双链核糖核酸在诱导细胞裂解中的应用.pdf

本发明涉及核糖核酸在生产药物中的应用，其中所述核糖核酸包含双链结构并且所述双链结构包含第一条链和第二条链，其中所述第一条链包含连续核苷酸的第一段序列并且所述第二条链包含连续核苷酸的第二段序列，其中第一段序列不与将用所述药物治疗的生物体的细胞的核酸(优选mRNA)互补，和/或其中第二段序列不同于将用所述药物治疗的生物体的细胞的核酸(优选mRNA)。

权利要求书
1.  核酸、优选核糖核酸在生产药物中的应用，
其中所述核酸包含双链结构并且所述双链结构包含第一条链和第二条链，
其中所述第一条链包含连续核苷酸的第一段序列并且所述第二条链包含连续核苷酸的第二段序列，
其中所述第一段序列不与将用所述药物治疗的生物体的细胞的靶核酸、优选mRNA互补和/或
其中所述第二段序列不同于将用所述药物治疗的生物体的细胞的靶核酸、优选mRNA。

2.  根据权利要求1的应用，其中所述靶核酸是生物体的细胞的任何核酸，优选生物体的细胞的任何mRNA。

3.  根据权利要求1或2的应用，其中所述靶核酸是生物体的细胞的转录组的任何元件，优选转录组的所有元件。

4.  根据权利要求1到3中任何一项的应用，其中所述细胞是病理细胞，该病理细胞优选与所述疾病有关。

5.  根据权利要求1到4中任何一项的应用，
其中所述第一段序列与将要治疗的生物体的非病理细胞的核酸、优选mRNA互补，和/或
其中所述第二段序列与将要治疗的生物体的非病理细胞的靶核酸、优选mRNA相同。

6.  根据权利要求5的应用，其中所述非病理细胞的靶核酸与所述病理细胞的靶核酸在一个或多个核苷酸位点上不同。

7.  根据权利要求1到6中任何一项的应用，其中所述药物用于治疗和/或预防疾病，其中该疾病优选为肿瘤或癌症。

8.  根据权利要求4到7中任何一项的应用，其中所述病理细胞是肿瘤抑制因子缺陷的并且所述连续核苷酸的第一段序列与编码功能性肿瘤抑制因子的核酸互补，和/或
所述连续核苷酸的第二段序列与编码功能性肿瘤抑制因子的核酸相同。

9.  根据权利要求8的应用，其中所述第一段序列与编码功能性肿瘤抑制因子的核酸互补，所述病理细胞对于所述功能性肿瘤抑制因子是肿瘤抑制因子缺陷的，并且
所述第二段序列与编码功能性肿瘤抑制因子的核酸相同，病理细胞对于所述功能性肿瘤抑制因子是肿瘤抑制因子缺陷的。

10.  根据权利要求4到9中任何一项的应用，其中所述病理细胞缺乏功能性肿瘤抑制因子的基因或者其转录物。

11.  根据权利要求4到9中任何一项的应用，其中所述病理细胞缺乏提供功能活性的肿瘤抑制因子的基因或者其转录物。

12.  根据权利要求11的应用，其中所述基因或其转录物包含一个或多个突变，其中该突变优选选自点突变和缺失突变，其中该突变优选导致功能失活的肿瘤抑制因子。

13.  核酸、优选核糖核酸在生产药物中的应用，
其中所述核酸包含双链结构并且所述双链结构包含第一条链和第二条链，
其中所述第一条链包含连续核苷酸的第一段序列并且所述第二条链包含连续核苷酸的第二段序列，
其中所述核酸或者其部分或其链是RNA干扰应答阴性的。

14.  根据权利要求13的应用，其中所述核酸在将要用所述药物治疗的生物体的病理细胞中是RNA干扰应答阴性的。

15.  根据权利要求13或14的应用，其中所述核酸在将要用所述药物治疗的生物体的非病理细胞中是RNA干扰应答阳性的。

16.  根据权利要求1到15中任何一项的应用，其中所述核酸诱导应激反应，优选所述病理细胞的编程性细胞死亡和/或增殖抑制。

17.  药物组合物，其包含核酸、优选核糖核酸和优选地药学上可接受的载体，其中所述核酸包含双链结构并且所述双链结构包含第一条链和第二条链，
其中所述第一条链包含连续核苷酸的第一段序列并且所述第二条链包含连续核苷酸的第二段序列，
其中所述第一段序列不与将用所述药物治疗的生物体的细胞的靶核酸、优选mRNA互补和/或
其中所述第二段序列不同于将用所述药物治疗的生物体的细胞的靶核酸、优选mRNA。

18.  根据权利要求17的药物组合物，其中所述靶核酸是将使用所述药物组合物治疗的生物体的细胞的任何核酸，优选该生物体细胞的任何mRNA。

19.  根据权利要求17或18的药物组合物，其中所述靶核酸是将用所述药物组合物治疗的生物体的细胞的转录组的任何元件，优选转录组的所有元件。

20.  根据权利要求17到19中任何一项的药物组合物，其中所述细胞是病理细胞，该病理细胞优选与将用所述药物组合物治疗和/或预防的疾病有关。

21.  根据权利要求17到20中任何一项的药物组合物，其中所述核酸如权利要求1-16中任何一项所定义。

22.  根据权利要求17到21中任何一项的药物组合物，其还包含至少一种脂类，优选阳离子脂类。

23.  根据权利要求22的药物组合物，其中所述脂类是β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油基-酰胺三盐酸盐。

24.  根据权利要求17到23中任何一项的药物组合物，其还包含辅助脂类。

25.  根据权利要求24的药物组合物，其中所述辅助脂类是二植烷酰磷脂酰乙醇胺。

26.  治疗需要该治疗的患者的方法，其包括施用优选用于治疗癌症和/或肿瘤的根据权利要求16到24中任何一项的药物组合物和/或在上述权利要求中任何一项中描述的核酸的步骤。

27.  根据权利要求26的方法，其中所述患者显示出如上述权利要求中任何一项中定义的细胞，优选病理细胞。

说明书双链核糖核酸在诱导细胞裂解中的应用
本发明涉及双链核酸，该双链核酸包含基本上彼此互补的第一条链和第二条链，本发明还涉及所述双链核酸作为药物的应用。
通常不希望有的细胞生长和尤其是肿瘤，在许多情形中是功能丧失的结果。该不受控制的细胞生长是选择用于治疗肿瘤的多种方法的靶标。此类方法包括特别是使用允许消除过表达的因子的化合物，所述因子在一些情形中是肿瘤抑制因子功能丧失的直接后果。针对该目的的适宜方法特别包括针对所述分子筛选的小分子或者通过抗体等从作用位点除去该类型的因子。然而，在这些情形的任一种中，治疗必须是持续的，否则一旦不对患有所述疾病的生物体提供所述各种方法，所述不平衡因子将再次过表达或者过量存在。其他方法利用通常观察到的与肿瘤有关的生理现象，如血管生成。一种似乎成功的方法是利用针对VEGF抗体以便抑制对肿瘤的营养供给。然而，因为血管生成是关键的生物学现象，所以副作用很大并且需要小心留意。
用于治疗肿瘤和肿瘤相关疾病的另一种策略是使用溶瘤病毒。此类病毒，特别是腺病毒，用于感染肿瘤细胞，该肿瘤细胞经感染后经历编程性细胞死亡，从而裂解肿瘤。然而，病毒介导的溶癌作用通常分别需要待治疗的细胞和肿瘤的特定的遗传背景以便提供细胞的肿瘤选择性裂解。
小干扰RNA，也称为siRNA，已经作为靶基因表达的序列特异抑制方法引起了极大关注。siRNA介导称作RNA介导的干扰(RNAi)的现象，RNAi是转录后基因沉默机制，其由序列与沉默的基因同源的双链RNA(dsRNA)引起(Fire(1999)，Trends Genet 15，358-63，Tuschl，等(1999)，Genes Dev 13，3191-7，，Waterhouse，等(2001)，Nature 411，834-42，Elbashir，等(2001)，Nature 411，494-8，综述见Sharp(2001)，Genes Dev 15，485-90，Barstead(2001)，Curr Opin Chem Biol 5，63-6)。RNAi已经广泛用于确定许多生物体中的基因功能，所述生物体包括植物(Baulcombe(1999)，CurrOpin Plant Biol 2，109-13)、线虫(Montgomery，等(1998)，Proc Natl Acad SciUSA 95，15502-7)，果蝇(Kennerdell，等(1998)，Cell 95，1017-26，Kennerdell，等(2000)，Nat Biotechnol 18，896-8)。在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中，已经通过RNAi对约1/3的基因组进行了功能分析(Kim(2001)，Curr Biol 11，R85-7，Maeda，等(2001)，Curr Biol 11，171-6)。
直到最近，在哺乳动物细胞中RNAi还未普遍应用，除了早期小鼠发育以外(Wianny，等(2000)，Nat Cell Biol 2，70-5)。发现将21nt长的核糖寡核苷酸的双链体转染到哺乳动物细胞中干扰基因表达并且不诱导通常用长dsRNA得到的序列独立的干扰素驱动的抗病毒应答，这一发现导致在分化的哺乳动物细胞中的新的可能应用(Elbashir等(2001)，Nature 411，494-8)。有趣的是，这些小干扰RNA(siRNA)类似长dsRNA的加工产物，提示在分化的哺乳动物细胞中潜在的旁路机制。已经鉴定了Dicer复合体，其是RNA酶III家族的成员，是最初dsRNA加工必需的(Bernstein，等(2001)，Nature 409，363-6，Billy，等(2001)，Proc Natl Acad Sci USA 98，14428-33)。以前当使用未经修饰的核糖寡核苷酸时遇到的问题之一是在细胞或者甚至在含有血清的培养基中的快速降解(Wickstrom(1986)，J BiochemBiophys Methods 13，97-102，Cazenave，等(1987)，Nucleic Acids Res 15，10507-21)。受转染的siRNA诱导的各自击倒(knock-down)是否将被保持足够长时间以实现表型改变，它将取决于具体基因功能和所用的测定系统。
迄今所用的siRNA的主要特征是双链结构的一条链与靶核酸序列互补，而另一条链由于构成siRNA双链结构基础的碱基配对机制而与靶核酸相同。为了克隆或者稳定，增加附着到形成siRNA的双链结构的两条链任一条链上的任何核苷酸或者序列。
迄今，siRNA似乎不是治疗肿瘤和肿瘤疾病的适宜方法。即使通过siRNA降解了不平衡的因子，由于形成肿瘤的细胞未被siRNA清除，所以此类降解必须维持很长时间。另一方面，特征不是控制因子的损失而是异常但是其他生理因子的那些形式的肿瘤需要仅处理该异常形式的高度特异的siRNA。然而，对于此类siRNA地设计，必须知道负责该不平衡因子的各种异常形式的核酸序列的种类。尽管已知对于特定类别的肿瘤发生相同的异常，但是需要对通过siRNA治疗的肿瘤的仔细的分子生物学表征，而这是非常耗时和耗钱的。此外，考虑到siRNA的高度特异性，为特定组的患者的不同肿瘤的治疗设计的siRNA种类实际上是否适于治疗不同组患者的相同肿瘤似乎是有问题的。
因此，当前设想的siRNA的应用遇到一些担忧。
因此，本发明的问题之一是提供治疗肿瘤和肿瘤相关疾病的方法，和提供有关的各种化合物。
第一方面，本发明的问题是通过将核酸、优选核糖核酸用于生产药物来解决，
其中所述核酸包含双链结构并且该双链结构包含第一条链和第二条链，
其中所述第一条链包含连续核苷酸的第一段序列并且所述第二条链包含连续核苷酸的第二段序列，
其中所述第一段序列不与将用所述药物治疗的生物体的细胞的靶核酸、优选mRNA互补，和/或
其中所述第二段序列不同于将用所述药物治疗的生物体的细胞的靶核酸、优选mRNA。
在一个实施方案中，靶核酸是生物体的细胞的任何核酸，优选生物体的细胞的任何mRNA。
在一个实施方案中，靶核酸是转录组(transcriptome)的任何元件(element)，优选生物体细胞的转录组的所有元件。
在一个实施方案中，细胞是优选与所述疾病有关的病理细胞。
在一个实施方案中，第一段序列与待治疗的生物体的非病理细胞的核酸、优选mRNA互补和/或
第二段序列与待治疗的生物体的非病理细胞的靶核酸，优选mRNA相同。
在一个优选实施方案中，非病理细胞的靶核酸与病理细胞的靶核酸在一个或多个核苷酸位置上不同。
在一个实施方案中，所述药物用于治疗和/或预防疾病，其中此类疾病优选为肿瘤或癌。
在一个实施方案中，病理细胞是肿瘤抑制因子缺陷的并且连续核苷酸的第一段序列与编码功能性肿瘤抑制因子的核酸互补和/或
连续核苷酸的第二段序列与编码功能性肿瘤抑制因子的核酸相同。
在一个优选实施方案中，第一段序列与编码功能性肿瘤抑制因子的核酸互补，病理细胞对所述功能性肿瘤抑制因子是肿瘤抑制因子缺陷的，和
第二段序列与编码功能性肿瘤抑制因子的核酸相同，病理细胞对所述功能性肿瘤抑制因子是肿瘤抑制因子缺陷的。
在一个实施方案中，病理细胞缺少功能性肿瘤抑制因子的基因或者其转录物。
在一个实施方案中，病理细胞缺少提供功能活性肿瘤抑制因子的基因或者其转录物。
在一个优选实施方案中，所述基因或者其转录物包含一个或数个突变，其中此类突变优选选自点突变和缺失突变，其中此类突变优选导致功能失活的肿瘤抑制因子。
在第二方面，本发明的问题是通过将核酸、优选核糖核酸用于生产药物来解决，其中所述核酸包含双链结构并且该双链结构包含第一条链和第二条链，
其中所述第一条链包含连续核苷酸的第一段序列并且所述第二条链包含连续核苷酸的第二段序列，
其中所述核酸或者其部分或其链是RNA干扰应答阴性的(response-negative)。
在第二方面的一个实施方案中，所述核酸在将用所述药物治疗的生物体的病理细胞中是RNA干扰应答阴性的。
在第二方面的一个实施方案中，所述核酸在将用所述药物治疗的生物体的非病理细胞中是RNA干扰应答阳性的。
在第一和第二方面的一个实施方案中，所示核酸诱导病理细胞的应激反应，优选编程性细胞死亡和/或抑制所述病理细胞的增殖。
在第三方面，通过药物组合物解决了本发明涉及的问题，所述药物组合物包含核酸、优选核糖核酸，和优选药学上可接受的载体，其中所述核酸包含双链结构并且该双链结构包含第一条链和第二条链，
其中第一条链包含连续核苷酸的第一段序列，第二条链包含连续核苷酸的第二段序列，
其中第一段序列不与将用所述药物治疗的生物体的细胞的靶核酸、优选mRNA互补和/或
其中第二段序列与将用所述药物治疗的生物体的细胞的靶核酸、优选mRNA不同。
在第三方面的实施方案中，靶核酸是将使用所述药物组合物治疗的生物体细胞的任何核酸，优选此类生物体细胞的任何mRNA。
在第三方面的实施方案中，靶核酸是将使用所述药物组合物治疗的生物体细胞的转录组的任何元件，优选将使用所述药物组合物治疗的生物体细胞的转录组的所有元件。
在第三方面的实施方案中，细胞是优选与将通过所述药物组合物治疗和/或预防的疾病有关的病理细胞。
在第三方面的实施方案中，所述核酸如关于本发明第一方面所定义。
在第三方面的实施方案中，药物组合物还包含至少一种脂类，优选阳离子脂类。
在第三方面的优选实施方案中，脂类是β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油基-酰胺三盐酸盐。
在第三方面的实施方案中，药物组合物还包含辅助脂类。
在第三方面的优选实施方案中，辅助脂类是二植烷酰磷脂酰乙醇胺。
在第四方面，通过用于治疗需要此类治疗的患者的方法解决了本发明涉及的问题，所述方法包括施用优选用于治疗癌症和/或肿瘤的根据本发明第三方面的药物组合物和/或如本发明的第一方面所述的核酸。
在第四方面的一个实施方案中，患者显示出前面权利要求中任何一项中定义的细胞，优选病理细胞。
本发明人已经令人惊奇地发现可以使用双链核酸治疗多种疾病，包括但不限于，肿瘤和肿瘤相关疾病。优选地，根据本发明的双链核酸的使用导致应激反应。此类应激反应导致下面现象的任一种，所述现象单独或者以任何组合在本文中也称作应激反应，即细胞周期停滞、生长抑制、细胞死亡、编程性细胞死亡、细胞的清除，优选通过编程性细胞死亡或者其介导的细胞清除，或者这些现象任一种的诱导，其中所述细胞以成因(causative)的方式或者非成因的方式，即直接或者间接与所述疾病有关。此外，本发明人现在理解所述应激反应可直接或者间接参与、导致或者产生于用双链核酸治疗的细胞、组织、器官或者生物体中天然免疫应答和/或抗病毒应答。应当理解可以实施本发明而不用知道双链核酸的作用方式并且不用确切知道导致所述应激反应的机制和更具体地，分别导致其一个或几个方面如编程性细胞死亡和细胞裂解的机制。
此外，本发明人已经令人惊奇地发现在RNA干扰应答存在下也可以引起应激反应。如果细胞遇到一定量的对靶核酸特异并且不能通过RNA干扰机器处理的RNAi分子，导致这种机器的溢出(overflow)，那么可以实现所述应激反应。RNAi分子的溢流引导过量或多余的RNAi分子进入不同的途径，其导致本文描述的应激应答。
根据本发明使用并且在本文中也称作根据本发明的双链核酸的双链核酸包含第一条链和第二条链。第一条链包含连续核苷酸的第一段序列，第二条链包含连续核苷酸的第二段序列。两条链都是碱基配对，优选通过Watson-Crick碱基配对进行配对。更优选地，碱基配对是完全的，即在第一段核苷酸序列和第二段核苷酸序列之间没有错配。
本发明人通过使用该类双链核酸还令人惊奇地发现，可以导致上面定义的应激反应，条件是第一段序列或者第一条链的序列不与核酸互补，其中该核酸优选为靶核酸，更优选地，此类核酸包含在转录系统如细胞、组织、器官或者生物体中。该类核酸将通常在本文中称作靶核酸。此类互补性的缺乏将基本上在下面两种情形下产生。第一种情形是转录系统中不存在此类靶核酸，其中此类转录系统优选为细胞，并且其中此类靶核酸更优选地不存在于细胞的转录组中。该情形也在本文中称作缺乏导致上述应激反应的基因。在基因缺乏的情形下，优选没有RNA干扰应答，然而，存在这样的实施方案，其中可以存在此类RNA干扰应答。在实施例中提供了关于如何可以测量此类应激反应的测定法。在第二种情形下，基本上存在靶核酸，然而，根据本发明的双链核酸的分别的第一段和第一条链的序列相对于或与细胞中存在的靶核酸比较、或者更优选地相对于细胞的转录组包含一个或几个错配。换句话说，通过分别在第一段序列和第一条链中提供一个或几个错配，实现了在第一种情形下相同的效果，所述错配导致不再产生相对于存在于转录系统如细胞和优选相对于细胞的转录组的任何靶核酸的互补性。由于该设计，靶核酸和根据本发明的双链核酸的第一段序列和第一条链在互补性方面不再具有相互作用或者关系，从而该类型相互作用或者关系的缺少提供了上述应激反应并且分别通常不进行本领域已知的RNA干扰反应的引发，或者按照本发明的双链核酸和靶核酸至少不发生在所述第一段序列和第二段序列的匹配条件下观察到的结果。因此当涉及本文尤其本段中列出第一和第二种情形中内在的互补性和错配时，存在逐渐改变或者过渡。对于每种和任何个别情形，通过使用本文实施例中描述的测定法可以确定引发所述应激反应所需的此类错配的程度。在任何情形下，优选在上面提供的意义上，优选分别包含错配的第一段序列和第一条链不与转录系统、优选细胞的任何其他靶核酸或者细胞的转录组的另一靶核酸互补。
分别对于第二条链和第二段序列的设计可以作相同的考虑，其中分别对于该第二段序列和第二条链，标准是同一性而不是互补性，其中在优选实施方案中，当第一段序列和第二段序列，第一条链和第二条链分别完全匹配，即它们之间没有任何错配，如果第一条链和第一段序列分别如上述设计，那么将自动实现所述完全匹配。
不希望被任何理论所束缚，似乎分别参与RNA干扰(其在本文中也称作RNA干扰应答)的多种蛋白质和因子比较一条链与靶核酸，所述一条链优选为反义链，其优选为与根据本发明的双链核酸有关的本文中所用的第一条链。对于在根据本发明的双链核酸提供的反义链与靶核酸如mRNA链匹配的意义上存在阳性应答的情形，产生的一种结构，该结构直接和间接被参与RNA干扰的核酸酶(例如，RISC复合体)识别并使得靶核酸降解。为这种反应提供的双链RNA，如siRNA，也在本文中称作RNA干扰应答阳性的。然而，如果各因子不能发现与siRNA的一条链、优选反义链匹配的靶核酸，那么不提供此类信号和结构，或者提供不同或额外的信号，其最终导致上面定义的应激反应或应激应答。导致或者引起该类型应激反应的双链核酸也称作RNA干扰应答阴性的，尽管不能排除至少在一些实施方案中，可以发生某种RNA干扰应答。因此，根据本发明的双链核酸提供了优选导致编程性细胞死亡或者细胞死亡的信号，其中根据本发明的双链核酸在根据本发明的双链核酸的一条链、优选反义链、更优选第一条链和靶核酸之间在更广义上具有错配，所述靶核酸优选为转录系统的每种和任一种核酸，更优选转录系统如细胞的转录组的任何核酸。然而，本发明人设想RNA干扰机制之外的其他机制参与介导施用本发明的双链核酸时观察到的应激反应的效果，所述机制即在引发RNA干扰应答意义上不干扰靶核酸的机制。参与该应激反应的其他组分可以是例如，PKR途径或者任何其他干扰素相关途径或者任何促凋亡(pro-apototic)途径的部分。
根据本发明人的当前理解，如果完全匹配而因此不受一个或多个错配打断的总共12、13、14个连续核苷酸、或者根据本发明的双链核糖核酸的互补链或者相同链的更少的核苷酸不与靶核酸匹配或者不与靶核酸相同，那么将出现此种情形。如果优选地共约15个或更多核苷酸与靶核酸互补或者相同，这将导致RNA干扰应答从而不导致编程性细胞死亡。对于第二种情形实现的情形下，上面的后一结果将尤其可以应用，所述第二种情形即由于分别在第一段序列和第一条链，和/或第二段序列和第二条链中存在的错配，靶核酸不被识别。更优选地，如果靶核酸同样分别不存在于细胞和其转录组中，那么不考虑这种设计。
本发明人已经更特别地发现如果设计根据本发明的双链核酸以针对或者处理肿瘤抑制因子并且这种肿瘤抑制因子不存在于肿瘤细胞中，这将导致RNA干扰应答阴性反应从而导致上述应激反应和最终导致编程性细胞死亡或者细胞死亡或生长抑制。
然而，根据本发明的双链核酸的可应用性不限于肿瘤、肿瘤疾病、癌症和癌症疾病，其中包括恶性和良性肿瘤和癌症，但是根据本发明的双链核酸还可以应用于其他疾病。更优选地，当功能丧失或者导致该功能丧失的基因的损失形成待消除的疾病或者病理状况的基础时，根据本发明的双链核酸总是可以应用，在所述疾病或者病理状况中优选生物体内各自细胞具有或者显示出该基因丧失。在一个实施方案中，将根据本发明的双链核酸优选分别施用于细胞和生物体，所述双链核酸体为转录系统的任何靶核酸提供错配，优选当本发明双链核酸的一条链与靶核酸碱基配对而不引发该类型细胞中RNA干扰应答时提供错配。
使用根据本发明的双链核酸可以治疗的其他疾病为这样的疾病，其中所述疾病直接或间接涉及核酸或者各自mRNA编码的肽或者蛋白质，其中此类核酸或者mRNA与野生型相比显示出一个或多个核苷酸交换。换句话说，可以根据本发明治疗的其他疾病为这样的疾病，它们显示出一个或多个核苷酸多态性(SNP)。此类核酸或者mRNA分别在患病细胞、组织、器官和生物体中，或者倾向于发展此类疾病的任何细胞、组织、器官和生物体中，此类核酸或者mRNA与不患病或者健康细胞、组织、器官和生物体的核酸或mRNA不同，将它们称作靶核酸或者转录系统的核酸的部分，优选称作转录系统如细胞的转录组的核酸之一。当设计根据本发明的双链核酸时，也必须考虑这种类型的靶核酸。因此，双链核酸，更尤其作为靶核酸的反义链的第一段序列和其第一条链不可以与转录系统尤其诸如直接或间接参与疾病的细胞的转录组的核酸互补，从而允许引起或者产生本文定义的应激反应。与之相关的应该注意根据本发明的双链核酸优选包含靶核酸的部分，其含有SNP或者至少一个SNP，否则将不可能区分不具有SNP的那些细胞、组织、器官或者患者。换句话说，SNP定义了靶核酸的一段核苷酸序列，其不与本文定义的根据本发明的双链核酸的第一段序列和第一链互补，从而此类互补性的缺乏将例如引起本文定义的应激反应。当然，应该承认，优选地，根据本发明的双链核酸也不与本文教导的转录系统的任何其他核酸互补。
在本发明范围内，本文所用的治疗也包括预防。在一个实施方案中，尤其当待预防的疾病分别是癌症和肿瘤时，将根据本发明的药物和药物组合物施用于患者或者将预防发展该疾病的人。使用根据本发明的双链核酸，倾向于显示出本文描述的任何情形，如例如，肿瘤抑制因子的基因的损失或者功能丧失，或者已经经历此类损失的任何细胞可以被处理并从而最终受到抑制或者裂解。由于此，生物体将没有这种细胞，所述细胞是肿瘤或者癌症疾病的起源，对于单克隆肿瘤和癌症尤其如此。与之相关地，注意到细胞通常是二倍体细胞。尽管由此任何遗传信息以双份存在，但是遗传信息将在两套遗传信息之间改变，各自基因的转录物也会如此。然而，与预期的具体疾病的功能失活蛋白质(分别对于肿瘤和癌症优选为肿瘤抑制因子)的转录物的存在可以根据本发明处理，从而引起应激反应，其最终直接或间接导致各种病理细胞的生长抑制、编程性细胞死亡或者裂解。
如文中所用的，如果不相反指出，根据本发明的双链核酸具有下面的结构：该核酸包含双链结构并且该双链结构包含第一条链和第二条链，其中第一条链包含连续核苷酸的第一段序列，第二条链包含连续核苷酸的第二段序列。所述设计也称作基本设计。优选地，双链核酸是双连年核糖核酸。然而，在本发明范围内，双链核酸是双链脱氧核糖核酸。在另一个实施方案中，双链核酸包含第一条链，第一段序列和第一条链分别为核糖核酸，第二条链和第二段序列分别为脱氧核糖核酸。在备选实施方案中，第一段序列和第一条链分别为脱氧核糖核酸，第二条链和第二段序列分别为核糖核酸。
根据本发明，根据本发明的双链核酸的基本设计可以在原则上如下修饰，尤其对于本文公开的第二种情形，即当靶核酸存在于转录系统，但是如果根据本发明的双链核酸的第一条链和第一段序列分别优选提供的反义链由于一个或几个错配而不与靶核酸完全互补时，由互补性的缺乏引起本文定义的应激反应。通过相反链上不正确碱基配对的一对核苷酸形成任何错配。在第一个修饰中，根据本发明的双链核酸的第一段连续核苷酸序列与靶核酸互补，只是一个或几个核苷酸产生此类错配。换句话说，该类第一段序列不与靶核酸互补，更优选不与转录系统如细胞的转录组的任何核酸互补。在任何情形中，优选经修饰的根据本发明的双链核糖核酸是RNA干扰应答阴性的。除了在相应于错配位置的位置上的一个或几个核苷酸之外，根据本发明的双链核酸的连续核苷酸的第二段序列在一个实施方案中与靶核酸相同。如果第一段连续核苷酸与靶核酸，更优选转录系统的任何核酸碱基配对，那么错配导致凸起或者环结构。在优选实施方案中，错配数为1到10，优选2到8，更优选2到4，最优选4个，其中此类错配优选分别安排在第一段序列和第二段序列中。如文中所用的，从第一个数字到第二个数字的特定范围指该范围包含的任何数字。例如，如果范围为1到4，这指实际公开的为从1到4的任何整数，即1、2、3和4。
在本发明的优选实施方案中，具有基本设计或者其修饰的根据本发明的双链核酸包含第一条链上长为14或更少核苷酸的核苷酸序列或者一段核苷酸序列，所述序列或一段序列优选与本文定义的靶核酸序列完全配对。换句话说，根据本发明的双链核酸包含第一条链(其优选为反义链)上最大长度为14个核苷酸的序列并且此序列优选与靶核酸完全比配。根据本发明的双链核酸的第一条链或者第一段序列包含的额外或其他核苷酸不完全碱基配对，从而产生错配，此类错配提供了根据本发明的双链核酸的特征，即总体第一段序列不与本文定义的靶核酸互补。可以在本文公开的两种情形下都实现该特征，即，靶基因根本不存在于细胞中，更精确地，不存在于将使用根据本发明的双链核酸治疗的细胞的转录组中，然而在存在靶基因时，根据本发明的双链核酸引发应激反应，其中此类应激反应及其引发分别优选通过根据本发明的双链核酸的第一段序列导致，所述第一段序列不与靶核酸互补。
与上面相同的考虑可应用于根据本发明的双链核酸的第二条链，其中标准是同一性而不是互补性。
在备选实施方案中，连续核苷酸的第一段序列不与靶核酸完全互补，而第二段序列与靶核酸完全相同。然而，根据本发明的双链核酸的这种构建体导致类似于在反义链和靶核酸之间观察到的错配或者凸起的双链结构。然而，还在本发明范围内，第一段序列和第二段序列完全，即完美地碱基配对，其将意味着在如下假设：第一段序列由于一个或几个核苷酸不与靶核酸互补而不与靶核酸完全碱基配对的情形下，从而第二段序列不完全与靶核酸相同。在优选实施方案中，关于靶核酸的第一段序列的错配的位置位于不完全与靶核酸相同的第二段序列的相应位置上。应当承认，对于根本不存在靶核酸，如对于不存在转录组的各自mRNA成员的情形下，也可以使用关于错配的前述实施方案，优选限制性条件是这种类型的分子仍然适于引发上面概述的应激反应。
第一段序列和靶核酸之间的错配可以如此排列以便截短第一段核苷酸序列，从而减小互补序列的长度，或者错配可以位于第一段序列内，其意味着优选在不同于5’和3’端的位置。这在原则上同样可应用于第二段连续核苷酸水平上“错配”的数目和位置，所述第二段连续核苷酸通常特征为与靶核酸相同。
在本发明范围内，可以改变错配的数目和位置，其中认为此类改变在本发明的范围内，只要观察到上述效果，即介导RNA干扰的因子，优选表达系统提供了导致应激反应的信号。
根据本发明的双链核酸的长度可以为少至15个和多至几百寡核苷酸对。在一个实施方案中，根据本发明的双链核酸的第一条链和第二条链为相同长度。然而，在备选实施方案中，根据本发明的双链核酸的第一条链和第二条链长度不同。在一个实施方案中，第一段序列与第一条链具有相同长度，第二段序列与第二条链具有相同长度。应当认识到第一段序列和/或第二段序列的最小长度与在RNAi领域中实现的那些长度相似，如本领域中公知并且也在本文指出。在备选实施方案中，第一段序列和/或第二段序列的长度为19到40个核苷酸，优选19到30个核苷酸，更优选21到30个核苷酸，最优选21到27个寡核苷酸，其中这也可以分别应用于第一条链和第二条链。公认优选地，第一段序列和/或第二段序列的长度小于引发PKR反应的寡核苷酸的长度，其中PKR反应造成对基因表达的非特异效应，导致干扰素应答。另一方面，第一段序列和/或第二段序列和第一条链和/或第二条链分别可以长为几百个寡核苷酸，其中在这些条件下，优选这些序列和链的仅一部分将在关于根据本发明的双链寡核苷酸在本文描述的意义上作用，即引起应激反应。第一段序列和/或第二段序列越长，它们越可能作为整体或者其部分发现转录组中的靶序列从而引发特异RNA干扰的可能性越大，当施用根据本发明的双链核酸时优选避免所述RNA干扰。还应理解分别对于第一和第二段序列所述的也可以分别应用于第一条链和第二条链。为了清楚，将提及在本发明的一些实施方案中，可以耐受该类型的干扰素应答。在本发明的另一方面，还涉及双链核酸在生产药物中的应用，其中此类药物用于刺激患者的免疫系统，其中优选地患者是需要所述药物的患者。当根据本发明的其他方面设计根据本发明的双链核酸时，更尤其当所述双链核酸用于治疗诸如肿瘤的疾病时，认为所述双链核酸适于引起非特异的免疫应答。此类非特异免疫应答可以是有利的并且从而用作疾病的协助疗法，在所述疾病中此类非特异免疫应答适于增加主要治疗的功效。此类主要治疗可以优选地为任何肿瘤治疗或者涉及接种的的任何治疗，所述接种为例如为了治疗感染性疾病或者治疗癌症和肿瘤疾病的接种。
然而，优选根据本发明的双链核酸的长度不诱导干扰素应答。当设计原则如上面对根据本发明的双链核酸所概述时，更优选地，其长度和更优选地第一段序列和/或第二段序列的长度为15到30，更优选地17到25，甚至更优选地19到23，最优选地21到23个核苷酸。
优选地，根据本发明的双链核酸包含第一条链和第二条链的3’末端的一个或几个脱氧核糖核苷酸，优选两个脱氧核糖核苷酸，最优选地2个TT。备选地，这类修饰可以存在于根据本发明的双链核酸的第一条链和第二条链的5’末端。在更优选的实施方案中，该类修饰优选由1或几个，更优选两个脱氧核糖核苷酸组成，所述修饰附着到第一条链(优选反义链)的3’末端，并且一个或几个，更优选两个脱氧核糖核苷酸附着到第二条链的5’末端，即所述第二条链优选为根据本发明的双链核酸的有义链。在根据本发明的双链核酸的另一备选实施方案中，第一条链和第二条链的两个末端是平末端的。双链核酸的长度可以为本文中所描述的任何长度。然而，第一段序列和第二段序列的长度分别优选为19到30个核苷酸，更优选21到27个核苷酸，甚至更优选21到23个核苷酸。在更优选的实施方案中，错配数(如果存在)为1到4个，更还优选为2到4个和3或4个错配。
根据本发明的双链核酸的进一步设计可以如下。优选地，根据本发明的双链核酸的核苷酸可以为核糖核苷酸。备选地，原则上，双链核酸中所含任何核苷酸可以包含修饰，其中所述修饰优选选自具有反向无碱基的核苷酸和在2’位具有NH2-修饰的核苷酸。根据本发明的双链核酸中所含各自核苷酸的任何进一步修饰可以选自氨基、氟、甲氧基、烷氧基和烷基。优选地，烷氧基为乙氧基。还优选地，烷基指甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基和异丁基，其中此类修饰位于核苷酸的糖部分的2’位。不管哪种类型的修饰，核苷酸都优选为核糖核苷酸。
上述修饰额外或备选地，每个和任何核苷酸可以在核苷酸的磷酸部分修饰。此列修饰可以是存在硫代磷酸酯。在本发明范围内，根据本发明的双链核酸的序列和链的单个核苷酸通过磷酸二酯键或者通过硫代磷酸酯键，或者两种键的组合分别在单个链和序列的核苷酸序列的长度上连接。
根据本发明的双链核酸的每一条链或者两条链的其他修饰是末端核苷酸，即最3’或最5’核苷酸的任何修饰。此类修饰可以选自反向(脱氧)脱碱基、氨基、氟、氯、溴、CN、CF、甲氧基、咪唑、羧酸酯、硫醇化、C1到C10低级烷基、经取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基、OCF3、OCN、O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-链烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2，N3；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；多烷基氨基或者取代的甲硅烷基，等等，如欧洲专利EP 0 586 520 B1或EP 0 618 925 B1描述。如本文所用并且更具体地关于前述修饰所用的，烷基或者包含“烷基”的任何术语指任何碳原子链，其包含1到12个，优选1到6个，更优选1到2个碳原子。
另一末端修饰是生物素基团。此类生物素基团可以优选附着到第一条链和/或第二条链的最5’或最3’核苷酸或者两端上。在更优选的实施方案中，生物素基团偶联到多肽或者蛋白质上。还在本发明范围内，所述多肽或蛋白质通过其他前述末端修饰的任一种附着。所述多肽或蛋白质可以赋予本发明核酸分子其他特征。所述多肽或蛋白质还可以作为另一分子的配体。如果所述其他分子是受体，那么可以通过结合配体激活所述受体的功能和活性。受体可以显示出内化活性，其允许结合本发明核酸分子的配体的有效转染。偶联到本发明核酸分子的配体的一个实例是VEGF，相应受体是VEGFF受体。
前述修饰，优选涉及核苷酸，更优选核糖核苷酸的2’位的那些修饰可以以某种模式应用于根据本发明的双链核酸。这样的一种模式是如国际专利申请PCT/EP 03/08666中描述的空间模式。更具体地，此类空间模式为使得双链核糖核酸包含双链结构，其中双链结构包含第一条链和第二条链，其中第一条链包含连续核苷酸的第一段序列并且其中所述第一段序列至少与靶核酸部分互补，所述第二条链包含连续核苷酸的第二段序列并且其中所述第二段序列至少与靶核酸部分相同，其特征是所述第一条链和/或所述第二条链包含在2’位具有修饰的多组经修饰的核苷酸，其中在链内每组经修饰的核苷酸在一边或者两边侧翼为核苷酸的侧翼基团，其中形成核苷酸的侧翼基团的侧翼核苷酸为未经修饰的核苷酸或者具有修饰的核苷酸，所述修饰不同于所述修饰核苷酸的修饰。在优选实施方案中，经修饰的核苷酸组包含一个核苷酸，未经修饰的核苷酸组包含一个核苷酸。此外，优选未经修饰的核苷酸是核糖核苷酸并且经修饰的核苷酸是如本文公开的修饰的核糖核苷酸，所述修饰为核苷酸的核糖部分的2’位上的甲氧基。在更优选的实施方案中，第一条链，即反义链的5’末端以经修饰的核苷酸开始，而在有义链的相应位置上，在3’末端的核苷酸为未经修饰的核苷酸。
另一种修饰可以基于区分个体核苷酸是嘌呤还是嘧啶。在一个备选方案中，如本文描述的修饰根据本发明的双链核酸的任何嘌呤核苷酸，在另一备选实施方案中，如本文描述的修饰根据本发明的双链核酸的任何嘧啶核苷酸。该类型的修饰模式在国际专利申请PCT/US 03/70918等中描述。更具体地，根据本发明的双链核酸的第一条链和序列，即反义链的嘧啶核苷酸为2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸，根据本发明的双链核酸的第一条链和序列，即反义链的嘌呤核苷酸为2’-O-甲基嘌呤核苷酸。
还在本发明范围内，形成双链核酸的两条链相互连接。这种连接可以由单个连接或者多个连接组成。优选地，在形成根据本发明的双链核酸的两条链之一的5’末端和另一条链的3’末端之间发生连接。这种类型的连接优选通过连接体(linker)产生。这种连接体优选由多个核苷酸组成。备选地，这种连接体由非核苷酸聚合物，如肽、LNA、PNA或者PEG组成。
在本发明范围内，化学合成根据本发明的双链核酸并随后配制成制剂。这种制剂可以是本领域中已知的任何制剂。优选制剂包含至少一种脂类，优选一种脂类和辅助脂类。甚至更优选地，脂类为如实施例中描述的阳离子脂类，辅助脂类为如实施例中描述的辅助脂类。制剂优选显示出实施例中描述的制剂的特征。
还在本发明范围内，体外或者体内合成根据本发明的双链核酸。为此，提供了遗传构建体，其转录导致形成根据本发明的双链核酸的两条链。所述遗传构建体优选包含启动子，编码所述链的序列的转录处于所述启动子的控制下。遗传构建体可以为这样的遗传构建体，使得每条链从其自己的启动子转录，其中启动子是相同的。在备选实施方案中，启动子为同一启动子。在另一实施方案中，同一启动子控制两条链和其编码序列的转录。在另一实施方案中，遗传构建体包含编码根据本发明的双链核酸的两条链的序列，其中两条链通过一条序列相互连接，所述序列允许遗传转录物或者其部分转录后形成环或者发夹。在这种条件下，转录物可以回折使得两条互补链，即根据本发明的双链核酸的第一条链和第二条链可以碱基配对并通过环序列连接。这种技术描述于国际专利申请PCT/AU 99/00195或者国际专利申请PCT/IB 99/00606等中，将所述专利申请的公开内容并入本文作为参考。应当理解各自启动子是本领域已知的并且描述于CurrentProtocols in Molecular Biology；Ausubel F.M.，Brent R，Kingston R.E.，MooreD.D.，Seidman J.G.，Smith J.A.和Struhl K.(1996)；J.Wiley&Sons，NewYork等。
在另一实施方案中，根据本发明的双链核酸还可以设计成例如本领域描述和已知的任何RNAi分子或者siRNA分子，条件是根据本发明的双链核酸将施用或者根据本发明的双链核酸将在其中表达或者由活性的转录系统中不存在靶核酸。可以根据本发明的技术教导使用的另一种形式的siRNA分子是如国际专利申请PCT/US 03/05346中描述的siRNA。
关于前述可能的修饰，如果这种修饰在RNAi分子或者siRNA分子上实现，所述分子具有并且发现细胞中的靶核酸，那么优选此类修饰仍然允许根据本发明的双链核酸和优选地对于此类分子设计成任何siRNA分子和任何RNAi分子，其在将导致RNA干扰应答的意义上将是有活性的。换句话说，可能在根据本发明的双链核酸上实现的修饰优选为任何修饰，其如果应用于根据现有技术的RNAi分子和siRNA分子，仍然能够导致RNA干扰应答。不希望被任何理论束缚，本发明人认为本文描述并且分别用于例如通过根据本发明的双链核酸介导的编程性细胞死亡和细胞裂解的应激反应可能仍然在一定程度上与RNA干扰机器如RISC复合体的组分相互作用，并且这些组分对修饰的可接受性的要求也可以应用于根据本发明的双链核酸。在这个范围内，前述内容已经提供了适宜的测定法，其允许哪种修饰也优选对于根据本发明的双链核酸也是可接受的。
在如上概述的根据本发明的第一种情形中，根据本发明的双链核酸针对靶核酸，靶核酸本身不存在于转录系统如细胞中。优选地，所述核酸不以mRNA、hnRNA或者其他转录产物存在。更具体地，本发明的双链核酸不针对所述表达系统中含有的各自核酸的任一种，其中所有该核酸也称作转录组或者在本文中通常称作靶核酸。在这些情形下，针对靶核酸的本发明的双链核酸指第一条链的第一段序列在本文定义的程度上与靶核酸互补并且第二条链的第二段序列在本文定义的程度上与靶核酸相同。由于上文描述的机制，干扰机器将不会发现靶核酸并从而引起应激反应。为了使细胞不发现靶核酸，必须设计根据本发明的双链核酸使得没有转录组的其他核酸将实际上作为靶标从而引发RNA干扰应答。这可以通过生物信息学实现。通常，将可能的把靶序列与全体转录组比较并根据核酸序列设计各自序列使得其不包含与另一核酸匹配的序列，从而不导致脱靶(off-target)效应，这将不允许见到阴性RNA干扰应答，或者在治疗应用中发生可能地不希望的副作用。尤其对于肿瘤疾病，靶核酸是肿瘤抑制因子，其优选不是各自细胞系的转录组的部分。因此，通过该方法治疗并且可以对其使用根据本发明的双链核酸的优选的肿瘤为这样的肿瘤，其是肿瘤抑制因子阴性的。优选的肿瘤抑制因子为PTEN、p53、p21和Rb，然而本发明不限于它们。还在本发明范围内，不仅一种双链核酸用于本文公开的目的，如生产药物，而且两种或两种以上的此类双链核酸用于所述目的，其中至少两种双链核酸处理两种不同的肿瘤抑制因子，这导致应激反应自身或者引起应激反应的功效增加。
在本发明范围内，病理细胞可以是肿瘤抑制因子缺陷的。这意味着病理细胞不产生或者具有肿瘤抑制因子。由于缺少肿瘤抑制因子，可以出现癌症或者肿瘤。肿瘤抑制因子缺陷状态(也是功能丧失状态)可以以不同方式产生。首先，细胞可以缺乏所述肿瘤抑制因子的任何遗传信息。这种缺乏将导致细胞根本不具有任何肿瘤抑制因子并且，因此没有这种基因的转录物。第二，细胞可以缺乏任何功能性肿瘤抑制因子。功能性肿瘤抑制因子在本文中优选理解为在抑制肿瘤中有活性的任何肿瘤抑制因子。任何功能性肿瘤抑制因子的缺乏可以分别来自基因或者其转录物，它们具有一个或多个突变，所述突变导致功能上无活性的肿瘤抑制因子。此类突变可以例如是点突变或者缺失突变。认为具有这些突变的转录物是本文定义的靶核酸从而允许分别设计根据本发明的双链核酸。
还应当了解当使用具有与肿瘤抑制因子互补的一条链的该类型的双链核酸时，在非病理细胞，即与将用根据本发明的双链核酸治疗的生物体的疾病如肿瘤中不相关的细胞中，将导致肿瘤抑制因子的击倒。这种击倒最可能通过RNA干扰应答介导。然而，尽管这可以认为是某种类型的副作用，但是认为该副作用对于根据本发明的治疗方案不是关键的，因为根据本发明的双链核酸仅以瞬时的方式具有活性，这意味着一旦导致例如编程性细胞死亡的毒副作用被引发时，各种病理细胞已经被消除，而非病理细胞不再暴露于这种类型的活性剂从而肿瘤抑制因子的击倒将停止。换句话说，在不像各自肿瘤细胞的非肿瘤抑制因子阴性的那些细胞中，肿瘤抑制因子仅在有限时间内被击倒，这将不允许细胞发展病理状况。
这同样可应用于本文公开的第二种情形下的策略，其涉及使用根据本发明的双链核酸，该双链核酸相对于靶核酸具有一个或多个错配，其中各自靶核酸存在于细胞，更具体地，病理细胞或者与任何病理或者疾病状况有关的细胞中。再次，优选设计根据本发明的双链核酸使得不产生RNA干扰应答，但是引起本文描述的应激反应，而与病理状况无关或者没有发展病理状况的倾向的那些细胞将仅经历短暂的击倒。当然，应该避免任何其他的脱靶效应，这可以通过分别使用生物信息学，选择适宜的条件和序列来实现。
本发明的另一方面涉及生产和/或设计治疗本文公开的疾病的药物，所述疾病更具体地为肿瘤、肿瘤疾病、癌症和癌症疾病以及特征是功能丧失或基因损失的疾病或者包括至少一种本文定义的SNP的疾病。根据待治疗的疾病的方法，更具体地，与所述疾病有关的细胞按照它们是否表达造成这种疾病的因子，优选肽和蛋白质来表征。如果所述细胞不表达这种因子和/或不包含编码这种因子的转录物，那么设计本发明的双链核酸以避免任何脱靶效果，其中细胞的转录组不包含各自因子的mRNA或者hnRNA。备选地，如果各自因子是正常，即健康细胞中发现的因子的突变形式，那么设计双链RNA使得与所述mRNA或者hnRNA或者该因子的突变形式的其他转录物互补，其中导入许多错配以允许产生本文描述的应激反应，其中优选不产生阳性RNA干扰应答，并且再次，通过据此设计序列避免任何脱靶效应。可通过使用本领域技术人员已知的生物信息学可以进行这种序列设计。应当了解应该避免任何脱靶效应，然而，如果脱靶效应被减小，或者与细胞的其他组分或者因子相关发生，认为所述脱靶效应不对细胞造成任何伤害，那么所述脱靶效应在原则上足够。然而，优选地，没有各自序列导致的脱靶效应。
现在通过参考附图和实施例进一步阐明本发明，从附图和实施例可以得到本发明的其他特征、实施方案和优点。
图1显示了小RNA双链体的反应原理，图1A阐明了本发明涉及的原理机制，图1B阐明了siRNA的作用方式；
图2A显示了可应用于本发明的多种siRNA构建体；
图2B显示了使用针对PTEN设计的siRNA或者反义分子对细胞裂解物的免疫印迹结果；
图2C显示了使用针对PTEN设计的siRNA或者反义分子对细胞裂解物的免疫印迹结果，其中除了p110α，PTEN和pAkt，还将pFKHR用作读出；
图3A显示了分别使用不同的反义构建体和siRNA构建体，在12和24小时后affymatrix实验的探针组数目的增加和减少；
图3B显示了使用用于PTEN mRNA击倒的不同反义和RNA构建体，affymatrix实验的结果；
图4A显示了描绘用多种siRNA表达构建体处理时PC3肿瘤体积的图表；
图4B显示了描绘用多种siRNA表达构建体处理时HeLa肿瘤体积的图表；
图5A显示了细胞增殖测定中用不同RNA分子转染细胞72小时后的PC-3细胞；
图5B显示了细胞增殖测定中用不同RNA分子转染细胞160小时后的PC-3细胞；
图6显示用不同的双链RNA分子处理HeLa细胞后细胞裂解物的蛋白质印迹分析；
图7显示了使用不同的制剂，表示绝对肿瘤体积作为细胞刺激后天数的函数图；
图8显示了施用PBS和含有双链核糖核酸的不同浓度的脂类制剂时，肿瘤体积作为细胞刺激(challenge)后函数的图；
图9显示了施用PBS和含有双链核糖核酸的不同浓度的脂类制剂时，肿瘤体积作为细胞刺激后函数的图。
实施例1：用不同的击倒技术减少HeLa细胞中PTEN蛋白质
为了评估用不同击倒技术导致HeLa细胞中PTEN蛋白质的减少，制备了siRNA构建体和基因区段，即制备了反义构建体。可以从图1A得到各自序列和设计原理。应当注意到针对PTEN的siRNA构建体分别称作PTEN1、PTEN2和PTEN3。而且，产生了siRNA构建体，它们每一个都具有四个错配，称作PTEN1 MM、PTEN2 MM和PTEN3 MM。还公知这些siRNA构建体中的错配的排列可以用于任何其他siRNA，即该排列不限于用于PTEN，而且也可以用于其他靶核酸序列。与PTEN mRNA序列、即靶序列相比的错配以箭头标出。此外，产生了反义构建体，它们在5’和3’端具有倒置脱碱基并且在核心中包含一段9个脱氧核糖核苷酸序列，其侧翼是每端6个寡核苷酸。各自反义构建体称作PTEN1 GB。还对于该类型反义分子，设计了错配反义形式，其与靶PTEN mRNA相比包含共四个错配。
HeLa细胞保持在极限必需培养基Eagle(EMEM)中，该培养基含有2mM L-谷氨酰胺、Earle’s BSS 1mM丙酮酸钠，0.1mM非必需氨基酸，10％胎牛血清(FCS)。通过使用L8脂类(Atugen，Berlin)在10cm板(30％到50％汇合)中实施合成siRNA和反义转染，即GeneBlocs转染。通过向完全培养基中的细胞加入siRNA和脂类在无血清培养基中预先形成的5×浓缩复合物转染HeLa细胞。10cm板中总转染体积为10ml。取决于细胞密度，最终脂类浓度为0.8到1.2μg/ml。为了免疫印迹，将细胞裂解并在硝酸纤维素膜上印迹含有等量蛋白质的细胞提取物的等分试样，并通过标准方法使用鼠单克隆抗-PTEN抗体(Santa Cruz Biotechnology)分析并用鼠单克隆抗-p110α抗体评估相等负荷(Klippel，1994)。
对HeLa细胞测试多种构建体的效果并以免疫印迹描绘结果。
原则上，无论何时击倒PTEN，Atk的磷酸化形式的水平都将增加。然而，还已知磷酸-Akt在应激条件下显示出增加的表达。比较多种siRNA构建体，可以从图1B得出通常产生击倒，尽管下游读出，即磷酸-Akt不再与涉及的生物体信号级联一致。仅通过siRNA构建体表明了该效果，而反义构建体在HeLa细胞的表达水平下不显示出该类型的不配对反应。换句话说，siRNA介导的PTEN击倒不一定导致刺激Akt磷酸化。该结果表明细胞中siRNA分子的存在可以防止正常的信号转导。这导致如关于PTEN3 MM所阐明的结论，即根据本发明设计的双链核糖核酸可以导致应激反应，包括细胞毒性应答和编程性细胞死亡和受损的细胞信号转导。
此外，作为甚至更进一步的下游可能的读出，使用pFKHR。pFKHR是另一种转录因子。在该实验中，发现PTEN3构建体尤其有趣，将PTEN3构建体进行滴定实验，证实在图2B中表示的结果。该滴定实验表明受损细胞信号转导不是由过多胞内siRNA导致，这通过不能通过的递送有限量的siRNA减小所述信号转导得到证明。
实施例2：在Affymetrix实验中试验多种击倒技术的影响
使用关于实施例1描述的核苷酸设计Affymetrix实验，其中GB1对应于PTEN1 GB，GB1 MM对应于PTEN1 GB MM，siRNA1对应于PTEN1，siRNA1 MM对应于PTEN1 MM。
调用的(called)探针组的选择标准是在所治疗和未治疗的细胞中都存在并且信号强度的改变为至少2.5倍。
对于微阵列实验，从用相应GB/siRNA处理的细胞制备RNA并产生生物素化cRNA探针并根据生产商的方案(Affymetrix，Santa Clara，CA-USA)将所述cRNA探针与Affymetrix Human Genome U95组(ChipHGU133A和B)杂交。使用Affymetrix软件(Microarray suite，版本5.0)实施每个芯片的绝对分析和样品的比较分析。
在图3A中描绘了这些实验的结果。从Affymetrix实验，在用前述击倒构建体处理各自HeLa细胞后分析了约6,000个探针组。对于任何情形，可以从结果得到12小时后被调用的探针组中有显著减少，而与具体序列无关。注意到12小时后siRNA构建体具有被调用的探针组的显著减少。在任何情形中，反义介导的效果没有siRNA构建体之一明显。
24小时温育后，不管具有或没有错配，对于反义构建体，各自HeLa细胞显示出被调用的探针组显著增加，从而这是12小时后观察到的情形的逆转。这与使用siRNA构建体的情形相反，siRNA构建体仍然显示出被调用探针组的明显减少。于是，甚至相应于根据本发明的双链核糖构建体的错配siRNA也显示出被调用的探针组的显著减少。
实施例3：通过不与肿瘤细胞的转录组配对的dsRNA抑制肿瘤细胞生长
在本实施例中，描述了一个实验，其中不与肿瘤细胞的转录组配对的dsRNA导致肿瘤细胞生长的抑制。
可以如下概述本实验的基本方法。产生表达短发卡RNA(shRNA)的人前列腺癌细胞(PC3)或者HeLa细胞。在8只nu/nu小鼠中注射共5×106个细胞(subcutan HeLa，前列腺内PC3)。对于PC3，注射后56天处死小鼠，对于HeLa，注射后10天处死小鼠。终点是移植肿瘤的生长。
结果在图4中描绘。
图4A显示用所示shRNA表达构建体稳定转染的PTEN(-/-)前列腺癌细胞(PC3)的肿瘤体积。包括用GFP表达质粒稳定转染的PC3细胞作为同位肿瘤模型的对照。各自序列为：
PTEN guucacuguaaagcuggaaaggg aaaaaaaaaaaa cccuuuccagcuuuacaguga
PTEN MM
guucacucuaaaggugcaaacgg aaaaaaaaaaaa ccguuugcaccuuuagaguga
在该具体实验中，设计了针对PI3K的两个亚基，即p110b和p110a的siRNA。考虑到p110b亚基(有时也称作p110beta)的重要性，针对该靶标的siRNA构建体在减小肿瘤体积方面应该尤其有效(也通过该实验证实)。然而，令人惊奇地发现作为p110a MM的siRNA也和肿瘤特异p110bsiRNA几乎一样有效，而p110a是p110b的阴性对照。此外，作为p110b的错配形式的siRNA构建体仍然表现出显著抑制PC3肿瘤细胞体积。该效果证明如下理解：即使根据本发明的双链核糖核酸设计成不与PC3肿瘤细胞的转录组的mRNA或者另一元件相互作用，这也分别导致细胞毒性应答和编程性细胞死亡，该结论可以从肿瘤体积的减小得出。
得到了本发明的令人惊奇的发现，如果siRNA针对转录组中不存在于各自细胞系中的转录组的一个成员，那么所述siRNA构建体原则上可以有效诱导细胞毒性应答和细胞程序性死亡，并且不引起其他核酸引起的RNA干扰应答，通过PTEN构建体的效果证实了该发现，所述构建体与高度特异的p110b siRNA构建体几乎一样有效。
该实验的另一结果在图4B中描绘，图4B显示了利用subcutane肿瘤模型中所用的所指出的shRNA表达质粒稳定转染的PTEN(+/+)HeLa细胞的肿瘤体积。这里，PTEN siRNA构建体发现了靶标，因为HeLa细胞关于两个等位基因都是PTEN阳性的从而不诱导所述细胞毒性应答。然而，p110b MM构建体，即对p110特异的siRNA构建体，但是按照本文公开的设计原理具有几个错配，其不会允许正确的，即阳性RNA干扰应答，而且也导致HeLa肿瘤体积的显著减小。
实施例4：通过dsRNA分子的转染诱导PC-3细胞增殖减少
进行该实施例是为了评估dsRNA分子的修饰模式的影响以及所导入的dsRNA的靶核酸的存在和不存在的影响。
诱导下面的dsRNA分子：
PTENA 5′-cuccuuuuguuucugcuaacg-TT
PTENB 3′-TT-gaggaaaacaaagacgauugc-
PTENAMM 5′-cucauuuucuuugugcucacg-TT
PTENBMM 3′-TT-gaguaaaagaaacacgagugc
PK 71A 5′-cuucucgcaguacaggcucuc-TT
PK 71B 3′-TT-gaagagcgucauguccgagag
NM_013355
PTENAV15 5′-cuccuuuuguuucugcuaacg
PTENBV15 3′-gaggaaaacaaagacgauugc
PTENAV1 5′-cucuuuuguuucugcuaacg
PTENBV1 3′-gaggaaaacaaagacgauugc
PTENAV10 5’-uaaguucuagcuguggugg
PTENBV10 3’-auucaagaucgacaccacc
粗体和加下划线的＝2’-O-甲基修饰
大写字母＝脱氧nt
使用PC-3细胞在10cm板上以增殖测定法评估多种dsRNA分子的功效。
塑料皿上的增殖测定
将30-50％汇合的PC-3细胞用各自dsRNA分子转染(见实施例1)。温育后，在72小时照相(图5A)(72小时温育)并在160小时时照相(图5B)(160h温育)。转染条件为与atuFECT01(1μg/ml)复合的100nMsiRNA分子。
β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油基-酰胺三盐酸盐

二植烷酰(Diphytanoyl)磷脂酰乙醇胺

dsRNA分子的制剂
将阳离子脂类β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油基-酰胺三盐酸盐和辅助脂类二植烷酰磷脂酰乙醇胺的氯仿溶液混合从而两种脂类以1∶1的比例存在。随后，真空下除去氯仿并将获得的脂类膜以1μg脂类/ml的浓度在水中再水化。所形成的阳离子脂类在超声浴中室温下进行分散体的超声处理6分钟。为了将脂类与dsRNA分子复合，将dsRNA(2mg/l DPBS)与脂类(0.735mg/ml超纯水)以1∶1体积比混合，涡旋并在37℃温育约20分钟。该制剂也在本文中称作atuFECT01。
从图5A和5B中可以看出，不同RNA分子对PC-3细胞增殖的能力具有不同影响。所述增殖测定是指示细胞生长并从而也指示它们的促有丝分裂和编程性细胞死亡活性的潜能的适宜测定法。
比较图5A和5B中描绘的结果，重要的是注意到生长72小时后，使用不同RNA分子处理细胞的效果如下条件相比不是那么显著，在所述条件下在10cm板上再过160小时后观察细胞。
PK71AB是siRNA分子，即包含21个碱基对的双链RNA分子，其针对PKN beta(NM_013355)并从而适于根据RNA干扰机制下调PKN betamRNA。然而，PKN beta对PC-3细胞的生长不具有任何影响。
PTENAB是包含如上述PTENA和PTENB序列的双链结构。160小时后，PC-3细胞受到抑制并且生长和存活显著降低。由于PC-3细胞是PTEN-/-细胞，即它们不具有包含编码PTEN的mRNA或者其他转录的RNA的转录组，这证明了本申请中公开的发现，即通过使用双链核酸，更优选地，核糖核酸，如不与转录组匹配的双链核糖核酸可以诱导细胞增殖的抑制和编程性细胞死亡。
而且使用PTENABMM显示出了上面关于PTENAB描述的相似的效果。PTENABMM是双链核糖核酸，其包含如上述的序列PTENAMM和PTENBMM。除了不显示出PTEN基因的转录的PC-3细胞以外，错配在抑制的细胞增殖方面显示出更强烈的应答从而导致分别与72h和160h后的密度相比细胞密度方面更强的编程性细胞死亡效果。
然而，分别使用PTENA和PTENB作为单链构建体，比较图5A和5B可以发现单链核糖核酸不导致PC-3细胞增殖的抑制，从而证明为了实现本文公开的效果，需要双链核酸结构。
双链核糖核酸分子PTENABV15包含上面描述的双链PTENAV15和PTENBV15。该分子显示出修饰模式，从而第一个、第三个等等，即每隔一个核苷酸包含一个修饰，尤其对于2’-O甲基化核糖部分，其中修饰的第一个核苷酸是从反义链的5’末端开始的第一个核苷酸。与PTENAV链互补的PTENBV15链具有相同模式，然而，存在一个核苷酸移码，从而第2、4、6等等，即每隔一个核苷酸以与反义链相同的方式受到修饰，即受到2’O-甲基化核糖修饰。
该结果证明该修饰模式(其在本文中也称作空间修饰模式的一个实施方案)导致本文描述的效果。
对于双链RNA分子PTENABV10也同样如此，PTENABV10也涉及PTEN mRNA或PTEN转录物，然而，考虑到PC-3细胞的具体遗传背景，PTEN mRNA或PTEN转录物是不存在的。该序列还导致增殖测定中PC-3细胞生长的抑制，从而表明基于本文公开的机制的细胞裂解和编程性细胞死亡。
最后，分析了由上述PTENAV1和PTENBV1的各自序列组成的分子PTENABV1，然而其在该测定中无活性，即这种分子不适于抑制细胞增殖。尽管该序列同样针对PTEN并且应该在这个范围内起作用，然而，该分子的特征在于两条链在核糖的2’位都被完全甲基化，其中已知这种总体修饰不引起RNA干扰。为此，本发明人得出结论，即为了引发本文公开的效果，修饰是允许的，然而，完全修饰的dsRNA分子的产生在本发明中是不起作用的，在所述分子中反义链在2’核糖被完全甲基化并且优选已知有义链不能有效引起RNAi应答。
注意到用于该实施例中的dsRNA分子的长度为21个核苷酸对。
实施例5：错配诱导的编程性细胞死亡
为了证明本发明的发现，即通过双链核酸可以诱导细胞生长的抑制，尤其是编程性细胞死亡，所述双链核酸优选为双链核糖核酸，其不完全碱基配对而是与将引起RNA干扰反应的最佳siRNA分子相比显示出至少一个、优选几个错配，进行下面的实验。
使用atuFECT01(1μg/ml)用100nm siRNA转染HeLa细胞，如上关于实施例4所述制备atuFECT01。使用下面的序列：
PTENM 5′-cuccuuuuguuucugcuaacg-TT
      3′-TT-gaggaaaacaaagacgauugc
PTENMM 5′-cucauuuucuuugugcucacg-TT
       3′-TT-gaguaaaagaaacacgagugc
p110αM  5′-cuccaaagccucuugcucagu-TT
         3′-TT-gagguuucggagaacgaguca
p110αMM 5′-cugcaaacccuguugcucacu-TT
         3′-TT-gacguuugggacaacgaguga
加下划线的nt＝对应于导入的错配
大写字母＝脱氧nt
如此处理的细胞分别在48和72h后裂解，并使用所示抗体通过免疫印迹分析。
请注意到上面的序列中，通过下划线指出dsRNA分子的错配。因此，对于PTENMM，错配基于反义链上的4、9、13和18位。核苷酸1位于5’端，其中此类错配称作存在于HeLa中的PTEN mRNA(HeLa的转录组仍然包含PTEN mRNAs)。
对于p110α，其是实施例3中描述的PI3K的亚基，错配在有义链上的3、8、12和20位，第一个核苷酸是5’端的核苷酸，错配还存在于有义链上的相应位置。在任一情形中，双链RNA分子包含21个核苷酸的一段序列和21个核苷酸的第二段序列。在每种情形中，在有义和反义链的每一条的3’端都存在二脱氧核苷酸，即TT。
结果在图6中描绘。从图6可以得出，针对p110α产生的导致p110α蛋白质减少。对于双链RNA分子与靶mRNA，即p110αmRNA完全匹配的情形，对于PTEN同样如此。
另一读出是RB和GSK3α，其以它们的脱磷酸化形式表明增殖的抑制，其中在两种情形中脱磷酸化意味着活化。另一读出是裂解的PARP信号，其表明程序性细胞死亡。完全确定被激活的caspase-3切割死亡底物PARP(Lazebnik等，1994，Nature 371，346-347)。
再次参考图6，至少72h后，PTENMM和p110αMM明显减小RB和GSK3α磷酸化的程度。此外，对于完全相同的dsRNA分子，可以确定所切割的部分以显著水平存在，表明用这些dsRNA分子处理的细胞经历编程性细胞死亡。这证明即使存在靶序列，使用不完全匹配双链RNA分子也导致应激反应，包括，但不限于，编程性细胞死亡，并最终导致生长抑制和/或细胞抑制和/或细胞裂解。
实施例6：人PC3小鼠模型中基于dsRNA的治疗
实验设计
根据食品和药物管理局(美国健康和人类服务部，食品和药物管理局，Rockville，MD)的关于非临床实验研究的良好实验室规范(GLP条例)并按照德国动物保护法作为法律基础(Bundesgesetzblatt，I，25 May 1998，p.1094)进行体内实验。得到地区政府机构的批准(Landesamt für Arbeitsschutz，Gesundheitsschutz und technische Sicherheit Berlin)。人前列腺癌细胞PC-3(美国典型培养物保藏中心(ATCC)2002，Manassas，VA 20108)培养在含有2mM谷氨酰胺(Gibco BRL)，20mM Hepes(Biochrom)和10％胎牛血清(Gibco BRL)的F-12K Kaighn’s改良培养基(Gibco BRL)中。将培养的细胞胰酶消化并在停止培养基的胰酶作用后收获。加入洗涤步骤(PBS；离心5分钟/1000转/分钟)，最后考虑细胞数和温育的体积，重悬浮沉淀。
动物和细胞刺激
保持在SPF条件(层流气流设备，Scantainer，Scanbur)下的雄性Shoe：NMRI-nu/nu小鼠(DIMED Schnwalde GmbH)用作PC3细胞的接受者。将8周龄和重28-32g的动物皮下接种5×106/0,1ml肿瘤细胞到左腹股沟区。细胞刺激后17天，根据4个处理组将动物随机化，每组包括6只动物。肿瘤大小为每个处理组150到160mm3。连续观察动物，记录发现。施用10mm可高压灭菌的Ssniff NM-Z(ssniff Spezialditen GmbH)作为强化食物，饮用的自来水经酸化，动物可随意获得食物和水。
制剂
如上面关于实施例4描述的制备制剂。
此外，将300μl该制剂静脉内注射到30g小鼠，其分别导致10mgsiRNA和3.7mg脂类/kg体重的剂量。裸siRNA(2mg/ml DPBS)用DPBS以相同体积比填补并适当处理。对于每次处理新鲜制备复合物。
siRNA治疗
将包括作为对照的PBS的siRNA制剂通过尾静脉静脉内施用。治疗方案由9个连续的每天注射组成。达到10mg siRNA和3.7mg脂类/kg体重的剂量水平进行0.3ml/30g小鼠的注射体积。包括下面的处理组：
PBS；
PTEN/AB/裸露的；
PTEN/AB
评估
对于实验期间定期记录体重以评估动物的生理状况。通过一对卡钳在治疗期每天和以后每周3次二维测量肿瘤。根据V(mm3)＝ab2/2(b＜a)(体内癌症模型.1976-1982.Washington，D.C.：National Cancer Institute 1984(NIH Publication No.84-2635，1984年2月))计算体积。通常，对所述方法进行的细胞数导致100％肿瘤获得。
通过从眼窝窦进行血液穿刺评估血液参数：
酶：ALT，AST，AP；
细胞组成：WBC，RBC，PLT，Hb，Hkt；
白细胞分化。
将肿瘤和肝脏组织的组织学分析样品在5％甲醛中固定并石蜡包埋。通常，将切片HE染色。
通过Mann和Whitney的u检验统计学地验证关于肿瘤大小的结果。
/atuFect01；
MTP18/atuFect01.
PTENV1/atuFect01
PTENGB/atuFecto1
使用下面的双链核糖核酸和反义分子：
PTENA 5’cuccuuuuguuucugcuaacg-TT
PTENB 5’cguuagcagaaacaaaaggag-TT
MTP18A 5’ugccuucuugccuuugucuau
MTP18B  5’auagacaaaggcaagaaggca
PTENAV1 5’cuccuuuuguuucugcuaacg
PTENBV1 5’cguuagcagaaacaaaaggag
PTEN53 GB3.5 5′cuccuuTTGTTTCTGcuaacg
请注意任何2’O-甲基修饰的核糖核苷酸都以粗体和下划线标出，大写字母指出脱氧核糖核苷酸，大写且斜体的任何字母指出包含硫代磷酸酯的脱氧核糖核苷酸。
结果在图7中描绘。
从图7可以得出20天后，与施用PTENAB/atuFECT01引发的应答相比，对PBS的应答根据Mann和Whitney是统计学显著的(P＝0.05)并且与任何其他治疗方案相比绝对肿瘤体积增加较少。在第17到18天每天施用多种制剂。
在另一实验中，将动物用PBS或者用PTENAB/atuFECT01 10mg/kg和PTENAB/atuFECT01 1mg/kg刺激。在第19到26天每天施用各种制剂。结果描绘于图8。
从图8可以得出，如果施用更大量的制剂，相对肿瘤体积增加较小，从而证明在体外研究中也观察到的剂量依赖性反应。
在另一实验中，其结果描绘于图9，以相同的动物模型评估了PBS、PTEN-V1/atuFECT01 10mg/kg和Gene Bloc 53/atuFECT01 10mg/kg的影响。
从该图可以得出由上述PTENAV1和PTENBV1链组成的PTEN-V1构建体如上述用特定脂类配制，从而此类分子在有义链和反义链上都被完全修饰，从而任何2’OH位都被修饰成2’O-甲基。该分子实际上在小鼠模型中无效，并且增加的肿瘤体积类似于用PBS处理的肿瘤体积的增加。原因是完全修饰，优选反义链的完全修饰使得该链无活性从而当在细胞系统中使用这种类型的双链RNA分子时，所观察到的效果将导致上述的应激反应，其中所述细胞系统中不存在靶核酸，即mRNA，更确切地PTENmRNA。
而且，针对PTEN的Gene Bloc 53/atuFECT01不能有效减小肿瘤体积，这并不令人惊奇，因为特定PC-3细胞并不提供靶标，并且根据实施例4中描述的实验，单链寡核苷酸不适于诱导所观察到的和本文公开的效果。
本说明书中公开的本发明的特征、权利要求书和/或附图可以单独和以任何组合作为实现多种形式的本发明的材料。
                              序列表
<110>阿图根股份公司
<120>双链核糖核酸在诱导细胞裂解中的应用
<130>A 19017 PCT
<140>PCT/EP 04/06999
<141>2004-06-28
<160>29
<170>Patentln version 3.1
<210>1
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<212>RNA
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<223>干扰RNA；
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