发明简述
本发明目的是提供一种可低成本大规模有效生产LH-RH衍生物
的方法。
为解决上述问题我们进行了深入研究。结果，发现了一种适于工
业化生产LH-RH衍生物的酶法合成方法，即我们的发明。
本发明特征在于
在选自胰凝乳蛋白酶和胰凝乳蛋白酶样酶中的一种酶存在下，将
通式(1)所示的肽片段
pGlu-His-Trp-OR1 (1)(其中R1代表低级烷基)
和通式(2)所示的肽片段
H-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y (2)
(其中X代表选自D-Leu、D-Ser(But)、D-Trp、(2-萘基)-D-Ala和
Gly中的氨基酸；Y代表Gly-NH2、Azgly(氮杂甘氨酸)-NH2或NHR2(其
中R2是低级烷基))
进行反应，产生通式(3)所示的LH-RH衍生物
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y (3)
(其中X和Y如上所定义)。
此处，本发明特征在于上述R1是具有1至3个碳原子的烷基，R2
是具有1至3个碳原子的烷基。本发明特征还在于上述选自胰凝乳蛋
白酶和胰凝乳蛋白酶样酶中的酶是胰凝乳蛋白酶。
另外，本发明的特征在于
在选自胰凝乳蛋白酶和胰凝乳蛋白酶样酶中的一种酶存在下，将
通式(4)所示的肽片段
pGlu-His-Trp-OR1 (4)(其中R1代表低级烷基)
和通式(5)所示的肽片段
H-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y (5)
(其中X代表选自D-Leu、D-Ser(But)、D-Trp、(2-萘基)-D-Ala和
Gly中的氮基酸；Y代表Gly-NH2、Azgly-NH2或NHR2(其中R2是低级
烷基))
在水或缓冲液与有机溶剂混合成的一种溶剂中反应，产生通式(6)
所示的LH-RH衍生物
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y (6)
(其中X和Y如上所定义)。
此处，本发明的特征在于所述水或缓冲液与有机溶剂混合成的一
种溶剂是，其中将水或缓冲液和可与水混溶的有机溶剂混合而得的一
种混合物，或者是一种其中水或缓冲液被可与水部分混溶的有机溶剂
饱和而得的混合物。
另外，本发明的特征在于
在选自胰凝乳蛋白酶和胰凝乳蛋白酶样酶中的一种固定化酶存在
下，将通式(7)所示的肽片段
pGlu-His-Trp-OR1 (7)(其中R1代表低级烷基)
和通式(8)所示的肽片段
H-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y (8)
(其中X代表选自D-Leu、D-Ser(But)、D-Trp、(2-萘基)-D-Ala和
Gly中的氨基酸；Y代表Gly-NH2、Azgly-NH2或NHR2(其中R2是低级
烷基))
在水或缓冲液与有机溶剂混合成一种溶剂中反应，产生通式(9)所
示的LH-RH衍生物
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y (9)
(其中X和Y如上所定义)。
本说明书中，LH-RH衍生物指下文通式(10)(SEQ.ID.NO：1)所示
的LH-RH中的第6位或第10位的Gly被一个不同的氨基酸、一个特
定氨基酸或修饰氨基酸取代的肽。
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (10)
相应于第6位Gly的氨基酸(下文称为X)可以是普通的D-氨基
酸或经修饰的D-氨基酸。例如，这里所说的D-氨基酸可以是D-Leu、
D-Trp、D-Ala、D-Phe、D-Val或D-His，而经修饰的氨基酸可以是D-
Ser(But)或(2-萘基)-D-Ala。此外，X可以是L-氨基酸。当X是D-
氨基酸时，优选D-Leu、D-Trp、D-Ala、D-Ser(But)或(2-萘基)-D-Ala；
当X是L-氨基酸时，优选Gly。相应于第10位的Gly的氨基酸(下
文称为Y)优选为Gly-NH2、Azgly-NH2或NHR2(其中R2是低级烷基)。
这里的“低级烷基”指具有1至3个碳原子的烷基，如甲基、乙
基、丙基或异丙基。R1优选甲基或乙基，R2优选乙基或甲基。
此外，本说明书中表示氨基酸、肽、保护基、溶剂和其他所用的
缩写形式均按照国际纯粹化学和应用化学联合会(IUPAC)和国际生物
化学联合会(IUB)的规则或是本发明所属领域的常规符号。例子如下所
示。除非另有说明，可能的氨基酸光学异构体指L-构型。
Tyr：酪氨酸残基
Gly：甘氨酸残基
Azgly：氮杂甘氨酸残基
Glu：谷氨酸残基
pGlu：焦谷氨酸残基
Ser：丝氨酸残基
Arg：精氨酸残基
Pro：脯氨酸残基
Leu：亮氨酸残基
His：组氨酸残基
Ala：丙氨酸残基
Trp：色氨酸残基
Et：乙基
Boc：叔-丁氧羰基
Aoc：叔-戊氧羰基
Bz：苄基
Z：苄氧羰基
Tos：甲苯磺酰基
OMe：甲酯
OBz：苄酯
OSu：N-羟基琥珀酰亚胺酯
TFA：三氟乙酸
THF：四氢呋喃
DMF：二甲基甲酰胺
DCC：二环己基碳二亚胺
WSC：N-乙基-N’-二甲氨基丙基-碳二亚胺
HOSu：N-羟基琥珀酰亚胺
HOBt：1-羟基苯并三唑
MeOH：甲醇
EtOH：乙醇
AcOH：乙酸
通式(1)所示的肽片段与通式(3)所示的LH-RH衍生物的氨基酸
序列中的第1至3位氨基酸残基一致。并且，通式(2)所示的肽片段与
通式(3)所示的LH-RH衍生物的氨基酸序列中的第4至10位氨基酸残
基一致。
根据熟知的合成肽的方法可以合成通式(1)或通式(2)所示的肽片
段。例如，根据The Peptides.Vol.1，Schreder和Luhke.，1966，Academic
Press，New York U.S.A.或在Peptide Svnthesis，Izumiya等1975，
Maruzen Corporation中所述的方法，可通过叠氮法、酰氯法、酸酐法、
混合酸酐法、DCC法、活化酯法(如对-硝基苯酯法、N-羟基琥珀酰亚
胺法和氰基甲酯法)、使用Woodword K试剂的方法、羰基咪唑法
(carboimidazole)、氧化还原法、DCC加成(HONB、HOBt、HOSu)法
和固相合成法，来合成肽片段。使用这些合成肽的常用法，例如可通
过所谓的逐步延长法或者通过片段缩合法来生产肽。其中在逐步延长
法中，是根据氨基酸序列将一个个氨基酸按序与C-末端氨基酸缩合，
而片段缩合法是先合成几个片段然后再把它们相互偶联起来。
在合成上述通式(1)或(2)所示肽片段的反应过程中，将不参与反
应的官能团通过常规保护基团保护起来，反应完成后去除保护。并且，
通常将参与反应的官能团活化。这些反应方法均为熟知方法，所用试
剂可适当选自熟知试剂。
例如氨基保护基包括苄氧羰基(Z)、叔-丁氧羰基(Boc)、叔-戊
氧羰基(Aoc)、异冰片基氧基羰基(isobonyloxycarbonyl)、对-甲氧苄
氧羰基、2-氯苄氧羰基、金刚烷基氧基羰基、三氟乙酰基、邻苯二
甲酰基、甲酰基、邻-硝基苯基亚磺酰基和二苯基硫膦基。通常Boc
用于保护氨基。但是当偶联D-Ser(But)时，使用Z对氨基进行保护，
在去除保护基时可只去除Z基而不去除But(叔丁基)。
例如羧基保护基包括烷基酯(例如甲酯、乙酯、丙酯、丁酯和叔
丁酯)、苄酯、对-硝基苄酯、甲基苄酯、对-氯苄酯、二苯甲基酯、
苄氧羰基酰肼、叔丁氧羰基酰肼和三苯甲基酰肼。为进行酰肼化，优
选使用甲酯或乙酯。
例如参与肽合成时羧基的活化包括酰氯法、酸酐法、混合酸酐法、
叠氮法、活化酯(例如五氯苯酚、对-硝基苯酚、N-羟基琥珀酰亚胺、
N-羟基苯并三唑和N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二羧基亚胺的酯)
法。其中在片段缩合时叠氮法的外消旋趋势较小，为优选使用的方法。
此外，在缩合剂如包括环己基碳二亚胺和碳二咪唑
(carbodiimidazole)等碳二亚胺试剂存在下或在焦磷酸四乙酯存在下可
进行肽键合成反应。
通常蛋白酶主要用来裂解肽键。并且，很久以来就熟知蛋白酶也
可以用于其逆反应以合成肽键。利用酶进行长链肽的合成仅限于其中
肽结构含有的氨基酸具有有限的底物特异性这种情况或者酶具有有限
的底物特异性这种情况。因此，如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶这些常用
酶极少用于肽合成反应。一般来讲，酶反应主要用于相对短链的肽键
如寡肽。但这也要花费时间去检验合成条件。基于这一点，通常使用
化学合成方法来生产肽，仅在化学合成法产生许多副反应或反应很困
难时才试使用酶法合成。当合成是在能进行大量生产的温和条件下进
行且使用适当条件可以解决上述化学合成的问题时，酶法合成可以是
非常有用的。
作为深入研究的结果，本发明人通过在胰凝乳蛋白酶或胰凝乳蛋
白酶样酶存在下使通式(1)和通式(2)所示的肽片段反应以使其相互偶
联，成功地有效地生产出了通式(3)所示的LH-RH衍生物。
用于本发明的胰凝乳蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，其在国际生物
化学联合会(IUB)酶学委员会的注册编号为EC.3.4.21.1，获自牛胰。
胰凝乳蛋白酶为市售产品，由SIGMA公司等出售。
胰凝乳蛋白酶样酶为蛋白水解酶，它们识别芳香族氨基酸如Tyr
和Phe，包括(例如)α-胰凝乳蛋白酶。
优选使用胰凝乳蛋白酶或胰凝乳蛋白酶样酶，因为胰凝乳蛋白酶
或胰凝乳蛋白酶样酶的识别位点之一Trp存在于LH-RH衍生物中。
采用胰凝乳蛋白酶或胰凝乳蛋白酶样酶的反应在pH为约5至10
的含缓冲液的介质中进行，优选pH为约6至9，更优选pH为约7.5
至8.5。
这里使用的术语“含缓冲液的介质”指缓冲液本身为介质的溶剂，
或缓冲液(选自下文所述的各种缓冲液)与一种可与水混溶的有机溶剂
混合成的混合物，或缓冲液与一种部分与水混溶的有机溶剂混合成的
混合物。
对缓冲液没有特别的限制。只要pH在上述范围内，各种缓冲液
均可使用。例如缓冲液包括Tris-盐酸、MacIlvaine缓冲液、磷酸缓冲
液、乙酸铵缓冲液、Atkins & Pantin缓冲液和佛罗那缓冲液。
当缓冲液用作反应介质时，通常将缓冲液与一种可与水混溶的有
机溶剂混合。可与水混溶的有机溶剂包括二甲基甲酰胺(DMF)、二甲
基亚砜(DMSO)、二甲基咪唑啉酮(DMI)、六甲基磷酰三胺(HMPA)、
甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)。优选二甲基甲酰胺、甲醇和乙醇。
另外，可使用与水部分混溶的有机溶剂如丁醇(1-BuOH)或乙酸乙
酯(EtOAc)。使用这类有机溶剂时，优选使用BuOH，以便于后处理中
进行分配色谱。
这些有机溶剂可单独使用，或可以两种或多种结合使用。
当在水或缓冲液与有机溶剂的混合物中进行胰凝乳蛋白酶和胰凝
乳蛋白酶样酶的反应，而不是在仅由水或缓冲液组成的溶剂中进行反
应时，可显著提高所需肽的收率。
从反应性角度考虑，可与水混合的有机溶剂对水或缓冲液的混合
比例通常优选为50体积％或更小。当使用一种固定化酶如固定化于
硅藻土上的胰凝乳蛋白酶时，优选混合比例为80％或更大。当使用一
种可与水部分混溶的有机溶剂时，优选使用被水饱和的有机溶剂，这
样可获得酶的高反应效率。
在胰凝乳蛋白酶或胰凝乳蛋白酶样酶能起作用的温度范围内进行
上述酶反应，通常为约0℃至约50℃，优选约0℃至约20℃。在约10
℃时该反应具有能抑制同时发生的水解反应的效果。
胰凝乳蛋白酶或胰凝乳蛋白酶样酶的用量不受特别限制，可依据
反应条件改变。例如，基于50g底物使用约50mg至约100mg胰凝乳
蛋白酶在反应1小时后导致目标肽的合成产率为约75至约85％。
相对于每摩尔通式(2)所示的肽片段通常使用1至5mol或优选2
至4mol通式(1)所示的肽片段。
在本发明方法中，可使用溶于水或合适缓冲液中的胰凝乳蛋白酶
或胰凝乳蛋白酶样酶，或通过常规方法包括载体偶联法、交联法、包
埋法和其他可用于固定化酶的方法得到了固定化的酶。用于载体偶联
法中的载体包括多糖衍生物如纤维素、葡聚糖和琼脂糖；聚丙烯酰胺
凝胶；硅藻土；和多孔玻璃。交联法中的交联剂包括(例如)戊二醛、
双偶氮联苯胺、N，N-多亚甲基双碘乙酰胺和N，N-亚乙基双顺丁烯
二酰亚胺。包埋法中所用的材料包括(例如)聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯
醇凝胶、淀粉、konnyaku粉、尼龙、聚脲、聚苯乙烯、乙基纤维素、
火棉胶和硝酸纤维素。但固定化方法不限于使用上述载体的这些方
法。
根据本发明的生产方法，例如通过下述方式可获得通式(11)所示
的LH-RH衍生物：
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt (11)。
即，将一定量的下式(12)所示的肽片段
pGlu-His-Trp-OMe (12)
和一定量的下式(13)所示的肽片段
H-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt (13)
在具有所给活性的胰凝乳蛋白酶存在下，在pH为约7.8和温度
约为10℃的由水饱和的正丁醇中搅拌1小时，得到LH-RH衍生物。
为便于在后处理中将其脱除，优选胰凝乳蛋白酶的活性为约1000或
更高国际单位(U)/mg。反应中使用的式(12)所示肽片段与式(13)所示肽
片段的摩尔比为3∶1时可获得高收率。此外，例如作为加入反应流体
中的溶于水或缓冲液的酶的替代物，可使用根据常规方法固定化于琼
脂糖上的胰凝乳蛋白酶作为固定化酶。使用固定化酶，在反应完成之
后，便于通过过滤器如玻璃过滤器来过滤除去，并且允许重复使用。
如上所述可获得LH-RH衍生物，并且所得LH-RH衍生物可按下
述方法纯化。
本发明方法生产的LH-RH衍生物可通过常规方法脱盐和纯化。
可通过各种方法进行脱盐，即利用衍生物与盐的分子大小不同的方
法，包括凝胶过滤、超滤和透析。例如使用醋酸纤维素制备的膜进行
超滤、使用Sephadex柱如Sephadex LH-20、Sephadex-60、Sephadex
G-25进行凝胶过滤和使用如DEAE-纤维素进行离子交换色谱。在纯
化中，包括分配色谱的液相色谱使用不互相混溶的两种类型液体(如水
和正丁醇)，并利用在两液相中的分配系数的不同，使用固相如硅胶的
正相色谱和使用如ODS-硅胶的逆相色谱可作为高效液相色谱(HPLC)
来使用。
例如由于用本发明方法生产的LH-RH衍生物是亲水的，可通过
使用下述的不完全与水混溶的有机溶剂来纯化该衍生物。使用有机溶
剂来萃取上述反应的混合物。通过将水加入被萃取的流体中进行分
配，然后使用溶剂如醚进行固化。用于萃取的优选有机溶剂是正丁醇
(n-BuOH)。由于其具有高极性且不与水混溶，这种溶剂可达到高的萃
取率，这样便于进行随后的分配色谱过程。
将300ml正丁醇(约1/4体积的反应混合物)加入到反应混合物中
(1200ml)，以便在反应混合物中的正丁醇和水之间进行分配色谱。如
果必要可重复使用正丁醇进行萃取。分别将水相层和有机层进行浓
缩。从水相回收到的上述肽片段(7)可再用于后面的反应。
优选使用如乙醚或乙酸乙酯这类溶剂来固化获自分配色谱有机层
的粗纯产品，因为LH-RH衍生物微溶于这种溶剂。然后，将固化的
产品溶解于合适的缓冲液中如乙酸胺，使用合适的固相和流动相通过
柱色谱进行分级分离。使用弱阳离子交换树脂如CM纤维素或强阳离
子交换树脂如SP，从而获得与LH-RH中所含的Arg残基的相互作
用。使用缓冲液(与溶解固化的粗纯产品时所用的缓冲液相同)作为流
动相，具有当盐浓度呈线性梯度增加时能获得高收率的优越性。例如
可使用0.01M的乙酸胺水溶液和0.1M的乙酸胺水溶液。选择合适的
固相和洗脱剂所得洗脱液可使用HPLC来纯化。在HPLC中ODS硅
胶柱如TSK胶ODS-120T可用作固定相，且ODS硅胶柱的使用是最
合适的。另外，0.1％的TFA-乙腈可用作流动相。这里乙腈浓度从起
始的0.1％TFA-20％乙腈按每分钟1％的梯度增加，由此获得
0.1％TFA-50％乙腈的线性梯度，然后目标LH-RH衍生物可被很好地
分离。纯化不限于上述方法。并且，当使用固定化酶时，可无需实施
分配色谱而就进行离子交换。
本发明生产LH-RH衍生物的方法在工业上更为有用，因为它与
常规方法相比具有下述优点。
i)由于酶反应的性质，可在合成LH-RH衍生物时没有副反应发
生(如外消旋)，这样LH-RH衍生物易得到纯化和分离。
ii)可获得高收率的LH-RH衍生物。并且可回收和再使用未反
应的片段，因此该方法具有经济上的优越性。
如果必要，可将LH-RH衍生物转变成其可药用盐，如乙酸盐、
盐酸盐和磷酸盐。
实施例
使用下述实施例将更为详细地描述本发明，但本发明不限于这些
实施例。
在下述实施例中，通过测定高效液相色谱(HPLC)中的保留时间和
旋光度并通过氨基酸分析来鉴定所得的纯化肽。除非另有说明，通过
下述方法和条件进行测定。
(1)高效液相色谱(HPLC)
在HPLC分析中，使用LC-Module-1(日本水株式会社制)作为检
测器。
(HPLC分析条件)
柱：TSK胶ODS-120T(4.6×250mm)
洗脱剂：0.1％TFA-乙腈
(线性梯度；按每分钟增加1％，乙腈浓度从20％增至50％)
流速：1mL/min
检测波长：220nm
(2)旋光度
在测定旋光度时，使用DIC-370(由JASCO公司生产)。
(旋光度测量条件)
光束：Na灯589nm
温度：20℃
层长：100mm
浓度：5mg/ml
(3)氨基酸组成
在氨基酸组成分析中，将所得肽在6N盐酸(含0.1％苯酚)中于110
℃水解20小时，然后使用日立氨基酸分析仪L-8500(由日本日立公
司生产)进行氨基酸分析。
实施例1
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的制备
(1-1)Boc-Arg(Tos)-Pro-NHEt的制备
首先，将214.3g Boc-Arg(Tos)-OH溶解在150mL THF和100mL
DMF的混合物中，然后用冰-乙醇冷却至-20℃。接着，向混合物中
依次滴加35mL N-甲基吗啉和66mL氯甲酸异丁基酯，并在-20℃搅
拌1分钟，从而产生混合酸酐。将所得反应混合物与在300mL THF
中溶解有71.1g H-Pro-NHEt的溶液混合，并在0℃搅拌5分钟，然后
在室温搅拌30分钟。然后将所得反应混合物减压浓缩。将1200mL乙
酸乙酯分两次加到剩余物中，将剩余物用500mL水洗涤两次，然后减
压浓缩乙酸乙酯相。通过用乙醚处理使剩余物固化并干燥产物。由此
得到22 1.1 8g Boc-Arg(Tos)-Pro-NHEt(产率80.0％)。
Boc-Arg(Tos)-Pro-NHEt的熔点，旋光度，TLC的Rf和元素分析
如下：
m.p.： 100-102℃
[α]D： -30.3(c＝1.0，MeOH)
Rf： 0.69(BuOH/AcOH/H2O＝4/1/5)
元素分析(C25H40N6O6S·H2O)
计算值 C：52.61％ H：7.42％ N：14.73％
实测值 C：52.85％ H：7.30％ N：14.41％
(1-2)Z-Leu-Arg(Tos)-Pro-NHEt的制备
将如(1-1)中所述制备的110.5g Boc-Arg(Tos)-Pro-NHEt溶解在
150mL二氯甲烷(DCM)中。加入150mL TFA，同时用冰冷却溶液，
然后将混合物在室温搅拌30分钟。将所得反应混合物减压浓缩。向
剩余物中加入1500mL乙醚以固化产物，然后进行干燥。得到H-
Arg(Tos)-Pro-NHEt·TFA。
将脱保护的H-Arg(Tos)-Pro-NHEt·TFA溶解在80mL DMF和
200mL THF的混合物中，然后冷却溶液并用N-甲基吗啉中和。接着
将溶解有53.06g Z-Leu-OH和23.02g HOSu的200mL THF和36.4mL
WSC加入上述经中和的溶液中，然后将混合物在0℃搅拌5分钟，再
在室温搅拌过夜。用茚三酮证实后，减压浓缩反应混合物。
将1500mL乙酸乙酯加到剩余物中后，分别用500mL水和500mL
饱和盐水洗涤混合物两次。接着减压浓缩乙酸乙酯相并用乙醚处理剩
余物以固化产物，然后进行干燥。从而得到119.5g Z-Leu-Arg(Tos)-
Pro-NHEt(产率85.1％)。
Z-Leu-Arg(Tos)-Pro-NHEt的熔点，旋光度，TLC的Rf和元素分
析如下：
m.p.： 99-103℃
[α]D： -40.6(c＝1.0，MeOH)
Rf： 0.75(BuOH/AcOH/H2O＝4/1/5)
元素分析(C34H49N7O7S)
计算值 C：58.53％ H：7.06％ N：14.01％
实测值 C：58.40％ H：7.26％ N：13.78％
(1-3)Z-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的制备
向如(1-2)中所述制备的20.99g Z-Leu-Arg(Tos)-Pro-NHEt中加入
32mL茴香醚。然后向溶液中加入约200mL HF，同时用干冰-乙醇
冷却至-70℃，然后将混合物在0℃搅拌1小时。接着减压浓缩产物。
用乙醚处理剩余物。过滤出沉淀的产物，然后在氢氧化钠上真空干燥
该产物。从而得到H-Leu-Arg-Pro-NHEt·HF。
将8.86g Z-D-Ser(But)-OH溶解在100mL THF中。用干冰-乙醇
将溶液冷却至-20℃。然后依次向溶液中滴加3.3mL N-甲基吗啉和
3.96mL氯甲酸异丁基酯，将该混合物在-20℃搅拌1分钟，从而产生
混合酸酐。将所得反应混合物与200mL H-Leu-Arg-Pro-NHEt·HF的
DMF溶液(用N-甲基吗啉中和过)混合，然后将混合物在0℃搅拌5
分钟，再在室温搅拌30分钟。减压浓缩产物。将500mL水加到剩余
物中然后用200mL正丁醇萃取产物5次。用水洗涤萃取液5次。接
着减压浓缩正丁醇相，用乙醚处理使剩余物固化。从而得到22.89g Z-
D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt(产率90.5％)。
Z-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的熔点，旋光度，TLC的Rf和
元素分析如下：
m.p.： 121-123℃
[α]D： -49.0(c＝1.0，MeOH)
Rf： 0.51(BuOH/AcOH/H2O＝4/1/5)
元素分析(C34H56N8O7)
计算值 C：59.28％ H：8.19％ N：16.27％
实测值 C：59.01％ H：8.15％ N：16.19％
(1-4)Z-Ser-Tyr-OMr的制备
将23.9g Z-Ser-OH和23.2g H-Tyr-OMe溶解在50mL DMF中，
向所得溶液中加入12.7g HOSu和20mL WSC，然后将混合物在0℃搅
拌5分钟，再在室温搅拌过夜。用茚三酮证实后，减压浓缩反应混合
物。将500mL乙酸乙酯加到剩余物中，依次用200mL 1N盐酸、200mL
饱和碳酸氢钠水溶液和饱和盐水各洗涤两次。减压浓缩乙酸乙酯相。
用己烷处理使剩余物固化。从而得到38.44g Z-Ser-Tyr-OMe(产率
92.3％)。
Z-Ser-Tyr-OMe的熔点，旋光度，TLC的Rf和元素分析如下：
m.p.： 49-53℃(分解)
[α]D： +2.3(c＝1.0，MeOH)
Rf：0.89(BuOH/AcOH/H2O＝4/1/5)
元素分析(C21H24N2O7)
计算值 C：60.57％ H：5.81％ N：6.73％
实测值 C：60.88％ H：5.88％ N：6.99％
(1-5)Z-Ser-Tyr-NHNH2的制备
将如上(1-4)所述制备的38.0g Z-Ser-Tyr-OMe溶解在200mL甲
醇中。将50g肼加到所得溶液中，然后使混合物在室温放置过夜。接
着减压浓缩产物，并将剩余物用甲醇洗涤。得到34.2g Z-Ser-Tyr-
NHNH2(产率90.0％)。
Z-Ser-Tyr-NHNH2的熔点，旋光度，TLC的Rf和元素分析如下：
m.p.： 194-197℃
[α]D： +9.9(c＝1.0，DMF)
Rf：0.64(BuOH/AcOH/H2O＝4/1/5)
元素分析(C20H24N4O6)
计算值 C：57.69％ H：5.81％ N：13.45％
实测值 C：57.85％ H：5.83％ N：13.49％
(1-6)Z-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的制备
将在上述(1-3)中制备的28.0g Z-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt
溶解在300mL甲醇中，然后在2.5g 10％钯/碳存在下将氢气通入所
得溶液。室温搅拌7小时后，从反应混合物中除去催化剂，减压浓缩
滤液，然后将剩余物用乙醚处理。从而得到H-D-Ser(But)-Leu-Arg-
Pro-NHEt。
将在上述(1-5)中制备的20.1g Z-Ser-Tyr-NHNH2溶解在150mL
DMF中，然后用干冰-乙醇冷却溶液至-20℃。向溶液中加入43.5mL
HCl-二噁烷和6.5mL亚硝酸异戊酯以便得到叠氮化合物。加入
24.4mL三甲胺以便中和反应混合物。将混合物转移至含有H-D-
Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的150mL DMF溶液中，在-20℃搅拌2小
时并在4℃搅拌17小时然后浓缩。接着向剩余物中加入500mL水，
并用200mL正丁醇萃取混合物5次。用水洗涤萃取液5次，减压浓
缩正丁醇相，然后用乙醚处理剩余物以固化产物。从而得到33.2g Z-
Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt(产率87.5％)。
Z-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的熔点，旋光度，TLC
的Rf和元素分析如下：
m.p.： 115-118℃(分解)
[α]D： -27.6(c＝1.0，DMF)
Rf：0.36(BuOH/AcOH/H2O＝4/1/5)
元素分析(C46H70N10O11)
计算值 C：58.83％ H：7.15％ N：14.91％
实测值 C：58.88％ H：7.55％ N：14.90％
(1-7)Z-pGlu-His-OH的制备
将52.6g Z-pGlu-OH溶解在400mL THF中。用干冰-乙醇将所
得溶液冷却至-20℃。向溶液中滴加22.0mL N-甲基吗啉和26.4mL氯
甲酸异丁基酯，然后将混合物在-20℃搅拌1分钟，从而产生混合酸酐。
将25.3g HOSu加到所得反应混合物中然后搅拌30分钟。接着将溶解
在400mL水中的62.9g H-His-OH·HCl和28.0mL三乙胺(TEA)的溶
液加到混合物中。在0℃搅拌1小时及室温搅拌过夜后，减压浓缩反
应混合物。用乙酸乙酯洗涤剩余水溶液，并用正丁醇萃取水相。用水
洗涤萃取液几次，然后减压浓缩正丁醇相。用乙醚固化剩余物后，将
之溶解在水中并将pH调至5。将溶液装入填充HP-20的柱(5.0×20cm)
上，用水洗涤直到洗脱液的Pauli反应显示±，并用甲醇洗脱。减压浓
缩洗脱出的甲醇液。用乙醚处理剩余物，然后从甲醇-乙醚中重结晶。
从而得到59.5g Z-pGlu-His-OH(产率74.3％)。
Z-pGlu-His-OH的熔点，旋光度，TLC的Rf和元素分析如下：
m.p.： 146-149℃(分解)
[α]D： -0.91(c＝1.0，DMF)
Rf： 0.14(BuOH/AcOH/H2O＝4/1/5)
元素分析(C19H20N4O6)
计算值 C：57.00％ H：5.03％ N：13.99％
实测值 C：57.23％ H：5.05％ N：14.05％
(1-8)Z-pGlu-His-Trp-OMe的制备
将在上述(1-7)中制备的40.0g Z-pGlu-His-OH、19.6g H-Trp-
Ome·HCl和12.7g HOSu溶解在100mL DMF中，在冷却下用N-甲
基吗啉中和所得溶液，加入2.0mL WSC，然后将混合物在0℃搅拌5
分钟并在室温搅拌过夜。用茚三酮证实后，减压浓缩反应混合物。向
剩余物中加入200mL乙酸乙酯-正丁醇(1∶1)然后用100mL水洗涤
有机相3次。减压浓缩有机相。通过用乙醚处理使剩余物固化。从而
得到48.5g Z-pGlu-His-Trp-OMe(产率92.3％)。
Z-pGlu-His-Trp-OMe的熔点，旋光度，TLC的Rf和元素分析如
下：
m.p.： 112-115℃(分解)
[α]D： -1.5(c＝1.0，DMF)
Rf：0.3(BuOH/AcOH/H2O＝4/1/5)
元素分析(C31H32N6O7)
计算值 C：61.99％ H：5.37％ N：13.99％
实测值 C：61.54％ H：5.33％ N：13.80％
(1-9)pGlu-His-Trp-OMe的制备
将在上述(1-8)中制备的40.0g Z-pGlu-His-OMe溶解在50mL
DMF中。在500mg 10％钯/炭存在下将氢气通入溶液。接着在室温搅
拌混合物7小时，从溶液中除去催化剂，然后减压浓缩滤液。通过用
乙醚处理使剩余物固化。从而得到28.5g pGlu-His-Trp-OMe(产率
91.8％)。
pGlu-His-Trp-OMe的熔点，旋光度，TLC的Rf和元素分析如下：
m.p.： 132-137℃(分解)
[α]D： +4.1(c＝1.0，DMF)
Rf： 0.18(BuOH/AcOH/H2O＝4/1/5)
元素分析(C23H26N6O5)
计算值 C：59.22％ H：5.62％ N：18.02％
实测值 C：59.01％ H：5.55％ N：17.89％
(1-10)H-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的制备
将在上述(1-6)中制备的93.0g Z-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-
Pro-NHEt溶解在800mL甲醇中，然后在在5.0g 10％钯/炭存在下将
氢气通入溶液。在室温搅拌混合物7小时后，从溶液中除去催化剂，
然后减压浓缩滤液。通过用乙醚处理使剩余物固化。从而得到74.0g
H-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt(产率90.3％)。
H-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的熔点，旋光度，TLC
的Rf和元素分析如下：
m.p.： 124-128℃(分解)
[α]D： +10.1(c＝1.0，DMF)
Rf： 0.16(BuOH/AcOH/H2O＝4/1/5)
元素分析(C38H64N10O9)
计算值 C：56.70％ H：8.01％ N：17.40％
实测值 C：56.55％ H：7.97％ N：17.18％
(1-11)pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的制
备
将在上述(1-9)中制备的30g pGlu-His-Trp-OMe和在上述(1-10)
中制备的22g H-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt溶解在1300mL
正丁醇饱和的水中。用1M盐酸或氨水将溶液pH调节至7.8。向溶液
中加入在2.5mL正丁醇饱和水中溶解有78mg胰凝乳蛋白酶
(1000U/mg)而得的溶液，然后将混合物在10℃搅拌1小时。将300mL正
丁醇加到反应混合物中以便使合成的肽在水和正丁醇之间进行分配从
而分离出下层(水相)和上层(正丁醇相)。将200mL正丁醇加到下层，
重复相同的分离色谱3次。用100mL水洗涤上层5次，分别浓缩有
机相和水相，然后分别用乙醚固化。从水相中回收的H-Ser-Tyr-D-
Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt将再循环至反应中。浓缩有机相(正丁醇)
层，将乙醚加到剩余物中以成粉末。
将从有机相得到的粉末溶解在0.01M乙酸铵水溶液中，然后将
溶液装入填充CM-纤维素的柱(4×30cm)。用0.01M至0.1M的乙酸
铵水溶液(pH4.4，500mL)进行线性梯度洗脱(60mL/小时)并将洗脱液分
成10mL的等份。用高效液相色谱分析各洗脱液。合并目标流出液并
冻干。从而得到22.4g pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-
NHEt(产率74.9％)。
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的旋光度、
元素分析和氨基酸组成如下：
[α]D： -46.0(C＝1.0，H2O)
元素分析(C60H86N16O13·CH3COOH·H2O)
计算值 C：55.76％ H：7.09％ N：16.78％
实测值 C：55.60％ H：7.10％ N：16.79％
氨基酸组成：
Ser 2.05(2)，Glu 1.08(1)，Pro 0.99(1)，Leu 1.09(1)，Tyr 0.92(1)
His 0.93(1)，Arg 1.06(1)
(1-12)用固定化酶合成pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-
Arg-Pro-NHEt
(1)pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的合成
将在上述(1-9)中所述制备的2.00gpGlu-His-Trp-OMe和在上述(1
-10)中制备的1.3g H-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt溶解在
200mL水中。然后用1M盐酸或氨水将溶液pH调节至7.8。向溶液
中悬浮2.5g固定化胰凝乳蛋白酶(琼脂糖载体，2000U/mg)，然后在证
实了混合物的pH为7.8后，将混合物在10℃搅拌1小时。通过玻璃
过滤器过滤反应混合物而除去固定化胰凝乳蛋白酶。
浓缩滤液并装入填充CM-纤维素的柱(4x30cm)。用0.01M至0.1M
的乙酸铵水溶液(pH4.4，500mL)的线性梯度进行洗脱(60mL/小时)并将
洗脱液分成10mL的等份。用HPLC分析洗脱液。合并目标流出液并
冻干。从而得到1.45g pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-
NHEt(产率82.4％)。
所得化合物的熔点，旋光度，TLC的Rf值和元素分析与在(1-11)
中所述制备的pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的
那些值相同。
(2)底物特异性研究
在如上述酶反应条件下，进行用如表1所示的肽作为底物的反
应。反应2小时后，用HPLC分析合成的肽。从每个峰面积计算产率。
表1
所用底物 产率(％)
pGlu-His-Trp-OMe+H-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg- 78.8
Pro-NHEt
pGlu-His-D-Trp-OMe+H-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu- 0.0
Arg-Pro-NHEt
pGlu-D-His-Trp-OMe+H-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu- 7.8
Arg-Pro-NHEt
pGlu-His-Trp-OMe+H-D-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu- 0.0
Arg-Pro-NHEt
如表1所示，当使用其中Trp(酶的识别部位)具有D构型的底物
时，产率为0％，反应根本不进行。当使用其中His(其与酶识别部位
的N-末端邻接)具有D构型的底物时，产率低至7.8％，但是证实产
物是存在的。当使用其中Ser(酶结合部位)具有D构型的底物时，产
率再次为0％并且反应根本不进行。
因此，说明当使用酶法合成时，由于酶对底物的特异性Ser和His
的外消旋化难于发生，因此可以获得具有高旋光纯度的产物。
实施例2
在该实施例中，用实施例1的相同方式制备pGlu-His-Trp-Ser-
Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt，只是根据下列(2-1)至(2-3)来制
备根据实施例1中的(1-1)至(1-3)制备的Z-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-
NHEt。
(2-1)Z-Leu-Arg-NHNH2的制备
将172.5g Z-leu-OH和178.9g H-Arg-Oet·2HCl加到800mL
DMF/THF(1/1)混合溶液中。在0℃通过加入143mL N-甲基吗啉来中
和溶液。接着向溶液中加入147.5mL DCC然后在0℃搅拌5分钟并再
在室温搅拌15小时。减压浓缩反应溶液然后向所得剩余物中加入
1000mL水。用500mL乙酸乙酯洗涤产物2次后，用1000mL正丁
醇萃取水相3次。减压浓缩正丁醇相得到Z-Leu-Arg-OEt。
将Z-Leu-Arg-OEt溶解在500mL甲醇中。在用冰冷却溶液下加
入150mL NH2NH2·H2O，然后将混合物在室温搅拌18小时。减压浓
缩反应混合物，向所得剩余物中加入500mL水，然后用1000mL正
丁醇萃取水相5次。用500mL水洗涤萃取液4次然后减压浓缩。通
过用乙醚处理使所得剩余物固化，然后进行干燥。从而得到209.7g Z-
Leu-Arg-NHNH2(产率74.1％)。
Z-Leu-Arg-NHNH2的熔点，旋光度，TLC的Rf和元素分析如下：
m.p.： 105-107℃
[α]D： -30.6(c＝1.0，MeOH)
Rf： 0.60(BuOH/AcOH/H2O＝4/1/5)
元素分析(C20H33N7O4)
计算值 C：55.61％ H：7.64％ N：22.51％
实测值 C：55.84％ H：7.42％ N：22.41％
(2-2)Z-Leu-Arg-Pro-NHEt的制备
将在上述(2-1)中制备的130.8g Z-Leu-Arg-NHNH2溶解在500mL
DMF中并用干冰-乙醇将溶液冷却至-20℃。向溶液中加入225mL 4N
HCl-二噁烷和40.5mL亚硝酸异戊酯以便得到叠氮化合物。再加入
126mL三乙胺以中和混合物。将被中和的混合物转移至含有42.6g H-
Pro-NHEt的200mL DMF中，在-20℃搅拌2小时并在4℃搅拌16小
时并浓缩。向剩余物中加入800mL水，然后用400mL乙酸乙酯洗涤
混合物2次。用800mL丁醇萃取水相3次，然后用400mL水洗涤。
减压浓缩所得正丁醇相。通过用乙醚处理使所得剩余物固化，然后进
行干燥。得到154.5g Z-Leu-Arg-Pro-NHEt(产率94.3％)。
Z-Leu-Arg-Pro-NHEt的熔点，旋光度，TLC的Rf和元素分析如
下：
m.p.： 125-126℃
[α]D： -66.6(c＝1.0，MeOH)
Rf： 0.45(BuOH/AeOH/H2O＝4/1/5)
元素分析(C27H43N7O5)
计算值 C：59.43％ H：7.94％ N：17.97％
实测值 C：59.31％ H：7.78％ N：18.13％
(2-3)Z-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的制备
将如上述(2-2)中制备的154.5g Z-Leu-Arg-Pro-NHEt溶解在
1500mL甲醇中，并在14g 10％钯/炭存在下将氢气通入溶液。将混合
物在室温搅拌16小时，然后从混合物中除去催化剂。减压浓缩所得
滤液得到H-Leu-Arg-Pro-NHEt。
将82.3g Z-D-Ser(But)-OH溶解在200mL THF中。用干冰-乙醇
将溶液冷却至-20℃。接着依次滴加30.7mL N-甲基吗啉和36.3mL氯
甲酸异丁基酯，然后在-20℃搅拌反应溶液1分钟，从而得到混合酸酐。
将所得反应混合物与含有H-Leu-Arg-Pro-NHEt的700mL DMF溶液混
合，然后在0℃搅拌5分钟并在室温搅拌30分钟。接着减压浓缩反应
混合物，并向剩余物中加入1000mL水。用500mL乙酸乙酯洗涤混
合物2次并用1000mL乙酸乙酯/正丁醇(2∶1)的混合溶液萃取2次。
用500mL水洗涤萃取液5次并减压浓缩。通过用乙醚处理使所得剩
余物固化然后干燥。从而得到178.3g D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt(产
率91.2％)。
所得化合物的熔点，旋光度，TLC的Rf值及元素分析与在实施
例1(1-3)中所述制备的D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的那些值相同。
实施例3
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt的制备
(3-1)Boc-D-Leu-Leu-Arg(Tos)-Pro-NHEt的制备
将在实施例1(1-2)中制备的20.99g Z-Leu-Arg(Tos)-Pro-NHEt溶
解在200mL甲醇中，然后在1.5g 10％钯/炭存在下向溶液中通入氢气。
将混合物在室温搅拌7小时，除去催化剂，然后减压浓缩滤液。通过
用乙醚处理使剩余物固化。从而得到H-Leu-Arg(Tos)-Pro-NHEt。
将H-Leu-Arg(Tos)-Pro-NHEt溶解在80mL DMF和200mL THF
中。在冷却下用N-甲基吗啉中和溶液。向溶液中加入在200mL THF
中溶解有8.86g Boc-D-Leu-OH和23.02g HOSu而得的溶液和36.4mL
WSC。接着将混合物在0℃搅拌5分钟及在室温搅拌过夜。用茚三酮
证实后，减压浓缩反应混合物。向剩余物中加入500mL水，然后用
200mL正丁醇萃取5次并用水洗涤5次。减压浓缩正丁醇相，然后通
过用乙醚处理使剩余物固化。从而得到21.5g Boc-D-Leu-Leu-
Arg(Tos)-Pro-NHEt(产率92.1％)。
Boc-D-Leu-Leu-Arg(Tos)-Pro-NHEt的熔点，旋光度，TLC的Rf
和元素分析如下：
m.p.： 119-121℃
[α]D： -45.2(c＝1.0，MeOH)
Rf： 0.50(BuOH/AcOH/H2O＝4/1/5)
元素分析(C30H56N8O6)
计算值 C：57.67％ H：9.03％ N：17.93％
实测值 C：57.43％ H：8.89％ N：17.80％
(3-2)Z-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(Tos)-Pro-NHEt的制备
将在上述(3-1)中制备的25.8g Boc-D-Leu-Leu-Arg(Tos)-Pro-
NHEt溶解在10mL DCM中。加入10mL TFA，同时用冰冷却溶液，
然后将混合物在室温搅拌30分钟。接着减压浓缩反应混合物，向剩
余物中加入200mL乙醚以便固化，然后干燥产物。从而得到H-D-
Leu-Leu-Arg(Tos)-Pro-NHEt·TFA。
将16.6g Z-Ser-Tyr-NHNH2溶解在100mL的DMF中，并用干冰-
乙醇冷却至-20℃。向溶液中加入29.8mL 4N HCl-二噁烷和5.3mL亚
硝酸异戊酯以便得到叠氮化合物。将用16.7mL三乙胺中和的混合物
转移至含有H-D-Leu-Leu-Arg(Tos)-Pro-NHEt·TFA的200mL DMF中，
在-20℃搅拌2小时并在4℃搅拌17小时并浓缩。向剩余物中加入500mL
水，然后用200mL正丁醇萃取混合物5次并用水洗涤5次。减压浓
缩所得正丁醇相。通过用乙醚处理使所得剩余物固化。得到25.0g Z-
Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(Tos)-Pro-NHEt(产率83.2％)。
Z-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(Tos)-Pro-NHEt的熔点，旋光度，TLC
的Rf和元素分析如下：
m.p.： 114-118℃(分解)
[α]D： -30.1(c＝1.0，DMF)
Rf： 0.32(BuOH/AcOH/H2O＝4/1/5)
元素分析(C45H68N10O10)
计算值 C：59.45％ H：7.54％ N：15.41％
实测值 C：59.33％ H：7.52％ N：15.32％
(3-3)H-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt的制备
向如(3-2)中所述制备的20.4g Z-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(Tos)-
Pro-NHEt中加入32mL茴香醚，然后用干冰-乙醇冷却至-70℃，向
混合物中加入200mL HF并在0℃搅拌1小时。接着减压浓缩反应混
合物。用乙醚处理剩余物。过滤沉淀的产物，然后在氢氧化钠上真空
干燥产物。从而得到16.0g H-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt(产率
92.4％)。
H-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt的熔点，旋光度，TLC的Rf
和元素分析如下：
m.p.： 121-123℃
[α]D： +11.0(c＝1.0，DMF)
Rf： 0.20(BuOH/AcOH/H2O＝4/1/5)
元素分析(C37H62N10O8)
计算值 C：57.35％ H：8.06％ N：18.07％
实测值 C：57.21％ H：8.01％ N：18.10％
(3-4)pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt的制备
按实施例1(1-11)相同的方式得到1.33g(产率76.4％)的pGlu-
His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt，其中只是用在上述(3-3)
中制备的1.30g H-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt代替了H-Ser-Tyr-
D-Ser(But)-leu-Arg-Pro-NHEt。
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt的旋光度、元素
分析和氨基酸组成如下：
[α]D： -32.0(c＝0.52，5％AcOH)
元素分析(C59H84N16O12)
计算值 C：58.59％ H：7.00％ N：18.53％
实测值 C：58.40％ H：7.10％ N：18.31％
氨基酸组成；
Ser 1.05(1)，Glu 1.08(1)，Pro 0.99(1)，Leu 2.09(2)，Tyr 0.92(1)，
His 0.93(1)，Arg 1.06(1)
实施例4
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-leu-Arg-Pro-Azgly-NH2的制备
(4-1)Z-Pro-Azgly-NH2的制备
将24.9g Z-Pro-OH、11.2g半卡巴肼盐酸盐和14.5mL三乙胺溶
解在200mL DMF中。向冷却至0℃的该溶液中加入20.6g DCC并将
混合物在4℃搅拌16小时。接着从反应混合物中滤出二环己基脲
(DCU)，并减压浓缩滤液。向剩余物中加入500mL乙酸乙酯，并用
200mL水洗涤混合物2次并减压浓缩，然后通过用乙醚处理使剩余物
固化。从而得到16.7g Z-Pro-Azgly-NH2(产率54.3％)。
Z-Pro-Azgly-NH2的熔点，旋光度，TLC的Rf和元素分析如下：
m.p.： 189-190℃(分解)
[α]D： -43.6(c＝1.4，DMF)
Rf： 0.62(BuOH/AcOH/H2O＝4/1/5)
元素分析(C14H18N4O4)
计算值 C：54.89％ H：5.95％ N：18.29％
实测值 C：54.41％ H：7.74％ N：15.60％
(4-2)Boc-Arg(NO2)-Pro-Azgly-NH2的制备
将上述(4-1)中制备的16.5g Z-Pro-Azgly-NH2溶解在500mL DMF
中，然后在1.1g 10％钯/炭存在下向溶液中通入氢气。将混合物在室
温搅拌7小时，除去催化剂，然后减压浓缩滤液。加入1500mL乙醚
至剩余物中以固化产物然后干燥。从而得到H-Pro-Azgly-NH2·TFA。
将13.5g Boc-Arg(NO2)-OH溶解在100mL THF中。用干冰-乙醇
将溶液冷却至-20℃。然后依次向溶液中滴加3.3mL N-甲基吗啉和
3.96mL氯甲酸异丁基酯，将该混合物在-20℃搅拌1分钟，从而产生
混合酸酐。将所得反应混合物与200mL含有H-Pro-Azgly·TFA的
DMF溶液(用N-甲基吗啉中和过)混合，然后将混合物在0℃搅拌5
分钟及在室温搅拌30分钟。减压浓缩混合物。将500mL水加到剩余
物中然后用200mL正丁醇萃取混合物5次。用水洗涤萃取液5次。
减压浓缩正丁醇相，用乙醚处理使剩余物固化。从而得到16.7g Boc-
Arg(NO2)-Pro-Azgly-NH2(产率88.6％)。
Boc-Arg(NO2)-Pro-Azgly-NH2的熔点，旋光度，TLC的Rf和元
素分析如下：
m.p.： 135-137℃(分解)
[α]D： +35.3(c＝1.0，DMF)
Rf： 0.49(BuOH/AcOH/H2O＝4/1/5)
元素分析(C17H31N9O7)
计算值 C：43.12％ H：6.60％ N：26.62％
实测值 C：54.41％ H：7.74％ N：15.60％
(4-3)Z-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azgly-NH2(SEQ ID NO：2)
将上述(4-2)中制备的110.54g Boc-Arg(NO2)-Pro-Azgly-NHEt溶
解在150mL DCM中。在用冰冷却下向溶液中加入150mL TFA并将混
合物在室温搅拌30分钟。接着减压浓缩反应混合物，向剩余物中加
入1500mL乙醚以固化产物，然后干燥。从而得到H-Arg(NO2)-Pro-
NHEt·TFA。
将H-Arg(NO2)-Pro-NHEt·TFA溶解在80mL DMF和200mL THF
的混合物中。在冷却的同时用N-甲基吗啉中和溶液。接着向溶液中
加入在200mL THF中溶解有53.06g Z-Leu-OH(0.2mol)和23.02g
HOSu(0.22mol)而得的溶液和36.4mL(0.2mol)WSC，并将混合物在0
℃搅拌5分钟然后在室温搅拌过夜。用茚三酮证实后，减压浓缩反应
混合物。向剩余物中加入1500mL乙酸乙酯，依次用500mL水和
500mL饱和盐水溶液各洗涤混合物2次。然后减压浓缩乙酸乙酯相，
通过用乙醚处理使剩余物固化并干燥产物。从而得到27.52g Z-Leu-
Arg(NO2)-Pro-Azgly-NH2(SEQ ID NO：2)(产率98.6％)。
Z-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azgly-NH2的熔点，旋光度，TLC的Rf和元
素分析如下：
m.p.： 88-90℃
[α]D： -30.2(c＝1.5，DMF)
Rf： 0.57(BuOH/AcOH/H2O＝4/1/5)
元素分析(C26H40N10O8)
计算值 C：50.31％ H：6.50％ N：22.57％
实测值 C：50.24％ H：6.41％ N：22.45％
(4-4)Z-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2的制备
将在上述(4-3)中制备的16.5g Z-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azgly-
NH2(SEQ ID NO：2)溶解在500mL DMF中，并在1.1g 10％钯/炭存在下
向溶液中通入氢气。将混合物在室温搅拌7小时，除去催化剂，然后
减压浓缩滤液。加入1500mL乙醚至剩余物中以将之固化然后干燥产
物。从而得到H-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2(SEQ ID NO：3)。
将8.86g Z-D-Ser(But)-OH溶解在100mL THF中。用干冰-乙醇
将溶液冷却至-20℃。然后依次向溶液中滴加3.3mL N-甲基吗啉和
3.96mL氯甲酸异丁基酯。将该混合物在-20℃搅拌1分钟，从而产生
混合酸酐。将所得反应混合物与200mL含有H-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2
的DMF溶液(用N-甲基吗啉中和过)混合，然后将混合物在0℃搅拌
5分钟及在室温搅拌30分钟，最后减压浓缩反应混合物。将500mL水
加到剩余物中然后用200mL正丁醇萃取混合物5次。用水洗涤萃取
液5次后，减压浓缩正丁醇相，用乙醚处理使剩余物固化。从而得到
16.9g Z-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2(产率78.3％)。
Z-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2的熔点，旋光度，TLC的Rf
和元素分析如下：
m.p.： 115-118℃
[α]D： -45.8(c＝1.0，DMF)
Rf： 0.51(BuOH/AcOH/H2O＝4/1/5)
元素分析(C33H54N10O8)
计算值 C：55.14％ H：7.57％ N：19.48％
实测值 C：55.01％ H：7.42％ N：19.33％
(4-5)Z-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2的制备
将在上述(4-4)中制备的26.7g Z-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-
NH2溶解在500mL甲醇中，并在1.9g 10％钯/炭存在下向溶液中通入
氢气。将混合物在室温搅拌7小时，除去催化剂，然后减压浓缩滤液。
用乙醚处理剩余物，过滤出沉淀的产物，然后用氢氧化钠真空干燥。
从而得到H-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2。
将在上述实施例1(1-5)中制备的18.5g Z-Ser-Tyr-NHNH2溶解在
150mL DMF中，然后用干冰-乙醇冷却溶液至-20℃，。向溶液中加
入33.4mL HCl-二噁烷和6.0mL亚硝酸异戊酯以便得到叠氮化合
物。接着加入18.7mL三乙胺以便中和反应混合物。将混合物转移至
含有H-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NH2的150mL DMF溶液中，在-20℃
将混合物搅拌2小时然后在4℃搅拌17小时并浓缩。接着向剩余物中
加入500mL水，并用200mL正丁醇萃取产物5次。用水洗涤萃取液
5次，减压浓缩正丁醇相，最后用乙醚处理剩余物以进行固化。从而
得到28.3g Z-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2(产率78.6％)。
Z-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2的熔点，旋光度，
TLC的Rf和元素分析如下：
m.p.： 110-113℃(分解)
[α]D： -28.2(c＝1.0，DMF)
Rf： 0.36(BuOH/AcOH/H2O＝4/1/5)
元素分析(C45H68N12O12)
计算值 C：55.77％ H：7.07％ N：17.34％
实测值 C：55.64％ H：7.01％ N：17.29％
(4-6)H-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2的制备
将在上述(4-5)中制备的25.4g Z-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-
Pro-Azgly-NH2溶解在500mL甲醇中，并在1.3g 10％钯/炭存在下向
溶液中通入氢气。将混合物在室温搅拌7小时，除去催化剂，然后减
压浓缩滤液。通过用乙醚处理剩余物使剩余物固化。从而得到H-Ser-
Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2(产率94.6％)。
H-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2的熔点，旋光度，
TLC的Rf和元素分析如下：
m.p.： 120-122℃
[α]D： +11.2(c＝1.0，DMF)
Rf： 0.31(BuOH/AcOH/H2O＝4/1/5)
元素分析(C37H62N12O10)
计算值 C：53.22％ H：7.48％ N：20.13％
实测值 C：53.19％ H：7.43％ N：20.01％
(4-7)pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2的
制备
按实施例1(1-11)相同的方式制备1.29g(产率75.9％)pGlu-His-
Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2，其中只是用上述(4-
6)中制备的1.3g H-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2代替了
H-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt。
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2的旋光
度、元素分析和氨基酸组成如下：
[α]D： -52.4(c＝1.0，DMF)
元素分析(C59H84N18O14)
计算值 C：55.82％ H：6.67％ N：19.86％
实测值 C：55.70％ H：6.55％ N：19.72％
氨基酸组成；
Ser 2.02(2)，Glu 1.07(1)，Pro 1.00(1)，Leu 1.03(1)，Tyr 0.92(1)，
His 0.94(1)，Arg 1.02(1)
实施例5
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2的制备
(5-1)H-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2的制备
用Milligen Bioresearch Corporation制造的肽合成器9600进行固
相合成。
首先，将对-甲基二苯甲胺(MBHA)树脂(PEPTIDE INSTITUTE，
INC.，氨基0.72mmol/g)放入反应容器中用于肽固相合成，并在氩气流
及搅拌下依次用8mL DCM(4次，每次1分钟)，含有60％TFA的8mL
DCM溶液(20分钟)，4mL DCM(3次，每次15秒)，含有1mL DIEA
的3mL DMF溶液(两次，每次1分钟)，及8mL DMF(6次，每次40
秒)处理。在各处理后均进行过滤。
另-方面，将2mmol相应于氨基酸序列pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-
Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2的第10个氨基酸残基的Boe-Gly-OH溶解在
4mL DCM中。将该溶液放在氨基酸活化器中，向溶液中加入3mL
DCC(0.5M-DCM溶液)和4mL HOBt(0.5M-DCM溶液)，然后使混合物
反应30分钟。将反应混合物过滤并转移至浓缩容器中。然后向混合
物中加入3mL DMF，在氩气流下蒸馏除去DCM。接着将其中加入了
3mL DMF的剩余物转移至所述反应容器中用于肽固相合成，然后允
许反应进行30分钟。用8mL DCM(6次，每次20秒)洗涤产物。将2mmol
Boc-Gly-OH溶解在4mL DCM中，实施所谓的双偶合方法，其中类似
的操作在氨基酸活化容器中重复。然后过滤出产物，从而得到BoC-
Gly-MBHA树脂。
然后将得到Boc-Gly-MBHA树脂用8mL DCM(4次，每次1分钟)
洗涤然后过滤。在氩气气氛中及搅拌下依次用含有60％TFA的8mL
DCM溶液(20分钟)，4mL DCM(3次，每次15秒)，含有1mL DIEA
的3mL DMF溶液(两次，每次1分钟)，和8mL DMF(6次，每次40
秒)处理。另外，在每次处理后均进行过滤。
接着将2mmol相应氨基酸序列pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-
Arg-Pro-Gly-NH2的第9个氨基酸残基的Boc-Pro-OH溶解在4mL DCM
中。向氨基酸活化器中的溶液中加入1.5mL DCC(0.5M-DCM溶液)然
后使混合物反应7分钟。过滤反应混合物并转移至浓缩容器中。然后
向反应混合物中加入3mL DMF，在氩气流下蒸馏除去DCM。接着将
其中加入了3mL DMF的剩余物转移至所述反应容器中用于肽固相合
成，然后允许反应进行30分钟。用8mL DCM(6次，每次20秒)洗涤
产物，然后过滤，从而得到Boc-Pro-Gly-MBHA树脂。
如下表2所示，用氨基被保护的氨基酸依次偶合第8至4位的氨
基酸。
表2
氨基酸次序 被保护的氨基酸 用量(mmol)
8 Boc-Arg(Tos)-OH 2×2
7 Boc-Leu-OH 2
6 Boc-D-Trp-OH 2
5 Boc-Tyr(Bzl)-OH 2
4 Boc-Ser(Bzl)-OH 2
在上述固相合成中，当使用Arg时进行双偶合。因此，得到2.76g
保护的肽-MBHA树脂，Boc-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-D-Trp-Leu-Arg(Tos)-
Pro-Gly-MBHA。
向上述2.76g保护的肽-MBHA树脂中依次加入5mL茴香醚和
25mL氢氟酸酐，然后将产物在0℃搅拌1小时。反应后，减压蒸出
氢氟酸酐，然后用乙醚洗涤剩余物。从而得到1.30g H-Ser-Tyr-D-Trp-
Leu-Arg-Pro-Gly-NH2。
H-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2的旋光度，TLC的Rf和
元素分析如下：
[α]D： -50.4(c＝1.0，MeOH)
Rf： 0.13(BuOH/AcOH/H2O＝4/1/5)
元素分析(C59H84N16O12·AcOH·2H2O)
计算值 C：54.31％ H：7.04％ N：17.27％
实测值 C：54.20％ H：6.89％ N：16.97％
(5-2)pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2的制备
按实施例1(1-11)相同的方式制备1.26g(产率75.45％)pGlu-His-
Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，其中只是用上述(5-1)中制
备的1.30g H-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2代替了H-Ser-Tyr-D-
Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt。
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2的旋光度、元
素分析和氨基酸组成如下：
[α]D： -56.6(c＝1.0，H2O)
元素分析(C64H82N18O13·AcOH·2H2O)
计算值 C：56.32％ H：6.44％ N：17.91％
实测值 C：56.20％ H：6.38％ N：16.97％
氨基酸组成；
Ser 0.98(1)，Glu 1.07(1)，Gly 1.01(1)，Pro 0.99(1)，Leu 1.00(1)，
Tyr 0.92(1)，His 0.95(1)，Arg 1.08(1)
实施例6
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-(2-萘基)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2的制
备
(6-1)H-Ser-Tyr-(2-萘基)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2的制备
按实施例5(5-1)相同方式处理得到0.98g H-Ser-Tyr-(2-萘基)-D-
Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，其中只是用Boc-D-(2-萘基)-D-Ala-OH代
替了相应第6个氨基酸残基的Boc-D-Trp-OH。
H-Ser-Tyr-(2-萘基)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2的旋光度，TLC
的Rf及元素分析如下：
[α]D： -44.1(c＝1.0，MeOH)
Rf： 0.15
元素分析(C47H66N12O10)
计算值 C：58.86％ H：6.94％ N：17.52％
实测值 C：58.72％ H：6.88％ N：17.49％
(6-2)pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-(2-萘基)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
的制备
按实施例1(1-11)相同的方式制备0.93g(产率76.2％)pGlu-His-
Trp-Ser-Tyr-(2-萘基)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，其中只是用上述(6
-1)中制备的0.98g H-Ser-Tyr-(2-萘基)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2代
替了H-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt。
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-(2-萘基)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2的旋
光度、元素分析和氨基酸组成如下：
[α]D： -50.3(c＝1.0，H2O)
元素分析(C69H88N18O14)
计算值 C：59.47％ H：6.37％ N：18.09％
实测值 C：59.40％ H：6.33％ N：17.98％
氨基酸组成；
Ser 0.98(1)，Glu 1.05(1)，Gly 1.00(1)，Pro 1.03(1)，Leu 1.00(1)，
Tyr 0.93(1)，His 0.94(1)，Arg 1.07(1)
实施例7
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(SEQ ID NO：1)的
制备
(7-1)H-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(SEQ ID NO：4)的制备
按实施例5(5-1)相同方式处理得到1.12g H-Ser-Tyr-Gly-Leu-
Arg-Pro-Gly-NH2(SEQ ID NO：4)，其中只是用Boc-Gly-OH代替了相应
于第6个氨基酸残基的Boc-D-Trp-OH。
H-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2的旋光度，TLC的Rf及元
素分析如下：
[α]D： -40.1(c＝1.0，MeOH)
Rf： 0.10(BuOH/AcOH/H2O＝4/1/5)
元素分析(C33H53N11O9)
计算值 C：53.00％ H：7.14％ N：20.60％
实测值 C：53.20％ H：6.89％ N：20.97％
(7-2)pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(SEQ ID
NO：1)的制备
按实施例1(1-11)相同的方式制备1.16g(产率76.3％)pGlu-His-
Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(SEQ ID NO：1)，其中只是用上
述(7-1)中制备的1.12g H-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(SEQ ID
NO：4)代替了H-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt。
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2的元素分析和氨
基酸组成如下：
元素分析(C55H75N17O13·AcOH·2H2O)
计算值 C：53.55％ H：6.54％ N：18.63％
实测值 C：53.85％ H：6.89％ N：18.97％
氨基酸组成；
Ser 1.01(1)，Glu 1.03(1)，Gly 2.01(2)，Pro 0.98(1)，Leu 1.01(1)，
Tyr 0.94(1)，His 0.94(1)，Arg 1.08(1)