麦冬多糖MDG－1的制备方法.pdf

本发明公开了一种具有抗心肌缺血作用的麦冬多糖MDG－1的制备方法。该制备方法首先将麦冬块根经水提醇沉干燥后得到麦冬粗多糖，麦冬粗多糖采用超滤方法分离，再将超滤后的浓缩液用大孔弱碱阴离子交换树脂以水进行洗脱，收集4－8倍柱体积的洗脱部分，合并后，干燥，即得麦冬多糖MDG－1，其纯度≥90％。采用本发明方法制备麦冬多糖MDG－1，耗时短、成本低，能进行大量制备而适应工业化生产。

权利要求书
1、  一种麦冬多糖MDG-1的制备方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：
(1)麦冬多糖的提取
取干燥麦冬块根，压扁，用8-12倍量水提3次，合并水提液，并将其减压浓缩至0.5-1g/ml，加入75％-95％乙醇至含醇量达60％-80％，静置过夜，倾去上清液，沉淀重复醇沉1次，冷冻干燥，得淡黄色麦冬粗多糖粉末；
(2)将麦冬粗多糖粉末用15倍水溶解后，采用超滤方法分离，其中：超滤膜的材料选自醋酸纤维素、聚砜、聚酰胺或磺化聚砜；超滤膜的形状采用平板式、中空纤维式、管式或卷式；超滤压力为0.1-0.3MPa，超滤膜的截留分子量指标为10000；
(3)麦冬多糖的纯化
超滤后的浓缩液通过大孔弱碱性阴离子交换树脂，用水洗脱，收集4-8倍柱体积的洗脱部分，合并，干燥，即得麦冬多糖MDG-1。

2、  根据权利要求1所述的麦冬多糖MDG-1的制备方法，其特征在于，大孔弱碱阴离子交换树脂的型号为D-301、D-335、D-315或D-345。

说明书麦冬多糖MDG-1的制备方法
技术领域
本发明涉及一种具有抗心肌缺血作用的麦冬多糖MDG-1的制备方法。
背景技术
养阴类中药具有生津润燥、滋阴养液等功效，以治疗阴虚证为主，它们的毒性一般较小，作用比较温和，以滋补作用为主，对提高人体免疫力，防病治病具有重要的意义。随着人们对多糖药理作用的认识，多糖的研究也愈来愈受到重视，具有养阴作用的中药常含有大量的多糖，它们的生理活性作用分别体现在：免疫调节作用、抗肿瘤作用、降血糖、降血脂作用、抗氧化、抗衰老、保肝作用、抗病毒作用、抗疲劳、耐缺氧、抗纤维化、抗溃疡作用等各方面。
分子量在10000以下的麦冬多糖可明显增加小鼠耐缺氧能力和心肌营养血流量，能显著增加豚鼠离体心脏冠脉流量，显著抑制犬冠扎引起的心电图ST段抬高及CK、CK-MB的增加，同时有减小缺血心室肌重占总心室肌重的比例的趋势。口服、腹腔注射均能对抗异丙肾上腺素引起的心肌细胞坏死。证实了相对分子质量在10000以下的麦冬多糖是抗心肌缺血作用的有效部位之一。
中国专利CN1429557A于2003年7月16日公开了麦冬多糖提取物在制备抗心肌缺血药物中的应用。
如图1所示，中国专利CN1445244A于2003年10月1日公开的麦冬多糖MDG-1是分子量为5000的β-D-果聚糖，以2→1连接的呋喃型果糖为主，平均每2.8个主链基上有一个Fruf(2→6)Fruf(2→分支，且该多糖的还原端可能与α-D-Glc相连。
麦冬多糖MDG-1可以使缺血再灌的心脏收缩幅度和冠脉流量较快地恢复，并可抑制心率加快，还可降低缺血后血浆中乳酸脱氢酶的释放。说明麦冬多糖MDG-1对缺血再灌的心肌细胞具有保护作用。其机制可能有以下几个方面：①抑制心肌缺血造成的自由基生成增加和清除氧自由基，保护心肌细胞膜的作用[徐德生，冯怡，周跃华.麦冬多糖中抗急性心肌缺血活性部位研究[J].中成药，2004，26(10)：832-837.]。②增加心肌营养血流量[周跃华，徐德生，冯怡，等.麦冬提取物对小鼠心肌营养血流量的影响[J].中国实验方剂学杂志，2003，9(1)：22-24.]，使缺血的心肌较快恢复供血。进一步研究又发现MDG-1能显著抑制缺血性心肌细胞凋亡。阐明了麦冬多糖MDG-1为麦冬抗心肌缺血的物质基础之一。
鉴于麦冬多糖MDG-1在心血管系统中的治疗作用，麦冬多糖MDG-1的生产制备工艺就显得尤为重要。中国专利CN1445244A于2003年10月1日公开的麦冬多糖MDG-1的制备方法，包括下列步骤：(1)麦冬多糖的提取：取干燥麦冬块根，压扁用5-6倍量70％-95％乙醇回流3次，弃之，药渣水提2-3次，水提液减压浓缩至0.5-1g/ml，加入75％-95％乙醇至含醇量达60％-80％，静置过夜，倾去上清液，沉淀重复醇沉1次，冷冻干燥，得淡黄色麦冬多糖粉末，得率为20％左右；(2)麦冬多糖的超滤分离：麦冬总多糖用水稀释15倍，10000分子量膜超滤，压力为3.5大气压，超滤液70℃浓缩后，冷冻干燥；(3)麦冬多糖的纯化：取麦冬多糖少量水溶解，上DEAE SepharoseFF柱，水、0.1-4molNaCl梯度洗脱，蒽酮-硫酸法在线检测，收集水洗部分峰位，冷冻干燥后，水溶解上SephadexG50柱，水洗脱，合并峰位，冷冻干燥，再上SephadexG25柱，水洗脱，合并峰位，冷冻干燥，得到白色粉末，即为麦冬多糖MDG-1。但该制备方法耗时、成本高，无法适应工业化生产，也无法进行大量制备麦冬多糖MDG-1。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种耗时短、成本低，能进行大量制备而适应工业化生产的麦冬多糖MDG-1的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明提出的麦冬多糖MDG-1的生产制备工艺包括下列步骤：
1、麦冬多糖的提取
取干燥麦冬块根，压扁，用8-12倍量水提3次，合并水提液，并将其减压浓缩至0.5-1g/ml，加入75％-95％乙醇至含醇量达60％-80％，静置过夜，倾去上清液，沉淀重复醇沉1次，冷冻干燥，得淡黄色麦冬粗多糖粉末，得率20％左右；
2、麦冬多糖的分离
采用超滤方法进行分离，其中：超滤膜的材料选自醋酸纤维素、聚砜、聚酰胺或磺化聚砜；超滤膜的形状采用平板式、中空纤维式、管式或卷式；超滤压力为0.1-0.3MPa，溶液流速根据膜保持良好的透过率为宜，超滤膜的截留分子量指标为10000；
3、麦冬多糖的纯化
超滤后的浓缩液通过大孔弱碱性阴离子交换树脂，用水洗脱，收集4-8倍柱体积的洗脱部分，合并，干燥，即得麦冬多糖MDG-1。
作为本发明的优选技术方案，上述大孔弱碱阴离子交换树脂的型号最好为D-301、D-335、D-315或D-345。
相对于现有技术，采用本发明方法制备麦冬多糖MDG-1，耗时短、成本低，能进行大量制备而适应工业化生产。
附图说明
图1是麦冬多糖MDG-1的HPLC-ELSD图谱。
图2是本发明方法制备获得的麦冬多糖MDG-1的HPLC-ELSD图谱(纯度90％)。
具体实施方式
下面结合附图、实施例和比较例对本发明作进一步描述。
实施例1(麦冬多糖MDG-1的制备)
1.麦冬多糖的提取
称取干燥麦冬块根20kg，10倍量水提3次，每次30分钟，药渣水提2次。合并水提液并将其减压浓缩至1g/ml，加入95％乙醇至含醇量达70％，静置过夜，倾去上清液，沉淀重复醇沉1次，冷冻干燥，得淡黄色麦冬粗多糖粉末。
2.麦冬多糖的超滤分离
将麦冬粗多糖稀释15倍，使用截留分子量为10000、材质为醋酸纤维素的平板式超滤膜超滤，超滤压力为0.3MPa，超滤液在70℃的条件下浓缩后，冷冻干燥，得麦冬多糖3.6kg，得率为：18％。
3.麦冬多糖的纯化
取超滤后麦冬多糖3.6kg，用杭州汇华树脂有限公司生产的D-301大孔弱碱性阴离子交换树脂，以水进行洗脱，收集5倍柱体积水洗脱部分，合并后，干燥，得麦冬多糖MDG-1 1.01kg，得率为：5％。
4.麦冬多糖MDG-1的纯度鉴定
采用高效液相法：
色谱条件：SHODEX KS802色谱柱，流动相为水，流速1ml/min，柱温80℃，检测器为ELSD。多糖用适量水溶解，进样，呈一对称峰，如图2所示，说明该组分为分子量均一的多糖。纯度为：90％。结构鉴定为：MDG-1为β-D-果聚糖，以2→1连接的呋喃型果糖为主，平均每2.8个主链基上有一个Fruf(2→6)Fruf(2→分支)，该多糖的还原端可能与α-D-Glc相连。
实施例2(麦冬多糖MDG-1的制备)
1.麦冬多糖的提取
称取干燥麦冬块根20kg，8倍量水提3次，每次30分钟，药渣水提3次。合并水提液并将其减压浓缩至0.5g/ml，加入75％乙醇至含醇量达60％，静置过夜，倾去上清液，沉淀重复醇沉1次，冷冻干燥，得淡黄色麦冬粗多糖粉末。
2.麦冬多糖的超滤分离
将麦冬粗多糖稀释15倍，使用截留分子量为10000、材质为聚酰胺的中空纤维式超滤膜超滤，压力为0.1MPa，超滤液在70℃的条件下浓缩后，冷冻干燥。得麦冬多糖3.90kg，得率为：19.5％。
3.麦冬多糖的纯化
取超滤后麦冬多糖3.90kg，用蚌埠市辽源新材料有限公司生产的D-345大孔弱碱性阴离子交换树脂，以水进行洗脱，收集4倍柱体积水洗脱部分，合并后，干燥，得麦冬多糖MDG-1 1.14kg，得率为：5.7％。
4.麦冬多糖MDG-1的纯度鉴定
采用高效液相法：
色谱条件：SHODEX KS802色谱柱，流动相为水，流速1ml/min，柱温80℃，检测器为ELSD。多糖用适量水溶解，进样，呈一对称峰，说明该组分为分子量均一的多糖。纯度为：91％。结构鉴定为：MDG-1为β-D-果聚糖，以2→1连接的呋喃型果糖为主，平均每2.8个主链基上有一个Fruf(2→6)Fruf(2→分支)，该多糖的还原端可能与α-D-Glc相连。
实施例3(麦冬多糖MDG-1的制备)
1.麦冬多糖的提取
称取干燥麦冬块根20kg，12倍量水提3次，每次30分钟，药渣水提2次。合并水提液并将其减压浓缩至0.75g/ml，加入95％乙醇至含醇量达80％，静置过夜，倾去上清液，沉淀重复醇沉1次，冷冻干燥，得淡黄色麦冬粗多糖粉末。
2.麦冬多糖的超滤分离
将麦冬粗多糖稀释15倍，使用截留分子量为10000、材质为磺化聚砜的管式膜超滤，压力为0.2MPa，超滤液70℃浓缩后，冷冻干燥，得麦冬多糖4.06kg，得率为：20.3％。
3.麦冬多糖的纯化
取超滤后麦冬多糖4.06kg，用安徽三星树脂科技有限公司生产的D-315大孔弱碱性阴离子交换树脂，以水进行洗脱，收集8倍柱体积水洗脱部分，合并后，干燥，得麦冬多糖MDG-1 1.22kg，得率为：6.1％。
4.麦冬多糖MDG-1的纯度鉴定
采用高效液相法：
色谱条件：SHODEX KS802色谱柱，流动相为水，流速1ml/min，柱温80℃，检测器为ELSD。多糖用适量水溶解，进样，呈一对称峰，说明该组分为分子量均一的多糖。纯度为：90％。结构鉴定为：MDG-1为β-D-果聚糖，以2→1连接的呋喃型果糖为主，平均每2.8个主链基上有一个Fruf(2→6)Fruf(2→分支)，该多糖的还原端可能与α-D-Glc相连。
比较例(麦冬多糖MDG-1的实验室制备方法)
见中国专利CN1445244A说明书第13-14页实施例1部分。
将实施例1-3和比较例相比较，比较例中麦冬多糖的纯化需经DEAESepharoseFF柱、SephadexG50柱、SephadexG25柱等三个分离步骤；而实施例1-3中麦冬多糖的纯化只需经大孔弱碱性阴离子交换树脂一个分离步骤，工艺过程大大简化，所需时间大大缩短。
另外，DEAE SepharoseFF柱、SephadexG50柱和SephadexG25柱均采用进口填料，每100克分离柱填料需人民币4625元，而实施例1-3中麦冬多糖的纯化只需经大孔弱碱性阴离子交换树脂一个分离步骤，每100克大孔弱碱性阴离子交换树脂仅需人民币3.3元，成本大大降低，适合工业化生产。