我国药材资源丰富，据统计有1.2万余种，其中药用动植物占99％。现行使
用的中药材许多品种来源复杂，互混、互代现象屡有可见。近年来，由于经济
利益的驱使，药材伪、混品种的数量有增无减。为确保中药使用安全、有效，
对各种药材进行准确地鉴定十分重要。传统上是用经典的形态分类和解剖学特
征来进行中药品种的鉴定，这种鉴定方法的结果正确与否，很大程度上受检验
人员经验的影响，对一些人为加工伪装的假药材常感到真假难辨。特别是动物
类药材鉴定一直是中药鉴定中的一大难题，无论是传统的性状鉴别还是在近几
十年逐步发展起来的各种理化鉴别，均不能很好地解决药材鉴定的问题。随着
现代分子生物学技术的迅猛发展，分子遗传标记技术在医学、农学、动植物品
种鉴定等领域中得到越来越广泛的应用。已有将这一高科技手段应用于中药鉴
定中的研究文献报道(见Akio Hashimoto et al,Studies on“Signal”
constituents for Evaluation of Animal Crude Drugs.Ⅳ:Application of DNA
analytical technique to quality evaluation of medicines containing animal
crude drugs,Natural Medicines,1998,52:38；邵鹏柱等，运用基因技术
鉴定中药材，药物食品分析，1997,5:273；王义权等，中药材乌梢蛇及其混
淆品的DNA序列分析鉴别，药学学报，1999,34:67)，虽已取得了一些成果，
但由于采用的中药鉴定手段复杂、检测成本过高、某些具体的检测方法重现性
差，因而实际应用困难，这也是迄今DNA分子标记鉴别手段一直未能在药品检
验的实践中真正应用的原因。
本发明的目的就是为了解决动物中药材乌梢蛇、龟板、蛤士蟆油的真伪鉴
别难的问题。我们在对上述三种动物药材的DNA分子标记鉴别研究中，设计了
分别用于鉴别乌梢蛇、龟板、蛤士蟆油真伪的三对高特异性引物，用每一对引
物对药材中的DNA进行一次简单的多聚酶链式反应(PCR)，便可准确地鉴定出
受试药材的真伪。用这种引物可以制造用于这些药材鉴定的试剂盒，对于各地
市药检部门和从事中药材生产、销售的部门快速准确地鉴定这些药材，搞好质
量控制，打击假冒伪劣，净化药材市场将是十分有效的。
本发明的目的是通过如下的技术方案得以实现的：我们广泛收集了中药材
流通领域中乌梢蛇、龟板、蛤士蟆油正品药材及其各种伪混品，同时采集相应
的原动物标本。首先从各原动物样品中提取总DNA，用PCR方法扩增多个基因
片段并分别纯化，然后对各纯化后的基因片段进行DNA测序分析，建立上述三
种动物药材及其伪、混品原动物的DNA序列数据库，在比较数据库的基础上，
选择合适的DNA区段，针对各药材伪、混品出现的情况，分别设计乌梢蛇、龟
板和蛤士蟆油的鉴定引物，使每一对鉴定引物，在给定的PCR条件下，只能特
异性地扩增正品药材中该基因片段，而对任何非正品药材中提得的DNA均不能
扩增出该基因片段。当受试样品用本鉴定引物进行PCR扩增后，经凝胶电泳后
观察有无扩增条带的出现，便可准确地鉴定出样品的真伪。
本发明的核心部分是下列三对正品药材鉴定引物的DNA序列：
乌梢蛇正品鉴定引物：
引物1 5′-CACAGCCAACATCAACCTTGCCTTTTCGTTA-3′
引物2 5′-CTGATAGTCAGACATTTTTGTTTAGATAG-3′
龟板正品鉴定引物：
引物1 5′-CACCAGCTTACCCCATGAGGGCTCA-3′
引物2 5′-GCGCACCTCAGGACCGACTTAGGTT-3′
蛤士蟆油正品鉴定引物：
引物1 5′-CCCGATTCACCTAACCATCCTCTTCA-3′
引物2 5′-CCAGAGCCGGGTTAAAAAGAACAGCTAT-3′
用全自动DNA合成仪按上述三种动物药材鉴定引物的DNA序列进行合成，
即可得到本发明的各种鉴定引物白色粉末结晶。
用本鉴定引物按下列方法可对上述三种动物药材进行高特异性PCR鉴别：
1．药材DNA提取：按常规进行，用无离子水将受试样品(即需鉴别的某
药材)模板DNA浓度调节至0.2-0.5μg/μl。
2．鉴别PCR：引物浓度用无离子水溶解调节至0.06μg/μl。
反应体积均为30μl，
10×Taq DNA聚合酶缓冲液 3μl
2.5mM dNTPs 2μl
Tag DNA聚合酶 1单位
引物1和引物2 各1μl
受试样品DNA模板 1μl
无离子水 加至30μl
混均后，瞬时离心。
注：引物1、引物2分别为鉴别乌梢蛇、龟板、蛤士蟆油的鉴定引物。
3．PCR循环：
于PCR仪上，95℃预变性5分钟，按下列循环参数进行30个循环：
变性95℃ 40秒
复性60-72℃ 40秒
延伸72℃ 1分20秒
循环完毕后在72℃中保持5分钟补齐。
4．电泳观察：取出反应混合物5-10μl与载样缓冲液混合，1％琼脂糖凝
胶电泳检测扩增结果。如有阳性扩增，则受试样品为正品药材；如为阴性，即
无扩增条带，仅有引物二聚体，则受试样品为非正品药材。
用本鉴别引物，一个有大专以上文化程度的检验员，稍作训练；或一个有
过DNA分子技术基本实验经验的人，便可按上述说明，对受试的乌梢蛇、龟板、
蛤士蟆油样品进行准确地鉴定，不受检验人员有无鉴定该品种药材经验的影响。
快速简便，绝无误判，而且成本低廉，仅花费几块钱就可以完成一次鉴定检测。