含有重组血管内皮生长因子B(VEGF-B) DNA的转基因动物及其用途 【发明领域】
本发明涉及含有重组DNA的转基因动物和来自该动物的细胞，其中该DNA具有来自血管内皮生长因子B(VEGF-B)基因的修饰的核苷酸序列。该转基因动物和细胞对于血管发生和肿瘤形成的研究和进展，且特别是对于测定物质的VEGF-B样活性有用。
【发明背景】
正如其名称所暗示的，血管内皮生长因子(VEGF)是一种内皮细胞特异性促细胞分裂原。它具有潜在的血管发生活性，即它促进新血管的生长。生命的生理过程，血管发生涉及许多血液和血管细胞的蛋白质。在血管发生过程中，促细胞分裂因子，如VEGF，起重要作用。然而，这些因子所起作用的生化细节并不总是唾手可得的。
VEGF被鉴定和表征后，许多重要的发现将注意力集中在血管生成因子的活性和新因子的阐述上。早期的发现表明血管发生是正常发育和生理学所必需地。具体地说，诸如胚胎发生，伤口愈合和黄体形成的过程均涉及血管发生和血管生成因子。例如，在伤口愈合期间，VEGF mRNA水平升高，这表明VEGF的表达和愈合过程直接相关。另外，VEGF调节的缺陷可能与伤口愈合的紊乱相关。(Frank，S.，等，生物学化学杂志，2705：12607-12613(1995)。)
与血管生成因子相关的其它重要发现表明，持久的且不受调节的血管发生会恶化和引起许多疾病。例如，关节炎涉及新的毛细血管侵入关节并破坏软骨。在糖尿病中，视网膜中的新毛细血管侵入玻璃体液，引起出血和失明。(Folkman，J.和Shing，Y，生物学化学杂志，267(16)：10931-10934(1992))。血管生成因子在这些和其它疾病中的作用尚未清楚确定。
另一重要发现涉及血管发生和肿瘤进展间的联系。肿瘤生长和癌转移均是血管发生依赖性过程。(Folkman，J.和Shing，Y.，生物学化学杂志，267(16)：10931-10934(1992))。例如，当肿瘤细胞导入动物时，VEGF mRNA的表达方式表明在坏死的肿瘤生长区外周的细胞中以最高水平表达。在这些区域内鉴定了许多血管。在这些区域中VEGF的表达表明低氧血症(缺陷型氧合症状)触发坏死的肿瘤中VEGF的表达和释放。在下文更充分讨论的另一血管内皮细胞促分裂素，VEGF-B也与肿瘤生长，特别是黑素瘤直接相关。(1996年3月1日申请的美国申请系列号08/609,443)。
VEGF是在结构上与血小板衍生生长因子(PDGF)相关的蛋白质家族的一个成员。PDGF是平滑肌细胞，神经胶质细胞和其它一些细胞类型的潜在促细胞分裂原。在一个方面，以存在8个保守的半胱氨酸残基来鉴定PDGF家族的成员。在其有活性的生理学状态下，该蛋白质在8个半胱氨酸残基上以分子间和分子内键经二硫键形成二聚体。在另一方面，该家族成员在其促细胞分裂作用(特别是对内皮细胞和相关的细胞类型的作用)上相关。
血管内皮生长因子B(VEGF-B)，一种非糖基化的高碱性生长因子是一种新鉴定的PDGF家族的成员。由于与VEGF，PDGF-A，PDGF-B，和PlGF(胎盘生长因子)密切的结构相似性，VEGF-B在成年和胚胎组织，特别是在肌肉组织的血管发生中发挥作用。VEGF-B也是一种血管发生促细胞分裂原。VEGF-B在哺乳动物的许多组织中表达，但在心脏，骨骼肌和胰脏中最丰富。VEGF-B的表达情况不同于VEGF，尽管两者均在许多组织中表达。(Olofsson，B.等，美国科学院学报，93：2576-2581(1996))。
与其相关的促细胞分裂蛋白质一样，VEGF-B在体内以二硫键连接的二聚体存在。作为结构相似性的证明，VEGF-B与VEGF形成杂二聚体，这与参与PDGF-类蛋白质分子间和分子内二硫键结合的8个半胱氨酸残基保守一致。而且，VEGF-B和VEGF在许多组织中共同表达表明在天然状态下存在VEGF-B-VEGF杂二聚体。VEGF也与PlGF形成杂二聚体。(DiSalvo，等，生物学化学杂志，270：7717-7723(1995))。在该生长因子家族成员间产生的杂二聚体复合物可提供一系列血管发生或调节分子的基础。
正如所述，VEGF-B在许多组织和细胞类型中表达。例如，本文作为参考文献特别引用1996年3月1日申请的共同未决的美国申请系列号08/649,443，其详细描述的RT-PCR试验证实了在黑素瘤，正常皮肤和肌肉中存在VEGF-B mRNA。另外，Northern印迹显示了在各种小鼠和人组织，包括心脏，大脑和骨骼肌中的mRNA。
转基因动物模型对于研究蛋白质的功能和生理学活性是有用的工具，已产生了各种各样的这类动物用于该目的。用于产生转基因动物的一种具体技术涉及同源重组方法。在同源重组中，全部或部分基因组序列被含有同源序列的另一DNA取代。通过转基因操作和同源重组，可改变动物细胞中的基因或基因的一部分。将基因改变为编码不再具有天然蛋白质功能的蛋白质可产生无效突变体或无效等位基因。(参见，例如，美国专利号5,557,032。)
为了研究VEGF的功能和生理学，已报道了含有VEGF基因无效突变体的转基因胚胎。(Carmetliet，P.，等，自然，380：435-439(1996))。并得到了一些重要发现。在VEGF无效突变体杂合的胚胎中，血管发生异常但未丧失。VEGF无效突变体纯合的胚胎表明血管发生受到更大的损伤。纯合胚胎在妊娠中期死亡。在种系传递产生的杂合后代胚胎中观察到相似的表型。然而，由于Carmetliet等的研究局限于胚胎，所以没有报道动物的表型或使用。而且，VEGF转基因胚胎的产生尚未发现所有VEGF-样蛋白质的血管发生特征或肿瘤生长调节特征。
因此，尽管本领域努力解释了血管生成因子的功能和生理学，但这些因子仍然尚未完全了解，且仍然需要一些方法用于评价诸如VEGF-B的血管发生生长因子的活性以及其在上述各种疾病状态中的作用，和/或用于开发和/或评价其它的血管发生肽。
发明小结
在其一个方面，本发明涉及生产含有突变VEGF-B基因的转基因动物。VEGF-B基因通过同源重组方法进行突变。这些转基因动物有许多用途。例如，对该动物的研究可对治疗应用和VEGF-B多肽，其片段或诸如小分子的类似物的用药提供重要的信息。特别是，本发明的转基因动物可用于解释VEGF-B和/或其它细胞因子对诸如通透性，炎症和/或组织修复的生理现象的影响。动物或该动物的细胞在鉴定血管发生和/或肿瘤生长调节化合物的筛选试验中有用。该动物也可用于检测VEGF-B拮抗剂的体内分布和功能以及试验无毒性且含有VEGF-B的分子的方法中。
在另一方面，本发明提供了生产含有至少一种非功能性突变VEGF-B等位基因的转基因非人类动物的方法。该方法包含将转基因DNA导入非人类动物，优选小鼠的胚胎干细胞。转基因DNA具有与VEGF-B序列同源的区域。然后，选择转基因DNA在至少一个拷贝的内源性基因组VEGF-B序列位点已整合进干细胞基因组DNA的细胞。将该细胞导入发育中动物的胚泡并使其发育成转基因动物。
在另一方面，本发明提供了从上述方法生产的动物。
在另一方面，还提供了从上述方法生产的转基因动物分离的细胞。
在本发明方法的任意实施方案中使用的转基因DNA含有以本领域已知的许多方式改变，突变或修饰的VEGF-B基因的核苷酸序列。因此，用于产生转基因动物的DNA可含有许多不同的DNA序列。合适序列的选择取决于所需的效果。例如，至少可改变或缺失一个半胱氨酸密码子。所得的动物可产生与天然VEGF-B或另一PDGF类蛋白质形成二聚体的能力被改变的VEGF-B。在优选的实施方案中，VEGF-B的8个半胱氨酸残基中有7个被缺失，产生一个VEGF-B的无效突变体。
在另一方面，本发明提供了用于筛选影响血管发生或调节肿瘤生长或进展或者增强转基因动物心脏肌肉系统之能力的化合物的方法。该方法包含将化合物导入转基因动物并检测动物中的血管发生。另外，该方法包含将肿瘤细胞导入转基因动物，向该动物中导入一种化合物，并检测动物中的肿瘤形成。
上述方法的许多实施方案均包括在本发明的范围内。例如，可想到用于筛选恢复或可检测地影响VEGF-B基因产物活性之能力的化合物的方法，包括将化合物加入合适的细胞系或将化合物导入转基因动物。根据本发明产生的转基因动物和细胞系可用于这些方法。这些动物和细胞系系统也可用于选择能恢复或调节VEGF-B基因活性和/或血管发生的化合物。该化合物可以是蛋白质形式(例如，重组的或体外合成的)或编码VEGF-B或VEGF-B类似物的DNA形式。它可以是裸露的基因组DNA或有效连接到启动子上且可以进一步连接到病毒或细菌载体上的cDNA。该DNA可掺入脂质体结构，如在Lui等，自然生物技术，15：167-172(1997)中所述。也可在8-16细胞胚胎期给剔除了VEGF-B的小鼠胚胎提供DNA或蛋白质。
用突变VEGF-B基因序列(野生型或其突变的片段)获得的转基因动物可用于产生双重转基因动物。为达到该目的，可将突变VEGF-B转基因动物与相同种类的其它转基因动物或与该种类的天然存在的突变体动物杂交。所得的双重转基因动物或其细胞可用于与突变体亲本转基因动物相同的应用。
突变或修饰核酸序列的已知方法可用于与本发明结合以产生有用的VEGF-B突变体动物，细胞系，或序列。这类方法包括，但不限于点突变，定点诱变，缺失突变，插入突变，可从同源重组获得的突变，以及可从化学或放射处理DNA或携带该DNA的细胞而获得的突变。如果希望或必需，可用PCR分析或DNA测序来测定产生的突变。然后将突变体动物，细胞系或序列用于所述的DNA序列，系统，试验，方法或过程。突变或修饰的DNA按定义可以是与基因组DNA不同或不一致。突变体动物也可经过将含有本文所述的或可按本发明制备的序列的第一转基因动物与第二动物杂交产生。第二种动物含有的DNA可不同于第一种动物所含的DNA。以这种方式，可产生突变体动物的各种品系。
而且，重组DNA技术可用于突变上述DNA序列，将这些DNA序列与表达载体连接并表达VEGF-B蛋白质或突变体。从而可分析VEGF-B突变体的生化或行为活性。以这种方式，可产生突变的DNA序列以防止有效的VEGF-B表达。
本发明的“修饰的VEGF-B DNA”指来自VEGF-B基因的核苷酸序列，该序列已经过体外或重组DNA技术修饰。该修饰的VEGF-B DNA不含有与将要导入转基因DNA的胚胎干细胞之基因完全相同的核苷酸序列。然而，具体包括的修饰包括对VEGF-B DNA序列引入核苷酸的缺失，取代和插入。作为例子，一个具体修饰的VEGF-B DNA含有小鼠VEGF-B DNA序列部分外显子3和全部外显子4的缺失。经过缺失至少一个限制性片段可将VEGF-B基因座的限制性图谱(图1和3)用于设计许多修饰的VEGF-B DNA。
本发明的方法和转基因动物提供了用于解释血管发生和包括诸如VEGF-B的血管发生生长因子的各种物质的肿瘤生长调节活性的有用模型。VEGF-B的治疗，诊断和调节用途可从采用改变了VEGF-B基因的转基因动物的模型系统来确定。特别是，根据本发明的转基因动物可在以VEGF-B影响诸如通透性，炎症和/或组织修复的生理学现象之能力为基础的治疗方案形成中有用。另外，本发明的方法和转基因动物可用于评价其它多肽或小分子的VEGF-B样活性，如血管发生活性或VEGF-B对内皮细胞基因表达所具有的活性，其中该表达可影响其基础特征，例如，从血流中将养分吸收到特定的组织的特征。
经过监测和比较对野生型(+/+)，杂合子(+/-)和无效等位基因(-/-)动物的不同生理学应急的效果，可将本发明的转基因动物用于解释VEGF-B的发育和内环境稳定功能。例如，VEGF-B对凝血时间的影响可通过使用创伤试验来监测；VEGF-B对肿瘤生长的影响可通过监测植入的肿瘤细胞的增生来测定；VEGF-B对身体活性的影响可通过比较身体活性研究来揭示，和/或VEGF-B对应急反应的影响可通过应用诸如接触压缩空气的重度应急来测定。另外，VEGF-B对心率，心输出(例如，血压)和/或心脏动力学特征的影响可经过使用本发明的转基因动物按Zhou等，自然医学，4：201-07(1998)所述类似的程序来测定。
附图的简要描述
下文参考附图将更详细地描述本发明，其中：
图1是产生小鼠VEGF-B基因无效突变之策略的示意图；
图2显示了PCR扩增来自同胎交配的纯合子VEGF-B(+/+)，杂合子(+/-)和纯合的剔除VEGF-B基因座的小鼠(-/-)的F2后代尾DNA的琼脂糖凝胶电泳；
图3显示了小鼠VEGF-B基因座的详细限制性图谱。限制性酶和相应的标记在下面列出；
图4显示了用于产生靶向小鼠VEGF-B基因座的转基因载体的方法的示意图。下面描述的各构建体A-E在产生靶向小鼠VEGF-B基因座的转基因载体的举例的方法中显示；
图5a和5b是来自野生型(+/+)，杂合子(+/-)，和剔除(-/-)的小鼠心脏和骨骼肌组织RNA的Northern印迹，
图6是在同胎交配的纯合VEGF-B(+/+)和VEGF-B缺陷型(-/-)小鼠中移植的肿瘤生长的比较图。
举例性实施方案的详细描述
下面的描述和实施例是本发明实施方案和范围的举例。本发明并不局限于该描述的范围。
本领域的技术人员可预料到使用本领域已知的技术可修改下面的实施例和实施方案。例如，用已知方法在不改变发明人所示的效果或优势的前提下可产生所述或所要求保护的核酸序列中的变化。因此这些变化包括在本说明书和发明的范围内。
另外，本领域已知的许多技术的详细方案在下列文献中描述：Ansubel，F.M.等编辑，分子生物学常规方法，Greene PublishingAssociates和Wiley-Interscience，John Wiley&Sons，Boston，MA(1989)，和其1997年1月的增刊，下文称为“Ausubel(1989)”；Sambrook，J.，等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版，纽约冷泉港，(1989)，下文称为“Sambrook(1989)”和小鼠胚胎操作实验室手册，B.Hogan，R.Beddington，F.Constantini和E.Lacy，冷泉港实验室出版，(1994)，下文称为“Hogan(1994)”。本文特别引入这些文献作为参考。依靠这些文献，本领域的技术人员可实施本发明的实施方案。
短语“无效等位基因”，“无效突变”和“无效突变体”指编码与野生型蛋白质相比有改变的蛋白质的基因序列。一般来说，“无效突变体”的改变方式导致蛋白质基本上不具有其原始功能。例如，VEGF-B无效突变体是编码不再刺激血管内皮细胞生长或不再表现出上述VEGF-B的任何其它作用的蛋白质的DNA序列。然而，与VEGF-B的其它生化功能，如肝素结合和二聚体化相关的结构可存在于由该无效等位基因编码的蛋白质中。另外，“无效突变体”可指携带上述改变的蛋白质的基因序列的动物或细胞。
转基因DNA指能导入细胞使其掺入细胞基因组的DNA。该细胞能产生含有转基因DNA的转基因动物。一般来说，转基因DNA作为载体，转基因载体构建，用于施加进特定的细胞。该载体不必是特定的结构形式，如环形。
重组基因或序列指以本领域已知的任意一种重组DNA技术操作基因或序列。
本文所用的术语“修饰的VEGF-B DNA”指来自动物的VEGF-B核苷酸序列，它以一个或多个点突变，定点诱变，缺失突变，插入突变，可从同源重组获得的突变，和/或可从化学或放射处理DNA或携带该DNA的细胞获得的突变被修饰，或与另一DNA序列，如标记序列相连，该标记序列在自然界中不与野生型VEGF-B DNA相连。修饰的VEGF-B DNA可保留野生型VEGF-B DNA的一些或全部活性，例如，Flt-1受体结合基序。
本文提及的VEGF-B基因和DNA序列不限于来自小鼠或人的基因或序列。任何动物种类均可用作VEGF-B基因的来源。在插入转基因DNA的重组序列中，与特定胚胎干细胞的VEGF-B基因同源的序列不必来自与胚胎干细胞相同的种类。
不考虑所涉及的物种时，产生转基因动物的方法基本上是相同的。简单的说，在能整合转染细胞的时期，例如，在胚泡期，将转染的细胞注射进胚胎。然后，将胚胎再植入替代母亲中，产生具有转基因DNA的嵌合后代。因此，所需要的是来自动物的合适的胚胎干细胞。
来自各种动物的胚胎干(ES)细胞的生产是本领域的普通技术人员所熟知的。胚胎干细胞可从各种来源获得。它们包括小鼠，大鼠，奶牛，猪，绵羊和其它动物。例如，Joyner A.L.，(1993)，基因靶向实验方法，Wood，R.和Hames，B.D.编辑，实验方法系列，第126卷，Oxford IRL Press(本文特别引用以供参考)描述了产生ES细胞的方法。另外，小鼠胚胎操作实验室手册，B.Hogan，R.Beddington，F.Constantini和E.Lacy，冷泉港实验室出版，(1994)描述了小鼠胚胎的操作。此外，Couly和Le Douarin，发育，108：543-555(1990)描述了分离和操作鸡和鹌鹑胚胎的方法。Kimmel和Warga，自然，327：234-237(1987)描述了斑马鱼胚胎的分离和操作。Ware等，“农场动物胚胎干细胞系的发育”，繁殖研究协会，38：241(1988)讨论了适应于许多种类，如小鼠，牛，猪和羊胚胎干细胞的培养条件。因此，与具体举例的小鼠一样，本发明可应用于其它动物。
将DNA插入动物细胞的各种方法在本领域是已知的。例如，可将转基因DNA显微注射进合适的细胞。病毒载体可用于将DNA导入合适的细胞和细胞基因组。(例如，参见，Tsukui等，自然生物技术，14：982-985(1996)。)。并且，通过转染和电穿孔方法可体外操作细胞。(参见Ausubel(1989)和Hogan(1994))。
一般来说，转基因DNA通过随机整合或同源重组插入细胞基因组。为了鉴定和分离已发生同源重组的细胞，本领域的技术人员熟悉增加ES细胞和其它细胞中同源重组对随机整合的相对频率的方法。(参见，例如，Ausubel(1989)，美国专利号5,557,032，和Hogan(1994))。转基因DNA载体的设计涉及将细胞序列的某些部分，或与细胞序列同源的序列插入转基因DNA。这一部分必需与细胞序列足够同源以允许转基因DNA与细胞DNA进行体内杂交，使其发生同源重组。
插入本发明的胚胎干细胞的转基因DNA优选包含5’和3’同源区。这些同源区所起的功能是允许在胚胎干细胞中发生同源重组过程。本领域的技术人员可依靠的许多文献讨论了如何构建同源区用于同源重组。例如，Thomas&Capecchi，细胞，51：503-512(1987)，Mansour等，自然，317：348-352(1988)，和Capecchi，美国专利号5,487,992分别讨论了在同源重组技术中设计同源区的方法。因此，设计同源重组序列的方法是本领域已知的。
然而，导入了转基因DNA的每个细胞不会均发生同源重组。另外，情况常常是在细胞中存在一个以上拷贝的需要通过同源重组改变或取代的细胞DNA序列，例如，具有一个以上等位基因的基因。因此，通过同源重组，一些细胞仅仅可在一个细胞序列中插入转基因DNA，而在其它细胞中转基因DNA被插入一个以上的细胞序列中，或者甚至插入每个细胞序列中。因此，从用转基因DNA进行了同源重组的ES细胞可产生纯合以及杂合的动物。纯合动物可与野生型动物杂交以产生对于转基因DNA杂合的转基因动物。
实施例
为了分析在正常和疾病状态下VEGF-B在体内血管发育和维持中的作用，生产携带突变体VEGF-B等位基因的小鼠。以同源重组技术在功能上灭活小鼠的一个VEGF-B等位基因。因此，从这些细胞产生的小鼠携带一个突变型和一个野生型VEGF-B等位基因。
图1由4个小部分，1A到1D组成，它是生产小鼠VEGF-B基因无效突变的方法示意图。图1A是小鼠VEGF-B基因的外显子一内含子组成的示意图。图1B是VEGF-B基因座的限制性图谱，其中显示了许多限制性酶的裂解位点。图中的限制性酶表示如下：N＝NotI；S＝SpeI；K＝KpnI；H＝HindIII；E＝EcoRI。在下文所述举例的转基因DNA构建体中去除的SpeI-KpnI片段以黑框表示。图1C的转基因DNA构建体用于产生突变体VEGF-B等位基因。该构建体含有VEGF-B基因的5’同源片段(NotI/平末端化的SpeI)和3’同源片段(平末端化的KpnI/HindIII)，这两个片段位于pPGK-新霉素序列盒(neo)的两侧。图1D显示了在Southern印迹分析中用于鉴定VEGF-B野生型和突变型等位基因的DNA探针的位置。
在图2中，扩增的野生型带(wt)和从新霉素序列盒扩增的带(neo)的迁移显示在右边。
在下面部分中，描述了如何产生携带突变体VEGF-B等位基因的动物的详细方法和所得的小鼠表型的初步分析。
实施例1：选择用作转基因的VEGF-B序列
用于产生转基因动物的DNA可含有许多不同的DNA序列。合适序列的选择取决于所需的效果。例如，如果需要具有VEGF-B无效突变体的动物，则转基因DNA可含有编码不具有血管内皮细胞促分裂原的VEGF-B基本功能之蛋白质的序列。尽管可使用测定突变蛋白质分裂原活性的试验，但VEGF-B基因的结构信息也可用于精确推导特定突变方案的效果。
在本实施例中，缺失了部分VEGF-B小鼠基因。缺失的部分含有对二硫键重要的8个半胱氨酸残基中的7个。如上所述，VEGF-B是生长因子PDGF家族的一个成员。由于该家族的成员在结构上相关，可推导突变对其它PDGF家族成员的效应来提示对VEGF-B的影响。因此，产生特定效应的VEGF中的突变可能在VEGF-B中产生相同或相似的效应。同样，在PDGF家族其它成员中的突变可用于在VEGF-B基因中产生突变。当所有家族成员中，或者甚至对另一家族成员的结构信息表明保守的结构与特定活性相关时尤其如此。考虑到这些情况，产生无效突变体，其中缺失了8个半胱氨酸残基中的7个。由于从PDGF家族的资料已知这些半胱氨酸残基与二硫键形成和二聚体化有关，可预期7个半胱氨酸的缺失产生无功能的，突变的VEGF-B蛋白质。选择用于本发明的转基因DNA中的序列的进一步细节如下。
为了选择本发明中修饰的DNA序列，首先使用pcif-2作探针从小鼠λFIXII-文库(Stratagene；La Jolla，CA)克隆小鼠VEGF-B基因。该方法的细节在Olofsson等，生物学化学杂志，271：19310-19317(1996)(本文特别作为参考文献引用)中描述。分离和鉴定了3个λ-克隆，命名为10，11和12，各携带大约20kb的小鼠基因组DNA。经过用不同的限制性酶消化λDNA，随后以Southern印迹鉴定限制性片段可产生基因组DNA的详细的限制性图谱。从小鼠cDNA克隆序列获得的各种32P-标记的寡核苷酸探针用于Southern印迹。
从含有VEGF-B基因的λDNA的限制性图谱获得的信息用于选择基因转移的DNA。选择的DNA取决于转基因动物具有的特性，特征，基因型或表型。可需要各种特性，特征，基因型或表型。例如，其中VEGF-B DNA与诸如本领域已知的β-半乳糖苷酶，绿色荧光蛋白质或荧光素酶等标记序列连接的动物可以是确定表达的VEGF-B蛋白质的位置的试验所需的。具有与高度可诱导启动子或指导在哺乳动物组织中表达的启动子有效相连的VEGF-B DNA的动物可以是用于从该动物获得VEGF-B蛋白质所需的。可使用的许多启动子或表达系统在本领域是已知的。另外，突变的VEGF-B序列，一旦有效插入到转基因动物中，可提供用于确定血管发生或肿瘤发育的分子基础研究动物。
在一个转基因方案中，需要VEGF-B基因的无效等位基因。该无效等位基因的基因产物在VEGF-B的血管发生特性方面是没有功能的。具有VEGF-B无效等位基因的动物可用于各种试验以鉴定，例如，在动物中影响血管发生的化合物。
产生无效等位基因的方法涉及缺失或修饰DNA序列以防止形成分子内或分子间，或分子内和分子间二硫键。具体地说，缺失编码已知与或据信与二硫键有关的半胱氨酸残基的区域。或者，经过点突变或定点诱变方法突变单个的半胱氨酸残基，本领域已知许多这类方法。然而，以许多其它方法也可产生无效等位基因。例如，从VEGF-B的限制性图谱，可选择常规限制性位点用于产生缺失突变体。
原则上，有许多方法产生无效突变，包括，但不限于：(i)缺失全部基因；(ii)缺失关键的编码蛋白质的序列；和(iii)缺失转录调控序列。如果突变影响剪接，mRNA的稳定性等，也可出现无效突变。另外，改变阅读框或导入成熟前终止密码子的插入或取代也可引起无效突变。
从图1所示的限制性图谱，制备在VEGF-B基因中导入无效突变的靶向的转基因构建体的一种方式是经过缺失限制性片段。将PTKneo插入外显子1的“B”位点可能产生无效突变。从更详细的限制性图谱图3，可设计其它的方案。例如，也可设计任何外显子1，2，3，4，或5的缺失，以及一个以上外显子的联合缺失。
产生无效突变体的另一方法涉及缺失与受体结合相关的那些区域。对于PDGF和VEGF，存在关于受体结合的结构信息且在本领域是已知的。这些信息可用于缺失VEGF-B基因的有关部分以产生无效等位基因。同样，VEGF-B与受体Flt-1的结合和鉴定结合受体Flt-1的VEGF-B类似物的方法在1996年12月21日申请的共同未决的美国申请系列号60/033,697中讨论，本文特别作为参考文献引用。这些信息也可用于产生VEGF-B的无效等位基因。
从上面的讨论，本领域的技术人员可预料到本领域已知的许多技术可用于设计VEGF-B的无效等位基因。因此，本发明并不限于在产生携带VEGF-B无效等位基因的转基因动物中具体举例的缺失。
实施例2产生具有VEGF-B缺失突变体的转基因载体
在本发明的一个实施方案中，去掉了VEGF-B氨基末端结构域8个半胱氨酸残基中的7个。该缺失破坏了用于成熟VEGF-B分子共价二聚体化的3个分子内二硫键和两个分子间二硫键。为做到这点，缺失了330bp的SpeI-KpnI片段。该片段含有部分外显子3和全部外显子4。具体地说，缺失了由外显子3的3’部分编码的33个氨基酸和外显子4的全部24个氨基酸。由于缺少这些关键的氨基酸，从靶向等位基因产生的VEGF-B蛋白质是无功能的，且该等位基因是无效等位基因。
用于产生缺少VEGF-B的SpeI\KpnI片段的重组转基因载体的起始材料是亚克隆进质粒pBluescriptTM(Stratagene)的来自λ-克隆10的10kb NotI\HindIII片段(构建体A)，和克隆进pBluescript(的1.7kbpPGK-neo序列盒(Sibilia，M.科学269：234-238(1995))构建体B)。构建体A-E的示意图参见图4。
经过用KpnI消化构建体A的10kb VEGF-B片段，用T4聚合酶从KpnI粘性末端产生平末端，并最后用HindIII裂解来分离用于产生转基因载体3’区的1.2kb KpnI/HindIII片段。这一片段和所有随后的片段在1 x TBE(Tris Borate EDTA)缓冲液中制备的低凝胶温度(LGT)琼脂糖凝胶中分离。然后将分离的1.2kb片段连接进EcoRV和HindIII消化的pBluescript载体中，产生构建体C。
经过用NotI/SpeI裂解从构建体A分离转基因载体的5’片段。然后将分离的片段连接进NotI/SpeI消化的构建体C中产生构建体D。
经过用NotI/HindIII消化构建体B并用Klenow片段产生平末端分离pPGK-neo序列盒。凝胶纯化所得的片段，然后连接进用EcoRI消化并用Kenow片段平末端化的构建体D中，产生构建体E。选择正向插入了pPGK-neo序列盒的11.2kb载体作为转基因的靶向载体。
使用Southern印迹试验证实野生型与突变型等位基因的同一性。用EcoRI消化基因组DNA并制备用于印迹。用作上述筛选方法之探针的450bp放射标记的片段主要包含编码外显子7和VEGF-B cDNA3’非翻译区的序列。使用来自克隆10的DNA作模板经过PCR产生该探针。用于PCR的引物是5’-GTGAAGCTCCAGCCGAGCA(有义链)(SEQ ID NO：1)和5’-TAGTGTCTTCCATCTCTTT(反义链)(SEQ ID NO：2)。突变等位基因产生6.5kb的基因组EcoRI限制性片段，而在这些条件下野生型等位基因产生＞20kb的片段。
实施例3将转基因载体插入动物细胞
经过电穿孔将含有突变VEGF-B的载体(构建体E)转染进来自129/SW小鼠的E14.1细胞(Kuhn，R.等，科学254：707-710(1991))。用标准方法分离新霉素抗性克隆并鉴定。小鼠胚胎操作实验室手册，B.Hogan，R.Beddington，F.Constantini和E.Lacy编辑，冷泉港实验室出版(1994)描述了分离和操作胚胎的方法(本文特别引用作为参考)。分离几百个克隆的基因组DNA，EcoRI消化，并经过Southern印迹分析。使用这些方法，经过检测6.5kb带和野生型20kb带鉴定了3个阳性克隆，命名为1a，8f和9h。对于克隆1a和9h，用放射标记的PKG-neo序列盒探测Southern印迹也产生了预期6.5kb的带。这些资料显示ES细胞中的两个VEGF-B等位基因中的一个等位基因已被该构建体正确地靶向且产生了含有VEGF-B无效等位基因的ES细胞。
实施例4： 转基因动物的生产
使用标准方法将来自细胞系9h的细胞注射进小鼠胚泡。小鼠胚胎操作实验室手册，B.Hogan，R.Beddington，F.Constantini和E.Lacy编辑，冷泉港实验室出版(1994)描述了注射细胞的方法(本文特别作为参考文献引用)。以后代的外表颜色鉴定产生的嵌合小鼠，即那些具有转基因DNA的小鼠。
例如，由于ES细胞来自具有栗色(白-黄)皮毛和野灰色(Agouti)基因座携带者的129/SW小鼠，而宿主胚泡来自具有黑色外观且缺乏野灰色基因座的C57B1/6小鼠，因此，嵌合体将是栗色(仅由ES细胞贡献的皮肤块)，黑色(仅由宿主细胞贡献的皮肤块)和棕色或野灰色(具有129/SW和C57B1/6细胞混合体的皮肤块)的混合体。嵌合动物是棕色的，因为从129/SW细胞分泌的野灰色蛋白质将刺激C57B1/6毛囊细胞以加工黑色素(黑色色素)使皮毛变成棕色。
雄性嵌合小鼠与C57B1/6野生型雌鼠交配。在这些雌性小鼠的后代中存在棕色小鼠，这显示了转基因DNA的种系传递。
以上述Southern印迹分析了从这些F1小鼠尾制备的DNA。一般来说，手术切下0.5cm尾组织并用于制备DNA样品。在50％的棕色小鼠中存在6.5kb EcoRI片段表明对靶向的VEGF-B无效等位基因没有选择。携带靶向的VEGF-B基因座的F1小鼠是杂合子，因为它们也携带了VEGF-B的野生型等位基因。存在携带一个失活的VEGF-B等位基因的正常发育的F1小鼠表明VEGF-B的基因剂量对于存活不是关键的。
使杂合子F1小鼠杂交并经过Southern印迹和PCR分析后代的鼠尾DNA。使用两种技术获得的结果是相同的，并给出了PCR确定基因型方法的细节。用F2后代尾DNA作模板使用标准条件进行PCR扩增。使用位于外显子3和外显子4的两个引物将野生型等位基因鉴定为316bp的扩增带。这些引物分别为5’-GCCCAGCTGTGTGACTGT(正向)(SEQ ID NO：3)和5’-CCCACCCCATGCTACACT(反向)(SEQ ID NO：4)。使用位于新霉素抗性基因的两个引物将靶向的等位基因鉴定为140bp的带。这些引物分别是5’-TGTTCTCCTCTTCCTCATCTCC(正向)(SEQ IDNO：5)和5’-ATTGTCTGTTGTGCCCAGTC(反向)(SEQ ID NO：6)。PCR扩增的结果在图2中概括。分析表明VEGF-B靶向等位基因纯合的小鼠可存活且分析F2后代的大量动物后得到野生型，杂合子和携带无效等位基因的纯合子动物的比率为1∶2∶1。因此，无效等位基因以经典的孟德尔方式遗传。
对剔除VEGF-B的成年小鼠的第一外表检查与野生型小鼠相比未显示任何总体形态变化。然而，可观察到有些转基因VEGF-B突变体小鼠的心脏出现畸形。其心脏大小一般比野生型小且较大的血管似乎更扩张。这些表型表明剔除VEGF-B的小鼠可用作筛选对心脏组织生长或发育有影响的化合物的模型。
实施例5检查细胞或组织标本中的VEGF-B核酸
可用本领域已知的许多常规方法获得细胞或组织标本。一般来说，立即冷冻离心的细胞沉淀或组织样品。以异硫氰酸胍方法[Chomczynski等，分析化学，162：156-159(1987)]分离总RNA。使用0.2μg随机六脱氧核苷酸引物，5单位的鼠逆转录酶，作为模板的5μg总RNA和第一链cDNA合成试剂盒(Pharmacia)合成cDNA。37℃温育1小时后，反应混合物在-70℃贮存。除了不加逆转录酶外，同样制备PCR扩增的阴性对照样品。作为内部标准也试验了β-肌动蛋白，因为其以组成型高水平表达，且其表达在不同细胞中显示出无很大差异。
对于PCR扩增，从VEGF-B和β-肌动蛋白基因选择引物序列如下：VEGF-B有义：5’-GCCATGTGTCACCTTCGCAG-3’(SEQ IDNO：7)，VEGF-B反义：5’-TGTCCCTGGAAGAACACAGCC-3’(SEQID NO：8)，β-肌动蛋白有义：5’-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’(SEQ ID NO：9)，β肌动蛋白反义：5’-GGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG-3’(SEQ ID NO：10)[β-肌动蛋白序列包含Ng等，分子细胞生物学，5：2720-732(1985)的核苷酸2105-2125和2411-2432]。来自cDNA反应产物的4μl等分试样加热至94℃5分钟并用作含有20pmole引物，10xPCR缓冲液，1μl 20mM dNTPs和2.5U Taq聚合酶的PCR扩增的模板。用DEPC处理的水将终体积调至100μl。变性为在95℃1分钟，在62℃退火45秒，在72℃聚合50秒，对于VEGF-B共进行35个循环，对于β-肌动蛋白进行25个循环。每5个循环后，取15μl等分试样用于分析。
在含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶中进行5μl PCR反应混合物的电泳。大小标记DNA片段长度范围为24到726个碱基对(来自Promega，Madison，WI，USA)。
实施例6：来自转基因动物的细胞和组织的应用
如上所述，剔除VEGF-B的小鼠心脏比野生型小，这特别显示了其在心细胞生长测定，心率测定，心输出测定或其它心脏动力学特征的测定中的应用。本领域的技术人员可预料到在筛选试验中的其它用途。
为了在这些筛选方法中使用转基因动物的细胞和组织，可使用来自转基因动物的细胞或组织的培养物，它含有来自转基因动物的至少一个细胞。该细胞作为外植体生长或经过机械分散分离且作为原代培养物生长。另外，用本领域已知的转化方法或经过将转基因小鼠与例如，Jat等，PNAS USA 88：5096-5100(1991)描述的H-2KtsA58小鼠进行起始杂交，或用本领域已知的其它相关方法(参见，例如，McClean，J.S.，Tibtech 11：232(1993))可将该细胞转化成细胞系。以这种方式，剔除突变体与H-2KbtsA58转基因小鼠的杂交将产生各种细胞的条件永生细胞系。具体地说，细胞在ts(温度敏感性)A58 T-抗原许可的温度下开始生长，使细胞可培养许多代。T-Ag使细胞永生。当细胞转移到非许可温度下使T-Ag失活时，细胞分化，从而潜在地从不同组织产生许多不同的细胞系。
实施例7：血管发生和/或肿瘤生长调节活性的测定
组织样品，例如来自剔除VEGF-B的小鼠的心脏外植块，它也可含有相应的细胞，可将它用于试验VEGF-B类似物。这些组织样品或外植块也可在本领域已知的溶液中维持。可向组织样品或外植块中加入化合物，例如VEGF-B类似物或小分子，并分析其对组织样品或外植块的影响。以这种方式可试验诸如血管发生的生理学影响，抑制或帮助肿瘤生长，肌肉系统增多或其它与VEGF-B有关的影响。本领域的技术人员可依靠本领域已知的方法，例如Ausubel(1989)和Hogan(1994)中的方法设计特定的实施方案。
实施例8：VEGF-B转录子表达的考察
以Northern印迹在野生型小鼠(+/+)，杂合子小鼠(+/-)和纯合子剔除小鼠(-/-)中考察VEGF-B转录子在心脏和骨骼肌中的表达。杀死VEGF-B缺陷和野生型C57B1/6小鼠，速冻不同的组织并贮存在-80℃备用。使用硫氰酸胍/酸性酚方法[参见Chomczynski等，分析生物化学，162：156-159(1987)]制备总细胞RNA。在1％琼脂糖凝胶中每泳道使用20μg来自各样品的RNA，在80V下电泳大约3小时。随后将凝胶转移到尼龙膜(HybondTM-N+，Amersham)上，接着进行紫外线交联。在5xSSC，5xDenhardt溶液，0.5％SDS和100μg/ml单链DNA中进行预杂交2小时，接着根据厂商方案(Amersham)用特异性探针在65℃杂交过夜。
所用的两个探针是(a)全长小鼠VEGF-B cDNA和(b)包括无效等位基因中VEGF-B基因的缺失部分的探针。用随机标记试剂盒(Amersham)按推荐的方案将1.8kb的VEGF-B167cDNA片段用于制备第一探针。在Northern分析中使用的第二探针用VEGF-B外显子3和4内的148bp片段产生，该片段在无效等位基因/靶向载体中被Neo基因取代且经过PCR方法被标记[参见Konat等，PCR技术，第37-42页，Griffin编辑，CRC出版，Boca Raton(1994)]。在标记PCR中使用Taq DNA聚合酶和32P-dCTP，PCR为：在94℃1分钟，58℃下2分钟及72℃下3分钟，进行30个循环。
洗涤后，将膜对X-射线胶片曝光2到6天。膜在煮沸的0.5％SDS中剥离并接触磷酸Imager过夜以确保完全剥离。图5a显示了使用全长小鼠VEGF-B cDNA探针进行Northern印迹的结果。图5b显示了包含无效等位基因中VEGF-B缺失部分的探针所得的结果。
结果表明，两种探针均与从+/+小鼠获得的丰富的1.4kb VEGF-BmRNA杂交且还检测到丰度较低的两个其它转录子。这两个次要转录子长度分别为3.0和6kb。在+/-小鼠中获得的杂交信号明显减少，而两种探针均不能检测从-/-小鼠获得的RNA样品中的任何VEGF-B转录子。这表明靶向的VEGF-B等位基因已被剔除并产生了无效等位基因，且-/-小鼠没有VEGF-B蛋白质的合成。杂合子中VEGF-B转录子水平下降也表明剩下的完整VEGF-B等位基因的转录未受到补偿性正调。
实施例9：肿瘤的移植和测量
由于已知肿瘤的生长和转移形成取决于肿瘤组织的新血管发生，在同窝交配的野生型(+/+)和VEGF-B缺陷型(-/-)小鼠中考察了移植肿瘤的生长。在该试验中使用了雄性的VEGF-B缺陷型(-/-)和同窝交配的纯合子C57B1/6小鼠(+/+)。皮内注射小鼠T241纤维肉瘤。植入肿瘤细胞前用甲氧氟烷麻醉6至8周龄小鼠。然后将生长于对数期的1×106 T241小鼠纤维肉瘤细胞悬浮于100μl PBS中，并皮下植入各小鼠的背部中线。在各动物中测量肿瘤的生长。观察肿瘤并使用卡钳隔日测量。使用公式：宽2×长×0.52[参见Boehm等，自然，390：404-407(1997)]计算肿瘤体积。
结果在图6中表示。从图中可看出肿瘤的生长在-/-动物中比+/+动物中明显缓慢。似乎在指数生长期前是启动期，该时期在突变体动物中更长，+/+动物中的天数大约为18-20天，而在-/-动物中为30-32天。结果表明，VEGF-B很可能通过影响肿瘤的基质而影响肿瘤的血管发生。这一结论的得出是因为肿瘤细胞很可能表达内源性VEGF-B，而在突变体动物中观察到该效应。
该结果有助于直接影响内皮细胞生长或间接影响诸如细胞外基质的迁移，降解等。在每种情况下，该结果表明VEGF-B在促进肿瘤生长中发挥作用且表明根据对VEGF-B作用的抑制可开发抗肿瘤方案，例如经过使用单克隆抗体阻断VEGF-B与VEGFR-1的结合，或以小分子结合VEGFR-1，或用抗VEGF-B疗法，或结合两种或更多种上述方法。
上面提供的描述和实施例仅仅用于说明本发明且并不是用于限制。由于本领域的技术人员可对引入本发明实质和基础的所公开的实施方案进行修饰，因此本发明的构成应包括在所附权利要求书范围内的各种情况和其等价物。
序列表
(1)一般信息：
(i)申请人：VON EULER，Gabriel
AASE，Karin
BETSHOLTZ，Christer
ERISKSSON，Ulf
PEKNY，Milos
GEBRE-MEDHIN，Samuel
LI，Xuri
(ii)发明名称：具有重组血管内皮生长因子B(VEGF-B)DNA的转基因动物及其用途
(iii)序列数：10
(iv)联系地址：
(A)联系人：Evenson，McKeown，Edward &
Lenahan，P.L.L.C.
(B)街道：1200G大街，N.W.，Suite 700
(C)城市：华盛顿
(D)州：DC
(E)国家：USA
(F)邮编：20005
(v)计算机可读形式：
(A)媒体类型：Floppy软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，#1.25版
(vii)优先申请数据：
(A)申请号：US60/038,202
(B)申请日：1997年2月18日
(viii)代理人/律师信息：
(A)姓名：EVANS，Joseph D
(B)登记号：26,269
(C)案号：1064/43342
(ix)电信信息：
(A)电话：(202)628-8800
(B)电传：(202)628-8844(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：19个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1GTGAAGCTCC AGCCGAGCA 19(2)SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：19个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2TAGTGTCTTC CATCTCTTT 19(2)SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：18个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3GCCCAGCTGT GTGACTGT 18(2)SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：18个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4CCCACCCCAT GCTACACT 18(2)SEQ ID NO：5的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：22个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5 TGTTCTCCTC TTCCTCATCT CC 22(2)SEQ ID NO：6的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：20个碱基对
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(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6ATTGTCTGTT GTGCCCAGTC 20(2)SEQ ID NO：7的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：20个碱基对
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(i)序列特征：
(A)长度：21个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8TGTCCCTGGA AGAACACAGC C 21(2)SEQ ID NO：9的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：20个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9CGGGAAATCG TGCGTGACAT 20(2)SEQ ID NO：10的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：21个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10GGAGTTGAAG GTAGTTTCGT G 21