10
<210>14
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>14
Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr
1               5                   10
<210>15
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>15
Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr Phe Glu Tyr
1               5                   10
<210>16
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>16
Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu
1               5                   10
<210>17
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>17
Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr
1               5                   10
<210>18
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>18
Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly
1               5                   10
<210>19
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>19
Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg
1               5                   10
<210>20
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>20
Phe Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr
1               5                   10
<210>21
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>21
Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu
1               5                   10
<210>22
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>22
Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu
1               5                   10
<210>23
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>23
Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
1               5                   10
<210>24
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>24
Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro
1               5                   10
<210>25
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>25
Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
1               5                   10
<210>26
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>26
Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr
1               5                   10
<210>27
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>27
Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe
1               5                   10
<210>28
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>28
Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe
1               5                   10
<210>29
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>29
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser
1               5                   10
<210>30
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>30
Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys
1               5                   10
<210>31
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>31
Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
1               5                   10
<210>32
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>32
Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
1               5                   10
<210>33
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>33
Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
1               5                   10
<210>34
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>34
Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
1               5                   10
<210>35
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>35
Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr
1               5                   10
<210>36
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>36
Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp
1               5                   10
<210>37
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>37
Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser Thr Gly
1               5                   10
<210>38
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>38
Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn
1               5                   10
<210>39
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>39
Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His
1               5                   10
<210>40
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>40
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro
1               5                   10
<210>41
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>41
Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp Tyr Gly
1               5                   10
<210>42
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>42
Trp Pro Leu Asn Asp Tyr Gly Phe Tyr Thr
1               5                   10
<210>43
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>43
Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser
1               5                   10
<210>44
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>44
Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu
1               5                   10
<210>45
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>45
Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly
1               5                   10
<210>46
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>46
Gln Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu
1               5                   10
<210>47
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>47
Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr
1               5                   10
<210>48
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>48
Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr
1               5                   10
<210>49
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>49
Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly
1               5                   10
<210>50
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>50
Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val
1               5                   10
<210>51
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>51
Thr Asp Val Ser Thr Ala Ile His Ala Asp
1               5                   10
<210>52
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>52
Asp Val Ser Thr Ala Ile His Ala Asp Gln
1               5                   10
<210>53
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>53
Val Ser Thr Ala Ile His Ala Asp Gln Leu
1               5                   10
<210>54
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>54
Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr Gly
1               5                   10
<210>55
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>55
Ile Gly Ala Glu His Val Asp Thr Ser Tyr
1               5                   10
<210>56
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>56
Ser Ile Ala Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala
1               5                   10
<210>57
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>57
Ile Ala Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile
1               5                   10
<210>58
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>58
Ile Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met
1               5                   10
<210>59
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>59
Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys Asn Met Tyr
1               5                   10
<210>60
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>60
Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala
1               5                   10
<210>61
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>61
Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu
1               5                   10
<210>62
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>62
Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp
1               5                   10
<210>63
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>63
Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Asp
1               5                   10
<210>64
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>64
Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala
1               5                   10
<210>65
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>65
Thr Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val
1               5                   10
<210>66
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>66
Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile
1               5                   10
<210>67
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>67
Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn
1               5                   10
<210>68
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>68
Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp
1               5                   10
<210>69
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>69
Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile
1               5                   10
<210>70
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>70
Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu
1               5                   10
<210>71
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>71
Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
1               5                   10
<210>72
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>72
Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu
1               5                   10
<210>73
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>73
Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala
1               5                   10
<210>74
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>74
Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser
1               5                   10
<210>75
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>75
Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn Phe Thr Thr
1               5                   10
<210>76
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>76
Arg Glu Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr
1               5                   10
<210>77
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>77
Trp Phe Ile Thr Gln Arg Asn Phe Phe Ser
1               5                   10
<210>78
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>78
Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp
1               5                   10
<210>79
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>79
Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu
1               5                   10
<210>80
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>80
Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys
1               5                   10
<210>81
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>81
Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp
1               5                   10
<210>82
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>82
Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile
1               5                   10
<210>83
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>83
Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile
1               5                   10
<210>84
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>84
Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
1               5                   10
<210>85
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>85
Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu
1               5                   10
<210>86
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>86
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile
1               5                   10
<210>87
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>87
Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1               5                   10
<210>88
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>88
Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala
1               5                   10
<210>89
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>89
Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys
1               5                   10
<210>90
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>90
Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu
1               5                   10
<210>91
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>91
Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln
1               5                   10
<210>92
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>92
Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr
1               5                   10
<210>93
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>93
Val Met Val Thr Ile Leu Leu Cys Cys Met
1               5                   10
<210>94
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>94
Met Val Thr Ile Leu Leu Cys Cys Met Thr
1               5                   10
<210>95
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>95
Val Thr Ile Leu Leu Cys Cys Met Thr Ser
1               5                   10
<210>96
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>96
Thr Ile Leu Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys
1               5                   10
<210>97
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>97
Cys Ser Cys Leu Lys Gly Ala Cys Ser Cys
1               5                   10
<210>98
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>98
Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys Gly Val
1               5                   10
<210>99
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>99
Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys Gly Val Lys
1               5                   10
<210>100
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>100
Ser Glu Pro Val Leu Lys Gly Val Lys Leu
1               5                   10
<210>101
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>101
Ala Trp Ile Met Leu Leu Gln Phe Ala Tyr
1               5                   10
<210>102
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>102
Ser Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile Ile
1               5                   10
<210>103
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>103
Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys
1               5                   10
<210>104
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>104
Gly Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg
1               5                   10
<210>105
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>105
Lys Glu Glu Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln
1               5                   10
<210>106
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>106
Ser Arg Gly Asn Ser Pro Ala Arg Met Ala
1               5                   10
<210>107
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>107
Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg
1               5                   10
<210>108
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>108
Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr
1               5                   10
<210>109
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>109
Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys
1               5                   10
<210>110
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>110
Ala Gln Pro Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys
1               5                   10
<210>111
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>111
Gln Pro Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys Gln
1               5                   10
<210>112
<211>10
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>112
Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe
1               5                   10
<210>113
<211>1255
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>113
Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln
            20                  25                  30
His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg
        35                  40                  45
Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser
    50                  55                  60
Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Asp Asn Pro Val
65                  70                  75                  80
Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn
                85                  90                  95
Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln
            100                 105                 110
Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys
        115                 120                 125
Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met
    130                 135                 140
Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr
145                 150                 155                 160
Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser
                165                 170                 175
Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly
            180                 185                 190
Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp
        195                 200                 205
Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu
    210                 215                 220
Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro
225                 230                 235                 240
Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr
                245                 250                 255
Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile
            260                 265                 270
Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys
        275                 280                 285
Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn
    290                 295                 300
Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
305                 310                 315                 320
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser
                325                 330                 335
Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
            340                 345                 350
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
        355                 360                 365
Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala
    370                 375                 380
Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
385                 390                 395                 400
Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
                405                 410                 415
Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser
            420                 425                 430
Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu
        435                 440                 445
Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly
    450                 455                 460
Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp
465                 470                 475                 480
Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
                485                 490                 495
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
            500                 505                 510
Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn
        515                 520                 525
Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg
    530                 535                 540
Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp
545                 550                 555                 560
Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys
                565                 570                 575
Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser
            580                 585                 590
Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr
        595                 600                 605
Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr
    610                 615                 620
Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu
625                 630                 635                 640
His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile
                645                 650                 655
Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys
            660                 665                 670
Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala
        675                 680                 685
Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile
    690                 695                 700
Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys
705                 710                 715                 720
Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu
                725                 730                 735
Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile
            740                 745                 750
Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys
        755                 760                 765
Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe
    770                 775                 780
Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile
785                 790                 795                 800
Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met
                805                 810                 815
Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile
            820                 825                 830
Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr
        835                 840                 845
Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala
    850                 855                 860
Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe
865                 870                 875                 880
Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn
                885                 890                 895
Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala
            900                 905                 910
Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly
        915                 920                 925
Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu
    930                 935                 940
Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn
945                 950                 955                 960
Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp
                965                 970                 975
Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln
                980                 985                 990
Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala
        995                 1000                1005
Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp
    1010                1015                1020
Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala
    1025                1030                1035
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln
    1040                1045                1050
Glu Arg Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Glu Gly Lys
    1055                1060                1065
Ala Tyr Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser
    1070                1075                1080
Trp Phe Ile Thr Gln Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile Thr
    1085                1090                1095
Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly
    1100                1105                1110
Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp
    1115                1120                1125
Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser
    1130                1135                1140
Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val
    1145                1150                1155
Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys
    1160                1165                1170
Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr
    1175                1180                1185
Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu Gly Phe Ile
    1190                1195                1200
Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Leu Leu Cys Cys
    1205                1210                1215
Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Ala Cys Ser Cys Gly
    1220                1225                1230
Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys
    1235                1240                1245
Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
    1250                1255
<210>114
<211>221
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>114
Met Ala Asp Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Gln Leu Leu
1               5                   10                  15
Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Ala Trp Ile Met
            20                  25                  30
Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ser Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile Ile
        35                  40                  45
Lys Leu Val Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe
    50                  55                  60
Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Val Thr Gly Gly Ile Ala
65                  70                  75                  80
Ile Ala Met Ala Cys Ile Val Gly Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe Val
                85                  90                  95
Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe Asn
            100                 105                 110
Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro Leu Arg Gly Thr Ile Val
        115                 120                 125
Thr Arg Pro Leu Met Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly Ala Val Ile Ile
    130                 135                 140
Arg Gly His Leu Arg Met Ala Gly His Ser Leu Gly Arg Cys Asp Ile
145                 150                 155                 160
Lys Asp Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu Ser
                165                 170                 175
Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gln Arg Val Gly Thr Asp Ser Gly Phe
            180                 185                 190
Ala Ala Tyr Asn Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr Asp
        195                 200                 205
His Ala Gly Ser Asn Asp Asn Ile Ala Leu Leu Val Gln
    210                 215                 220
<210>115
<211>76
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>115
Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser
1               5                   10                  15
Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala
            20                  25                  30
Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn
        35                  40                  45
Val Ser Leu Val Lys Pro Thr Val Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn
    50                  55                  60
Leu Asn Ser Ser Glu Gly Val Pro Asp Leu Leu Val
65                  70                  75
<210>116
<211>422
<212>PRT
<213>SARS-CoV
<400>116
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile
1               5                   10                  15
Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly
            20                  25                  30
Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn
        35                  40                  45
Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Glu
    50                  55                  60
Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Gly
65                  70                  75                  80
Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Val Arg
                85                  90                  95
Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr
            100                 105                 110
Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys
        115                 120                 125
Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys
    130                 135                 140
Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu
145                 150                 155                 160
Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly
                165                 170                 175
Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg
            180                 185                 190
Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro
        195                 200                 205
Ala Arg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu
    210                 215                 220
Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly Gln
225                 230                 235                 240
Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser
                245                 250                 255
Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Gln Tyr Asn Val Thr
            260                 265                 270
Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly
        275                 280                 285
Asp Gln Asp Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln
    290                 295                 300
Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg
305                 310                 315                 320
Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr His Gly
                325                 330                 335
Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Gln Phe LysAsp Asn Val Ile
            340                 345                 350
Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu
        355                 360                 365
Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gln Pro Leu Pro
    370                 375                 380
Gln Arg Gln Lys Lys Gln Pro Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp
385                 390                 395                 400
Met Asp Asp Phe Ser Arg Gln Leu Gln Asn Ser Met Ser Gly Ala Ser
                405                 410                 415
Ala Asp Ser Thr Gln Ala
            420

一种肽文库、其合成方法及从该文库中筛选的活性片段.pdf_第1页
第1页 / 共139页
一种肽文库、其合成方法及从该文库中筛选的活性片段.pdf_第2页
第2页 / 共139页
一种肽文库、其合成方法及从该文库中筛选的活性片段.pdf_第3页
第3页 / 共139页
点击查看更多>>
资源描述

《一种肽文库、其合成方法及从该文库中筛选的活性片段.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《一种肽文库、其合成方法及从该文库中筛选的活性片段.pdf(139页珍藏版)》请在专利查询网上搜索。

本发明涉及一种肽文库,其中每一个肽的通式为:ZXnXn+1Xn+2Xn+3Xn+4Xn+5Xn+6Xn+7Xn+8Xn+9Y其中X代表任何一种L构型的天然氨基酸残基,n是指第Xn氨基酸在蛋白质序列中的天然排列位置,n为整数,Y代表NH2或者OH,Z代表氢或者Ac,其中Ac为乙酰基。所述的蛋白质序列的多肽优选为与人类相关的冠状病毒SARSCoV相关的S、M、E和N蛋白的多肽序列。本发明还涉及具有SA。

展开阅读全文
相关资源
猜你喜欢
相关搜索

当前位置:首页 > 化学;冶金 > 有机化学〔2〕


copyright@ 2017-2020 zhuanlichaxun.net网站版权所有
经营许可证编号:粤ICP备2021068784号-1