筛选雌激素类化合物的全酵母细胞传感器及其构建方法.pdf

本发明涉及一种筛选雌激素类化合物的全酵母细胞传感器及其构建方法。所说的全酵母细胞传感器，是一种基因重组酵母，该基因重组酵母带有外源性人雌激素受体hER基因、雌激素效应元件ERE以及酵母增强绿色荧光蛋白yEGFP。yEGFP的表达受ERE的调控。其构建方法是：先构建hER cDNA酵母表达载体并用该载体转染酵母细胞；再构建ERE调控的yEGFP报告载体；然后将报告载体转化于上述hER cDNA基因转染的酵母细胞中，得到的转化子即本发明的发光全酵母细胞传感器。本发明以yEGFP为报告基因所构建的发光酵母细胞传感器，不需要添加任何底物和辅助试剂，安全，对环境无污染，且操作方便、时间短，费用低。

权利要求书
1、  一种筛选雌激素类化合物的全酵母细胞传感器，其特征在于，是一种基因重组酵母，该基因重组酵母带有外源人雌激素受体hER基因、雌激素效应元件ERE以及酵母增强绿色荧光蛋白yEGFP，yEGFP的表达受ERE的调控。

2、  如权利要求1所说的筛选雌激素类化合物的全酵母细胞传感器，其特征在于，所说的基因重组酵母是W303-1A/hER-ERE-yEGFP，即在W303-1A酵母细胞中重组整合有hER、ERE和yEGFP，且yEGFP的表达受ERE的调控。

3、  权利要求1所说的筛选雌激素类化合物的全酵母细胞传感器的构建方法，是：
1)利用基因工程技术构建hER cDNA酵母表达载体，并用该载体转染酵母细胞；
2)构建ERE调控的yEGFP报告载体；
3)将步骤2)的报告载体转化于步骤1)的转染酵母细胞中，使yEGFP的表达置于雌激素受体的调控之下，得到的转化子即本发明的发光全酵母细胞传感器。

说明书筛选雌激素类化合物的全酵母细胞传感器及其构建方法
技术领域
本发明属于环境监测及卫生防疫领域，具体涉及一种快速筛选雌激素类化合物的全酵母细胞传感器及其构建方法。
背景技术
环境雌激素类化合物是指存在于环境中的能够干扰体内分泌系统的一大类化合物，又称为环境雌激素。在雌激素类化合物的体外检测方法中，以用基因重组酵母检测评价环境雌激素较为常见。常用的方法是将人雌激素受体(hER)基因、雌激素效应元件(ERE)及编码β-半乳糖苷酶的LacZ基因(报告基因)重组于酵母细胞，使β-半乳糖苷酶的表达量在雌激素的调控之下。β-半乳糖苷酶可催化底物ONPG(邻-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖)显黄色，通过颜色的深浅甄别或检测雌激素类化合物。但这种方法需要破坏酵母细胞壁。不同的破壁方法对实验结果影响较大；酶活性受时间、温度、pH、菌液浓度的影响较大，而且耗时长，费用高；所用试剂较多，某些具有致癌性，对环境有一定的污染。
发明内容
为了解决现有检测方法耗时长，费用高，有污染的不足，本发明提供了一种快速筛选雌激素类化合物的全酵母细胞传感器，用于环境雌激素检测，有效地解决了问题。
本发明采用的技术方案是：
一种筛选雌激素类化合物的全酵母细胞传感器，其特征在于，是一种基因重组酵母，该基因重组酵母带有外源hER(人雌激素受体)基因、ERE(雌激素效应元件)以及yEGFP(酵母增强绿色荧光蛋白)，yEGFP的表达受ERE的调控。
作为本发明的一个具体的技术方案，所说的全酵母细胞传感器可以是W303-1A/hER-ERE-yEGFP，即在W303-1A酵母细胞中重组有hER、ERE和yEGFP，且yEGFP的表达受ERE的调控。结构特征如图1所示，传感器中主要由2个附加型酵母载体构成：(1)表达载体(pYG/hER)由酵母较强启动子GPD(3-磷酸甘油醛脱氢酶)启动子驱动hER(人雌激素受体)表达；(2)报告载体(pLZ-yEGFP)的yEGFP(酵母增强绿色荧光蛋白)的表达是在ERE的调控之下。
所说的酵母细胞，除W303-1A外，其他有Trp-和Ura-表型的酵母细胞也适用于本发明。
上述所说的筛选雌激素类化合物的全酵母细胞传感器的构建方法是：
1)利用基因工程技术构建hER cDNA酵母表达载体，并用该载体转染酵母细胞；
2)构建ERE调控的yEGFP报告载体；
3)将步骤2)的报告载体转化于步骤1)的转染酵母细胞中，使yEGFP的表达置于雌激素受体的调控之下，得到的转化子即本发明的发光全酵母细胞传感器。
绿色荧光蛋白(GFP)最初是从水母(Aequorea Victoria)中分离出来的，当受到紫外光(UV)或蓝光激发，后能够发射强烈绿色荧光的蛋白质。GFP有许多优点，如发光的特异性与物种无关，不需要底物及辅助因子或其他蛋白质。这样可将ERE与GFP相串联，使GFP的表达处于ERE的调控之下，构建成一种生长快，且能在廉价的培养基上生长的基因重组酵母细胞传感器，其GFP的发光程度与环境中雌激素类化合物的污染程度具有量效关系。当雌激素类化合物作用于该细胞传感器时，会使人雌激素受体蛋白(hER)发生变构效应，经ERE顺式激活GFP基因表达，通过测定GFP的发光强度来评价环境中雌激素类化合物的污染程度。用GFP作为报告基因，会克服用酶作为报告基因不经济、可比性差等缺点，也省却了对酵母破壁的繁琐操作，可直接测其荧光强度，具有方便、快速、稳定性好、对环境无污染等特点。
传统的以酶作为报告基因的酵母细胞传感器，需要添加底物、缓冲液及相关试剂，如磷硝基苯酚、邻-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖、β-巯基乙醇等，有些具有致癌性，会对环境造成一定的污染，而且操作繁琐、费时、成本高。
而以yEGFP为报告基因所构建的发光酵母细胞传感器，不需要添加任何底物和辅助试剂，安全，对环境无污染，而且操作方便、时间短(仅需4小时)，费用低。
附图说明
图1 本发明全酵母细胞传感器示意图
图2 本发明全酵母细胞传感器工作原理图
图3 yEGFP在酵母细胞中的表达
A：空白对照；
B：1nmol/L雌二醇诱导后；
C：10nmol/L雌二醇诱导后。
图4 是pGDP212质粒结构示意图
图5 是pMP208质粒结构示意图
图6 是阳性受试物Logistic剂量效关系
具体实施方式
文中所用到的质粒或细胞：
MCF-7：购自中科院上海细胞研究所
pGDP212：本室构建保存。承诺向公众提供20年。根据GeneBank中的GPD启动子DNA序列(gi:171542)，用PCR方法从酵母DNA提取液中扩增GPD启动子，上游引物为5’-CTGATTTAAATCGAGTTTATCATTATCAATA-3，下游引物为5’-TCCGGATCCGTCGAAACTAAGTTCTTGGT-3’。在引物的5’端分别设计Swa I和BamH I两酶切位点(黑体字所示)，并增加3个保护碱基。PCR产物经常规纯化回收后备用。用Swa I和BamH I分别对载体pYESTrp2(Invitrogen公司)和GPD的PCR产物双切，用T4连接酶将GDP启动子与pYESTrp2载体相连，构建成GPD驱动的酵母表达载体(pYGDP)。
用PCR方法从质粒pAW8-yEGFP扩增yEGFP基因，上游引物为5′-TGCGGATCCATGTCTAAAGGTGAAGAATTA-3′，下游为5′-ATCGTCGACGGATCCTTATTTGTACAATTCATCC-3′，引物两端设计BamH I和Sal I酶切位点(斜体所示)，并增加3个保护碱基，扩增产物经PCR纯化试剂盒回收，用BamH I和Sal I酶双切后，将其插入到pYGDP载体的GPD启动子的下游，以验证GPD的启动效果，将该载体命名为pGPD212。(如图4)
W303-1A酵母细胞：由江南大学王正祥教授惠赠。
pAW8-yEGFP：由英国苏塞克斯大学Yari Fontebasso博士惠赠
pMP208：本室构建保存。结构如图5。(李湘鸣，罗方妮，陈春波，等.雌激素调控的绿色荧光蛋白在酵母细胞中的表达，扬州大学学报(农业与生命科学版)，2006，27(2)：63-67.)申请人承诺向公众提供20年。
实施例1：本发明全酵母细胞传感器的构建
(1)重组人雌激素受体酵母细胞的构建
1)hER cDNA酵母表达载体的构建：取常规培养扩增的乳腺癌细胞MCF-7100ml，用购自美国Promega公司的总RNA提取试剂合，按说明书(SV total RNA Isolation System)提取MCF-7细胞的总RNA。根据全长人雌激受体基因(hER cDNA)序列(gi:31233)，设计上、下游引物，上游引物为5’-CGGGATCCGGACCATGACCATGACCC-3’，下游引物为5’-ATGTCGACGGATCCTCAGACGTGGCAGGGAAA-3’。引物两端分别增设Bam HI和Sal I酶切位点，并加两个防护碱基。用RT-PCR方法扩增hER cDNA。PCR产物经胶回收试剂盒纯化后，用BamH I和Sal I酶切，将切下的hER cDNA插入到酵母附加型表达载体(pGDP212)中，构建成pYG/hER质粒，由GPD(3-磷酸甘油醛脱氢酶)启动子驱动hER表达，选择性标志为trp-(色氨酸基因缺陷)。阳性克隆载体pYG/hER经常规酶切鉴定、测定，以验证重组表达载体接头及阅读框的正确。
2)人雌激素受体在酵母细胞中的表达
载体pYG/hER用醋酸锂(LiAC)方法转染于W303-1A酵母细胞，用SD/trp-平板筛选出阳性克隆，挑取3mm左右克隆，置于SD/-trp培养液中扩大培养。取1.5ml酵母细胞培养液，常规离心收集细胞，弃上清，加入STES缓冲液悬浮细胞，置于-20℃冷冻30min后，沸水中煮5min，提取酵母DNA，用PCR方法鉴定人雌激素受体基因的存在。同时取对数生长期的酵母细胞，提取蛋白质，用Western blot方法进行分析，以确定hER特异性表达。将该酵母细胞命名为W303-1A/hER。
(2)雌激素效应元件(ERE)调控增强绿色荧光蛋白(EGFP)在酵母中的表达
1)GFP遗传码突变
GFP在酵母细胞中发光较弱，因为含有许多酵母不嗜好的遗传密码子。基因表达水平与嗜好的密码子使用程度有较强的关系。在保持GFP氨基酸序列不变的前提下，对GFP编码序列密码子进行突变，使其成为酵母偏爱的密码子，以增强该重组细胞的发光效果。pAW8-yEGFP是经过人工改造的EGFP，基因yEGFP含有许多酵母所偏好的遗传密码子，可大大增强GFP在酵母中的荧光强度。
2)ERE调控EGFP酵母报告载体的构建
用PCR方法从质粒pAW8-yEGFP扩增yEGFP基因，上游引物为5′TGCACCGGTATGTCTAAAGGTGAAGAATTA-3′，下游为5′-ATCGCGGCCGCTTATTTGTACAATTCATCC-3′，引物两端设计Age I和Not I酶切位点(斜体所示)，并增加3个保护碱基，扩增产物经PCR纯化试剂盒回收，用Age I和Not I双切后，将其插入到pMP208载体的下游，构建成ERE调控的yEGFP报告载体，将该载体命名为pLZ—yEGFP。
(3)雌激素调控重组yEGFP发光酵母细胞传感器的建立
将W303-1A/hER用SD/-trp培养液扩增，用醋酸锂方法将pLZ-yEGFP转化于重组酵母细胞W303-1A/hER中，使yEGFP的表达置于雌激素受体的调控之下。转化子经SD/-trp，-ura培养平板筛选，挑取克隆，对阳性转化子进行PCR鉴定；取振荡培养过夜酵母培养液1ml于4ml SD/-trp-，ura培养液中，加入终浓度为0、1和10nmol/L的17 β雌二醇，30℃振荡培养4小时，置于荧光显微镜下观察，拍照。在荧光显微镜下，用蓝光激发重组酿酒酵母涂片，发现许多粒粒耀眼的绿光，分布均匀一致，说明GFP基因在酵母细胞中已成功表达(图.3)，并发现发光强度与经雌二醇诱导有量效关系，即发光强度0.2nmol/L>0.1nmol/L>空白对照。将该酵母细胞传感器命名W303-1A/hER-ERE-yEGFP，结构如图1所示。
其工作原理如图2所示，当雌激素类化合物作用于酵母细胞时，yEGFP基因的表达量与雌激素类化合物的作用强度具有某种函数关系，通过测定yEGFP的发光强度可以反映雌激素类化合物的污染程度或快速筛选某些雌激素类化合物。
实施例2：
选用24孔细胞培养板，加入SD/-trp，-ura培养液1.8mL、30℃振荡过夜的重组酵母细胞培养液0.2mL及用二甲亚砜或乙醇配制的不同浓度的受试物[双酚A、甲体(α)、乙体(β)、丙体(γ)和丁(ε)体六六六、O，P′-DDT、P，P′-DDT、P，P′-DDD、P，P′-DDE雌二醇、雌酮、雌三醇、马来酸二乙酯(DEM)、邻苯二甲酸二丁酯(DPA)]10μL，30℃震荡培养4小时，取1mL离心(13000rpm)1min，用PBS洗涤1次，重悬于PBS中，分别取100μL于96孔透明酶标板和黑色酶标板内，用GENios Plus多功能酶标仪测OD600值和荧光强度，激发波长为488nm，发射波长为509nm，以单位OD600酵母细胞表示相对荧光强度。阳性受试物(阳性对照)选用雌二醇，操作方法同受试物。结果如表1至表4，图6。
表1  O，P′-DDT和P，P′-DDD的雌激素效应研究(相对发光度，X±S)

表2  O，P′-DDE和P，P′-DDT的雌激素效应研究(相对发光度，X±S)

表3  三种六六六农药的雌激素效应研究(相对发光度，X±S)

表.4  三种受试物的雌激素效应研究(相对发光度，X±S)