用于胰岛素产生细胞 的方法、组合物及生长与分化因子 发明背景
相关申请
本申请要求享有2002年5月28日提交的美国临时申请No.60/384000的优先权，该临时申请以其整体被并入本文作为参考。
【发明领域】
本发明涉及使非胰岛素产生胰细胞转化为干细胞的培养基、培养模式、培养条件和方法，所述干细胞能被增殖和分化为胰激素产生细胞。
相关技术描述
选择性地控制非胰岛素产生胰细胞，例如腺泡细胞或导管细胞扩展和转化为胰岛素产生细胞的能力，将创造新的糖尿病治疗方案，该方案避免现行糖尿病治疗的许多缺点。
糖尿病是一种由丧失将葡萄糖转运到身体细胞中的能力而引起的疾病，或者是因为没有产生足够的胰岛素，或者是因为减少了对胰岛素的应答。在健康人中，血糖微小升高刺激胰岛素的产生和分泌，其作用是增加葡萄糖摄入细胞，使血糖恢复到最佳水平。胰岛素刺激肝和骨骼肌细胞从血液中吸收葡萄糖并将其转化为能量贮藏分子糖原。它还刺激骨骼肌纤维从血液中吸收氨基酸并将它们转化为蛋白质，以及它作用于脂肪细胞刺激脂肪的合成。在糖尿病中，血流可被葡萄糖饱和，但葡萄糖不能到达细胞内需要和利用它的位置。结果身体细胞缺乏需要的能量，导致许多患受控不好的胰岛素依赖性糖尿病患者的消瘦外观。
在发现胰岛素及其作为糖尿病的治疗以前，唯一的出路是饥饿，可预测接着是死亡。用胰岛素治疗的今天，在过高剂量胰岛素的情况下，死亡仍会发生，过高剂量胰岛素导致极度低血糖和昏迷，然后死亡，除非通过葡萄糖的摄取而被逆转。在太低剂量胰岛素地情况下，死亡也仍会发生，太低剂量胰岛素导致酮酸中毒，如果不适当治疗，在紧急情况下也将导致昏迷和死亡。
虽然因为现在有适用于糖尿病的治疗，糖尿病通常不是一种致命的疾病，但没有一种标准的治疗能够取代身体的胰岛素微小量—微小量地产生和葡萄糖代谢的精确控制。结果，糖尿病人中的平均血糖水平一般仍然太高。长期高血糖水平随时间引起许多长期并发症。糖尿病是失明、肾衰竭、心脏病或中风的过早发展、坏疽并切除、阳痿的主要原因，而且它减少患者总估计寿命一至二十年。
糖尿病是世界上最常见的慢性疾病之一。在美国，糖尿病影响了大约一千六百万人-45岁以上成年人群的12％还多。新病例数以每年约150,000增加。除了那些患有临床糖尿病的人以外，表现出异常葡萄糖耐受症状的大约有二千万人。这些人是边缘的糖尿病人，在那些正常人和那些清楚为糖尿病人之间的中间。他们中的许多人早晚将发展为糖尿病而且一些估计糖尿病的潜在数目高达三千六百万或45岁以上成年人群的25～30％。
糖尿病及其并发症对现代社会具有较大的社会经济学影响。现在在美国花费在卫生保健上的费用是大约7000亿美元，其中大约1000亿被花费用于治疗糖尿病及其并发症。因为糖尿病的发病率正在提高，糖尿病保健的成本将占总卫生保健支出的不断增加部分，除非及时采取措施迎接挑战。糖尿病的医疗、情感和财政代价是巨大的，并且随着那些患糖尿病的人数增加而增加。
可以将糖尿病细分为两种不同类型：1型糖尿病和2型糖尿病。1型糖尿病以很少或没有循环胰岛素为特征并且它最常见于儿童或早期青少年。它是由胰岛产生胰岛素的β细胞的破坏引起的。因为对β细胞的自动免疫攻击导致所述破坏，1型糖尿病具有遗传诱因，它由一些还未鉴别的环境事件，例如病毒感染，或非感染剂的作用(毒素或食物)触发，该事件激发免疫系统对患者胰中的β细胞反应并且损坏患者胰中的β细胞。现认为导致1型糖尿病事件的致病顺序由几步组成。第一，认为遗传易感性是致病过程开始的基础要件。第二，由病毒或非感染剂，例如毒素或食物介导的环境损害激发第三步，在遗传易感个体胰岛中的炎性反应(胰岛炎)。第四步是β细胞的改变或转换，使得它们不再被免疫系统认为是“自己”，而是被看作是外来细胞或“非自己”。最后一步是针对“作为靶的”β细胞的完全损坏免疫应答的发展，其中细胞介导的免疫机制与细胞毒性抗体在产生胰岛素的β细胞的破坏中相互配合。尽管这种免疫攻击，一段时间内，新β细胞的产生是快的，足以位于被免疫系统破坏之前，从而存在大量的β细胞以控制血糖水平。但是，逐步地，β细胞的数目下降。当β细胞数降至临界水平(正常的10％)时，不能再控制血糖水平，以及进展为胰岛素产生的完全衰竭几乎是不可避免。现认为，β细胞的再产生持续几年，甚至在功能胰岛素产生停止以后，但当所述细胞发展成熟时，它们被破坏。
为了生存，患有1型糖尿病的人必须每天进行多次胰岛素注射并且每天多次通过刺破他们的手指取血测试他们的血糖。胰岛素的每天多次注射不足以模拟身体的微小量—微小量的胰岛素产生和葡萄糖代谢的精确控制。血糖水平通常比正常更高，引起并发症，包括失明、心脏病发作、肾衰竭、中风、神经损伤，和切除术。即使用胰岛素，糖尿病人的平均寿命比健康人少15-20年。
2型糖尿病通常出现在中年或中年后，特别影响那些超重的人。但是，在过去的几年间，年轻成年人中2型糖尿病的发病率显著地增加。在最近几年中，2型糖尿病发作的年龄已从40岁降至30岁，那些肥胖人成为这种疾病新的更年轻的受害者。在2型糖尿病中，正常需要胰岛素的身体细胞丧失了他们的敏感性并且不能对胰岛素正常应答。通过由胰β细胞产生额外的胰岛素可克服这种胰岛素耐受达许多年。但是，最终，由于升高的血糖水平，β细胞不得不产生大量的过量胰岛素，所以它们逐渐地衰竭。最后，过度工作的β细胞死亡以及胰岛素分泌停止，同时带来血糖升高至足够的水平，只能通过外源性胰岛素注射来控制它。高血压和异常胆固醇水平通常伴随2型糖尿病。这些状况，与高血糖一起，增加了心脏病发作、中风和导致切除术的腿部循环阻滞的风险。治疗2型糖尿病的药物包括起减少从肠的葡萄糖吸收或者由肝脏的葡萄糖产生作用的一些药物和直接刺激β细胞产生更多胰岛素的其他药物。但是，高水平葡萄糖对β细胞是毒性的，引起功能的进行性下降和细胞死亡。因此，许多2型糖尿病患者最终需要外源性胰岛素。最近令人不安的发现是最终需要胰岛素治疗的2型糖尿病人的估计从20％增加至40％。
糖尿病的另一种形式被称为年轻人成熟发作糖尿病(MODY)。这种形式的糖尿病是由于在胰岛素产生细胞中的遗传误差，该误差限制它加工通过特异性葡萄糖受体进入该这种细胞的葡萄糖的能力。MODY患者中的β细胞不能响应葡萄糖正确地产生胰岛素，导致高血糖症并且需要治疗，该治疗最终也需要胰岛素注射。
目前可适用于胰岛素依赖性糖尿病的医学治疗限于胰岛素施用和用整个胰或胰部分的胰移植。到目前为止，胰岛素治疗比胰移植更流行，通常需要通过多次皮下注射，或通过连续皮下注射给予胰岛素。常规胰岛素治疗涉及一天施用一次或两次注射中效胰岛素，添加或不添加小量常规胰岛素。多次皮下胰岛素注射技术涉及中效或长效胰岛素的施用，然后在晚上和/或早晨作为单剂量在每次饭前一起给予常规胰岛素。连续皮下胰岛素输注涉及小的电池驱动泵的应用，该泵通常通过27规格的蝶型针将胰岛素皮下递送至腹壁。用这种治疗样式，整个白天和晚上以基础速率，程序化的饭前以增加速率连续地递送胰岛素。在这些方法的每一种中，需要患者频繁地检测他的或她的血糖水平并且必要时调整胰岛素剂量。但是，控制血糖并不简单。尽管严格注意维持健康饮食、运动方案和总是注射合适量的胰岛素，但许多其它因素能不利地影响一个人的血糖控制，包括：应激、激素变化、生长期、疾病或感染以及疲劳。患有1型糖尿病的人必须经常对生命威胁性低血糖和高血糖反应作好准备。胰岛素依赖性糖尿病是一种生命威胁性疾病，它需要永不终止的警惕。
相比于胰岛素施用，已知整个胰移植或胰部分的移植治愈了患者中的糖尿病。但是，由于需要终生的免疫抑制治疗，通常仅在需要肾移植时进行胰移植，使单纯胰移植成为相对少见的手术。虽然胰移植在帮助胰岛素依赖性糖尿病人改善他们的血糖至他们不再需要胰岛素注射和减少长期并发症方面非常成功，但对整个胰移植来说有许多缺点。最重要地，进行胰移植涉及大手术并且需要终生应用免疫抑制药物以防止身体的免疫系统破坏作为外来移植物的胰。不用这些药物，几天间胰就被破坏。服用这些免疫抑制药物的风险是感染和肿瘤发病率的增加，二者各自都可以是生命威胁性的。手术操作中的内在风险，为防止移植排斥患者终生免疫抑制的需要以及与这种侵害性操作有关的发病率和死亡率，说明与整个胰移植用于治疗糖尿病有关的严重缺点。因此，对胰岛素注射和胰移植的替代将满足巨大的公众健康需要。
胰岛移植是比整个胰移植更简单(和更安全)得多的操作并且通过取代失去的β细胞能获得相同效果。胰岛素产生性β细胞存在于散布在整个胰中的朗格汉斯胰岛，一个横向位于胃后面的延长腺中。胰将1.5-3升含有用于消化的酶和酶原的碱液分泌到胆总管中。从组织学上看，胰由三类功能细胞组成：a)将它们的酶分泌到腔中的外分泌细胞，b)将所述酶携带至肠的导管细胞，和c)将它们的激素分泌到血流中的内分泌细胞。所述外分泌部分被排列为许多含有称为腺泡细胞的柱状至锥状上皮细胞的小腺(腺泡)。腺泡细胞占大约80％胰细胞并且负责将消化酶，例如淀粉酶、脂肪酶、磷脂酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨肽酶、弹性蛋白酶和各种其它蛋白分泌到胰管系统中。所述胰管系统由相互联系的导管的错综、支流样网络组成，这些导管排出每种分泌腺泡、向前排入更大的导管，最后排入主胰管。胰管系统的衬上皮细胞由导管细胞、占大约10％胰细胞的细胞型组成。导管细胞形态学从排出分泌腺泡的精细胚根中的立方型变化至主导管系统中高、柱状粘液分泌型。
胰的内分泌部分由约一百万个小内分泌腺，即散布在整个外分泌胰中的朗格汉斯胰岛组成。虽然胰岛细胞仅占大约2％胰细胞，但胰岛细胞通过适当地分泌胰岛素负责维持血糖水平并且是胰中最重要的细胞。按照所分泌的内分泌激素的类型分类，有七类胰岛细胞。胰岛β细胞产生胰岛素。如上文所讨论的，当没有足够的β细胞，或没有足够的胰岛素分泌时，不管潜在的原因，导致糖尿病。将糖尿病患者中的胰岛β细胞重构至足以恢复正常葡萄糖响应胰岛素产生的数目，将解决与胰岛素注射和大器官移植有关的问题。
在局部麻醉下，胰岛移植门诊操作允许病人在通过小导管将2-3毫升纯胰岛细胞的等效体输送到肝脏时完全保留意识。操作后不久患者可以回家或者恢复常规活动。因此，移植胰岛而不移植整个胰或其部分提供了许多绕开整个器官移植风险的方式。但是，缺乏适用于移植的胰岛细胞在胰岛细胞移植中仍然是一个未解决的问题。因为胰岛仅构成整个胰的约2％，将它们与不产生胰岛素的胰余下部分分离花费约6小时。虽然自动化的分离方法使从一个胰中分离足够移植到一个患者中的胰岛成为可能，但如与以前进行一次移植需要5或6个器官相反，对胰岛的需要仍然超过从尸体收获目前可获得的器官供应。在美国，由于低器官供体率和不断增加的胰岛素依赖性糖尿病发生的结合，仅有大约6,000份胰适用于移植的胰或胰岛细胞分离，同时每年被诊断为胰岛素依赖性糖尿病的新病例数大约有35,000(Hering，B.J.& Ricordi，C.(1999)Graft 2，12-27)。
解决严重胰岛细胞缺乏问题的一个方案是其它细胞的遗传改造以产生胰岛素。遗传改造其它细胞以产生胰岛素已经在肌肉和肝脏细胞中表现出一些成功，所述细胞能够被修饰以产生胰岛素的前体，胰岛素原。但是，改进这些遗传工程细胞中的胰岛素分泌将仍然需要相当大的研究努力以及它们的低胰岛素产生使它们还不适用于移植。另一种策略，异体移植，即从一个物种到另一个物种的器官(在糖尿病的情况下，或组织或细胞)移植要成为人移植胰岛素注射的可靠替代面临许多基本障碍。与异体移植有关的风险包括朊病毒例如引起疯牛病(牛海绵形脑病或BSE)的那些的转移，以及动物逆转录病毒例如PoERV(猪内源性逆转录病毒)的传递。另一个障碍是超急性排斥的问题。从进化角度看，移植中涉及的两个物种相距越远，当将一个物种的器官移植到另一个物种中时排斥过程越快和越严重并且需要更强和更大风险的免疫抑制。涉及遗传改造动物胰岛以使它们更不可能死于免疫系统攻击和破坏的策略具有干预沉默人内源性逆转录病毒序列(HERVs)的风险，大量所述序列分布在整个人基因组中。通过重组这些序列的激活以及跟着发生的HERV蛋白表达可导致癌或免疫系统功能失调(Romano等，Stem Cells 2000；18：19-39)。最后，动物和人器官和细胞在许多方面不同：在它们的解剖或结构，激素的产生，过滤速率，酶和其它化学物质的分泌和吸收方面，在它们的对疾病的耐受，和预计寿命方面。
解决关于胰岛细胞移植的组织可获得性问题的另一种策略是胚胎干细胞或全能干细胞的分离。全能干细胞是能够生长为身体中任何其它类型细胞的细胞，包括生长为整个生物。利用这类干细胞生长满足糖尿病移植需要所需的胰岛的问题在于它们从流产或体外受精的获得具有固有的伦理和政治风险。而且，使全能干细胞分化为正常胰岛素产生性细胞的技术从它们大量常规分化为将来所需要的胰岛素产生性细胞看，该技术还不完美以及还不受控制。它们响应葡萄糖浓度(该浓度激发正常β细胞中的胰岛素分泌)升高产生胰岛素的能力，显示它们不表现为正常胰岛β细胞(Vogel，Science，2001 292：615-617)。最后，为治疗目的在患者中应用胚胎干细胞带有肿瘤生长的内在危险。小鼠胚胎干细胞当被注射到成年小鼠中时是致瘤的，人胚胎干细胞当被注射到免疫机能不全的小鼠中时也证实相似的致瘤潜能。胚胎干细胞的潜在应用需要未分化干细胞与所想要的分化子代的精确分离，这是临床应用防止潜在肿瘤形成的关键和还未完成的前提(Solter和Gearhart，Science 1999，283：1468-1470)。
因此，存在对大量非致瘤人β细胞的重要未满足的医疗需求以治疗世界上数以百万计的糖尿病患者。由轻易可得的原材料例如被转化为临床上有关干细胞的胰腺泡和导管细胞大规模生产人胰岛素产生性β细胞的策略将克服目前方法所面临的障碍。
根据从原代胰细胞开始，使它们转化为胰岛素产生性细胞调查现有技术，基于起始目的细胞，经验历史上分成三类：胰岛细胞、导管细胞或腺泡细胞。有许多从胰岛细胞开始体外生长和扩展胰岛细胞群的现有经验。基本上所有这些方法分离纯化的胰岛并主要将它们置入贴壁培养系统，其中所述胰岛失去它们的胰岛表型，平铺为单细胞以及生长至汇合。大多数体外诱导直接分化胰岛细胞复制的努力表明有限的增殖胰岛细胞群同时保持它们分化状态的能力。汇集的这些研究的经验在于，在大多数情况下，培养这些贴壁胰岛细胞一段时间后，它们失去了它们的胰岛表型并分化为更原始的细胞型，该细胞型不好表征但体外扩展一段时间。然而，因为培养物的失去，这些细胞不可避免地进入衰老。
现证明，使这些更原始的细胞再分化回分化的胰岛非常困难(Nielson 92，Brelje 93，Bonner Weir 93，Otonkoski 91，Otonkoski94)。但是，在一种方法(Cornelius 97)中，允许将来自NOD小鼠的胰岛培养物铺板然后不更换培养基放置数周。不好鉴别的上皮细胞型的少数细胞是所有生存下来并可被生长出的细胞，它证实了增殖和在不同培养条件和试剂的状态下被分化为胰岛细胞的能力。所述的美国专利5,834,308和6,001,647，声称这些不好描述的上皮细胞为干细胞，该细胞需要这种培养以分离、生长和使它们发育为功能胰岛素产生性细胞的方法。虽然用这种胰细胞贴壁培养的方法证实了干细胞的存在，但细胞饥饿至最小存活以及生长和分化为胰岛细胞的技术是有问题的。这种方法需要胰岛细胞的广泛生长以达到生产用于糖尿病治疗的大规模移植物所需要的水平。至今没有证据表明，该方法可应用于人细胞以及可能扩大规模并同时保留临床产品所需这些胰岛细胞的分化表型。因此，我们转向如本发明中所述的一种替代方法，它在以下方面显著不同，它不从原代胰岛细胞开始形成可被扩展和分化为胰岛素产生性细胞的干细胞。取而代之的是，我们从非胰岛素产生性胰细胞开始，使它们转化为干细胞，该干细胞扩展然后分化为胰岛细胞。
其它方法将胰岛细胞置入MATRIGEL，胶原或琼脂糖，而不是利用贴壁培养物(Kerr-Conte 96)。这导致胆囊管结构的形成，伴随胰岛组织的退化以及导管结构和导管表型的细胞的生长和分化。本申请的发明人也将分离的人胰岛置入MATRIGEL并且证实导管细胞的诱导，所述导管细胞取代分化的胰岛细胞群。不同的基质也能使胰岛细胞转化为导管细胞，特别是在HGF的存在下(Lefrbvre 98)，但还是不能产生胰岛。虽然要求保护由这些结构形成的胰岛细胞，但不清楚它们的来源是来自存在于起始细胞中的残留胰岛组织还是新的胰岛素产生性细胞。导管结构和胰岛细胞还可以从还没有被特异鉴别的干细胞发育。
已被开发的下一种方法是从胰管细胞开始测定形成新胰岛细胞的能力。它基于在被疾病或操作被诱导损伤的发育性胎儿胰和成人胰中的观察，其中一个观察到了芽出导管结构的新胰岛的形成，它产生这样一种观念，即存在与导管结构有关的胰干细胞，该导管结构可被胎儿发育，或对成人胰中的胰岛群的损伤或损失激活。
从来自小鼠和大鼠胰而不是来自人胰的分离和纯化的导管结构开始(Fung，US 6,326,201)，单细胞开始体外形成单细胞层，该单细胞层主要为成纤维细胞和基质细胞的混合物。最终一些胰岛素产生性细胞开始出现在这些贴壁培养物中，但在单细胞层中仍然是低水平。少数生长因子的添加最小化地增加单细胞层中的胰岛素细胞数。但是，单细胞至被称为非粘附细胞(NAC)的细胞群开始出现漂浮在含有胰岛激素细胞型的单细胞层培养物上。在收获前通过利用生长因子脉冲可增加这些NAC’s。他们还描述了pdx1阳性细胞，一些与作为β细胞所需的胰岛素共染色，其它只具有pdx1染色，他们将其描述为祖细胞。上述NAC’s还能显示出葡萄糖刺激的胰岛素释放。他们还能向单细胞层中添加不同的生长因子，诱导增殖和表型变化。他们描述了应用凝集素纯化这些他们生产的祖细胞。因此，他们的结果支持来自大胰管的纯化胰管细胞被去分化为祖细胞的能力，通过利用他们的特异方法，所述祖细胞能分化为胰岛素产生性细胞。本发明在以下方面与Fung的工作显著不同：我们的起始胰细胞是人胰细胞而不是从纯化的导管结构中分离的。事实上，他声称仅由胰管组织生产导管细胞，他将该胰管组织定义为包括主胰管、副胰管、背胰管和腹胰管。他将小页间导管和闰管分别定义为他的胰管定义中不包括的单独实体。我们的起始胰组织排除了他定义为胰管的组织，因为这些更大的结构和结构部分在细胞分离过程中被筛选出我们的制备物并且在原材料的组织切片中观察不到。只有CK19染色阳性的胰管组织是位于腺泡细胞集合体内并且被腺泡细胞完全包围的闰管。
因此，我们的起始胰细胞是腺泡细胞、被腺泡细胞包围的闰管细胞和基质细胞的混合物，这些细胞是在从起始细胞混合物中纯化胰岛之后被收获的，在胰起始细胞中余下非常少的胰岛细胞。另外，我们的培养技术在不同的培养模式、多重培养基以及生长因子方面显著不同，这些生长因子显著不同，并被描述如下。
另一项工作是Bonner-Weir 2000的工作，该工作也从富含导管的胰组织开始，并陈述：他们的方法实际上不对我们利用的起始胰细胞起作用。他们的培养方法还依赖于不是我们主要方法主题的MATRIGEL，以允许新细胞迁入和形成胰岛素产生性细胞。
发展大量胰岛素产生性细胞的第三种方法从腺泡细胞开始。用腺泡细胞的大多数早期工作是维持它在培养物中的表型以更好地了解这些细胞(Oliver 87，Brannon 88)。然后企图了解胰癌细胞的来源，将注意转到导管细胞和腺泡细胞明显使表型变为一些类型导管细胞的能力，如所描述的。在胶原凝胶中培养腺泡细胞，Lisle & Losdon 1990描述了这种现象：培养6-12天，腺泡细胞在这种培养物中失去它们的特异性细胞标记并获得与导管细胞类似的标记(利用他们自己的单克隆抗体)，但后来随着培养继续，回复到它们的原始腺泡细胞标记。
再有，对胰癌感兴趣的Hall & Limoine 1992，描述了腺泡细胞在塑料皿上的培养，由此细胞经过5-10天开始变化为开始表达导管细胞标记之一CK19，但到3周时死亡。Arias & Bendayan 1993在MATRIGEL上培养了大鼠和豚鼠腺泡细胞，维持了它们的腺泡表型，但到一周时损失细胞。向MATRIGEL中腺泡细胞的培养物中添加2％DMSO使表型变为导管样细胞，该导管样细胞在MATRIGEL内开始形成孢囊(cyst)和小管(tubule)。另外，当在孢囊结构中时，所述细胞开始表达CAII，被导管细胞用来释放碳酸氢盐和水的一种特异酶。蛋白质抑制剂阻止所述向导管样表型的变化。看起来，MATRIGEL和DMSO的组合朝更原始阶段向前推动了去分化的胰岛细胞并进一步使它们分化为具有功能标记和形成三维结构能力的成熟导管细胞。提出了机制的问题：是否涉及干细胞或是否这表示转分化。
然后，Bouwens 1994研究了新生大鼠中潜在的导管细胞标记并描述，CK7是大胰管的标记而CK19在更小的导管，闰管，以及腺泡的泡心细胞中被表达。大鼠独有的另一种标记，CK20，与CK19标记类似细胞。他还注意到，当增殖继续进行时，一些邻近扩展性胰岛的细胞也表达CK19或CK20。检查在平板上培养的小鼠胰细胞，Vila 1994证实，人腺泡细胞在开始时表达CK18，但随时间，它们的表达变换为CK7和CK19，伴有淀粉酶水平下降。另外粘蛋白1表达和另一种导管细胞标记，CFTR(导管细胞的氯化物转运蛋白的标记)升高。而且，提出了问题：是否这种变化的机制表示转分化或涉及干细胞。他们还发现，HGF和TGFa暴露都引起这些细胞增殖，这暗示干细胞可能引起胰岛管恶性肿瘤以及可能在胰导管恶性肿瘤的发育中具有影响。但是，未观察到胰岛素产生。
Kerr-Conte 1996证实，将纯化的人胰岛置入MATRIGEL产生胆囊管样结构，该结构含有小芽状的胰岛细胞。至于这些可明显增殖的导管样细胞的来源可能是什么，从这项工作中还不清楚，但没有胰岛细胞增殖的证据。而且，如前文所讨论的，这表明这些可能使胰岛细胞去分化为导管样细胞，尽管分化的细胞不增殖，但这些细胞增殖的能力提高了这种可能性：这些细胞代表干细胞。但是，未观察到胰岛素产生。
Bouwens 1998比较了转分化的可能性与干细胞引起来自导管、腺泡或胰岛分化细胞的去分化细胞增殖的干细胞作用。虽然由于表现出不同细胞类型表达的细胞标记，他赞成转分化机制，但他的主要理由是因为这些细胞的确定性干细胞标记还没有被发育，因此要特异性地鉴别它们是不可能的。然而，他承认，间接证据能轻易地提示干细胞的存在以及所述特异性标记仅仅是还没有被完善。而且，在他的观察中也未观察到胰岛素产生。
Kerr-Conte 2000和在美国专利申请(20020155598)中显示，“多能胰干细胞”的存在是使终未分化的人胰细胞变为更原始细胞型的能力的主要原因，所述更原始细胞型具有扩展然后被分化为终未分化的另一种类型特异细胞的能力。作为这种干细胞的一种被认可的标记，她认为共表达CK19和pdx1的导管样细胞(Fung类似地建议)是那些干细胞。她在贴壁培养物中培养了人腺泡细胞和导管细胞的混合物，所述培养物显示淀粉酶的丧失，CK19的增加，以及pdx1在所得扁平为单细胞层的导管样细胞中的表达增加。但是，她不能显示向胰岛素产生性细胞的转化，却能显示神经内分泌细胞标记，嗜铬粒蛋白A的新表达。事实上，她的pdx1和CK19染色细胞是胰岛素产生性细胞的前体细胞的证据的声称与Fung和我们自己以及他们作为干细胞一致。但是她在她的专利申请中的声称，这些确实是胰岛素产生性细胞，仍未被图4和5中所表示的她自己的数据证明，这些数据没有提供通过这些转化的细胞增加胰岛素产生的任何直接证据。因此，她证实了干细胞的存在但没有证实它们向胰岛素产生性细胞的分化。与本发明相比，这是一个显著的区别，在本发明中我们清楚地证实了胰岛素产生性细胞的产生。这两个出版物中所描述的方法利用了胰岛含量减少、在单细胞层中培养的单胰细胞，使腺泡表型转变为被称为导管前体的导管样表型。根据她的定义，这些导管前体细胞具有被分化为胰岛素产生性细胞的能力。她试图通过将导管前体细胞置入MATRIGEL或胶原的基质再分化。她清楚地证实了导管前体细胞增殖的能力，但在专利申请中，没有证实任何新胰岛素产生性细胞的形成。
在她的技术与本发明中的技术之间存在显著区别。该发明中的第一步，即使非胰岛素产生性胰细胞的表型转化为干细胞，除了利用几种不同类型生长因子的贴壁培养以外，可在几种不同的培养模式中利用几种不同的培养基。如通过它经历复制为中间、更原始细胞的能力证实，形成了干细胞，所述更原始的细胞携带至今被认可用来鉴别这种干细胞的独特标记，这些标记是导管细胞标记如CK19和pdx1在复制细胞中的表达。她的第二步不产生胰岛素产生性细胞。在我们的第二步中，然后通过不同的生长因子和条件组使这些干细胞分化为胰岛素产生性细胞，在不同的细胞培养模式中再次证实。我们的发明还利用了比她的出版物和专利申请中所述的更复杂的生长和分化因子(表？？？)。下文还显示了我们的新胰岛素产生性细胞的正常组织学和功能。本发明中所用干细胞的定义是基于美国国家医学图书馆(National Library of Medicine)的定义：它是一种未终末分化的，经历复制以及能分化为一种以上类型分化细胞的细胞。我们的实施例显示，起始非胰岛素产生性胰细胞在第一组培养条件下被转化为复制并携带CK19和pdx1标记的干细胞。这些干细胞然后能被分化为激素产生性胰岛细胞例如胰岛素或胰高血糖素以及在如下文所述的各种分化条件下分化为导管结构。
定义：
这些定义的许多的一般出处是OMIM，National Center forBiotechnology Information，National Library of Medicine，National Institute of Health。
腺泡细胞—胰细胞，占胰的80％并产生许多不同的酶，包括淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和许多其它酶。通过它们的酶含量，通过特异的细胞角蛋白例如CK18，以及通过抗表面唾酸糖蛋白的凝集素可鉴别腺泡细胞。腺泡细胞形成胰中被称为腺泡的球形结构单元，腺泡由极化的细胞组成，该极化的细胞将它们的酶产物释放到位于每个腺泡中心的小、中央化的闰管中。在初级细胞检查的任何时候，许多腺泡细胞含有两个核。
导管细胞—胰细胞，占胰的10％，界定更大的小叶间导管和小叶内导管以及最小的闰管，从腺泡中排出胰酶。导管细胞还产生碳酸氢盐和水以稀释酶和从这些导管结构释放到肠中后改变肠pH。通过细胞角蛋白亚型例如CK19和通过负责酸氢盐产生的酶可鉴别导管细胞。
胰岛细胞—内分泌细胞，占胰的2％并作为被称为胰岛的单独的细胞集合体(aggregate)存在，含有制造不同激素的不同细胞型。为所述胰岛集合体50-60％的β细胞制造允许葡萄糖进入身体大多数细胞的胰岛素。为所述胰岛30％的α细胞制造在禁食期间被释放的胰高血糖素，以允许葡萄糖从肝脏的送递以维持正常血糖。胰岛细胞10％的δ细胞制造精细协调葡萄糖水平的促生长素抑制素。胰多肽产生性细胞(胰岛细胞的5-10％)释放它们的改变外分泌和胃肠功能的激素。除这些主要的胰岛细胞型以外，还有其它制造许多其它激素的胰岛细胞型，其它激素包括GIP、VIP、胃泌素、铃蟾肽和其它。另外，所述胰岛含有作为富含毛细管床网状(fenestrated)的内皮，每种胰岛细胞将它的激素产物释放到毛细管床中。
胰细胞—含有腺泡、导管和胰岛细胞类型以及支持细胞和血管细胞的来自人供体(或其它哺乳动物物种)的初级胰细胞。
胰岛缺失(islet-depleted)的胰细胞—利用不连续或连续密度梯度从消化的胰细胞的悬液中分离胰岛后余下的细胞。该种群主要由具有腺泡集合体内小百分比的闰管的腺泡细胞(＞90％)、血管和神经组织，以及残留量的污染性胰岛物质组成。
胰腺泡—将它们的酶产物排空到中央腺泡区的任何小球形腺泡细胞结构，中央腺泡区排空到闰胰管中。
闰管—来自胰的细管或腺泡的导管，它排到小叶内导管内。
小叶内导管—从闰管收集胰汁并排到小叶间导管内的导管。
小叶间导管—从小叶内导管收集胰汁并排到胰管内的导管。
胰管—导管中最大的，包括主胰管、副胰管、背胰管和腹胰管。
干细胞—未末端分化，能进行复制以及能分化为一种以上类型分化细胞的细胞。
细胞生长—是细胞DNA的复制，接着是可通过BrdU或含氚胸苷掺合或KI67证实的胞质分裂。
细胞扩展—用来定义细胞的数目，该细胞已进行细胞分裂并增加它们的数目和总量，而不是通过过度生长简单地增大。
增殖—新部分或子代的快速和重复产生(如在通过快速连续的细胞分裂的细胞群中)。
细胞过度生长—用来定义增加它们细胞容积的增大细胞，而不是通过细胞分裂生长。
细胞周期—细胞生长周期。在细胞周期中的细胞离开静止期(G0期)，复制它们的内容物并分裂成两个。
分化—用来表明，细胞从先祖水平或更基础或一般化功能至更特异功能。
转分化—用来表明，细胞从确定功能水平转变为另一种水平。
去分化—用来表明，细胞从确定功能水平至较不确定功能水平或基础细胞。
全能的—能够发育为完全生物或分化为任何它的细胞或组织。
多能的—1：发育潜能不固定：具有发育可塑性例如多能细胞或多能胚胎组织。2：能够影响一种以上的器官或组织。
生长因子(GF)—包括可诱导细胞复制的许多化合物。有一般的生长因子例如表皮生长因子(EGF)和血管内皮生长因子(VEGF)。还有它们的作用更特异的生长因子。(例如胰岛素样生长因子1(IGF1)对胰岛的作用，或促红细胞素对红血细胞祖细胞的作用)。
分化因子(DF)—包括可诱导细胞型特异分化的许多化合物。用于胰岛细胞、腺泡细胞和导管细胞的特异分化因子。用于腺泡细胞的例子是地塞米松。
去分化因子(DDF)—包括用于胰岛细胞、腺泡细胞和导管细胞的许多因子，它们允许细胞失去分化的功能和转变为谱系中更低的功能水平。
基质—用来定义水凝胶或可聚合物质，它们使细胞保持在适当的位置，用于在不同条件下的培养。这些包括MATRIGEL、胶原、藻酸盐和其他。
组织培养瓶、皿或平板基层—用来定义特定类型的塑料或玻璃表面，该表面成形为用于生长细胞的组织培养瓶、培养皿或培养板。制备这些表面以便它们促进或阻碍贴壁或非贴壁细胞生长。
包被的培养瓶、皿或平板表面—被化合物薄层包被的细胞培养皿。
悬浮培养—在不存在任何来自化合物薄层或任何基质的支持下，将细胞悬浮在组织培养基中。
α-生育酚—几种脂溶性维生素的任何一种，这些脂溶性维生素化学上是生育酚类，在各种脊椎动物的营养中是必需的，脊椎动物中它们的缺乏与不生育、肌肉中退化性改变或血管异常有关，特别存在于小麦胚芽、植物油、卵黄和绿叶蔬菜中或合成制造，以及主要在动物饲料中和作为抗氧化剂被使用。
脱铁运铁蛋白—由少突神经胶质细胞产生的蛋白质，它对细胞存活来说是必需的并且参与细胞分化。
心房肽—一种强排钠利尿和血管舒张肽或衍生自共同前体并由心房分泌的不同大小低分子量肽的混合物。所有这些肽共同具有一段大约20个氨基酸的序列。
生物素—尤其存在于酵母、肝脏和卵黄中的维生素B复合体的无色晶体生长维生素C10H16N2O3S。
BSA—(牛)血清白蛋白，是一种占大约一半血清蛋白质的单体蛋白质。在体内，它在稳定细胞外液容积中起作用和起类固醇、脂肪酸和一些激素载体的作用。
C钠尿肽(CNP)—一种22个氨基酸的肽，为排钠利尿肽家族中的一员。它来自内皮和肾细胞源，具有选择性心血管作用。
CAII-II型碳酸酐酶，被导管细胞用来产生碳酸氢盐的酶，其被分泌到胰管中以中和由胃产生的十二指肠中的酸。
泛酸钙—白色粉末状盐C18H32CaN2O10，合成制造并用作泛酸的来源。
肉碱—季铵化合物C7H15NO3，特别存在于脊椎动物肌肉中并参与脂肪酸跨线粒体膜的转移。
过氧化氢酶—由具有高铁血红素基团的蛋白质复合物组成并催化过氧化氢分解成水和氧的酶。
CCK—缩胆囊素，是一种脑和肠肽。在肠中，它诱导胰酶释放和胆囊收缩。它具有刺激胰岛素分泌的能力。CCK肽以多种分子形式(例如，硫酸化CCK8、未硫酸化CCK8和CCK4)存在，各自由CCK基因产物的不同转录后加工产生。
CFTR—囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)，起氯离子通道的作用。已发现CFTR基因中的突变引起囊性纤维化。CFTR中的突变影响胰、肠腺、胆汁树、支气管腺和汗腺中的外分泌功能。
CGRPα，(降钙素基因相关肽)—测定血液中激素降钙素的量的试剂。
霍乱毒素B亚单位—霍乱毒素的无毒性亚单位B对蛋白质复合物是重要的，因为它允许蛋白质通过神经节苷脂GM1的五糖链与细胞表面结合。
CK19—细胞角蛋白19，是已知最小(40-kD)的酸性角蛋白，水不溶性中间丝家族中的一员。不同的细胞角蛋白可被用作鉴别某些类型上皮和上皮肿瘤的标记。CK19角蛋白存在于许多类型上皮细胞中，包括许多导管上皮和腺上皮。在胰中，它存在于导管上皮中，在内分泌和外分泌细胞中不存在。
CK19+细胞—在培养中的上皮细胞中，特别是，在来自胰组织的“中间的”或转分化细胞中表达细胞角蛋白19。
皮质类固醇—各种肾皮质甾类(例如皮质酮、可的松和醛固酮)中的任何一种，基于它们主要生物活性，将它们分为糖皮质类固醇和盐皮质类固醇。
皮质酮—肾皮质的无色晶体皮质类固醇C21H30O4，它在蛋白质和碳水化合物代谢中是重要的。
皮质酮(Reichstein’s物质H)—肾皮质的无色晶体皮质类固醇C21H30O4，它在蛋白质和碳水化合物代谢中是重要的。
C-肽—c-肽(“连接”肽)是一种在胰岛素原转化为成熟胰岛素后释放的短多肽。它的分子量是3,582Da。
Cyclodextran—2-羟基丙基-β-环糊精。一种促进疏水性物质溶解的组织培养基添加剂。
DIF-1/Differanisole A—分化-诱导因子-1(DIF-1)是分离自盘基网柄菌属(Dictyostelium)的氯化己芬酮(hexaphenone)。DIF-1在多种类型哺乳动物肿瘤细胞中表现出抗肿瘤活性，尽管潜在的机制还不知道。Dictyostelium discoideum的形态发生素，DIF-1的结构与Differanisole A的结构密切相似，已从简单真核生物，Chaetomium的代谢物中分离了Differanisole A，作为鼠和人未分化肿瘤细胞的分化诱导剂。
DL-α-生育酚乙酸酯—具有高维生素E效能的生育酚C29H50O2。
DMF(n-n-二甲基甲酰胺)—影响细胞分化。酸化速率的抑制可能是由于减少的代谢性酸产生。H+产生和转运的改变促成它对细胞分化的作用。
DMSO—二甲基亚砜(CH3)2SO—它是一种已知诱导细胞分化的试剂，也是一种溶剂，还是一种用于冷冻活细胞的冷冻保护剂，还是一种用于治疗间隙膀胱炎的抗炎剂。
DMSO(二甲基亚砜)—一种用于治疗间隙膀胱炎的抗炎剂(CH3)2SO。
EGF—表皮生长因子，是一种用于许多外胚层和中胚层起源的培养细胞的强促有丝分裂因子，体内对特异细胞的分化具有显著作用，成熟EGF是一种由53个氨基酸组成和分子量为约6,000的单链多肽。
内皮缩血管肽1—由21个氨基酸残基组成的多种多肽中的任何一种，在不同细胞和组织中产生这些多肽，它们在调节血管舒缩活性、细胞增殖和激素产生中起作用，以及与血管疾病的发展有关联。
乙醇胺—无色液体氨基醇C2H7NO，特别用作脂肪和油的溶剂，—也称为单乙醇胺。
Exendin 4—GLP-1的长效类似物
FACS—荧光激活的细胞分选术
FCS—胎牛血清。从未出生的牛回收的血清。
FGF—FGF超家族由23个已知成员组成，他们全部含有一个保守的120个氨基酸的区域。最初认为FGFs具有增殖活性；现在认为它们在发育、血管发生、血细胞形成和肿瘤发生中起作用。几乎所有的FGFs同种型都具有激活其它同种型的受体的能力。这解释了由不同FGF亚型产生的类似效果。
FGF2—成纤维细胞生长因子2(FGF-碱性的)是一种广谱促有丝分裂、血管发生和神经营养因子，它在许多组织和细胞型中被低水平表达。现认为FGF2与许多生理和病理过程，包括肢发育、血管发生、创伤愈合和肿瘤生长有关联。
半乳糖—一种光学活性糖C6H12O6，比葡萄糖溶解性更差和甜度更小，已知呈右旋、左旋和外消旋形式。
GLP-1—胰高血糖素样肽1是一种衍生自前胰高血糖素原分子的30个氨基酸的肽。GLP-1增强葡萄糖分泌和合成。它使胰β细胞“有葡萄糖活性”并可适用于非胰岛素依赖性糖尿病的治疗。
GLP-2—GLP-2是一种33个氨基酸的胰高血糖素原衍生的肽。GLP-2通过对胃游动性与养分吸收、隐窝细胞增殖和凋亡和肠通透性的作用维持肠粘膜上皮细胞的完整性。
葡萄糖—一种光学活性糖C6H12O6，它具有醛式羰基。对所有植物和动物细胞而言，碳水化合物，特别是葡萄糖的断裂是能量的主要来源。在糖尿病中，将葡萄糖转运到身体细胞中的能力减小。血糖水平异常地高(高血糖)。升高的血糖可导致酮酸中毒，导致昏迷和死亡。较轻微的高血糖引起侵害眼、肾、神经和血管的长期并发症。
谷胱甘肽—含有谷氨酸、半胱氨酸、和甘氨酸各一个氨基酸残基的肽C10H17N3O6S，它广泛存在于植物和动物组织中，并在生物氧化-还原过程中和作为辅酶起非常重要的作用。
生长激素—生长激素(GH)由腺垂体腺合成。人生长激素的分子量为22,005并含有191个氨基酸残基，具有2个二硫键。生长激素的主要生物作用是出生后的生长控制。它的影响主要由胰岛素样生长因子介导。
GRP(胃泌素释放肽)—胃泌素释放肽受体(GRP-R)能引起许多，但不是所有能表达该受体的细胞的增殖。
Hb9—同源异型框9是以序列特异方式结合DNA的蛋白质家族中的一员，这些蛋白质与发育和成体组织中基因表达的控制有关联。
HGF—肝细胞生长因子(也称为分散因子或hepatopoietin A)具有一系列靶，除上皮细胞例如肝细胞以外还包括内皮细胞和黑色素细胞。它影响多样组织、介导胚胎中决定肝脏和肌肉发育的胎盘生长发育以及B-细胞增殖和生长。
HNF3α—肝细胞核因子3，α。叉头类转录因子中的一员。HNF 3A和HNF3B二者都在内胚层起源的组织，即胃、肠、肝脏和肺中被表达。HNF3家族的所有成员以及HNF4G和HNF6在胰β细胞中被表达。
HNF6—在小鼠发育过程中，Hnf6在作为外分泌和内分泌胰细胞的前体的上皮细胞中被表达。在hnf6缺乏的胚胎中，外分泌胰好像正常但内分泌细胞分化受损。Neurogenin-3，一种测定内分泌细胞前体必需的转录因子的表达几乎被废除。在生命中的后期，内分泌细胞的数目增加但胰岛的结构被干扰，以及β细胞缺乏葡萄糖转运蛋白-2表达。成年hnf6缺乏小鼠为糖尿病鼠。这提示，hnf6控制前体阶段胚胎胰内分泌分化并正向调节内分泌原基因ngn3。
HuSA—人血清白蛋白—参见BSA(牛血清白蛋白)。
IBMX—3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，抑制环AMP磷酸二酯酶的化合物，它引起β细胞释放胰岛素。
IGF1—胰岛素样生长因子-1。IGF1和IGF2二者都具有与胰岛素原的显著结构同源。
IGF2—胰岛素样生长因子-2。IGF1和IGF2二者都具有与胰岛素原的显著结构同源。
Johe’s N2—为支持多潜能CNS干细胞而配制的无血清培养基，补充有各种生长和分化因子。
KGF—角质细胞生长因子或FGF-7：一种28kDa，单链分泌型糖蛋白，它具有限制于上皮细胞的靶特异性。已知表达FGF-7的成体细胞包括成纤维细胞、T细胞、平滑肌细胞和卵巢膜细胞。在胚胎中，在整个间充质的许多发育阶段发现了KGF。
Ki67—一种细胞增殖标记。这种未知功能的蛋白质在细胞周期间的G1期被表达；它具有60-90分钟的半衰期。
催乳激素—刺激乳汁产生的任何激素(例如催乳素)。
层粘连蛋白—一种糖蛋白，它是结缔组织基底膜的组分并促进细胞粘着。
亮氨酸-脑啡肽—一种天然肽神经递质。最初从猪脑中分离的天然鸦片五肽。亮氨酸-脑啡肽(YGGFL)和甲硫氨酸-脑啡肽(YGGFM)特别强地与d型鸦片受体结合。
亚油酸(Linoleic acid)—一种液体未饱和脂肪酸C18H32O2，它特别以半干油(如花生油)的形式存在并且对一些动物的营养是必需的—也被称为亚油酸(linolic acid)。
亚麻酸—一种液体未饱和脂肪酸C18H30O2，它特别以干油(如亚麻子油)的形式存在并且对一些动物的营养是必需的。
甲硫氨酸-脑啡肽—一种天然肽神经递质。最初从猪脑中分离的天然鸦片五肽。亮氨酸-脑啡肽(YGGFL)和甲硫氨酸-脑啡肽(YGGFM)特别强地与d型鸦片受体结合。
Muc-1-1型粘蛋白，通常由特殊胰管细胞分泌的粘蛋白的主要类型。
肌醇—一种生物活性肌醇，它不是光学活性的，是维生素B复合体的组分和亲脂剂，它广泛存在于植物、微生物和包括人的高等动物中—也被称为肌醇(mesoinositol)。
N2—Johe’s N2培养基。
Neuro—神经基质培养基，一种中性细胞培养基。
NGF—神经生长因子，是一种12.5kDa，120个氨基酸残基长的非糖基化多肽。它作为前肽原被合成；它被加工过的形式是120个氨基酸的片段。NGF的典型形式是25kDa，无二硫键连接的同型二聚体。已知神经生长因子调节交感神经元和某些感觉神经元的生长和分化。
烟酰胺—烟酰胺(烟酸酰胺)，一种苦味晶体碱性酰胺C6H6N2O，它是维生素B复合体的成员，由烟酸形成并在活生物中被转化成烟酸，通常作为辅酶的组分天然存在，以及与烟酸类似地被应用。
PCNA+细胞—用抗增殖细胞核抗原标记的细胞。增殖细胞核抗原最初与细胞的增殖态相关。更近来的证据表明，PCNA可能还与DNA修复相关。
PDGF—血小板衍生生长因子。一种在凝血时由血小板释放的因子，被显示能促进各种类型细胞的生长。后来从血小板纯化了这种因子并命名为血小板衍生生长因子(PDGF)。现已知PDGF由除血小板以外的许多细胞型产生并且发现它是几乎所有间充质衍生细胞，即血液、肌肉、骨/软骨，和结缔组织细胞的促分裂原。
pdx-1—胰十二指肠同源框因子-1，PDX-1，是胰发育、胰岛细胞分化和β细胞功能的维持所需要的。也被称为胰岛素促进因子-1(IPF1)或IDX1或促生长素抑制素转录因子-1(STF1)。PDX-1似乎是起外分泌和内分泌胰发育程序表达的主控开关的作用，如通过基因破坏研究揭示的，在该研究中所述基因的靶向缺失导致无胰表型。最初在外分泌和内分泌细胞中都表达PXDX-1；随着胰形态发生继续，它限制于一些导管细胞和胰岛的β和δ细胞。PDX-1还在成体细胞中起作用，调节胰岛素和促生长素抑制素基因。PDX1基因中的突变能引起胰发育不全，年轻人的成熟发作糖尿病和可能引起II型糖尿病。
胎盘催乳素—这种肽激素在结构上、免疫学上和功能上与垂体生长激素类似。它由胎盘合胞滋养层合成。
孕酮—雌甾类性激素C21H30O2，它由黄体分泌以形成植入的子宫内膜，以后在怀孕期间由胎盘分泌以防止发育性胚胎或胎儿的排斥，它以合成形式作为出生控制丸被用于治疗月经紊乱和减轻一些不育症的情况。
胰岛素原—胰岛素的前体。胰岛素衍生自折叠、由两个二硫键连接的单链前体。通过酶切除连接A链的氨基端与B链的羧基端的部分使胰岛素原转化成胰岛素。
促乳素—一种与生长激素结构非常相似的生长因子。
PTF1—参见PDX-1。
PTHRP—甲状旁腺相关蛋白。
腐胺—微毒的晶体尸碱C4H12N2，它是通过鸟氨酸的去羧基化而形成的，广泛但小量存在于活物中，特别存在于腐败的肉中。
Reg1—再生胰岛衍生蛋白Laos，也被称为胰石蛋白。
视黄酸(维生素A)—细胞分化的局部调节剂。它在发育肢中具有许多功能，在低等脊椎动物中调节肢再生中的关键事件。
乙酸视黄酯—维生素A的衍生物。
硒(亚硒酸)—一种化学上类似硫和碲的非金属元素，当通过吃一些生长在土壤中的植物而被消化时，在许多动物中引起中毒，它在土壤中大量存在并且以同素异形形式存在，其中灰色稳定形式的导电性随其照明的强度变化而变化，因而被用于电子装置中。
Sonic Hedgehog(小鼠，重组的)—在包括脑、骨、皮肤、生殖腺和肺的许多细胞型的发育中起非常重要的作用。
大豆胰蛋白酶抑制剂(I-S型)—一种含有198个氨基酸残基的高分子量蛋白质(大约22,500)。大豆胰蛋白酶抑制剂抑制蛋白水解活性但不抑制弹性水解(elastolytic)活性。
P物质—P物质是受伤害感受传入的高强度刺激时在初级传入-二级神经元突触释放的优势神经肽。通过NK1受体的激活(参见伤害感受部分中的表)，P物质产生二级神经元缓慢、持续时间长的去极化。这导致对伤害感受器刺激的突触后反应的增强，由此起伤害感受传递的强度编码机制的作用。
超氧化物歧化酶(SOD)—一种含金属的抗氧化酶，它潜在地减少在正常代谢细胞对氧和过氧化氢加工过程中形成的有害氧自由基。
TGFα和β—转化生长因子(TGFs)是生物活性多肽，它们可逆地在培养细胞上赋予转化表型。α-TGF表现出与表皮生长因子大约40％序列同源性。TGFβ是一种多功能肽，它在许多细胞型中控制增殖、分化和其它功能。TGFB与TGFA在诱导转化中协同作用。它还起负自分泌生长因子的作用。TGFB激活和信号传导的失调可导致细胞凋亡。许多细胞合成TGFB以及几乎它们全部具有这种肽的特异受体。TGFB1、TGFB2和TGFB3全部通过相同受体信号系统发挥作用。
TGFβsRII(2型可溶解受体)—TGFβ调节细胞的生长和增殖，阻止许多细胞型的生长。TGF-β受体包括1型和2型亚单位，这两种亚单位是丝氨酸-苏氨酸激酶并且通过转录调节剂的SMAD家族进行信号传导。TGF-β信号传导中的缺陷，包括SMADs中的突变，与人类中的癌有关。
转录因子(TF)—转录因子与DNA中的特异调节序列结合并调控RNA聚合酶的活性。这是调节DNA中编码的基因被复制或转录为信息RNA过程的关键步骤。正常情况下，许多不同转录因子的相互作用决定不同细胞型的特异表型。转录因子可以为基因表达的正或负调节剂。PDX1、neurogenin 3(ngn3)、Pax4、Pax6和其它是那些参与胰发育和分化的转录因子的实例。
运铁蛋白—在体内能够与铁离子结合并转运铁的血浆中的β球蛋白。
三碘甲腺原氨酸—一种晶体含碘激素C15H12I3NO4，它是一种由甲状腺素衍生的氨基酸并呈其可溶钠盐形式尤其被用于治疗甲状腺功能减退和代谢机能不全—也被称为碘塞罗宁(liothyronine)，T3。
三碘甲腺原氨酸(T3)—一种晶体含碘激素C15H12I3NO4，它是一种由甲状腺素衍生的氨基酸并呈其可溶钠盐形式尤其被用于治疗甲状腺功能减退和代谢机能不全。
Trolox(可溶性维生素E)—维生素E的细胞可透性、水可溶性衍生物，具有强抗氧化性质。防止大鼠胸腺细胞中的过硝酸盐介导的氧化应激和细胞凋亡。
血管活性肠肽(VIP)—一种测定血清中VIP量的试剂。
VEGF—血管内皮生长因子—VEGF是一种肝素结合糖蛋白，它以45kDa的同型二聚体被分泌。是内皮细胞最重要的生长和存活因子之一。它在结构上与血小板衍生生长因子有关。VEGF诱导血管发生和内皮细胞增殖并且它在调节血管发生中起重要作用。许多类型细胞，但通常不是内皮细胞它们本身，分泌VEGF。
硫酸锌—锌是一种重要的痕量矿物质并且为细胞分裂、细胞生长和创伤愈合必需酶的活性所需。锌还参与碳水化合物的代谢。胰β细胞具有高锌含量。
发明概述
在一种实施方案中，本发明涉及一种使分化的非激素产生胰细胞转化为分化的激素产生细胞的方法，该方法包括步骤：a)在一定条件下在第一细胞培养系统中用第一细胞培养基培养分化的非激素产生胰细胞，所述第一细胞培养基包含基础培养基、有或无血清，以及有或无生长因子，在该条件下分化的非激素产生胰细胞转化为干细胞；和b)在一定条件下在第二细胞培养系统中用第二细胞培养基培养所述干细胞，所述第二细胞培养基包含选自A组的至少一种化合物和选自B组的至少一种化合物，其中A组包括下列化合物：β动物纤维素(Betacellulin)、活化素A、BMP-2、TGF-β SRII、DMSO、SonicHedgehog、层粘连蛋白、甲硫氨酸-脑啡肽、DMF和霍乱毒素A；以及其中B组包括下列化合物：活化素A、心房肽、β动物纤维素、骨形态发生蛋白(BMP-2)、骨形态发生蛋白(BMP-4)、C钠尿肽(CNP)、雨蛙肽(caerulein)、降钙素基因相关肽(CGRP-α)、缩胆囊素(CCK8-酰胺)、缩胆囊素八肽(硫酸化CCK8)、霍乱毒素B亚单位、皮质酮(Reichstein’s物质H)、地塞米松、DIF-1、Differanisole A、二甲亚砜(DMSO)、EGF、内皮缩血管肽1、Exendin 4、FGF酸式、FGF2、FGF7、FGFb、胃泌素I、胃泌素释放肽(GRP)、胰高血糖素样肽1(GLP-1)、葡萄糖、生长激素、肝细胞生长因子(HGF)、IGF-1、IGF-2、胰岛素、KGF、催乳激素、层粘连蛋白、亮氨酸-脑啡肽、白血病抑制因子(LIF)、甲硫氨酸-脑啡肽、正丁酸、神经生长因子(β-NGF)、烟酰胺、n-n-二甲基甲酰胺(DMF)、甲状旁腺素释放肽(Pth II RP)、PDGF AA+PDGFBB混合物、PIGF(胎盘GF)、孕酮、促乳素、腐胺二氢氯化物γ照射的细胞培养物、REG1、视黄酸、硒、亚硒酸、Sonic Hedgehog、大豆胰蛋白酶抑制剂、P物质、超氧化物歧化酶(SOD)、TGF-α、TGF-βsRII、TGF-β1、运铁蛋白、三碘甲腺原氨酸(T3)、Trolox、血管活性肠肽(VIP)、VEGF、维生素A和维生素E，在此条件下，所述干细胞分化为激素产生细胞。
在一种优选的实施方案中，所述第二细胞培养基包括选自A组的至少两种化合物和选自B组的至少两种化合物。
在一种更优选的实施方案中，所述第二细胞培养基包括选自A组的至少三种化合物和选自B组的至少三种化合物。
在还一种更优选的实施方案中，所述第二细胞培养基包括选自A组的至少四种化合物和选自B组的至少四种化合物。
在还一种更优选的实施方案中，所述第二细胞培养基包括选自A组的至少五种化合物和选自B组的至少五种化合物。
在还一种更优选的实施方案中，所述第二细胞培养基包括选自A组的至少六种化合物和选自B组的至少六种化合物。
在一种实施方案中，本发明涉及一种将干细胞培养为分化的激素产生细胞的方法，该方法包括在细胞培养系统中用细胞培养基培养所述干细胞，其中所述干细胞被分化为激素产生性细胞以及其中所述培养基包括无血清的基础培养基并且还包括选自A组的至少一种化合物和选自B组的至少一种化合物，其中A组包括下列化合物：β动物纤维素、活化素A、BMP-2、TGF-βSRII、DMSO、Sonic Hedgehog、层粘连蛋白、甲硫氨酸-脑啡肽、DMF和霍乱毒素A；以及其中组B包括下列化合物：活化素A、心房肽、β动物纤维素、骨形态发生蛋白(BMP-2)、骨形态发生蛋白(BMP-4)、C钠尿肽(CNP)、雨蛙肽、降钙素基因相关肽(CGRP-α)、缩胆囊素(CCK8-酰胺)、缩胆囊素八肽(硫酸化CCK8)、霍乱毒素B亚单位、皮质酮(Reichstein’s物质H)、地塞米松、DIF-1、Differanisole A、二甲亚砜(DMSO)、EGF、内皮缩血管肽1、Exendin 4、FGF酸式、FGF2、FGF7、FGFb、胃泌素I、胃泌素释放肽(GRP)、胰高血糖素样肽1(GLP-1)、葡萄糖、生长激素、肝细胞生长因子(HGF)、IGF-1、IGF-2、胰岛素、KGF、催乳激素、层粘连蛋白、亮氨酸-脑啡肽、白血病抑制因子(LIF)、甲硫氨酸-脑啡肽、正丁酸、神经生长因子(β-NGF)、烟酰胺、n-n-二甲基甲酰胺(DMF)、甲状旁腺素释放肽(Pth II RP)、PDGF AA+PDGF BB混合物、PIGF(胎盘GF)、孕酮、促乳素、腐胺二氢氯化物γ照射的细胞培养物、REG1、视黄酸、硒、亚硒酸、Sonic Hedgehog、大豆胰蛋白酶抑制剂、P物质、超氧化物歧化酶(SOD)、TGF-α、TGF-βsRII、TGF-β1、运铁蛋白、三碘甲腺原氨酸(T3)、Trolox、血管活性肠肽(VIP)、VEGF、维生素A和维生素E。
在一种优选的实施方案中，所述细胞培养基包括选自A组的至少两种化合物和选自B组的至少两种化合物。
在还一种优选的实施方案中，所述细胞培养基包括选自A组的至少三种化合物和选自B组的至少三种化合物。
在还一种优选的实施方案中，所述细胞培养基包括选自A组的至少四种化合物和选自B组的至少四种化合物。
在还一种优选的实施方案中，所述细胞培养基包括选自A组的至少五种化合物和选自B组的至少五种化合物。
在还一种优选的实施方案中，所述细胞培养基包括选自A组的至少六种化合物和选自B组的至少六种化合物。
附图简要说明
图1.从在组合阵列的生长和分化因子的存在下，在藻酸盐中培养的细胞中的胰岛素释放。供体#2212、#2278和#3023。
图2.从在组合阵列的生长和分化因子的存在下，在藻酸盐中培养的细胞中的胰岛素释放的刺激指数。供体#2212、#2278和#3023。
图3.从在前八种生长和分化因子组合(A-H)的存在下，在藻酸盐中培养的细胞中的胰岛素释放。供体#2212
图4.从在前八种生长和分化因子组合(A-H)的存在下，在藻酸盐中培养的细胞中的胰岛素释放的刺激指数。供体#2212
图5.从在前八种生长和分化因子组合(A-H)的存在下，在藻酸盐中培养的细胞中的胰岛素释放。供体#2278
图6.从在前八种生长和分化因子组合(A-H)的存在下，在藻酸盐中培养的细胞中的胰岛素释放的刺激指数。供体#2278
图7.从在前八种生长和分化因子组合(A-H)的存在下，在藻酸盐中培养的细胞中的胰岛素释放。供体#3023
图8.从在前八种生长和分化因子组合(A-H)的存在下，在藻酸盐中培养的细胞中的胰岛素释放的刺激指数。供体#3023
图9.从在前八种生长和分化因子组合(A-H)的存在下，在藻酸盐中培养的细胞中的胰岛素释放。供体#3036
图10.从在前八种生长和分化因子组合(A-H)的存在下，在藻酸盐中培养的细胞中的胰岛素释放的刺激指数。供体#3036
图11.从在前八种生长和分化因子组合(A-H)的存在下，在藻酸盐中培养的细胞中的C-肽释放的刺激指数。供体#3036
图12.从在前四种生长和分化因子组合(I-L)的存在下，在贴壁培养物中培养的细胞中的C-肽释放。
图13.在第二层30因子筛选中测定的，在前六种生长和分化因子组合的存在下，在贴壁培养物中培养的细胞的每孔胰岛素原阳性细胞数。
本发明和优选实施方案详述
在一种实施方案中，本发明涉及一种由不产生激素的分化细胞型生产激素产生细胞的方法。优选地，所述分化细胞型是胰细胞。优选地，所述细胞是胰岛缺失的胰细胞。更优选地，所述分化细胞型是非激素产生胰细胞。
在本发明一方面中产生的激素产生细胞优选产生由胰岛细胞产生的激素的一种或多种。更优选地，所述激素产生细胞产生胰岛素。
因此，本发明的优选方面是用于非激素产生胰细胞大规模扩展和非激素产生胰细胞大规模转化成激素产生细胞的方法和组合物。优选地，所产生的激素是胰岛素，但其它激素也被包含在本发明内，特别是来自胰岛细胞的激素。
在另一种优选的实施方案中，本发明提供适用于使胰非激素产生胰细胞转化为激素产生细胞的方法的组合物。
表5和6列出了可被添加到培养基中的因子，它包括潜在的生长因子和潜在的分化因子。为本公开目的，可相互交换使用术语“因子”、“组分”和“补充物”。
这些组分、因子和补充物包括但不限于活化素A、心房肽、β动物纤维素(Betacellulin)、骨形态发生蛋白(BMP-2)、骨形态发生蛋白(BMP-4)、C钠尿肽(CNP)、雨蛙肽、降钙素基因相关肽(CGRP-α)、缩胆囊素(CCK8-酰胺)、缩胆囊素八肽(硫酸化CCK8)、霍乱毒素B亚单位、皮质酮(Reichstein’s物质H)、地塞米松、DIF-1、Differanisole A、二甲亚砜(DMSO)、EGF、内皮缩血管肽1、Exendin4、FGF酸式、FGF2、FGF7、FGFb、胃泌素I、胃泌素释放肽(GRP)、胰高血糖素样肽1(GLP-1)、葡萄糖、生长激素、肝细胞生长因子(HGF)、IGF-1、IGF-2、胰岛素、KGF、催乳激素、层粘连蛋白、亮氨酸-脑啡肽、白血病抑制因子(LIF)、甲硫氨酸-脑啡肽、正丁酸、神经生长因子(β-NGF)、烟酰胺、n-n-二甲基甲酰胺(DMF)、甲状旁腺素释放肽(Pth II RP)、PDGF AA+PDGF BB混合物、PIGF(胎盘GF)、孕酮、促乳素、腐胺二氢氯化物γ照射的细胞培养物、REG1、视黄酸、硒、亚硒酸、Sonic Hedgehog、大豆胰蛋白酶抑制剂、P物质、超氧化物歧化酶(SOD)、TGF-α、TGF-βsRII、TGF-β1、运铁蛋白、三碘甲腺原氨酸(T3)、Trolox、血管活性肠肽(VIP)、VEGF、维生素A和维生素E。
关于活化素A，优选的浓度是0.125-1.5ng/ml；还更优选的浓度是0.25-1ng/ml；还更优选的浓度是0.375-0.75ng/ml；还更优选的浓度是0.45-0.6ng/ml；和最优选的浓度是0.5ng/ml。
关于心房肽，优选的浓度是38.25-459ng/ml；还更优选的浓度是76.5-306ng/ml；还更优选的浓度是114.75-229.5ng/ml；还更优选的浓度是137.7-183.6ng/ml；和最优选的浓度是153ng/ml。
关于β动物纤维素，优选的浓度是1.25-15ng/ml；还更优选的浓度是2.5-10ng/ml；还更优选的浓度是3.75-7.5ng/ml；还更优选的浓度是4.5-6ng/ml；和最优选的浓度是5ng/ml。
关于骨形态发生蛋白(BMP-2)，优选的浓度是1.25-15ng/ml；还更优选的浓度是2.5-10ng/ml；还更优选的浓度是3.75-7.5ng/ml；还更优选的浓度是4.5-6ng/ml；和最优选的浓度是5ng/ml。
关于骨形态发生蛋白(BMP-4)，优选的浓度是0.125-1.5ng/ml；还更优选的浓度是0.25-1ng/ml；还更优选的浓度是0.375-0.75ng/ml；还更优选的浓度是0.45-0.6ng/ml；和最优选的浓度是0.5ng/ml。
关于C钠尿肽(CNP)，优选的浓度是27.4625-329.55ng/ml；还更优选的浓度是54.925-219.7ng/ml；还更优选的浓度是82.3875-164.775ng/ml；还更优选的浓度是98.865-131.82ng/ml；和最优选的浓度是109.85ng/ml。
关于雨蛙肽，优选的浓度是7.5-90ng/ml；还更优选的浓度是15-60ng/ml；还更优选的浓度是22.5-45ng/ml；还更优选的浓度是27-36ng/ml；和最优选的浓度是30ng/ml。
关于降钙素基因相关肽(CGRP-α)，优选的浓度是47.625-571.5ng/ml；还更优选的浓度是95.25-381ng/ml；还更优选的浓度是142.875-285.75ng/ml；还更优选的浓度是171.45-228.6ng/ml；和最优选的浓度是190.5ng/ml。
关于缩胆囊素(CCK8-酰胺)，优选的浓度是6.25-75ng/ml；还更优选的浓度是12.5-50ng/ml；还更优选的浓度是18.75-37.5ng/ml；还更优选的浓度是22.5-30ng/ml；和最优选的浓度是25ng/ml。
关于缩胆囊素八肽(硫酸化CCK8)，优选的浓度是1.425-17.1ng/ml；还更优选的浓度是2.85-11.4ng/ml；还更优选的浓度是4.275-8.55ng/ml；还更优选的浓度是5.13-6.84ng/ml；和最优选的浓度是5.7ng/ml。
关于缩胆囊素八肽(硫酸化CCK8)，优选的浓度是3.125-37.5ng/ml；还更优选的浓度是6.25-25ng/ml；还更优选的浓度是9.375-18.75ng/ml；还更优选的浓度是11.25-15ng/ml；和最优选的浓度是12.5ng/ml。
关于皮质酮(Reichstein’s物质H)，优选的浓度是0.5-6ng/ml；还更优选的浓度是1-4ng/ml；还更优选的浓度是1.5-3ng/ml；还更优选的浓度是1.8-2.4ng/ml；和最优选的浓度是2ng/ml。
关于地塞米松，优选的浓度是0.5-6ng/ml；还更优选的浓度是1-4ng/ml；还更优选的浓度是1.5-3ng/ml；还更优选的浓度是1.8-2.4ng/ml；和最优选的浓度是2ng/ml。
关于DIF-1，优选的浓度是75-900ng/ml；还更优选的浓度是150-600ng/ml；还更优选的浓度是225-450ng/ml；还更优选的浓度是270-360ng/ml；和最优选的浓度是300ng/ml。
关于Differanisole A，优选的浓度是75-900ng/ml；还更优选的浓度是150-600ng/ml；还更优选的浓度是225-450ng/ml；还更优选的浓度是270-360ng/ml；和最优选的浓度是300ng/ml。
关于二甲亚砜(DMSO)，优选的浓度是0.25-3ng/ml；还更优选的浓度是0.5-2ng/ml；还更优选的浓度是0.75-1.5ng/ml；还更优选的浓度是0.9-1.2ng/ml；和最优选的浓度是1ng/ml。
关于EGF，优选的浓度是1.25-15ng/ml；还更优选的浓度是2.5-10ng/ml；还更优选的浓度是3.75-7.5ng/ml；还更优选的浓度是4.5-6ng/ml；和最优选的浓度是5ng/ml。
关于内皮缩血管肽1，优选的浓度是125-1500ng/ml；还更优选的浓度是250-1000ng/ml；还更优选的浓度是375-750ng/ml；还更优选的浓度是450-600ng/ml；和最优选的浓度是500ng/ml。
关于Exendin 4，优选的浓度是5.25-63ng/ml；还更优选的浓度是10.5-42ng/ml；还更优选的浓度是15.75-31.5ng/ml；还更优选的浓度是18.9-25.2ng/ml；和最优选的浓度是21ng/ml。
关于FGF酸式，优选的浓度是0.625-7.5ng/ml；还更优选的浓度是1.25-5ng/ml；还更优选的浓度是1.875-3.75ng/ml；还更优选的浓度是2.25-3ng/ml；和最优选的浓度是2.5ng/ml。
关于FGF2，优选的浓度是0.625-7.5ng/ml；还更优选的浓度是1.25-5ng/ml；还更优选的浓度是1.875-3.75ng/ml；还更优选的浓度是2.25-3ng/ml；和最优选的浓度是2.5ng/ml。
关于FGF7，优选的浓度是0.625-7.5ng/ml；还更优选的浓度是1.25-5ng/ml；还更优选的浓度是1.875-3.75ng/ml；还更优选的浓度是2.25-3ng/ml；和最优选的浓度是2.5ng/ml。
关于FGFb，优选的浓度是0.625-7.5ng/ml；还更优选的浓度是1.25-5ng/ml；还更优选的浓度是1.875-3.75ng/ml；还更优选的浓度是2.25-3ng/ml；和最优选的浓度是2.5ng/ml。
关于胃泌素I，优选的浓度是0.008038-0.09645ng/ml；还更优选的浓度是0.016075-0.0643ng/ml；还更优选的浓度是0.024113-0.048225ng/ml；还更优选的浓度是0.028935-0.03858ng/ml；和最优选的浓度是0.03215ng/ml。
关于胃泌素释放肽(GRP)，优选的浓度是35.75-429ng/ml；还更优选的浓度是71.5-286ng/ml；还更优选的浓度是107.25-214.5ng/ml；还更优选的浓度是128.7-171.6ng/ml；和最优选的浓度是143ng/ml。
关于胰高血糖素样肽1(GLP-1)，优选的浓度是8.25-99ng/ml；还更优选的浓度是16.5-66ng/ml；还更优选的浓度是24.75-49.5ng/ml；还更优选的浓度是29.7-39.6ng/ml；和最优选的浓度是33ng/ml。
关于葡萄糖，优选的浓度是270-3240ng/ml；还更优选的浓度是540-2160ng/ml；还更优选的浓度是810-1620ng/ml；还更优选的浓度是972-1296ng/ml；和最优选的浓度是1080ng/ml。
关于生长激素，优选的浓度是6.25-75ng/ml；还更优选的浓度是12.5-50ng/ml；还更优选的浓度是18.75-37.5ng/ml；还更优选的浓度是22.5-30ng/ml；和最优选的浓度是25ng/ml。
关于肝细胞生长因子(HGF)，优选的浓度是0.625-7.5ng/ml；还更优选的浓度是1.25-5ng/ml；还更优选的浓度是1.875-3.75ng/ml；还更优选的浓度是2.25-3ng/ml；和最优选的浓度是2.5ng/ml。
关于IGF-1，优选的浓度是0.625-7.5ng/ml；还更优选的浓度是1.25-5ng/ml；还更优选的浓度是1.875-3.75ng/ml；还更优选的浓度是2.25-3ng/ml；和最优选的浓度是2.5ng/ml。
关于IGF-2，优选的浓度是0.625-7.5ng/ml；还更优选的浓度是1.25-5ng/ml；还更优选的浓度是1.875-3.75ng/ml；还更优选的浓度是2.25-3ng/ml；和最优选的浓度是2.5ng/ml。
关于胰岛素，优选的浓度是2375-28500ng/ml；还更优选的浓度是4750-19000ng/ml；还更优选的浓度是7125-14250ng/ml；还更优选的浓度是8550-11400ng/ml；和最优选的浓度是9500ng/ml。
关于KGF，优选的浓度是0.625-7.5ng/ml；还更优选的浓度是1.25-5ng/ml；还更优选的浓度是1.875-3.75ng/ml；还更优选的浓度是2.25-3ng/ml；和最优选的浓度是2.5ng/ml。
关于催乳激素，优选的浓度是12.5-150ng/ml；还更优选的浓度是25-100ng/ml；还更优选的浓度是37.5-75ng/ml；还更优选的浓度是45-60ng/ml；和最优选的浓度是50ng/ml。
关于层粘连蛋白，优选的浓度是562.5-6750ng/ml；还更优选的浓度是1125-4500ng/ml；还更优选的浓度是1687.5-3375ng/ml；还更优选的浓度是2025-2700ng/ml；和最优选的浓度是2250ng/ml。
关于亮氨酸-脑啡肽，优选的浓度是0.75-9ng/ml；还更优选的浓度是1.5-6ng/ml；还更优选的浓度是2.25-4.5ng/ml；还更优选的浓度是2.7-3.6ng/ml；和最优选的浓度是3ng/ml。
关于白血病抑制因子(LIF)，优选的浓度是0.625-7.5ng/ml；还更优选的浓度是1.25-5ng/ml；还更优选的浓度是1.875-3.75ng/ml；还更优选的浓度是2.25-3ng/ml；和最优选的浓度是2.5ng/ml。
关于甲硫氨酸-脑啡肽，优选的浓度是0.75-9ng/ml；还更优选的浓度是1.5-6ng/ml；还更优选的浓度是2.25-4.5ng/ml；还更优选的浓度是2.7-3.6ng/ml；和最优选的浓度是3ng/ml。
关于正丁酸，优选的浓度是1135-13620ng/ml；还更优选的浓度是2270-9080ng/ml；还更优选的浓度是3405-6810ng/ml；还更优选的浓度是4086-5448ng/ml；和最优选的浓度是4540ng/ml。
关于神经生长因子(β-NGF)，优选的浓度是0.625-7.5ng/ml；还更优选的浓度是1.25-5ng/ml；还更优选的浓度是1.875-3.75ng/ml；还更优选的浓度是2.25-3ng/ml；和最优选的浓度是2.5ng/ml。
关于烟酰胺，优选的浓度是152500-1830000ng/ml；还更优选的浓度是305000-1220000ng/ml；还更优选的浓度是457500-915000ng/ml；还更优选的浓度是549000-732000ng/ml；和最优选的浓度是610000ng/ml。
关于n-n-二甲基甲酰胺(DMF)，优选的浓度是0.25-3×10-6％；还更优选的浓度是0.5-2×10-6％；还更优选的浓度是0.75-1.5×10-6％；还更优选的浓度是0.9-1.2×10-6％；和最优选的浓度是1×10-6％。
关于甲状旁腺素释放肽(Pth II RP)，优选的浓度是51.5-618ng/ml；还更优选的浓度是103-412ng/ml；还更优选的浓度是154.5-309ng/ml；还更优选的浓度是185.4-247.2ng/ml；和最优选的浓度是206ng/ml。
关于PDGF AA+PDGF BB混合物，优选的浓度是1.25-15ng/ml；还更优选的浓度是2.5-10ng/ml；还更优选的浓度是3.75-7.5ng/ml；还更优选的浓度是4.5-6ng/ml；和最优选的浓度是5ng/ml。
关于PIGF(胎盘GF)，优选的浓度是0.625-7.5ng/ml；还更优选的浓度是1.25-5ng/ml；还更优选的浓度是1.875-3.75ng/ml；还更优选的浓度是2.25-3ng/ml；和最优选的浓度是2.5ng/ml。
关于孕酮，优选的浓度是0.75-9ng/ml；还更优选的浓度是1.5-6ng/ml；还更优选的浓度是2.25-4.5ng/ml；还更优选的浓度是2.7-3.6ng/ml；和最优选的浓度是3ng/ml。
关于促乳素，优选的浓度是0.3-3.6ng/ml；还更优选的浓度是0.6-2.4ng/ml；还更优选的浓度是0.9-1.8ng/ml；还更优选的浓度是1.08-1.44ng/ml；和最优选的浓度是1.2ng/ml。
关于腐胺二氢氯化物γ照射的细胞培养物，优选的浓度是0.025-0.3ng/ml；还更优选的浓度是0.05-0.2ng/ml；还更优选的浓度是0.075-0.15ng/ml；还更优选的浓度是0.09-0.12ng/ml；和最优选的浓度是0.1ng/ml。
关于REG1，优选的浓度是8.1375-97.65ng/ml；还更优选的浓度是16.275-65.1ng/ml；还更优选的浓度是24.4125-48.825ng/ml；还更优选的浓度是29.295-39.06ng/ml；和最优选的浓度是32.55ng/ml。
关于视黄酸，优选的浓度是6.25-75ng/ml；还更优选的浓度是12.5-50ng/ml；还更优选的浓度是18.75-37.5ng/ml；还更优选的浓度是22.5-30ng/ml；和最优选的浓度是25ng/ml。
关于硒(亚硒酸)，优选的浓度是6.25-75ng/ml；还更优选的浓度是12.5-50ng/ml；还更优选的浓度是18.75-37.5ng/ml；还更优选的浓度是22.5-30ng/ml；和最优选的浓度是25ng/ml。
关于Sonic Hedgehog，优选的浓度是6.25-75ng/ml；还更优选的浓度是12.5-50ng/ml；还更优选的浓度是18.75-37.5ng/ml；还更优选的浓度是22.5-30ng/ml；和最优选的浓度是25ng/ml。
关于大豆胰蛋白酶抑制剂，优选的浓度是250-3000ng/ml；还更优选的浓度是500-2000ng/ml；还更优选的浓度是750-1500ng/ml；还更优选的浓度是900-1200ng/ml；和最优选的浓度是1000ng/ml。
关于P物质，优选的浓度是1250-15000ng/ml；还更优选的浓度是2500-10000ng/ml；还更优选的浓度是3750-7500ng/ml；还更优选的浓度是4500-6000ng/ml；和最优选的浓度是5000ng/ml。
关于超氧化物歧化酶(SOD)，优选的浓度是2.5-30IU/ml；还更优选的浓度是5-20IU/ml；还更优选的浓度是7.5-15IU/ml；还更优选的浓度是9-12IU/ml；和最优选的浓度是10IU/ml。
关于TGF-α，优选的浓度是0.25-3ng/ml；还更优选的浓度是0.5-2ng/ml；还更优选的浓度是0.75-1.5ng/ml；还更优选的浓度是0.9-1.2ng/ml；和最优选的浓度是1ng/ml。
关于TGF-βsRII，优选的浓度是1.25-15ng/ml；还更优选的浓度是2.5-10ng/ml；还更优选的浓度是3.75-7.5ng/ml；还更优选的浓度是4.5-6ng/ml；和最优选的浓度是5ng/ml。
关于TGF-β1，优选的浓度是0.125-1.5ng/ml；还更优选的浓度是0.25-1ng/ml；还更优选的浓度是0.375-0.75ng/ml；还更优选的浓度是0.45-0.6ng/ml；和最优选的浓度是0.5ng/ml。
关于运铁蛋白，优选的浓度是687.5-8250ng/ml；还更优选的浓度是1375-5500ng/ml；还更优选的浓度是2062.5-4125ng/ml；还更优选的浓度是2475-3300ng/ml；和最优选的浓度是2750ng/ml。
关于三碘甲腺原氨酸(T3)，优选的浓度是8.375-100.5ng/ml；还更优选的浓度是16.75-67ng/ml；还更优选的浓度是25.125-50.25ng/ml；还更优选的浓度是30.15-40.2ng/ml；和最优选的浓度是33.5ng/ml。
关于Trolox，优选的浓度是156.25-1875ng/ml；还更优选的浓度是312.5-1250ng/ml；还更优选的浓度是468.75-937.5ng/ml；还更优选的浓度是562.5-750ng/ml；和最优选的浓度是625ng/ml。
关于血管活性肠肽(VIP)，优选的浓度是16.625-199.5ng/ml；还更优选的浓度是33.25-133ng/ml；还更优选的浓度是49.875-99.75ng/ml；还更优选的浓度是59.85-79.8ng/ml；和最优选的浓度是66.5ng/ml。
关于VEGF，优选的浓度是0.625-7.5ng/ml；还更优选的浓度是1.25-5ng/ml；还更优选的浓度是1.875-3.75ng/ml；还更优选的浓度是2.25-3ng/ml；和最优选的浓度是2.5ng/ml。
关于维生素A，优选的浓度是6.25-75ng/ml；还更优选的浓度是12.5-50ng/ml；还更优选的浓度是18.75-37.5ng/ml；还更优选的浓度是22.5-30ng/ml；和最优选的浓度是25ng/ml。
关于可溶性维生素E，优选的浓度是156.25-1875ng/ml；还更优选的浓度是312.5-1250ng/ml；还更优选的浓度是468.75-937.5ng/ml；还更优选的浓度是562.5-750ng/ml；和最优选的浓度是625ng/ml。
在一种实施方案中，在细胞培养基中用悬浮、贴壁或基质的模式培养干细胞，所述培养基含有或不含血清，含有表1任一栏中所列的化合物。更优选地，所述培养模式是MATRIGEL，胶原、水凝胶或其它可交联凝胶基质。更优选地，所述培养模式是水凝胶基质。最优选地，所述培养模式是藻酸盐基质。
在一种实施方案中，在细胞培养基中培养干细胞，所述培养基含有或不含血清，含有表1，A栏中所列出的化合物。优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少一种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少两种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少三种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少四种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少五种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少六种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少七种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少八种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少九种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少十种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少11种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少12种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少13种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少14种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少15种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少16种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少17种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少18种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少19种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少20种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少21种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少22种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少23种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少24种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少25种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少26种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少27种。更优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列因子和补充物的至少28种。最优选地，所述培养基含有表1，A栏中所列出的全部因子和补充物。
在一种实施方案中，在细胞培养基中培养干细胞，所述培养基含有或不含血清，含有表1，B栏中所列出的化合物。优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少一种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少两种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少三种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少四种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少五种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少六种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少七种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少八种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少九种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少十种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少11种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少12种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少13种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少14种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少15种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少16种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少17种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少18种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少19种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少20种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少21种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少22种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少23种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少24种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少25种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少26种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少27种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少28种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少29种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少30种。更优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列因子和补充物的至少31种。最优选地，所述培养基含有表1，B栏中所列出的全部因子和补充物。
在一种实施方案中，在细胞培养基中培养干细胞，所述培养基含有或不含血清，含有表1，C栏中所列出的化合物。优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少一种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少两种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少三种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少四种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少五种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少六种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少七种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少八种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少九种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少十种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少11种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少12种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少13种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少14种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少15种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少16种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少17种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少18种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少19种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少20种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少21种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少22种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少23种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少24种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少25种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少26种。更优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列因子和补充物的至少27种。最优选地，所述培养基含有表1，C栏中所列出的全部因子和补充物。
在一种实施方案中，在细胞培养基中培养干细胞，所述培养基含有或不含血清，含有表1，D栏中所列出的化合物。优选地，所述培养基含有表1，D栏中所列因子和补充物的至少一种。更优选地，所述培养基含有表1，D栏中所列因子和补充物的至少两种。更优选地，所述培养基含有表1，D栏中所列因子和补充物的至少三种。更优选地，所述培养基含有表1，D栏中所列因子和补充物的至少四种。更优选地，所述培养基含有表1，D栏中所列因子和补充物的至少五种。更优选地，所述培养基含有表1，D栏中所列因子和补充物的至少六种。更优选地，所述培养基含有表1，D栏中所列因子和补充物的至少七种。更优选地，所述培养基含有表1，D栏中所列因子和补充物的至少八种。更优选地，所述培养基含有表1，D栏中所列因子和补充物的至少九种。更优选地，所述培养基含有表1，D栏中所列因子和补充物的至少十种。更优选地，所述培养基含有表1，D栏中所列因子和补充物的至少11种。更优选地，所述培养基含有表1，D栏中所列因子和补充物的至少12种。更优选地，所述培养基含有表1，D栏中所列因子和补充物的至少13种。更优选地，所述培养基含有表1，D栏中所列因子和补充物的至少14种。更优选地，所述培养基含有表1，D栏中所列因子和补充物的至少15种。更优选地，所述培养基含有表1，D栏中所列因子和补充物的至少16种。更优选地，所述培养基含有表1，D栏中所列因子和补充物的至少17种。更优选地，所述培养基含有表1，D栏中所列因子和补充物的至少18种。更优选地，所述培养基含有表1，D栏中所列因子和补充物的至少19种。更优选地，所述培养基含有表1，D栏中所列因子和补充物的至少20种。更优选地，所述培养基含有表1，D栏中所列因子和补充物的至少21种。更优选地，所述培养基含有表1，D栏中所列因子和补充物的至少22种。更优选地，所述培养基含有表1，D栏中所列因子和补充物的至少23种。最优选地，所述培养基含有表1，D栏中所列出的全部因子和补充物。
在一种实施方案中，在细胞培养基中培养干细胞，所述培养基含有或不含血清，含有表1，E栏中所列出的化合物。优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少一种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少两种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少三种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少四种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少五种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少六种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少七种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少八种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少九种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少十种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少11种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少12种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少13种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少14种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少15种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少16种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少17种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少18种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少19种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少20种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少21种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少22种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少23种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少24种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少25种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少26种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少27种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少28种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少29种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少30种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少31种。更优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列因子和补充物的至少32种。最优选地，所述培养基含有表1，E栏中所列出的全部因子和补充物。
在一种实施方案中，在细胞培养基中培养干细胞，所述培养基含有或不含血清，含有表1，F栏中所列出的化合物。优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少一种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少两种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少三种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少四种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少五种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少六种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少七种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少八种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少九种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少十种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少11种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少12种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少13种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少14种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少15种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少16种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少17种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少18种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少19种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少20种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少21种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少22种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少23种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少24种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少25种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少26种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少27种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少28种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少29种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少30种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少31种。更优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列因子和补充物的至少32种。最优选地，所述培养基含有表1，F栏中所列出的全部因子和补充物。
在一种实施方案中，在细胞培养基中培养干细胞，所述培养基含有或不含血清，含有表1，G栏中所列出的化合物。优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少一种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少两种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少三种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少四种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少五种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少六种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少七种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少八种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少九种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少十种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少11种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少12种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少13种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少14种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少15种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少16种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少17种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少18种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少19种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少20种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少21种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少22种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少23种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少24种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少25种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少26种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少27种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少28种。更优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列因子和补充物的至少29种。最优选地，所述培养基含有表1，G栏中所列出的全部因子和补充物。
在一种实施方案中，在细胞培养基中培养干细胞，所述培养基含有或不含血清，含有表1，H栏中所列出的化合物。优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少一种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少两种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少三种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少四种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少五种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少六种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少七种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少八种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少九种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少十种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少11种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少12种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少13种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少14种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少15种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少16种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少17种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少18种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少19种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少20种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少21种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少22种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少23种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少24种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少25种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少26种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少27种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少28种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少29种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少30种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少31种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少32种。更优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列因子和补充物的至少33种。最优选地，所述培养基含有表1，H栏中所列出的全部因子和补充物。
在一种实施方案中，在细胞培养基中用悬浮、贴壁或基质的模式培养干细胞，所述培养基含有或不含血清，含有表2任一栏中所列的化合物。更优选地，所述培养模式是贴壁。最优选地，所述培养模式是藻酸盐贴壁。
在一种实施方案中，在细胞培养基中培养干细胞，所述培养基含有或不含血清，含有表2，I栏中所列出的化合物。优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少一种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少两种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少三种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少四种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少五种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少六种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少七种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少八种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少九种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少十种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少11种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少12种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少13种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少14种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少15种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少16种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少17种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少18种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少19种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少20种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少21种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少22种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少23种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少24种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少25种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少26种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少27种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少28种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少29种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少30种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少31种。更优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列因子和补充物的至少32种。最优选地，所述培养基含有表2，I栏中所列出的全部因子和补充物。
在一种实施方案中，在细胞培养基中培养干细胞，所述培养基含有或不含血清，含有表2，J栏中所列出的化合物。优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少一种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少两种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少三种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少四种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少五种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少六种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少七种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少八种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少九种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少十种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少11种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少12种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少13种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少14种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少15种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少16种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少17种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少18种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少19种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少20种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少21种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少22种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少23种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少24种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少25种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少26种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少27种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少28种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少29种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少30种。更优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列因子和补充物的至少31种。最优选地，所述培养基含有表2，J栏中所列出的全部因子和补充物。
在一种实施方案中，在细胞培养基中培养干细胞，所述培养基含有或不含血清，含有表2，K栏中所列出的化合物。优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少一种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少两种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少三种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少四种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少五种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少六种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少七种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少八种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少九种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少十种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少11种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少12种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少13种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少14种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少15种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少16种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少17种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少18种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少19种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少20种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少21种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少22种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少23种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少24种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少25种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少26种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少27种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少28种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少29种。更优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列因子和补充物的至少30种。最优选地，所述培养基含有表2，K栏中所列出的全部因子和补充物。
在一种实施方案中，在细胞培养基中培养干细胞，所述培养基含有或不含血清，含有表2，L栏中所列出的化合物。优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少一种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少两种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少三种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少四种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少五种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少六种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少七种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少八种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少九种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少十种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少11种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少12种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少13种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少14种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少15种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少16种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少17种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少18种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少19种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少20种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少21种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少22种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少23种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少24种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少25种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少26种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少27种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少28种。更优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列因子和补充物的至少29种。最优选地，所述培养基含有表2，L栏中所列出的全部因子和补充物。
实施例
实施例1
胰细胞的顺序培养：先在藻酸盐中，然后悬浮培养
在含有1.6％藻酸盐，补充有导致干细胞产生的10％FBS、胰岛素、运铁蛋白、硒和EGF的由DMEM混合物和Ham’s F12营养混合物组成的培养基中，培养胰细胞6-12天。通过解聚作用从藻酸盐珠中收获干细胞，然后在补充有120种组合排列中的60种生长和分化因子的组合的基础培养基中，在超低贴壁板(Costar)中悬浮培养11天。在培养期结束时，细胞进行24小时基础葡萄糖培养基(5mM葡萄糖)、20mM葡萄糖或20mM葡萄糖+IBMX的攻击。收获上清液并用ELISA进行胰岛素含量分析。洗涤并溶解细胞然后用picogreen试验测定每孔的DNA含量。通过从在单独用葡萄糖或葡萄糖与IBMX组合刺激后的孔中上清液中的胰岛素含量中减去用基础培养基刺激的孔中的胰岛素含量，计算“胰岛素差”。单独用葡萄糖刺激后产生的上清液的胰岛素差为0.007-0.9908ng/孔，而用葡萄糖和IBMX刺激后的为0.0098-1.1523ng/孔。如通过所述胰岛素差计算的，许多孔产生低水平的胰岛素。与在添加组合排列中的因子以前测定的对照孔和在没有另外的生长和分化因子的基础培养基中培养的对照孔相比，少数孔产生显著量的胰岛素。
这些数据表明，为了促进胰干细胞向胰岛素产生细胞的分化，选择特定的生长和分化因子可与不同的培养模式结合使用。
实施例2
干细胞的顺序培养：先在藻酸盐中，然后贴壁培养
在含有1.6％藻酸盐，补充有导致干细胞产生的10％FBS、胰岛素、运铁蛋白、硒和EGF的由DMEM混合物和Ham’s F12养分混合物组成的培养基中，培养胰细胞6-12天。通过解聚作用从藻酸盐珠中收获干细胞，然后在补充有120种组合排列中的60种生长因子的组合的基础培养基中，在贴壁培养物中，在胶原包被板上培养8天。在培养期结束时，细胞进行24小时基础葡萄糖培养基(5mM葡萄糖)、20mM葡萄糖或20mM葡萄糖+1mM IBMX的攻击。收获上清液并用ELISA进行胰岛素含量分析。洗涤并溶解细胞然后用picogreen试验测定每孔的DNA含量。通过从在单独用葡萄糖或葡萄糖与IBMX组合刺激后的孔中上清液中的胰岛素含量中减去用基础培养基刺激的孔中的胰岛素含量，计算“胰岛素差”。单独用葡萄糖刺激后产生的上清液的胰岛素差为0.0019-0.9714ng/孔，而用葡萄糖和IBMX刺激后的为0.0052-0.9524ng/孔。如通过所述胰岛素差计算的，许多孔产生低水平的胰岛素。与在添加组合排列中的因子以前测定的对照孔和在没有另外的生长和分化因子的基础培养基中培养的对照孔相比，少数孔产生显著量的胰岛素。
这些数据表明，为了促进胰干细胞向胰岛素产生细胞的分化，选择特定的生长和分化因子可与不同的培养模式结合使用。
实施例3
干细胞在藻酸盐培养物中的培养
在含有1.6％藻酸盐的由补充有导致干细胞产生的10％FBS、胰岛素、运铁蛋白、硒和EGF的DMEM混合物和Ham’s F12养分混合物组成的培养基中，培养胰细胞6-12天。通过解聚作用从藻酸盐珠中收获干细胞，然后将其重新投入1.2％藻酸盐珠并在补充有120种组合排列中的60种生长因子组合的基础培养基中培养另外7-11天。在培养期结束时，使细胞进行基础葡萄糖培养基(5mM葡萄糖)、20mM葡萄糖或20mM葡萄糖+1mM IBMX的24小时攻击。收获上清液并用ELISA进行胰岛素和C-肽含量分析。将藻酸盐珠解聚，洗涤并溶解细胞，然后用picogreen试验测定每孔的DNA含量。
用由双份孔检查的结果，检查了来自4个利用来自4个不同人供体材料的重复实验的胰岛素和C-肽数据。通过将由在葡萄糖或葡萄糖和IBMX存在下孵育诱导的胰岛素或C-肽水平与由在基础培养基中孵育的孔产生的胰岛素或C-肽水平进行比较，鉴别了表现出胰岛素释放一致刺激的孔。对所有孔进行胰岛素测试以测定哪个孔的生长和分化因子的组合产生显著刺激的胰岛素释放：图1中描绘了这些测试的结果。这些点图显示了组合排列中每孔在基础葡萄糖、高葡萄糖或高葡萄糖加IBMX刺激后的胰岛素含量。这些中的许多显示了具有非常少胰岛素的孔，一些孔表现出高胰岛素基础水平以及高刺激和其它孔具有显著刺激释放。为有助于挑选最好的孔组合，以基础除高葡萄糖或以基础除IBMX计算刺激指数。这些结果显示在图2中。利用这些结果，这些清楚地表明了最好孔的多种侯选孔。为测定哪些是所选八种最好的孔，进行了几种另外的分析。
检查四个利用来自四个不同供体的细胞的不同实验表明，在这些实验中，存在供体与供体之间的变异。通过来自所有供体的分析测定了八种最好的孔。接着对这些个体供体的每一个进行了比较。图3中显示了供体#2212中来自基础与从IBMX刺激的胰岛素释放。与第0天相比，除孔A、D和E以外，每个最好的孔都具有刺激胰岛素的显著增加。来自这个供体的所有孔在一定程度上具有高基础胰岛素。将结果用刺激指数表示(图4)表明，最好的孔B、C、F、G和H具有最高应答。检查供体#2278的结果，在第0、7和14天，来自基础、高葡萄糖或IBMX的胰岛素释放显示了与对照孔的显著差别(图5)。因为导致所有最好孔低刺激指数的不清楚的原因，这种供体最好的孔都具有非常高的基础胰岛素(图6)。检查供体#3023的结果，在第0、7和14天，将来自最好孔的从基础、高葡萄糖或高葡萄糖与IBMX的胰岛素释放与对照进行了比较(图7)。这个供体具有较低的基础胰岛素释放，基本上所有最好的孔具有显著刺激的胰岛素释放。计算刺激指数(图8)，这些还表明了从最好孔的显著释放。但是，各自具有不同因子组合的最好孔在胰岛素释放方面有区别。一些表明IBMX释放高于葡萄糖(所期望的)，而其它的表明葡萄糖高于葡萄糖加IBMX。这提示，这些孔中的不同组合导致胰岛素产生细胞具有不同的能力。检查第四个供体(#3036)的结果，基础胰岛素水平低，在葡萄糖或葡萄糖加IBMX攻击后，具有显著刺激的胰岛素释放(图9)。回头看图2中的孔，这些最好的孔明显好于大多数的响应，来自其它供体的也是这种情况。刺激指数的检查(图10)表明，与单独葡萄糖相比，同葡萄糖加IBMX产生自这个供体的胰岛素产生细胞给出更高的响应。如图11中所示，以C-肽的刺激指数对这些上清液进行了C-肽含量分析。
总之，这些结果证实了含有不同生长和分化因子组合的孔之间的显著差别以及供体与供体之间的变异。所选择的最好孔不是最终答案，为了定义最佳组合需要另外的研究。
表1显示了这些最好的几个生长因子组合。
表1
导致最好胰岛素产生的培养基组成 物质 浓度(μg/ml) A BC D E F G H活化素A 0.0005 ★★ ★心房肽 0.1530 ★ ★ ★ ★β动物纤维素 0.0050 ★★ ★骨形态发生蛋白(BMP-2) 0.0050 ★ ★ ★ ★ ★骨形态发生蛋白(BMP-4) 0.0005 ★ ★C钠尿肽(CNP) 0.1099 ★★ ★ ★雨蛙肽 0.0300 ★ ★ ★ ★ ★CCK8 0.0057 ★ ★ ★CCK8(26-33)，酰胺， 0.0250 ★ ★ ★CGRPα 0.1905 ★ ★ ★霍乱毒素B亚单位 0.0125 ★ ★ ★ ★ ★皮质酮 0.0020★ ★地塞米松 0.0020★ ★ ★ ★ ★DIF-1/Differanisole A 0.3000 ★★ ★ ★DMF(nn二甲基甲酰胺) 0.0000 ★ ★★ ★ ★DMSO(二甲基亚砜) 0.0010 ★ ★ ★ ★ ★EGF 0.0050 ★ ★内皮素1 0.5000 ★ ★★ ★ ★ ★Exendin 4 0.0210 ★ ★ ★ ★酸性FGF(aFGF＝FGF1) 0.0025 ★ ★★ ★ ★ ★ ★FGF7(KGF) 0.0025 ★ ★ ★ ★ ★FGFb(＝FGF2) 0.0025 ★ ★ ★人胃泌素I 0.0000 ★GLP-1(7-36)酰胺，人(胰高血糖素样肽1) 0.0330 ★ ★葡萄糖 1.0800 ★★ ★ ★ ★ ★生长激素(促生长素) 0.0250 ★ ★ ★GRP(胃泌素释放肽) 0.1430 ★ ★ ★ ★肝细胞生长因子(HGF) 0.0025 ★ ★ ★重组人IGF-1 0.0025 ★★ ★ ★重组人IGF-2 0.0025 ★ ★ ★ ★ ★胰岛素 9.5000 ★ ★★ ★ ★ ★ ★ ★来自人胎盘的催乳激素 0.0500 ★★ ★层粘连蛋白 2.2500 ★★ ★ ★ ★亮氨酸-脑啡肽 0.0030★ ★ ★LIF，人(白血病抑制因子)0.0025★★甲硫氨酸-脑啡肽0.0030★★★正丁酸钠盐4.5400★★★★★人神经生长因子(βNGF)0.0025★★★★★烟酰胺610★★★★★★★PDGF AA+PDGF BB混合物0.0050★★★★PIGF(人胎盘生长因子)0.0025★★孕酮0.0030★★★★催乳素0.0012★★★pT II RP(甲状旁腺素相关肽)0.2060★★★★★腐胺二氢氯化物γ-照射的细胞培养物0.0001★★★★REG1，的新细胞肽模拟物0.0326★★★视黄酸(维生素A)0.0250★★★★★★★硒(亚硒酸钠盐)0.0250★★Sonic Hedgehog(重组小鼠)0.0250★★★★★★★P物质(全长)(H1875是片段1-4)5★★★★超氧化物歧化酶(SOD)5IU/ml★★★TGFα0.0010★★★★TGF B10.0005★★★TGF β sRII(2型可溶性受体)0.0050★★★★运铁蛋白2.7500★★★★三碘甲状原氨酸(T3)0.0335★★★Trolox(可溶性维生素E)0.6250★★★★大豆胰蛋白酶抑制剂，(I-S型)0.5000★★★★★★★血管活性肠肽(VIP)0.0665★★★★★VEGF0.0025★★★★
实施例4
在藻酸盐中培养的细胞的培养基分析
对在实施例3中由组合排列生产的由3个供体产生的上清液的胰岛素含量的统计分析，导致影响胰岛素产生和细胞生长的正和负效应物的清单，以及一致地好组合。
如通过这种组合系统所鉴别的，对干细胞向胰岛素产生细胞的转化具有潜在正作用的生长和分化因子，是：β动物纤维素、BMP-2、雨蛙肽、硫酸化CCK8、霍乱毒素B亚单位、CNP、皮质酮、DMF、DMSO、EGF、Exendin 4、FGF-1、葡萄糖、GRP、IGF-1、IGF-2、胰岛素、KGF、层粘连蛋白、亮氨酸-脑啡肽、甲硫氨酸-脑啡肽、NGFβ、烟酰胺、PDGF AA.BB、pTHRP、硒、SHH、P物质、TGFβsRII、运铁蛋白、vEGF、VIP。
如通过这种组合系统所鉴别的，对干细胞向胰岛素产生细胞的转化具有潜在负作用的生长和分化因子，是：活化素A、ANP、BMP-4、CCK8酰胺、CGRPα、地塞米松、DIF-1、内皮缩血管肽1、FGF-2、胃泌素I、GH、GLP-1、HGF、催乳激素、LIF、正丁酸、PIGF、孕酮、促乳素、腐胺、REG-1、视黄酸、SOD、大豆胰蛋白酶抑制剂、T3、TGFα、TGFβ、Trolox。
实施例5
干细胞的顺序培养：先贴壁，然后贴壁培养
在补充有120种组合排列的60种生长因子组合的基础培养基中，在胶原包被板上培养干细胞另外8天，所述干细胞由在PCM中的胶原包被板上贴壁培养6-12天产生。或者在第一培养期后从胶原包被板取出细胞并将其在新鲜培养板上重新铺板，然后在补充有120种组合排列的60种生长因子组合的基础培养基中培养另外8天。在培养期结束时，使细胞进行基础培养基或20mM葡萄糖的24小时攻击。收获上清并用ELISA进行胰岛素或C-肽含量分析。洗涤并溶解细胞然后用picogreen试验测定每孔的DNA含量。
对来自3个独立制备物，组成型产生胰岛素或诱导产生胰岛素葡萄糖刺激的孔的数据进行了统计分析并鉴别了“最好的孔”。表2中显示了前四个“最好的孔”中生长因子的组成。
表2
导致最好胰岛素产生的培养基的组成 物质浓度(μg/ml)IJKL活化素A0.0005★心房肽0.1530★★★β动物纤维素0.0050★★骨形态发生蛋白(BMP-2)0.0050★骨形态发生蛋白(BMP-4)0.0005★C钠尿肽(CNP)0.1099★★雨蛙肽0.0300★★CCK8，硫酸化的0.0057★★CCK8(26-33)，酰胺，0.0250★★★CGRPα0.1905★★★霍乱毒素B亚单位0.0125★★★皮质酮0.0020★★地塞米松0.0020★★★DIF-1/Differanisole A0.3000★★★DMF(nn二甲基甲酰胺)0.0000★DMSO(二甲基亚砜)0.0010★EGF0.0050★内皮素10.5000★Exendin 40.0210酸性FGF(aFGF＝FGF1)0.0025★★FGF7(KGF)0.0025★★★FGFb(＝FGF2)0.0025★人胃泌素I0.0000★★GLP-1(7-36)酰胺，人(胰高血糖素样肽1)0.0330★★★★葡萄糖1.0800★★★生长激素(促生长素)0.0250GRP(胃泌素释放肽)0.1430★肝细胞生长因子(HGF)0.0025★★★重组人IGF-10.0025★★重组人IGF-20.0025★★★胰岛素9.5000★★★★来自人胎盘的催乳激素 0.0500★★层粘连蛋白 2.2500★★亮氨酸-脑啡肽 0.0030★★LIF，人(白血病抑制因子) 0.0025★★★甲硫氨酸-脑啡肽 0.0030★★★正丁酸钠盐 4.5400★★人神经生长因子(βNGF) 0.0025★★烟酰胺 610★★★PDGF AA+PDGF BB混合物 0.0050★PIGF(人胎盘生长因子) 0.0025★★孕酮 0.0030★★催乳素 0.0012★★pT II RP(甲状旁腺素相关肽) 0.2060★★★★腐胺二氢氯化物γ-照射的细胞培养物 0.0001★★REG1，新细胞肽模拟物 0.0326★★视黄酸(维生素A) 0.0250★★★★硒(亚硒酸钠盐) 0.0250★Sonic Hedgehog(重组小鼠) 0.0250★★★★P物质(全长)(H1875是片段1-4) 5★★超氧化物歧化酶(SOD) 5IU/ml★★TGFα 0.0010★★★TGF B1 0.0005TGF β sRII(2型可溶性受体) 0.0050★★★★运铁蛋白 2.7500★★★三碘甲状原氨酸(T3) 0.0335Trolox(可溶性维生素E) 0.6250★大豆胰蛋白酶抑制剂，(I-S型) 0.5000★★血管活性肠肽(VIP) 0.0665★★VEGF 0.0025★
图12表示由这种实验产生的C-肽结果，表现出从显示正响应的基础、葡萄糖和葡萄糖加IBMX刺激的释放。检测收获自个体孔样品中的胰岛素和DNA浓度的范围，表明这是一种用于筛选生长和分化因子组合在胰细胞衍生的干细胞生长和分化中的作用的可行方法。
实施例6
120种组合排列的进一步优化
根据被诱导的胰岛素产生或总胰岛素产生，前面实施例中的数据鉴别了“最好的孔”。然后存在于“最好的培养基”中的成分可经历第二层筛选以简化和更好地定义诱导从干细胞产生的胰岛素产生细胞最小数目的因子。或者，正效应物(实施例4)可经历第二层筛选以获得相同的结果。
在该实施例中，将培养基“L”的30种组分排列到60中因子排列中。将由在胶原上贴壁培养7天产生的干细胞置于筛选状态中另外3、5或10天。在每个时间点，固定细胞并利用胰岛素原特异抗体进行免疫组织化学处理。利用自动显像分析，记数胰岛素原阳性细胞的数目。图13中显示了第3、5和7天利用培养基M、N、O、P和Q的胰岛素原阳性细胞的数目。这些培养基是第二层筛选中最有前途的。在所述图中，将它们于与来自60种因子排列的最有前途培养基“L”进行比较。结论是，该实施例表明，可改善和改进上述60种因子组合排列。
实施例7
基因芯片研究(DNA寡微阵列)
基因芯片(BD Atlas阵列)的应用允许我们测量8,000个基因的相对表达水平(mRNA水平)。可利用该方法“指纹分析”或鉴别细胞型。分化胰细胞中mRNA表达的分析可能鉴别参与转分化过程的基因。这种类型的比较将允许我们将起始胰细胞与中间干细胞，中间干细胞与激素产生细胞，以及这种最终产物与正常人胰岛进行比较。
产生存在于人胰中不同细胞型的基因表达型的“指纹”的这类技术的利用将起两个关键作用。也许这种分析最重要的作用将是清楚地定义在转分化过程中产生的细胞的基因表达特征，从而在分子水平上定义这些细胞的独有特征。这种分析的第二种作用将是提供改进我们研究方法的工具。所述分析将使我们了解胰岛素产生表型如何被调节的机制。细胞表面标记的知识将有助于快速细胞鉴别以及提供从“不想要的”细胞中挑选出想要的细胞的手段。存在于这些细胞上的细胞信号分子和转录因子的信息将有助于生长因子的鉴别，其为要更有效地完成起始物质向能够以与天然存在的β细胞相似的方式产生胰岛素的细胞的转化和扩展所需要的生长因子。虽然在公开可得的文献和报道中可获得一些关于胰细胞基因表达和表型的信息，但它们多数与非人类动物模型或胚胎发育有关。这些基因芯片研究对我们的申请和发现来说是特异的。
表3和4显示了在PCM贴壁培养物中培养7天后比较的两种胰岛缺失、人胰细胞制备物的结果。借助标准方法分离RNA然后在比较微阵列中筛选。虽然在相同条件下培养上述两种制备物，但判断一种制备物是“优异的”，而判断另一种是“好的”(以其后来产生C-肽的能力为标准)。在这些培养物中表达的大多数基因将是相同的，但将有一些被差异表达的基因。一些差异将是供体特异性的(例如MHC标记的差别)，而其它的可使我们了解决定“优异”与“好”结果的基因。
由各不同制备物表达的8,000个基因的检查产生了一个大清单，它太长以至于不能包括。表3总结了那些我们认为可特别适用于我们的研究和获得新胰岛素产生细胞的目的基因。这些基因中的一些对分化过程是重要的，而其它是相关的并可能是成功干细胞形成的先兆。表4是大约90种“强表达”信息(信号强度为最大值的10-100％)的汇编。所述“强表达”信息特别适用于鉴别可被用于鉴别和分类不同细胞群体(腺泡与胰岛或分化成功的与分化差的)的表面标记。另外，“强表达”基因的完全清单是很大的，因此只呈现了缩写版本。
表3
在“优异”制备物(2071)与“好”制备物(2078)中以比较
不同水平表达的重要/有用基因一览表。 在“优异的”制备物中以更高水平表达的基因 系# 基因制备物比率2078∶2071 Genbank 简要说明 574 无毛(小鼠) 同系物 下降5.4 AF039196 存在于多种不同组织中，在脑组织中具 有最高表达的转录因子。可能具有特异 阻抑蛋白的功能。两种制备物之间的差 别非常大，在“好的”制备物中表达更 高。 1237 正弦眼(sine oculis)同源 框(果蝇属) 同系物3 下降2.6 NM_005413 一种已在眼发育中研究过的同源框基 因；也在成体中表达(完全分化的眼组 织)。激活Pax6的表达！(Pax6是成 熟的β细胞标记)。在有关胰腺文献中 没有提到正弦眼的出版物。 16 7-60蛋白质 下降2.5 NM_007346 阿片样生长因子受体，蛋氨酸(5)- 脑啡肽(一种存在于MFA中的因子)。 配体是一种在发育、细胞更新、癌、创 伤愈合及血管发生中调节细胞增殖和 组织形成的抑制肽。 234 CDC37(细胞分 裂37，S. Cerevisiae同 系物) 下降2.8 U63131 通过与CDK4相互作用，细胞周期展进 的正向调节剂。可能也是调节NF-κB 复合体的成分。 在“好”制备物(2078)中以更高水平表达的基因系# 基因制备物比率2078∶2071 Genbank 简要说明866神经原性分化2(ND2) 上升2.6 NM_006160已知介导神经元分化的螺旋-环-螺旋转录因子。与NeuroD1密切相关，(aka“β细胞E盒反式激活蛋白”或“β2”)。ND1的作用已经在小鼠模型中得到完全证实，ND2的作用还没有确定。ND2是优势腺泡形式？是优势转分化形式？935胰腺炎相关蛋白质 上升4.1 D13510一种腺泡蛋白质。通常丰度很低，但在胰腺炎中很高。它也是一些肝癌的标记。功能？在转分化过程中诱导表达？489G蛋白-偶联的受体56 上升3.1 NM_005682与一些促胰液素样受体有相似性并具有粘蛋白样结构域。存在于许多组织中。在人甲状腺的较小、更活跃的分泌滤泡中水平最高。是未分化腺泡的标记？1115视黄酸受体效应器(他扎罗汀(tazarotene)诱导)2 上升3.2 NM_002889类维生素A(retinoid)强生长抑制及细胞分化活性。这些效果由作为转录调控子的类固醇和甲状腺激素受体超家族成员的特异核受体蛋白质介导的。未分化腺泡的标记？
表4
培养7天后两种细胞制备物中以高水平表达的潜在重要
和/或有用基因一览表。 酶和协同因子 系# 基因 Genbank 简要说明 122 ATP酶Ca++转 运质膜2 L20977 膜Ca++泵，高度受限的组织分布，在耳蜗外毛细胞 和螺旋神经节中表征良好。表达强。是良好的腺泡 膜标记？ 387 双特异性酪氨 酸磷酸调节蛋 白 NM_004714 调节核功能？与胚后期神经形成有关联。而且，也 能够使结肠癌细胞在某些应激条件下存活。 657 κ轻链多肽增 强子激酶抑制 剂 NM_003639 激活NF-κ-B活化的增强子的激酶；它也在激活对 炎性细胞因子的反应中起作用。可能在分化性细胞 中起作用？ 659 肌醇聚磷酸盐 磷酸酶样 NM_001567 INPPL或SHIP2可能在通过生长因子和胰岛素调节 PI3K信号中起显著作用。在KO小鼠中的主要缺失 显示，在体内SHIP2是一种胰岛素信号和胰岛素敏 感性的强负调节蛋白。是我们系统中生长因子信号 传导的重要调节剂？ 824 MAP激酶激酶 激酶激酶2 NM_004579 存在于多种组织中，参与B细胞分化。 1228 唾液酸转移因 子8 NM_003034 用多唾液酸修饰NCAM。在我们系统中涉及修饰细 胞粘附分子？ DNA，转录因子和发育基因 196 心脏特异性同 源框 NM_004387 Aka NKX2-5，含同源框的基因，为组织分化，以及 测定发育的时间和空间型所必需。这已经在心脏形 成方面被表征。小鼠胰腺研究者已把注意力集中于 nkx2.2和nkx6.1。 200 软骨成对分类 同源异型蛋白 质 NM_006982 在人类中的功能未知。在小鼠中，为前脑间充质的 存活所必须。突变导致无颅畸形和部分无脑畸形。 213 C/EBPα U34070 在许多细胞型中调节分化。还显示出抑制细胞周期 蛋白依赖性激酶并引起生长停滞。 214 C/EBPβ NM_005194 在许多细胞型中调节分化。为正常增殖反应所必 需。 933 成对同源域转 录因子 NM_002653 bicoid类同源域蛋白质。这个家族的成员涉及器 官发育，左右不对称。在一些成体组织中也作为转 录调控子(例如催乳素基因)起作用。在发育模型 中，Pitx2通过Nodal信号直接开始，接着通过Nkx2 保持。如果它通过Nkx2保持，可能会存在于成熟的α和β细胞中。995 POU域，类型3 转录因子 NM_002699AKA Oct-6。涉及神经发育和再生；其它的发育作用？Oct-4在小鼠胰腺的发育中起作用。1285 Spi NM_003120与ets相关。为骨髓及B淋巴细胞的发育所必需。1347 转录因子21 NM_003206一种碱性螺旋-环-螺旋转录因子，在成体中，在肺、肾、心、胎盘和胰腺中表达。在胚胎中，为冠状血管及包含上皮层管状结构的器官发育所必需。可能表示在多种转录因子之间调节趋同点。生长因子和相关基因90抗米勒激素 NM_00479抗-米勒激素是TGF-β和抑制素基因家族的成员。介导雄性性别分化：引起米勒管的退化，该管分化为子宫和输卵管。在成体中的功能未知。935胰腺炎相关蛋白质 D13510在正常腺泡细胞中表达低，但在胰腺炎中很高。也由小肠和一些肝癌的上皮细胞表达。功能？197心脏调理素1 NM_001330包括LIF、睫状神经因子(CNTF)、制癌蛋白M、白介素6和11的细胞因子家族。为运动神经元发育和促进运动神经元存活所必需。808Midkine轴突生长启动因子2 NM_002391表现出轴突突起促进活性并在神经系统发育和/或维护中起作用。除发育中的一个很短时期外，认为其表达很低。受体及相关的信号转导81血管紧张肽受体1B NM_004835血管紧张肽是控制血压及心血管系统中容量的重要效应子。这些受体还存在于胰腺的外分泌、内分泌和血管细胞中。对AR免疫染色，主要是在血管内皮和胰腺导管系统的上皮中，而在腺泡中是弱的。550生长激素受体-结合蛋白质7 NM_005310在酪氨酸激酶信号中重要的多样性家族。与ras-GAP同源。在一些模型中，涉及转移进程。554生长激素促分泌受体 NM_004122GRS和GH释放因子对垂体释放生长激素具有促生长激素抑制素的交互影响。(见下文)。这种G-蛋白偶联受体也能结合ghrelin。期望在内分泌细胞上有这种标记。1277促生长激素抑制素受体3 NM_001051促生长激素抑制素在许多位点起作用抑制许多激素及其它分泌性蛋白质的释放。促生长激素抑制素的生物学效应可能由以组织特异方式表达的G-蛋白偶联受体介导。SSTR3在脑及胰岛中以高水平表达。1056蛋白质酪氨酸磷酸酶 NM_002850受体型PTP。一种可以调节生长及分化的信号分子。这种PTP还与成体神经修复的控制有关联。426Ephrin A5 U26403与受体酪氨酸激酶的EPH组成员结合。可能涉及轴突导向。Ephrin及其受体可以将细胞反应从排斥转向粘附。 172 丁酸酯反应因 子1(EGF反应 因子1) X79067被不同物质诱导：佛波酯TPA，EGF等。可介导细胞因子(富含AU)mRNA的快速降解。是活化/分化的标记？ 细胞表面或结构基因 47腺瘤样息肉大肠杆菌样(Coli-like) NM_005883位于膜/细胞骨架和核部分，遍在表达。APC与连环蛋白相互作用，并通过这些与E-钙粘着蛋白相互作用。可调节接触抑制信号传入细胞，或者可调节粘附。前者与突变APC在肿瘤形成中的早期的作用更一致。取决于什么蛋白质是APC复合体的成员，APC可参与细胞周期进展、发育途径细胞形态学或神经元功能。 95水孔蛋白5 NM_001651水孔蛋白是一种水通道蛋白。已知Aq5在唾液、眼泪和肺分泌物的产生中起作用。是导管上皮的标志？ 220CD151抗原 NM_004357跨膜4超家族、aka tetraspanin家族成员。一种细胞表面糖蛋白，已知是与整合蛋白与其它tetraspanins复合。这些复合体是用于结合基膜的细胞附着位点。这些蛋白质在细胞发育、活化、生长和死亡的调节中介导信号转导事件。 221CD3E抗原 NM_000733CD3E是T-细胞受体复合体亚单位之一。CD3-E是一种信号转导成分，在指导前T细胞谱系的定型中可能特别重要。在胰腺的谱系定型中的作用？ 303Cofilin NM_005507一种分布广泛的解聚丝状肌动蛋白并抑制单体肌动蛋白的聚合的细胞内肌动蛋白调节蛋白。 465Ficolin NM_003665其特征为血清蛋白。有钙非依赖性凝集素活性，但不像其它家族成员，它不结合纤连蛋白或弹性蛋白。 669整合蛋白，α3 NM_002204细胞表面粘附素分子，整合膜蛋白：与多种胞外基质蛋白相互在用。 690连接斑珠蛋白 M23410以可溶和膜结合的形式和粘着连接存在的主要胞质蛋白。(桥粒和中间连接) 694角蛋白7 x03212CK19的表达型对我们来说已经非常有用；其它的角蛋白也可能有用。角蛋白17 NM_000422角蛋白8 M34225 872神经元丝状蛋白 NM_014486NTP是在神经元细胞生长和萌芽过程中表达的蛋白之一。在转分化为神经内分泌细胞被表达？ 1008抑制蛋白1 NM_005022一种遍在的肌动蛋白单体结合蛋白。调控肌动蛋白的聚合以响应胞外信号。 1187S100 Ca++结合蛋白 NM_005620位于许多细胞的胞浆和/或核中的蛋白质家族。涉及细胞周期进展和分化的调节。与正常粘膜相比，在结肠癌中显著地升高。 1299Stratifin AF029082广泛地分布于胞浆中。富含于角化的复层上皮的组织中最为丰富。通过与含有磷酸丝氨酸的蛋白质结合介导信号转导。被诱导以应答DNA损伤，并在G2 AKA 14-3-3-∑中使得细胞停滞。1335胸腺素βM92381一种肌动蛋白螯合蛋白1435WishotAldrich交互作用蛋白NM_003387涉及从细胞表面受体到肌动蛋白细胞骨架的信号转导。诱导肌动蛋白聚合。 未知功能 829粘蛋白6 U97698一种被认为在保护胃肠道不受酸、蛋白酶、致病微生物和机械性创伤损害的大糖蛋白。 1257小pro富含蛋白质 NM_006945角化细胞分化标记。功能？