反转录方法 相关申请交叉文献
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发明背景
cDNA合成
在Mn++存在下，各种DNA依赖的DNA聚合酶可作为反转录酶起作用，其利用RNA作为模板从寡核苷酸引物开始合成互补的cDNA(Karkas，J.D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 70：3834-3838,1973)。当与真正的反转录酶(如禽成髓细胞瘤病毒(AMV)或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶)的合成速度、cDNA总产量和产生的全长转录物的丰度相比时，该反应被认为是低效率的(Powell，L.M.等人，Cell 50：831-840，1987)。
起反转录酶作用的热稳定的DNA依赖的DNA聚合酶已经用于cDNA合成。在升高的温度(高于50℃)下进行的反应预计会表现出高于嗜温型酶反应的引导特异性和反转录通过RNA次级结构区域的能力。可用作反转录酶的热稳定DNA聚合酶还被用于RT-PCR方法来产生从RNA靶开始的DNA拷贝(扩增子)(Myers，T.W.和Gelfand，D.H.Biochemistry 30：7661-7666，1991和美国专利5,322,770；5,310,652；和5,407,800)。
甜菜碱
已经表明，甜菜碱(N，N，N-三甲基甘氨酸)能提高PCR效率。美国专利5,545,539(Miller，1994年10月18日提交)描述了用有效量的甘氨酸为基础的渗压剂来改善PCR扩增核苷酸靶序列的方法。该渗压剂减少了扩增产物中的“模糊(stutter)条带”的出现，因此能更容易地检测核苷酸靶序列。
Rees等人(Biochemistry 32：137-144，1993)证明了甜菜碱具有减少或消除DNA热解链转换的碱基对组成依赖性。
DE4411588C1公开了一种用于RNA和DNA聚合酶反应的含有甜菜碱地缓冲液，以及该缓冲液在PCR反应和用MMLV反转录酶将RAN反转录成cDNA中的用途。
本领域所需的是一种提高cDNA总产量和全长转录物丰度的方法，以便提高整个RT-PCR方法的灵敏度和产量。
发明概述
我们已经发现，在Mn++存在下，甜菜碱提高了作为反转录酶起作用的热稳定DNA聚合酶合成的全长cDNA的产量。
本发明是一种DNA合成方法，该方法包括在有效提高反转录的甜菜碱用量下，使RNA模板与热稳定的DNA依赖的DNA聚合酶接触的步骤。聚合酶反转录RNA模板，产生了该模板的DNA拷贝。较佳的是，甜菜碱的浓度在0.5-3.0M之间，最佳的为2.0M(±0.5M)。
本发明还涉及用于反转录反应的试剂盒。在一个较佳的实例中，该试剂盒包括含有甜菜碱的溶液、核苷酸、脱氧核苷酸和DNA依赖的DNA聚合酶。较佳的是，该试剂盒包括将含甜菜碱溶液中的热稳定的DNA依赖的DNA聚合酶用于反转录反应的说明书。
在本发明的另一个实例中，该方法与一种扩增方法相结合，最佳的是与聚合酶链反应相结合。
本发明的一个目的是提供一种改进的反转录反应。
本发明的另一个目的是提供一种提高cDNA合成反应中全长转录物丰度和产量的方法。
本发明还有一个目的是改善RT-PCR方法的总的产量。
在审查了说明书和权利要求后，本发明的其它目的、特征和优点是显而易见的。
附图简述
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发明详述
本发明是一种DNA合成方法，该方法包括在有效提高反转录的甜菜碱用量下使RNA模板与热稳定的DNA依赖的DNA聚合酶接触的步骤。该方法适用于本领域技术人员所知的用DNA依赖的DNA聚合酶作为反转录酶的方法。
尽管本发明在下文列举了具体的DNA聚合酶，但是本发明并不局限于这些例子。文献中已有报道的其它热稳定的聚合酶均可用于实施本文描述的方法。这些例子包括从嗜热菌Bacillus stearothermophilus、Thermosipho africanus、Thermotogamaritima、嗜热菌属(Thermus species)SPS17、T.brockianus、T.flavus、T.lactues、T.rubens、T.ruber和T.species Z05。另外，还有从嗜热古细菌例如Desulfurococcus mobilis，Methanobacterium thermoautotrophicum，Methanothermus fervidus，Pyrococcus furious，Pyrodictium occulturn，Sulfolobus acidocaldariu，S.solfataricus，Thermococcus litoralis和Thermoplasma acidophilum分离获得的热稳定的聚合酶。
经修饰的热稳定的聚合酶可从蛋白水解性降解获得，或由截短的基因产生。这些蛋白也可用于实施本发明，只要它们具有用RNA模板聚合脱氧核糖核苷三磷酸的功能。
据信，本发明的方法对可以在反转录酶或作为反转录酶起作用的DNA聚合酶的反转录底物的任何RNA模板上起作用。
下文描述的例子是一个典型反转录反应混合物。较佳的反转录反应混合物包括RNA模板分子、寡核苷酸引物、所有四种dNTP的混合物以及合适的缓冲液。下文公开的例子所用的缓冲液含有0.01M Tris-HCl，pH8.3，0.05M KCl，1.5mM MgCl2和0.75mM MnCl2。美国专利5,322,770；5,310,652和5,407,800描述了依赖于Mn的反转录反应。
然后在反应混合物中加入热稳定的DNA聚合酶。较佳的，该热稳定的DNA依赖的DNA聚合酶分离自Thermus thermophilus或Bacillus stearothermophilus。然而，据信上述其它各种热稳定微生物的聚合酶也是合适的。
在甜菜碱存在下培育反应物，该甜菜碱宜从Sigma Chemical Company，St.Louis，MO按目录号#B2754以甜菜碱单水合物的形式购得。最好采用0.5-2.5M浓度的甜菜碱。2M(±0.5M)的浓度是较佳的。我们的实验表明，浓度为3M的甜菜碱至少勉强有效。
本发明需要聚合酶在产生的模板DNA拷贝中反转录RNA模板。可通过将反转录材料显示在电泳凝胶上来检测该DNA拷贝的存在与否。
在下述实施例中，我们能使cDNA的合成数量从不可观察量增加到可观察数量。但是，我们预计本发明的方法也适用于cDNA的合成仅仅是效率低但并不一定被完全抑制的场合。cDNA合成的任何改进(定义成产物增加至少10％(通过在全长产物中掺入放射性标记的dNTP来测定))是符合本发明的。
本发明还涉及一种用于用本发明的方法进行反转录反应的试剂盒。该试剂盒的最基本的形式包括含甜菜碱溶液或缓冲液的小瓶或容器，以及关于反应的说明书。较佳的是，试剂盒还包括脱氧核糖核苷酸以及热稳定的DNA依赖的DNA聚合酶。
实施例
A.实验
在混合物中用大肠杆菌核糖体RNA作为靶模板RNA，用分离自Thermusthermophilus和Bacillus stearothermophilus的DNA聚合酶合成cDNA。含有1 μg核糖体RNA制备物的反应混合物含有23S、16S和5S rRNA物质；在16S rRNA 3′末端附近退火的寡核苷酸引物；所有四种脱氧核糖核苷三磷酸(dATP，dCTP，dGTP和dTTP)的混合物；合适的反应缓冲液(0.01M Tris-HCl，pH8.3，0.05M KCl，1.5mM MgCl2和0.75mM MnCl2)；以及5单位的Tth DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶。在各种浓度的甜菜碱(高达3.0M)存在或不存在下，60℃培育混合物20分钟。用1％琼脂糖凝胶电泳和DNA大小标准品分析反应混合物。用溴化乙啶染色和紫外光(312nm)透照使核酸条带显色。
B.结果
电泳凝胶上的条带图形表明，反应混合物中存在约2M的甜菜碱提高了cDNA的合成(从出现强条带迁移到约1.4kb处可以看出)。该大小与全长cDNA/16S rRNA杂交体所预计的大小一致。在没有甜菜碱时，没有显示出这样的条带，反应混合物中主要是更小的产物。
当用碱性凝胶琼脂糖电泳分析反应样品时，导致所有RNA被破坏，结果发现一条cDNA条带迁移至1.4kb，这再一次与全长cDNA的合成相符。在没有甜菜碱时，在凝胶上再次看到了较小的产物。
关于甜菜碱增强TTh和Bst DNA聚合酶合成cDNA的机制还不清楚。在Mn++存在时升高的温度下RNA的稳定性提高、RNA的构型改变从而被更好地用作DNA聚合酶的模板、以及引导性改善是可能的因素。