一种分离巨核系祖细胞的方法 本发明涉及一种利用免疫磁珠两步法分离巨核系祖细胞的方法。
目前国际上及国内均单纯的采用分离CD34+细胞作为巨核细胞诱导分化的前体细胞，未见有分离巨核系祖细胞方法的报道。
造血干细胞(HSC)凭借其强大的自我更新和多系分化的能力而维持机体造血处于一相对恒定的状态，并持续一生。因此，HSC被认为是进行造血组织移植后重建长期造血和免疫功能的关键成分，而且在某些疾病的基因治疗中是最理想的靶细胞。因而，如何有效地分离造血干细胞始终是血液学研究领域的热点，这使得造血干细胞表型的研究显得尤为重要。近年来，造血细胞分选技术、造血生长因子的发现与克隆、各种ex vivo操作技术的建立与完善，使得造血细胞在数量、性能和功能方面的改造更易于操作与应用，从而产生了一个新兴的研究与应用领域，即造血细胞工程。造血细胞工程是利用造血干/祖细胞的高度增殖能力和多向分化潜能，通过细胞工程的技术，在体外模拟或部分模拟体内的造血环境或过程，对分离纯化的造血干/祖细胞进行体外扩增、定向诱导分化、功能激活与调控、目的基因转染等，从而在短时间内大量扩增早期的造血祖细胞及各阶段的造血前体细胞，以及定向诱导扩增大量的红细胞、粒/巨噬细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞、NK细胞、T/B淋巴细胞等功能细胞和免疫活性细胞，并可对部分细胞的功能进行激活和调控，对缺陷性基因进行靶向性转染，最终将造血细胞治疗更广泛和有效地应用于干细胞移植、生物免疫治疗、造血支持治疗和基因治疗等领域。造血细胞工程地应用有两个基础，一是前体细胞的分离(因为成熟细胞的代谢产物在体外培养过程中会对细胞的生长产生非常不利的影响)，二是体外培养体系的应用。巨核细胞体外培养是迄今为止最为困难的细胞，一方面是多种因素易影响巨核细胞的生长，另一方面是难于获得巨核系祖细胞。
目前临床和实验室分离HSC的方法均是针对CD34分子来进行的，然而，近年来对于HSC的体内和体外研究表明，能够重建长期造血和免疫功能的干细胞是不表达系特异性标志(Osawa M,Hanada K,Hamada H,et al.Long-termlymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negitivehematoloietic stem cell.Science,1996,173:242-245)。CD126分子为IL-6的受体(IL-6R)，研究表明，CD34+细胞可以分为两个细胞亚群，表达IL-6R和不表达IL-6R,IL-6R+细胞能被刺激形成粒-巨噬细胞，淋巴细胞和粒细胞，而IL-6R-细胞当被给予IL-6/sIL-6R时可形成红系及巨核系细胞，因此可证明巨核系祖细胞存在于IL-6R-细胞群中，我们利用上述特点采用免疫磁珠两步分离的方法建立了一种巨核系祖细胞的分离方法。
本发明的内容未公开发表，本领域的技术人员如不花费创造性劳动根本不能根据现有的技术推断得到本发明的分离方法。
本发明的目的是提供一种分离巨核系祖细胞的方法，以使得体外能高效诱导分化出巨核细胞以应用于基础及临床。
本发明的用于系阴性细胞分离的单克隆抗体组合：CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD24、CD41a、CD56、CD66b及GlycophorinA，上述组分与分离效果密切相关，基本囊括了粒系、单核、红系、巨核系及淋巴系细胞的所有成熟系特异性标志。
通过对脐带血单个核细胞的分离、及利用该方法分离的细胞的体外定向诱导分化、流式细胞仪分析的研究表明，本发明所分离出的细胞可在体外高效诱导分化出巨核细胞。诱导14天后巨核细胞所占的比例可达60％以上(以往的细胞分离方法只可诱导分化出30％左右)。
下面用实施例对本发明进行进一步详细说明。实施例1．脐带血单个核细胞的分离一方法
1．肝素抗凝的脐血(来自永定路医院)按1∶1的比例与PBS混匀，再按
4∶1与0.5％甲基纤维素混匀，室温静置30分钟，待红细胞自然沉降
至界限分明。
2．吸出上清，置于50ml离心管中，20℃、1500rpm离心5分钟。
3．弃上清，加5mlPBS重悬细胞。
4．先在10ml离心管中加入5ml淋巴细胞分离液，再缓慢沿管壁加入5ml
细胞悬液，20℃、1500rpm离心20分钟，分离出单个核细胞。
5．收集界面单个核细胞，用PBS洗涤。
6．用PBS悬浮细胞计数，备用。注：以上操作均严格按照无菌操作规程二．结果
经上述方法可从脐带血中分离出(8.465±4.04)×107个单个核细胞。实施例2．利用系特异性单克隆抗体组合及免癌磁珠分离系阴性(Lin-)细胞一、方法
(一)免疫磁珠标记
1 取分离的脐带血单个核细胞1×108，用PBS稀释到1ml，加入100μlcocktail抗体混合物(包括CD2,CD3,CD14,CD16,CD19,CD24,CD5,CD66b,CD41及Glycophorin A)，混合均匀，冰上孵育30分钟或室温孵育15分钟。
2 PBS洗涤细胞。
3 每毫升细胞加60μl磁珠，混匀。
4 冰上孵育30分钟或室温孵育15分钟。(二)分离步骤：
1 柱子安装：
1)将磁架竖直放置。
2)所有操作均在无菌条件下进行。
3)从无菌袋中取出柱子，注意不要碰到柱子的接头。
4)将柱子安装到磁场中，注意接头不能接触磁珠和磁架。
5)取出三接头活塞，并将针头连接在活塞上。
2 柱子的准备(注意：在柱子的初始化，洗及加样过程中任何时候都不
要让柱子流空)
1)安装磁铁和柱子，移去顶端的塞子。
2)设置三接头活塞，使液体从侧连接处进入柱子。
3)将一个灭菌的注射器装满PBS，除去气泡，连接到三接头的侧面。
4)缓缓推动注射器上的活塞，将PBS压到柱子中直到PBS达到不锈
钢基面以上，不要让气泡进入网眼，如柱中有气泡，轻弹柱壁，
可排除气泡。
5)洗柱：针头下端置一废液缸，移去针头上的的盖子，从柱端加入
缓冲液(含5％FBS的PBS)，旋转三接头活塞，使缓冲液从柱子流
到针头。
6)持续加入缓冲液，直到收集到3倍柱体积的液体。当液面刚好在
柱中基质以上时，旋转活塞，阻止介质继续从柱中流出。
3 分离细胞
1)从柱子的上端加入样品。
2)旋转活塞，使介质通过针头进入收集管，加8ml缓冲液洗柱(均
收集)。
3)收集流出的细胞即为Lin-细胞。二结果
通过上述方法从脐带血中分离出的Lin-细胞占单个核细胞的比率为(0.66±0.331)％；细胞绝对数为：(5.59±2.79)×105。实施例3．Lin-/CD126-细胞的分离一．方法
1．取CD126抗体(抗白细胞介素6受体抗体)工作液50μl(Backman
Coulter)与50μl免疫磁珠混合，混匀，4℃孵育30分钟。
2．将分离的Lin-细胞与上述混合物混匀，4℃孵育30分钟。
3．将细胞与抗体的混合物置于5ml分离管内，充分混匀，置于Backman
Coulter磁架上室温静置，直到磁珠贴于磁场一侧、试管内液体清亮
为止。
4．在磁场内轻轻将液体吸出，离心收集细胞即为CD126-/Lin-细胞。
5．加PBS混匀洗涤细胞。二．结果
CD126-/Lin-细胞占Lin-细胞的比率为：49.05±7.07％，细胞绝对数为：(2.74±0.40)×105。实施例4．Lin-/CD126-细胞体外向巨核细胞定向诱导分化一．方法
1．细胞培养：
IMDM(Gibco公司)培养基中含SCF 100ng/ml,TPO 4U/ml,IL-6
100ng/ml,sIL-6R 200ng/ml,2％BSA，胰岛素10μg/ml，转铁蛋白200
μg/ml,2-巯基乙醇0.01mmol/L,L-谷胺酰氨2mg/ml，叶酸50ng/ml，
维生素B1250ng/ml。Lin-/CD126-细胞接种浓度为2×104/ml，在37℃、
5％CO2、5％O2、90％N2条件下培养，每周半量换液，每3天补充上述
物质一次。第7天及第14天收集部分细胞用于细胞计数及巨核细胞表
型分析。
2．细胞计数及细胞表面标志分析
细胞直接用计数板计数，PBS洗涤细胞后，用PE-CD41,FITC-CD61单
克隆抗体加入PBS悬浮的细胞悬液中，冰上孵育30分钟，洗涤细胞，
流式细胞仪检测(Coulter)。同时设PE-IgG1及FITC-IgG1标记的阴性
对照抗体。二．结果
Lin-/CD126-细胞在上述细胞培养条件下，细胞总数在培养的第7天可扩增35±2.75倍，14天细胞总数可扩增94.5±12.96倍，流式细胞仪检测结果表明CD41a+/CD61+细胞(巨核系细胞)比例可达67％(见说明书附图)。
说明书附图所示为：Lin-/CD126-细胞体外向巨核细胞定向诱导分化细胞表型分析流式细胞仪检测结果
a．诱导分化前 b．诱导分化后