新型纤溶酶CGW-3及其制备方法 本发明涉及一种从链霉菌C3662发酵液中制备的新型抗血栓药物。
临床上，主要心脑血管疾病大都由于重要部位的血管被血栓阻塞所致。尽管血栓形成与血管及诸多因子有关，然而溶栓疗法是心脑血管栓塞性疾病的一种常规治疗手段。在溶栓剂方面目前主要有两大类：一类是纤溶酶原激活剂，已用到临床的有尿激酶，链激酶，t-PA等，正在研究开发中的这类药物还有葡激酶，另一类是可直接降解纤维蛋白的蛋白酶类药物，如多种蛇毒抗栓酶，蚓激酶，正在研制的纳豆激酶等。当前使用的溶栓药物虽然能为临床治疗提供一些可选择的品种，但还存在不同性质的缺陷和问题。有的药效作用比较缓慢，达到适宜再灌注血流需时较长(常达90分钟以上)，治疗效果不理想，此外还有引起出血性副作用，尤其是颅内出血，导致过敏反应，秃发，骨质疏松等不良反应；有一些溶栓药物来源较困难，如t-PA，尿激酶等；有的不易培养或分离技术比较繁琐，如蛇毒、蚓激酶和链激酶等；有的具溶栓活性的化合物毒性较大，如本实验室原来研制的纤溶酶SW-1。因此，期望的新的溶栓剂应具有的特征是：溶栓效果肯定，毒副作用小，给药方法容易，制备简单、价格合理等。
本发明的目的是从链霉菌中制备纤溶酶。链霉菌工业化培养条件成熟，为非致病菌，不产生内毒素，其本身具有外泌蛋白的能力，使产物的收取、纯化工艺比较简单，此外链霉菌还能产生蛋白降解抑制剂以保护所分泌的蛋白不受破坏。本发明与现有技术链霉菌来源的SW-1比较，其菌种不同，而且毒性显著降低，因此有可能开发成为临床较理想地新型抗血栓药物。
本发明的内容与要点：一、纤溶酶CGW-3的发酵
链霉菌C3662来源于南极土壤(保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中，保藏号CGMCC No.)，在合成五号培养基(KNO3 0.1～0.3％，NaCl 0.01～0.05％，K2HPO4 0.01～0.05％，FeSO4 0.0005～0.0002％，MgSO40.01～0.05％，可溶性淀粉1.0～3.0％，琼脂1.2～2.0％，PH 6.5～7.5)上25～29℃培养7～14天，将该菌种接种于培养基(葡萄糖1.0～3.0％，黄豆饼粉1.0～3.0％，淀粉0.5～2.0％，KH2PO4 0.01～0.1％，MgSO4 0.01～0.1％，CaCO3 0.1～0.5％，PH6.5～7.5)培养24～60小时，转种于同一培养基，25～27℃培养72～120小时，将培养物离心或过滤，得到发酵液。二、纤溶酶CGW-3的分离与纯化
链霉菌C3662发酵液经硫酸铵沉淀，Sephadex G-25脱盐，DEAE Sepharose脱色，CM Sepharose阳离子交换树脂及疏水层析后，得到CGW-3纯品，纯度可达HPLC90％(图1)，纯化流程如图2所示。三、纤溶酶CGW-3的检测和鉴别
1. CGW-3在纤维蛋白平板(含0.5～1.0％琼脂糖，0.2～0.5mg/ml纤维蛋白原和0.1～0.5μ/ml凝血酶)，经37℃保温16小时，显示透明圈，表明CGW-3为具有纤溶性质的纤溶酶。同时，CGW-3也具有对纤溶酶原的激活作用。因此，CGW-3既是纤溶酶，又是纤溶酶原激活剂。
2.根据CGW-3在SDS-PAGE蛋白电泳中的迁移率，其分子量为29KDa。
3. CGW-3在等电聚焦电泳中显示其等电点为8.5以上。
4. CGW-3的纤溶作用可被PMSF(苯甲基磺酰氟)抑制，而不受EDTA(乙二胺四乙酸)的影响，表明CGW-3可能是一种丝氨酸蛋白酶，而非金属蛋白酶。
5. CGW-3蛋白的N端15个氨基酸序列为：
V V G G T R A A Q G E F P F M
即缬氨酸—缬氨酸—甘氨酸—甘氨酸—苏氨酸—精氨酸—丙氨酸—丙氨
酸—谷氨酰胺—甘氨酸—谷氨酸—苯丙氨酸—脯氨酸—苯丙氨酸—甲硫
氨酸四、CGW-3的药理作用
1. CGW-3的静脉注射具有明显的抗栓效果
CGW-3用不同剂量在大白鼠舌下静脉给药，能明显延长颈动脉中血栓形成的时间(表一)。
表一 CGW-3对大鼠体内血栓形成的延长作用 给药剂量 血栓形成时间 (秒)血栓形成时间延长率％ 500μ/kg 100μ/kg 20μ/kg 对照 1572.4±176.03 1304.3±176.61 1011±90.18 685.2±93.96 129.5 90.4 47.5
X±SD，n＝10，与对照组比较，P＜0.01
2. CGW-3对动脉血栓有明显的溶栓作用
CGW-3通过股静脉给药，对金黄地鼠脑动脉血栓有明显的溶栓作用。给药剂量为40μ/kg时，给药后10分钟，用显微—电视—录像系统可观察到血栓溶解及血液流动状况，在500μ/kg剂量时，5分钟后，血栓明显减少。
3. CGW-3急性毒性极低
(1)CGW-3(粗品)小鼠口服8000mg/kg无死亡(表二)。
表二 CGW-3(粗品)小鼠口服急性毒性 剂量mg/kg 动物数 性别死亡动物数 100 1000 4000 5000 6000 8000 20 20 20 20 20 20 雌雄各半 雌雄各半 雌雄各半 雌雄各半 雌雄各半 雌雄各半 无 无 1 无 无 无
(2)CGW-3(粗品)小鼠静脉注射100mg/kg无死亡(表三)
表三 CGW-3(粗品)小鼠静脉注射急性毒性 剂量mg/kg 动物数 性别死亡动物数 1 10 100 20 20 20 雌雄各半 雌雄各半 雌雄各半 无 无 无
(3)CGW-3(纯品)小鼠静脉注射62500U/kg无死亡(表四)。
表四CGW-3(纯品)小鼠静脉注射急性毒性 剂量U/kg 动物数 性别 死亡动物数 2500 12500 62500 10 1O 10 雌雄各半 “ “ 无 “ “3. CGW-3无致突变作用
以组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97，TA98，TA100，及TA102，对CGW-3在1～3000μg/平皿范围内检测了致突变性(即Ames实验)结果见表五。
表五CGW-3诱发Ames菌株的回变菌落数(X+SD) 剂量 μg/皿 TA97 TA98 TA100 TA102 -S9mix +S9mix -S9mix +S9mix -S9mix +S9mix -S9mix +S9mix 3000 1000 100 10 1 阴性对 照(水) 阳性 对照 115±14.2 105±20.1 103±17.5 109±22.8 105±36.4 107±21.0 4-NQ0 0.5μg 298±50.7 139±18.1 159±22.0 133±31.2 148±32.7 167±27.3 160±6.0 2-AF 10μg 883±61.1 41±12.3 53±7.2 39±6.4 44±5.0 49±3.8 37±2.1 4-NQ0 0.5μg 161±28.5 58±5.3 61±2.1 55±7.9 52±8.0 49±16.2 53±8.9 2-AF 10μg 873±31 223±14.7 248±2.1 231±4.0 235±4.4 236±9.8 211±11.8 4-NQ0 0.5μg 1103±56.9 269±14.5 264±10.0 266±5.1 264±11.1 264±15.2 251±21.4 2-AF 10μg 718±31.6 364±11.1 366±25.0 322±10.6 312±15.1 331±27.3 288±28.4 MMC 0.4μg 947±108.7 373±24.7 370±15.4 345±43.6 333±28.3 333±24.7 338±22.3 2-AF 10μg 978±55.2
注：4-NQO为4-硝基喹啉-n-氧化物，A-AF为2-乙酰氨基芴，MMC为丝裂霉素
检测结果表明CGW-3在本试验条件下的Ames试验结果为阴性，说明CGW-3无致突变作用。
本发明的优点与积极效果是，链霉菌C3662代谢产物-纤溶酶CGW-3，不仅溶栓效果好，毒性低，而且工艺简便，生产成本低，环境污染少，显示了很好的开发前景。
附图说明：图1：CGW-3高压液相分析图谱，其中：横座标表示时间，纵座标表示毫伏，
峰值9.58处表示CGW-3的保留时间(出峰时间)图2：CGW-2纯化流程图