新的美登素生物碱类以及该美登素生物碱类与抗体制备缀合物的用途.pdf

本发明涉及具有式(I)的化合物：其中：ALK是(C1-C6)亚烷基；X1和X2各自独立地为以下基团之一：-CH=CH-、-CO-、-CONR-、-NRCO-、-COO-、-OCO-、-OCONR-、-NRCOO-、-NRCONR’-、-NR-、-S(O)n(n=0、1或2)或–O-；R和R’独立地为H或(C1-C6)烷基；i为整数1至40，优选为1至20，更优选为1至10；当X2是-CH=CH-时，j是对应1的整数，当X2不是-CH=CH-时，j是对应2的整数；Zb是单键、-O-或-NH-，Rb是H或(C1-C6)烷基、(C3-C7)环烷基、芳基、杂芳基或(C3-C7)杂环烷基；或Zb是单键且Rb是Hal。本发明涉及该美登素生物碱类与具有肿瘤细胞亲和性的抗体制备缀合物的用途。

权利要求书
1.  具有式(I)的化合物：

其中：
●ALK是(C1-C6)亚烷基；
●X1和X2各自独立地为以下基团之一：-CH=CH-、-CO-、-CONR-、-NRCO-、-COO-、-OCO-、
-OCONR-、-NRCOO-、-NRCONR’-、-NR-、-S(O)n(n=0、1或2)或-O-；
●R和R’独立地为H或(C1-C6)烷基；
●i为整数1至40，优选为1至20，更优选为1至10；
●当X2是-CH=CH-时，j是对应1的整数，当X2不是-CH=CH-时，j是对应2的整数；
●Zb是单键、-O-或-NH-，Rb是H或(C1-C6)烷基、(C3-C7)环烷基、芳基、杂芳基或(C3-C7)
杂环烷基；或Zb是单键且Rb是Hal。

2.  根据权利要求1的化合物，其中X2是-CH=CH-或-CONR-，该CO基团键接于–X1-ALK-基团，R是H或(C1-C6)烷基。

3.  根据权利要求1或2的化合物，其中-X1-ALK-是-S-CH2-。

4.  根据权利要求1至3的化合物，其中i是3、4、5、6、7、8、9或10。

5.  根据权利要求1至4的化合物，其具有式(II)：


6.  化合物，其选自以下化合物：


7.  根据前述权利要求任一项的化合物，其中-COZbRb是-COOH、-COO(C1-C6)烷
基、-COOMe 、-COOCH2CH=CH2、 基团
其中GI表示至少一个诱导基团-NO2、–Hal或–F。

8.  根据前述权利要求任一项的化合物，其形式为碱或盐或所述碱或所述盐的溶剂化物或水合物。

9.  制备缀合物的方法，包括以下步骤：
(i)使抗体的任选地添加缓冲液的水溶液与根据权利要求1至8的化合物的溶液接触；
(ii)然后任选地将步骤(i)中形成的缀合物与可能存在于溶液中的未起反应的试剂和任何聚集体分离。

10.  根据权利要求9的方法，其中所述反应的温度通常为20至40°C和/或所述反应时间为1至24小时。

11.  根据权利要求9至10的方法，其中在步骤(i)或(ii)之后，所述含缀合物的溶液经受超滤和/或渗滤的另外步骤(iii)。

12.  根据权利要求9至11的方法，其中所述抗体是特异结合EphA2受体的抗体或其表位结合片段，并且包括至少一个重链和至少一个轻链，其中所述重链包括具有由SEQIDNOS：1、2、和3表示的氨基酸序列的三个序贯互补决定区，并且其中所述轻链包括具有由SEQIDNOS：4、5、和6表示的氨基酸序列的三个序贯互补决定区。

13.  根据权利要求12的方法，其中所述抗体或所述表位-结合片段是人源化或表面修整的抗体或其表位-结合片段。

14.  根据权利要求12的方法，其中所述重链包括由SEQIDNO：12组成的氨基酸序列，和其中所述轻链包括由SEQIDNO：14组成的氨基酸序列。

15.  根据权利要求12的方法，其中所述重链的组成是氨基酸序列SEQIDNO：18，和其中所述轻链的组成是氨基酸序列SEQIDNO：16。

16.  可使用根据权利要求9至15的方法获得的缀合物。

17.  根据权利要求16的缀合物，其使用UV分光光度计测得的平均DAR高于4，更特别为4至10，甚至更特别为4至7，该DAR通过以下方程DAR=cD/cA确定，其中：
cD=[(εA280xA252)-(εA252xA280)]/[(εD252xεA280)-(εA252xεD280)]
cA=[A280-(cDxεD280)]/εA280
- -1
εD252=26,159M1cm
-1 -1
εD280=5,180Mcm
-1 -1
εA280=224,000Mcm
-1 -1
εA252=82,880Mcm
A252和A280是在UV分光光度计上分别在252和280nm测得的缀合物的吸光率。

18.  根据权利要求17的缀合物，其中DAR为5至8，更特别为5.5至8，甚至更特别为

5.  9至7.5。

19.  包含根据权利要求16至18的缀合物的水溶液。

20.  根据权利要求1至8的产物，其用作抗癌剂。

21.  根据权利要求16或18的缀合物，其用作抗癌剂。

22.  根据权利要求1至8的化合物用于制备缀合物的用途，其中具有下式的美登素生物碱类片段共价连接于抗体：

说明书新的美登素生物碱类以及该美登素生物碱类与抗体制备缀
合物的用途
技术领域
[0001]本发明涉及新的美登素生物碱类(maytansinoids)以及所述美登素生物碱类与抗体制备缀合物的用途。本发明也涉及包含所述美登素生物碱类和所述缀合物的组合物。
背景技术
[0002]关于用单克隆抗体-药物缀合物特异靶向肿瘤细胞的尝试已经发表了很多文章(Sela等人，inImmunoconjugates189-216(C.Vogel，ed.1987)；Ghose等人，在TargetedDrugs1-22(E.Goldberg，ed.1983)中；Diener等人，在Antibodymediateddeliverysystems1-23(J.Rodwell，ed.1988)中；Pietersz等人，在Antibodymediateddeliverysystems25-53(J.Rodwell，ed.1988)中；Bumol等人，在Antibodymediateddeliverysystems55-79(J.Rodwell，ed.1988)中。也参见：MonneretC.，etal.，BulletinduCancer2000，87(11)，829-38；RicartA.D.等人，NatureClinicalPracticeOncology
2007，4，245-255；SinghR.etRicksonH.K.，TherapeuticAntibodies：MethodsandProtocols，2009，525，445-467。不同类族的细胞毒素剂如紫杉烷衍生物(WO06061258)，细霉素(leptomycine)衍生物(WO07144709)，CC-1065和类似物(WO2007102069)或如甲氨蝶呤，道诺霉素，阿霉素，长春新碱，长春碱，美法仑，丝裂霉素C，苯丁酸氮芥已经用于与抗体接合。
[0003]使用对肿瘤细胞具有亲和性的寻靶抗体(targetingantibody)使得能够将细胞毒素剂直接递送至肿瘤细胞附近或直接投送到肿瘤细胞中，由此增加细胞毒素剂的功效而同时最小化通常与细胞毒素剂有关的副作用。
[0004]美登素生物碱类是源自美坦生的细胞毒素剂，其中美坦生是从脱落非洲灌木(castAfricanshrub)Maytenusserrata分离出的天然产物(US3896111)。已经制备出很多美登素生物碱类：参见US4151042；J.Med.Chem.1978，21，31-37；Nature1977，270，
721-722，Chem.Pharm.Bull.1984，3441-3451；US4248870；US4137230；Chem.Bull.1984，
3441。
现有技术
[0005] US5,208,020、US5,416,064、和R.V.J.Chari，31AdvancedDrugDeliveryReviews89-104(1998)描述了美登素生物碱类的缀合物如L-DM1(A)或L-DM4(A’)：[0006]

[0007]美登素生物碱类的缀合物描述于EP0425235和WO2004/103272。在EP0425235
中，描述了具有式(B1)、(B2)或(B3)的以下美登素生物碱类：
[0008]

[0009]其中Z0、Z1或Z2表示H或SR。
[0010]在WO2004/103272中，描述了具有式(C)的美登素生物碱类：
[0011]

[0012]其中Y’表示(CR7CR8)l(CR9=CR10)pC≡CqAr(CR5CR6)mDu(CR11=CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)uCR1R2SZ，其中A、B和D表示任选地取代的环烷基、环烯基、杂芳基或杂环烷基。[0013]在WO03/068144中，描述了具有式(D)的化合物：
[0014]

[0015]其中Z是细胞毒素剂，Q是R2COO、R2R3NCOO、R2OCOO、R2O、R2CONR3、R2R3N、R2OCONR3或
S。R2是SCR4R5R6。Z可以是选自以下的美登素生物碱类衍生物：
[0016]

[0017] 更特别地，公开了以下化合物(D)：
[0018]

[0019] 化合物(D)因此在聚乙二醇修饰的(pegylated)连接基中包含内二硫键。
[0020] 在2008年12月8日，ImmunogenInc.也在日内瓦的欧洲抗体大会(European
AntibodyCongress)公开了式(E)的缀合物：
[0021]

[0022] 和在于2008年10月在日内瓦举行的第20届的讨论会EORTC-NCI-AACR公开了式
(E’)的缀合物：
[0023]

[0024] 定义
[0025] ″烷基″表示脂族烃基团，其可以是在链中包含1至20个碳原子的直链或支化
的基团或包含3至10个碳原子的环状的基团。优选的烷基在链中包含1至12个碳原子。示例性的烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、2,2-二甲基丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、
3-戊基、辛基、壬基、癸基；
[0026]″环烷基″表示具有3至10个碳原子的环状脂族烃基。优选的环烷基在环状链中包含3至8个碳原子。示例性的环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基；
[0027]“芳基”表示具有6至14个碳原子、优选为6至10个碳原子的芳族单环或多环烃环系统。示例性的芳基包括苯基或萘基。
[0028]“杂芳基”表示不饱和的稳定的3至14元、优选为5至10元单、双、或多环，其中环的至少一个成员是杂原子。通常，杂原子是但不限于氧、氮、硫、硒或磷原子。优选地，杂原子是氧、氮或硫原子。示例性的杂芳基包括吡啶基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、嘧啶基、和三唑基；
[0029]“杂环烷基”表示包含至少一个杂原子的环烷基，其中环的至少一个成员是杂原子；
[0030]“烷氧基”表示-O-烷基，其中烷基如以上定义；
[0031]“烷酰氧基”表示-O-CO-烷基，其中烷基如以上定义；
[0032]“亚烷基”表示具有通式-CmH2m-的烷基，其由直链或支化烷烃通过移除两个氢原子形成。示例性的亚烷基包括亚甲基(-CH2-)，乙撑(-CH2CH2-)，丙撑(-CH2CH2CH2-)，丁撑
(-CH2CH2CH2CH2-)，异丁撑己撑(-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-)。直链亚烷基可以特别地由式-(CH2)m-表示，其中m为整数1至20；
[0033]“EphA2受体”表示属于Eph受体家族的酪氨酸激酶(在Pasquale，E.B.etal.，
2005，NatureReviewsMol.CellBiol.，6，462-475中综述)，并且包括例如以下的氨基序列：GenbankaccessionNosNM_004431(人EphA2)，NM_010139(鼠EphA2)，或NXM_345596(老鼠EphA2)。人EphA2是优选的EphA2受体。本申请使用的术语“EphA2配体”表示结合于、和任选地激活EphA2受体(例如刺激EphA2受体的自磷酸化)的蛋白质。本申请优选的EphA2配体是结合于EphA2受体的“ephrinA1”，并且包括，例如，GenbankaccessionNM_004428(人ephrinA1)中的氨基序列；
[0034]“多克隆抗体”是在一种或多种其它不同抗体之中或存在下制备的抗体。通常，多克隆抗体在几种其它制备不同抗体的B-淋巴细胞存在下由B-淋巴细胞制备。通常，多克隆抗体直接由免疫的动物获得；
[0035]“单克隆抗体”是由基本上同类抗体的群体获得的抗体，即形成该群体的抗体基本上相同，除了可能存在少量的自然产生的突变之外。这些抗体对准单个表位，因此是高度特异性的；
[0036]“裸抗体”是未接合于美登素生物碱类的抗体；
[0037]“表位”是在抗原上抗体结合的位点。表位可以通过邻接残基或通过经由折叠抗原蛋白而紧密邻近的非邻接残基形成。当暴露于变性溶剂时，通过邻接氨基酸形成的表位通常保留，而在所述暴露下通过非邻接氨基酸形成的表位通常丧失。
附图说明
[0038]图1：实施例1的去糖基化的缀合物在解卷积之后的HRMS谱；[0039]图2：实施例2的去糖基化的缀合物在解卷积之后的HRMS谱；[0040]图3：实施例3的去糖基化的缀合物在解卷积之后的HRMS谱；[0041]图4：实施例4的去糖基化的缀合物在解卷积之后的HRMS谱；[0042]图5：实施例5的去糖基化的缀合物在解卷积之后的HRMS谱；[0043]图6A-6C：序列；
[0044]图7：hu2H11R35R74缀合物在各种DAR的PK参数：柱状图表示在单剂量静脉给药
20mg/kgHGS中的缀合物给雄性CD-1鼠(n=4)之后，暴露于(AUC(0-inf)；左边)和清除
(Cl；右边)几种缀合物与DAR的关系。
[0045] 这些附图显示，对于各缀合物，存在携带0至10个美登素生物碱类的缀合物的分布(D0：无美登素生物碱类；Dx：x个美登素生物碱类)。
具体实施方式
[0046]新的美登素生物碱类
[0047]本发明涉及具有式(I)的化合物：
[0048]

[0049]其中：
[0050]●ALK是(C1-C6)亚烷基；
[0051] ●X1和X2各自独立地为以下基团之一：-CH=CH-、-CO-、-CONR-、-NRCO-、-COO-、-OCO-、-OCONR-、-NRCOO-、-NRCONR’-、-NR-、-S(O)n(n=0、1或2)或-O-；
[0052]●R和R’独立地为H或(C1-C6)烷基；
[0053]●i为整数1至40，优选为1至20，更优选为1至10；
[0054] ●当X2是-CH=CH-时，j是对应1的整数，当X2不是-CH=CH-时，j是对应2的整数；
[0055]●Zb是单键、-O-或-NH-，Rb是H或(C1-C6)烷基、(C3-C7)环烷基、芳基、杂芳基或
(C3-C7)杂环烷基；或Zb是单键且Rb是Hal。
[0056]更特别地，X2是-CH=CH-或-CONR-，其中CO基团连接于-X1-ALK-基团，而R是H或(C1-C6)烷基。更特别地，-X1-ALK-是-S-CH2-。更特别地，i是3、4、5、6、7、8、9或10。[0057]一种可以区别于式(II)的化合物：
[0058]

[0059] 式(II)包括更精确的以下化合物：
[0060]

[0061]化合物的存在形式可以是碱或盐或可以是所述碱或所述盐的溶剂化物或水合物。[0062]本发明的化合物包含反应性化学基团-C(=O)ZbRb(GCR1)，其对存在于抗体上的反应性化学基团(GCR2)具有反应性。GCR1和GCR2之间的反应使得可以通过共价键将细胞毒素剂连接到抗体上。因此，化合物倾向与抗体接合。更特别地，
Zb是O；在这种情况下，GCR1是羧酸基团(Rb=H)或酯基团。更特别地，-C(=O)ZbRb是-COOH、-COO(C1-C6)烷基，例如-COOCH3、或-COOCH2CH=CH2。在这些酯基团中，优选的是展示良好的对抗体的氨基(如赖氨酸基团)的反应性的那些活化酯。例如，活化酯可
以是以下的那些或基团 其
中GI表示至少一个诱导基团如-NO2或-Hal，例如-F。这种活化酯的实例是以下那些：
另一种-C(=O)ZbRb是
[0063] GCR2可以例如是在抗体表面的赖氨酸残基侧部上由赖氨酸具有的ε-氨基，铰链区的糖基或在还原链内S-S键之后半胱氨酸的硫醇基(GarnettM.C.，etal.，AdvancedDrugDeliveryReviews2001，53，171-216)。更近地，新方法已经意在通过突变引入半胱氨酸(JunutulaJ.R.，etal.，NatureBiotechnology2008，26，925-932；WO
09026274)或引入非天然氨基酸，使得可以开发新类型的蛋白质化学(deGraafA.J.，etal.，BioconjugateChem.2009，February3，2009(综述)；DOI:10.1021/bc800294a；WO
2006/069246以及ChinJ.W.，etal.，JACS2002，124，9026-9027(technologyReCode))。[0064] 本发明的化合物可以用于制备缀合物，在该缀合物上共价连接了至少一个具有下式的美登素生物碱类片段：
[0065]

[0066] 因此，具有式(I)的化合物可以用于制备缀合物，其中美登素生物碱类片段共价连接于抗体。
[0067] 制备具有式(I)的化合物的通用方案
[0068] 具有式(I)的化合物可以根据方案1制备：
[0069]

[0070] 方案1
[0071] 中间体P1包含RG1反应性基团，该基团能够与连接于包含PEG的中间体P2的反应性基团RG2反应形成X1。例如，X1=S的形成可以经由其中RG1=-SH的P1和其中RG2=-Br的
P2的反应通过在碱例如DIEA存在下的亲核取代反应制备。该反应的实例在实施例1.2给出。
[0072] 其中RG1=-SH的P1的实例是L-DM1和L-DM4以及EP1313738的化合物11a、c、d、
g：
[0073] L-DM1：ALK-SH=-CH2CH2-SH；[0074] L-DM4：ALK-SH=-CH2CH2CMe2-SH；[0075] 11a：ALK-SH=-CH2-SH；
[0076] 11c：ALK-SH=-CH2CH2CH2-SH；[0077] 11d：ALK-SH=-CH2CH2CH2CH2-SH；[0078] 11g：ALK-SH=-CHMe-CH2-SH
[0079] 反应的其它实例列于表I。
[0080] 表I
[0081]

[0082]

[0083]

[0084] 对于一些具有式(I)的化合物，最终所需的-ZbRb基团可以在另一个-ZbRb基团的至少一次转化之后在使P1和P2反应之后获得。实例在方案1’中给出，其中转化

[0085]

[0086] 方案1’
[0087] 同样，至少一次转化也可以在P1和P2的反应之前用于具有-ZbRb基团的中间体。
[0088] 另一个实例是转化-ZbRb=-OH→-ZbRb=Hal，其需要酰化试剂例如SOCl2。
[0089] 制备P1
[0090] P1可以使用美登木醇开始根据方案2制备：
[0091]

[0092]方案2
[0093]美登木醇通过酯化反应与包含反应性酰基-COOZ的中间体P3反应，其中Z是H或卤素原子。反应描述于WO2004/103272的图3a-d以及WO2007/021674。当Z是H时，酯化反应可以借助于增强酸官能团的反应性的偶联剂进行。
[0094]制备P2
[0095]制备P2的起始原料是PEG化合物，该化合物可以商购或可以使用所述可商购的PEG化合物通过本领域技术人员已知的至少一个化学反应制备。PEG化合物可商购，例如商购于JenKemTechnologyUSAInc.2033W.McDermottDr.Suite320#188，Allen，TX
75013-4675，USA。
[0096] 例如，下面描述使用可商购的化合物HOOCCH2CH2(OCH2CH2)i-OCH2CH2NH2来制备P2，其中X2=-CONR-和RG2=Hal(P2=Hal-ALK-CONR-CH2CH2(OCH2CH2)i-COZbRb)：
[0097]R=H
[0098]

[0099]步骤(i)：形成酰胺键和使酸基团活化；这两步骤分别在极性疏质子溶剂例如DCM中进行：胺基团和卤代链烷酸N-羟基琥珀酰亚胺基酯(例如卤代乙酸酯)反应，然后原位添加偶联剂例如DIC。
[0100]R≠H
[0101]

[0102]步骤(ii)：以呈酯形式保护羧酸和以呈三氟乙酰胺的形式保护胺；反应在极性疏质子溶剂例如DCM中在两个单独的步骤中进行：通过用三甲基甲硅烷基重氮甲烷用甲醇处理来保护酸，然后通过添加TFAA和TEA来保护胺；
[0103]步骤(iii)：将胺烷基化和将酯碱性水解；反应在极性疏质子溶剂如THF中在两个单独的步骤中进行：通过用NaH在携载离核基团的反应物例如烷基卤RHal的存在下处理将胺烷基化，添加LiOH在水中的溶液；
[0104]步骤(i)：在步骤(iii)之后，进行步骤(i)的反应，其中R=H。
[0105]同样，下面描述使用可商购的化合物Hal-CH2CH=CHCH2(OCH2CH2)i-COOtBu来制备
P2，其中X2=-CH=CH-和RG2=Hal(P2=Hal-CH2-CH=CH-CH2(OCH2CH2)i-COZbRb)：
[0106]

[0107]制备缀合物的方法
[0108]缀合物可以通过包括以下步骤的方法获得：
[0109](i)使抗体的任选地添加缓冲液的水溶液和式(I)的化合物的溶液接触并使其反应；
[0110](ii)然后任选地将步骤(i)中形成的缀合物与可能存在于溶液的未反应的试剂和任何聚集体分离。
[0111]细胞-结合剂的水溶液可以使用至少一种缓冲液缓冲，例如磷酸钾或N-2-羟基乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸(Hepes缓冲液)或缓冲液的混合物例如以下实施例中公开的缓冲液A。缓冲液取决于抗体的性质。具有式(I)的化合物处于在有机极性溶剂(或极性溶剂的混合物)例如DMSO或DMA中的溶液中。
[0112] 反应通常在20至40℃的温度进行。反应的持续时间可以为1至24小时。抗体和细胞毒素剂之间的反应可以通过空间排阻色谱(SEC)使用折射率和/或紫外检测器监测。如果缀合物收率过低，可以延长反应时间和/或可以添加具有式(I)的化合物。
[0113]本领域技术人员可使用多种不同的色谱方法以便于进行步骤(ii)的分离：缀合物可以通过以下技术纯化，例如SEC、吸附色谱(例如离子交换色谱，IEC)、疏水作用色谱(HIC)、亲和色谱、混合载体色谱例如羟基磷灰石色谱，或高效液相色谱(HPLC)。也可以使用通过渗析或渗滤的纯化。
[0114]可以使用的方法的实例描述于实施例I。
[0115]如本申请使用，术语“聚集体”表示可以在两个或更多个抗体之间形成的组合，该抗体已经或未通过接合进行改性。聚集体能够在大量参数的影响下形成，所述参数例如在溶液中高浓度的抗体、溶液的pH、高剪切力、结合的二聚物的数目和它们的疏水性质、温度
(参见Wang&Gosh，2008，J.MembraneSci.，318:311-316，以及其中引用的参考文献)；应注意这些参数中的一些的有关影响有时未精确阐明。在蛋白质或抗体的情况下，本领域技术人员可以参考Cromwelletal.(2006，AAPSJournal，8(3):E572-E579)。聚集体的含量可以使用本领域技术人员的已知技术(例如SEC)(参见Walteretal.，1993，Anal.Biochem.，212(2):469-480)确定。
[0116]在步骤(i)或(ii)之后，可以使含缀合物的溶液经受超滤和/或渗滤的另外的步骤(iii)。在这些步骤结束时可得到在水溶液中的缀合物。
[0117]缀合物在这些步骤的结束时作为水溶液回收。
[0118]抗体
[0119]术语“抗体”在本申请使用最宽的意义并且特别包括任何同种型的单克隆抗体(包括全长度单克隆抗体)例如IgG、IgM、IgA、IgD、和IgE，多克隆抗体，多特异性抗体(multispecificantibodies)，嵌合抗体，和抗体片段。与特异性抗原具有反应性的抗体可以通过重组方法(例如选择噬菌体或类似载体中重组抗体库)或通过使用抗原或编码抗原的核酸对动物进行免疫处理产生。
[0120]典型的抗体包括通过二硫键连接的两个相同的重链和两个相同的轻链。各重链和轻链包含恒定区和可变区。如本申请所使用，“VH”或“VH”是指抗体的免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’、或F(ab’)2片段的重链。关于“VL”或“VL”是指抗体的免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’、或F(ab’)2片段的轻
链。各可变区包含三个称为“互补决定区”(“CDR”)或“高变区”的片段，它们主要负责结合抗原的表位。它们通常称为CDR1、CDR2、和CDR3，从N-末端顺序编号。可变区的较高度保存的部分称为“构架区”(“FR”)。天然重链和轻链的可变区域各自包含四个FR区域，其广泛采用β-面构型，通过三个CDR连接，其中三个CDR形成环路连接，和在一些情况下形成β-面构型的部分。各链中的CDR通过FR区紧密接近地保持在一起，其中来自其它链的CDR有助于形成抗体的抗原-结合位点(参见Kabatetal.，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，5thedition，NationalInstituteofHealth，Bethesda，MD，
1991)。
[0121] 抗体(关于更多的详情参见，Janewayetal.《Immunobiology》，5thed，2001，GarlandPublishing，NewYork)可以例如选自WO04043344，WO08010101，WO08047242或WO05009369(anti-CA6)中提及的那些。
[0122]也可以考虑识别种类AEph受体家族成员例如EphA2受体(优选为人EphA2受体)并且用作所述受体的拮抗物的抗体或其片段。该抗体无任何激动剂活性。抗体或其表位-结合片段可以是描述于权利要求12-15的那些。
[0123]人源化抗体或其表位-结合片段优选地具有抑制表达EphA2受体的癌细胞的生长的另外能力。人源化抗体或其表位-结合片段优选地具有抑制表达EphA2受体的转移癌细胞移动的另外能力。
[0124]人源化抗体可以是人源化2H11R35R74抗体，或其表位-结合片段。人源化抗体可以通过编码hu53.2H11的多核苷酸序列的位点导向突变形成获得(WO2008/010101)。优选地，提供了2H11R35R74抗体的表面修整或人源化类型，其中抗体或其片段的表面暴露残基在轻链和重链都进行替换以更接近地类似已知的人抗体表面。人源化2H11R35R74抗体或其表位-结合片段具有改善的性质。例如，人源化2H11R35R74抗体或其表位-结合片段特异性识别EphA2受体。更优选地，人源化2H11R35R74抗体或其表位-结合片段具有抑制EphA2受体-表达细胞的生长的另外的能力。
[0125]2H11R35R74抗体的人源化类型在本申请关于以下方面完全表征：轻链和重链可变区的它们各自的氨基酸序列，轻链和重链可变区的基因的DNA序列，CDR的鉴定，它们表面氨基酸的鉴定，和关于它们以重组形式的表达方法的公开。但是，范围不限于抗体和包含这些序列的片段。相反，也考虑特异性结合EphA2受体的所有抗体和片段。优选地，特异性结合EphA2受体的抗体和片段拮抗受体的生物活性。更优选地，这样的抗体进一步基本上无激动剂活性。因此，抗体和表位-结合抗体片段可以在以下方面不同于2H11R35R74抗体或其人源化衍生物：它们的支架的氨基酸序列、CDR、和/或轻链和重链，但是仍然落在本发明的范围内。
[0126]2H11R35R74抗体的CDR通过建模确定，并且已经预知它们的分子结构。再次，尽管CDR对于表位识别重要，但是它们对本发明的抗体和片段不是关键的。因此，提供了具有改善性质的抗体和片段，这些性质通过例如本发明抗体的亲和力成熟产生。
[0127] 已经确定了鼠轻链IgVκ和Jκ种系细胞基因和重链IgVh和Jh种系细胞基因，其中53.2H11很可能源自于鼠轻链IgVκ和Jκ种系细胞基因和重链IgVh和Jh种系细胞基因，并且公开于WO2008/010101。所述种系细胞序列的登录号分别为MMU231196和AF303833。这样的种系细胞基因序列用于确定抗体中的体细胞突变，包括在CDR中的体细
胞突变。
[0128]2H11R35R74抗体的重链和轻链可变区的序列，以及它们的CDR的序列陈述于本申请。这样的信息可以用于制备2H11R35R74抗体的人源化类型。也可以通过hu53.2H11的位点导向突变形成获得本发明的人源化2H11R35R74抗体。这些人源化抗EphA2抗体或它们的衍生物也可以用作本发明的缀合物的细胞结合剂。
[0129] 因此，在一种实施方式中，本发明提供人源化抗体或其表位-结合片段，其包括一个或多个具有选自SEQIDNOS：1、2、3、4、5、6的氨基酸序列的CDR。在优选的实施方式中，本发明的人源化抗体包括至少一个重链和至少一个轻链，其中所述重链包括具有由SEQIDNOS：1、2、和3表示的氨基酸序列的三个序贯CDR，并且其中所述轻链包括具有由SEQIDNOS：4、5、和6表示的氨基酸序列的三个序贯CDR。
[0130] 人源化2H11R35R74抗体或其片段优选地包括具有由SEQIDNO.12组成的氨基酸序列的VH。包括具有由SEQIDNO14组成的氨基酸序列的VL的人源化2H11R35R74抗体或其片段也是优选的。优选地，人源化2H11R35R74抗体包括至少一个重链和至少一个轻链，其中所述重链包括具有由SEQIDNOS：1、2、和3表示的氨基酸序列的三个序贯CDR，其中所述轻链包括具有由SEQIDNOS：4、5、和6表示的氨基酸序列的三个序贯CDR，其中所述重链具有由SEQIDNO.12组成的氨基酸序列，和其中所述轻链具有由SEQIDNO.14组成的氨基酸序列。
[0131] 缀合物
[0132] 缀合物通常包括共价连接于抗体的1至10个美登素生物碱类的分子(所谓的“，药物-比-抗体比率”或“DAR”)。该数目可以根据抗体的性质和美登素生物碱类的性质，以及用于接合的实验条件(例如美登素生物碱类/抗体比率，反应时间，溶剂的性质和如果使用的助溶剂的性质)变化。因此，抗体和美登素生物碱类之间的接触得到包含以下的混合物：几种在不同的药物-比-抗体比率方面不同的缀合物；任选的裸抗体；任选的聚集体。确定的DAR因此是平均值。
[0133]本发明因此也涉及缀合物，其包含一种或多种共价连接于抗体的权利要求1-8中任一项限定的化合物。该连接优选地通过酰胺键实现。抗体优选地如权利要求12-15中任一项限定。
[0134] 本申请用于确定DAR的方法包括用分光光度法测量基本上纯的缀合物(即在步骤(ii)之后)的溶液在252nm和280nm的吸光率之比。特别地，所述DAR可以用分
-1 -1
光光度法使用在280和252nm测量的消光系数来确定：对于抗体，εA280=224,000Mcm
-1 -1
和εA252=82,880Mcm
；假定抗体的平均160,000分子量，对于美登素生物碱类，
-1 -1
-1 -1
εD280=5,180Mcm
和εD252=26,159M
cm)。计算的方法得自AntonyS.Dimitrov(ed)，LLC，
2009，TherapeuticAntibodiesandProtocols，vol525，445，SpringerScience并且更详细地描述于以下：
[0135]缀合物在252nm的吸光率(A252)和在280nm的吸光率(A280)在SEC分析的单体峰上(允许计算“DAR(SEC)”参数)或使用标准分光光度计设备(允许计算“DAR(UV)”参数)测量。吸光率可以如下表示：
[0136]A252=(cDxεD252)+(cAxεA252)
[0137]A280=(cDxεD280)+(cAxεA280)
[0138] 其中：
[0139] ●cD和cA分别是美登素生物碱类和抗体的溶液中的浓度
[0140] ●εD252和εD280分别是美登素生物碱类在252nm和280nm的摩尔消光系数
[0141] ●εA252和εA280分别是抗体在252nm和280nm的摩尔消光系数。
[0142] 具有两个未知数的这两个方程的解得到以下方程：
[0143] cD=[(εA280xA252)-(εA252xA280)]/[(εD252xεA280)-(εA252xεD280)]
[0144] cA=[A280-(cDxεD280)]/εA280
[0145] 平均DAR然后由药物浓度与抗体浓度之比计算：
[0146] DAR=cD/cA
[0147] 使用UV分光光度计测得的平均DAR(DAR(UV))更特别地高于4，更特别为4至10，甚至更特别为4至7。
[0148]缀合物以及具有式(I)的化合物可以用作抗癌剂。有利地，抗体使得可以之比对肿瘤细胞具有选择性的试剂，由此使得美登素生物碱类靶向肿瘤细胞的近环境或直接进入肿瘤细胞的内部(参见《Antibody-drugconjugatesforcancertherapy》CarterP.J.，etal.，CancerJ.2008，14，154-169；《Targetedcancertherapy:conferringspecificitytocytotoxicdrugs》ChariR.，Acc.Chem.Res.2008，41，98-107)。可以处理实体肿瘤或非实体肿瘤(liquidtumour)。
[0149] 将缀合物以缓冲水溶液的形式配制，浓度优选为1至10mg/ml。可以将该溶液原样给药或者可以稀释而形成输液剂。
实施例
[0150] 方法A：高压液相色谱-质谱(LCMS)
[0151] 波谱在WatersUPLC-SQD装置上以正离子和/或负离子电喷雾模式(ES+/-)获得。色谱条件如下：柱：ACQUITYBEHC18，1.7μm-2.1x30mm；溶剂：A：H2O(0.1%甲酸)B：CH3CN(0.1%甲酸)；柱温度：45℃；流动速率：0.6ml/min；梯度(2min)：在1min内由5%的B至50%的B；1.3min：100%的B；1.45min：100%的B；1.75min：5%的B。
[0152] 方法B：高压液相色谱-质谱(LCMS)
[0153]波谱在WatersZQ装置上以正离子和/或负离子电喷雾模式(ES+/-)获得。色谱条件如下：柱：XBridgeC182.5μm3x50mm；溶剂：A：H2O(0.1%甲酸)B：CH3CN(0,1%甲酸；柱温度：70℃；流动速率：0.9ml/min；梯度(7min)：在5.3min内由5%的B至100%的B；
5.5min：100%的B；6.3min：5%的B。
[0154] 方法C：质谱(MS)
[0155] 波谱在WatersUPLC-SQD装置上以正离子和/或负离子电喷雾模式(ES+/-)获得。色谱条件如下：柱：ACQUITYBEHC181,7μm-2,1x50mm；溶剂：A：H2O(0,1%甲酸)B：CH3CN(0,1%甲酸)；柱温度：50℃；流动速率：1ml/min；梯度(2min)：在0.8min内由5%的B至50%的B；1,2min：100%的B；1,85min：100%的B；1,95：5%的B。
[0156] 方法D：高压液相色谱-质谱(LCMS)
[0157] 波谱在WatersUPLC-SQD装置上以正离子和/或负离子电喷雾模式(ES+/-)获得。色谱条件如下：柱：ACQUITYBEHC181.7μm-2.1x50mm；溶剂：A：H2O(0.1%甲酸)B：
CH3CN(0.1%甲酸)；柱温度：50℃；流动速率：1ml/min；梯度(2min)：在0.8min内由5%的B
至50%的B；1.2min：100%的B；1.85min：100%的B；1.95：5%的B。
[0158] 方法G：缀合物的去糖基化和高分辨质谱(HRMS)
[0159] 去糖基化是使用糖苷酶进行酶消化的技术。以500μl缀合物+100μl的TrisHCl50mM缓冲液+10μl聚糖酶(glycanase)-F酶(100单位冻干的酶/100μl水)开始进行去糖基化。用涡流混合该混合物并使其在37℃保持过夜。然后去糖基化的样品准备通过HRMS分析。质谱都在WatersQ-Tof-2装置上以正离子电喷雾模式(ES+)得到。色谱条件如下：柱：4μmBioSuite250URHSEC4.6x300mm(Waters)；溶剂：A：甲酸铵25mM+1%甲酸：B：CH3CN；柱温度：30℃；流动速率0.4ml/min；无梯度洗脱70%A+30%B(15min)。[0160] 方法H：分析空间排阻色谱(SEC)
[0161] 柱：TSKgelG3000SWXL5μm柱，7.8mmx30cm，TOSOHBIOSCIENCE，LLC部分
#08541
[0162] 流动相：KCl(0.2M)，KH2PO4(0.052M)，K2HPO4(0.107M)，异丙醇(20%，以体积计)
[0163] 分析条件：以0.5ml/min无梯度洗脱30min
[0164] 分析在LachromEliteHPLC装置(Merck)上使用L2455DAD分光光度计检测器进行。
[0165] 缓冲液内容物
[0166] 缓冲液A(pH6.5)：NaCl(50mM)，磷酸钾缓冲液(50mM)，EDTA(2mM)
[0167] 缓冲液HGS(pH5.5)：组氨酸(10mM)，甘氨酸(130mM)，蔗糖5%(w/v)，HCl(8mM)
[0168] 使用的缩写
[0169] AcOEt：乙酸乙酯；ALK：(C1-C12)亚烷基，更特别为(C1-C6)亚烷基；DAR：药物抗体比；DBU：1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯；DCC：N,N’-二环己基碳二酰亚胺；DCM：二氯甲烷；DEAD：偶氮二羧酸二乙酯；DIC：N,N’-二异丙基碳二酰亚胺；DIPEA：N,N-二异丙基乙胺；DMA：二甲基乙酰胺；DMAP：4-二甲基氨基吡啶；DME：二甲氧基乙烷；DMF：二甲基甲酰胺；DMSO：二甲基亚砜；ε：摩尔消光系数；EEDQ：2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉；EDCl：N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二酰亚胺；EDTA：乙二胺四乙酸；Fmoc：芴基甲氧基羰基；Hal：卤素原子；HOBt：1-羟基苯并三唑；HEPES：4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸；HRMS：高分辨质谱；NHS：N-羟基琥珀酰亚胺；iPrOH：异丙醇；NMP：N-甲基吡咯烷酮；Rf：保留因子；RP：减压；RT：室温；SEC：空间排阻色谱；TBDMS：叔-丁基二甲基甲硅烷基；TEA：三乙胺；TFA：三氟乙酸；TFAA：三氟乙酸酐；TFF：切向流过滤；THF：四氢呋喃；TIPS：三异丙基甲硅烷基；TLC：薄层色谱；tR：保留时间。
[0170] 用于实施例的抗体
[0171] 两种抗体用于制备缀合物：
[0172]hu2H11：(也参考WO2008010101中的hu532H11)：抗体通过在布达佩斯条约下保藏在AmericanTypeCultureCollection，登录号PTA-7662的杂交瘤制得，并且描述于PCT申请WO2008/010101；
[0173] hu2H11R35R74：该人源化抗体结合于EphA2受体并且通过hu532H11(由序列SEQIDNO：18的重链和序列SEQNO：16的轻链组成)的位点-导向突变形成获得。[0174] 实施例1
[0175]

[0176]1.1.制备缀合物hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4
[0177] 在磁力搅拌下，在室温，添加9ml的hu2H11R35R74(14.36mg/ml在缓冲液A中)，然后添加16.85ml缓冲液A、3.23ml的HEPES1M、1.59ml的DMA，然后添加1.64ml的
L-DM4-AcNH-PEG4-CONHS活化酯的10mMDMA溶液。在室温进行1小时30分钟之后，添加额外0.085ml的L-DM4-AcNH-PEG4-CONHS活化酯的10mMDMA溶液。在室温进行1小时45分钟之后，粗缀合物介质用60ml的HGS缓冲液稀释并且通过TFF在Pellicon3cassettes上纯化。使样品逆着～10倍样品体积的HGS缓冲液渗滤，然后收集样品。TFF容器和线路用额外10ml的HGS缓冲液清洗。将两种溶液混合，通过0.22μmPVDF过滤-灭菌，在Amicon15上浓缩并通过0.22μmPVDF过滤-灭菌。由此得到17ml的hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4缀合物(c=5.76mg/ml)。然后针对最终药物载量(finaldrugload)和单体纯度分析缀合物。SEC分析(方法H)：DAR(SEC)=5.4；RT=16.757min；单体纯度=99.5%；HRMS数据：参见图1。
[0178]1.2.制备L-DM4-AcNH-PEG4-CONHS活化酯
[0179]在室温进行磁力搅拌下，将154.3mg的L-DM4(根据WO04/103272制备-参见化合物4b)装入玻璃小瓶中。然后添加90mg的3-[2-(2-{2-[2-(2-溴-乙酰氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯在0.94ml的DMA中的溶液，然后添加36μl的DIEA。在室温进行23小时之后，反应介质用5ml的AcOEt稀释并用7ml水洗涤。水相用5ml的AcOEt萃取。合并的有机相用MgSO4干燥，在RP下浓缩至干燥。得到228mg浅黄色粘性油，该产物用最小量的DMA稀释并通过快速色谱法在30g的C18-接枝的硅胶上纯化(洗脱梯度：水:乙腈的体积比为95:5至5:95)。在RP下浓缩级分2和3之后，获得无色粘性油，该产物用最小量的DMA稀释并通过快速色谱法在30g的C18-接枝的硅胶上纯化(洗脱梯度：水:乙腈的体积比为95:5至5:95)。在RP下浓缩级分
33至35之后，41mg的L-DM4-AcNH-PEG4-CONHS活化酯以白色蛋糖霜状产物的形式获得。质谱(B)：RT=4,06min；[M+H-H2O]+：m/z1164；[M+H]+：m/z1182；[M-H+HCO2H]-：m/z1226；
1HNMR(500MHz，以ppm计的δ，氯仿-d)：0.80(s，3H)；1.21(s，3H)；1.22(s，3H)；1.25(m，
1H)；1.29(d，J＝6,7Hz，6H)；1.46(m，1H)；1.57(d，J＝13.4Hz，1H)；1.64(s，3H)；1.76至
1.83(m，1H)；1.88至1.96(m，1H)；2.18(dd，J＝2.5et14.3Hz，1H)；2.36(m，1H)；2.53(m，
1H)；2.61(dd，J＝12.5和14.3Hz，1H)；2.82至2.92(m，10H)；2.98(d，J＝16.7Hz，1H)；
3.03(d，J＝9.6Hz，1H)；3.15(d，J＝12.9Hz，1H)；3.22(s，3H)；3.32(宽s，1H)；3.36(s，
3H)；3.42(m，2H)；3v50(d，J＝9.1Hz，1H)；3.53(t，J＝5.2Hz，2H)；3.58至3v67(m，13H)；
3.84(t，J＝6.4Hz，2H)；3.99(s，3H)；4.27(m,1H)；4.77(dd，J＝2.9和11.9Hz，1H)；
5.42(q，J＝6.7Hz，1H)；5.66(dd，J＝9.1和15.4Hz，1H)；6.23(s,1H)；6.43(dd，J＝11.3
和15.4Hz，1H)；6.64(d，J＝1.1Hz，1H)；6.74(d，J＝11.3Hz，1H)；6.85(d，J＝1.1Hz，1H)；
7.08(t，J＝5.2Hz，1H)
[0180] 1.3.制备3-[2-(2-{2-[2-(2-溴-乙酰氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯
[0181] 在室温进行磁力搅拌下，将671.4mg的3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸(CA(PEG)4，Pierce)装入玻璃小瓶中。然后添加597.4mg的溴-乙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯在14ml的DCM中的溶液。在室温进行15分钟之后，添加0.396ml的DIC。在1小时30min之后，使粗的反应接枝在烧结玻璃上过滤，使滤液通过快速色谱法在100g的CN-接枝的硅胶上纯化(洗脱梯度：正庚烷/iPrOH/AcOEt，其中增加iPrOH部分)。在RP下浓缩级分30至45之后，761mg的3-[2-(2-{2-[2-(2-溴-乙酰氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯以无色油的形式获得。质谱(A)：RT=0.74min；[M+H]+：m/z483/485(由于Br的两个同位素而存在两个峰)；[M-H+HCO2H]-：m/z527/529(由于Br的两个同位素而存在两个峰)。[0182] 溴-乙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯可以按照公开的过程制备(Biochemistry
1974，481)。
[0183]实施例2
[0184]

[0185]2.1.制备缀合物hu2H11R35R74-PEG4-NMeAc-DM4
[0186]在室温进行磁力搅拌下，添加4ml的hu2H11R35R74(14.36mg/ml在缓冲液A中)，然后添加7.5ml缓冲液A、1.45ml的HEPES1M、1.05ml的DMA，然后添加0.39ml的L-DM4-AcNMe-PEG4-CONHS活化酯的10mMDMA溶液。在室温进行30分钟之后，添加额外
0.19ml的L-DM4-AcNH-PEG4-CONHS活化酯的10mMDMA溶液。在室温进行3小时之后，粗缀合物介质用65ml的HGS缓冲液稀释并且通过TFF在Pellicon3cassettes上纯化。使样品逆着～10倍样品体积的HGS缓冲液渗滤，然后收集样品。TFF容器和线路用额外10ml
的HGS缓冲液清洗。将两种溶液混合，在Amicon15上浓缩并通过0.22μmPVDF过滤-灭菌。由此得到8.5ml的hu2H11R35R74-PEG4-NMeAc-DM4缀合物(c=6.01mg/ml)。然后针对最终药物载量和单体纯度分析缀合物。SEC分析(H)：DAR(SEC)=5.5；RT=16.7min；单体纯度=99.4%；HRMS数据：参见图2。
[0187]2.2.制备L-DM4-AcNMe-PEG4-CONHS活化酯
[0188]在室温进行磁力搅拌下，将133.4mg的L-DM4装入玻璃小瓶中。然后添加85mg的3-{2-[2-(2-{2-[(2-溴-乙酰基)-甲基-氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯在0.2ml的DCM中的溶液，然后添加32.9μl的DIEA。在室温进行1小时之后，使反应介质通过快速色谱法在30g的C18-接枝的硅胶上纯化(洗脱梯度：水:乙腈的体积比为95:5至5:95)。在RP下浓缩包含所需产物的级分之后，71.3mg的L-DM4-AcNMe-PEG4-CONHS活化酯以无色玻璃状产物的形式获得。质谱(D)：RT=0.98min；[M+H-H2O]+：m/z1178(主信号)；[M+Na]+：m/z1218；[M-H+HCO2H]-：m/z
1240；1HNMR(500MHz，以ppm计的δ，氯仿-d)：0.81(s，3H)；1.20至1.33(m，13H)；1.42
至1.52(m，1H)；1.56至1.61(m，1H)；1.65(s，3H)；1.73至1.83(m，1H)；1.96至2.04(m，
1H)；2.19(dd，J＝2.8和14.4Hz，1H)；2.29至2.41(m，1H)；2.55至2.66(m，2H)；2.83至
2.93(m，12H)；3.04(d，J＝9.8Hz，1H)；3.12(d，J＝12.7Hz，1H)；3.18至3.25(m，5H)；
3.37(s，3H)；3.47至3.54(m，3H)；3.57至3.68(m，15H)；3.85(t，J＝6.6Hz，2H)；3.99(s，
3H)；4.29(m，1H)；4.79(dd，J＝2.8和12.2Hz，1H)；5.41(q，J＝6.7Hz，1H)；5.68(dd，J＝
9.3和15.2Hz，1H)；6.23(s，1H)；6.43(dd，J＝11.0和15.2Hz，1H)；6.66(s，1H)；6.74(d，
J＝11.0Hz，1H)；6.83(s，1H)。
[0189]2.3.制备3-{2-[2-(2-{2-[(2-溴-乙酰基)-甲基-氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯
[0190]

[0191]在磁力搅拌下，在室温，在圆底烧瓶中，接连添加115.1mg的3-(2-{2-[2-(2-甲基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸、1.5ml的DCM、97.3mg的溴-乙酸
2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯。在2小时之后，添加72μl的DIEA，在室温再进行1小时之后，添加70.2μl的DIC。使粗反应介质在室温保持4小时，在-20℃保持16小时，然后通过快速色谱法在30g硅胶上纯化(洗脱梯度：DCM:甲醇的体积比为0:100至3:97)。在RP下浓缩包含所需产物的级分之后，85.8mg的3-{2-[2-(2-{2-[(2-溴-乙酰基)-甲基-氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯以白色固体的形式获得。质谱(A)：RT=0.84min；[M+H]+：m/z497/499
[0192]2.4.制备3-(2-{2-[2-(2-甲基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸
[0193]

[0194]在Ar的惰性气氛下，在圆底烧瓶中，伴随磁力搅拌，接连添加120.1mg的
3-[2-(2-{2-[2-(2,2,2-三氟-乙酰氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸甲酯、1ml无水THF和59.8μl的CH3I。反应介质用冰/水浴在约0℃冷却，并以少部分缓慢添加16.1mg的NaH(在油中50%纯度)。在0℃进行15分钟之后，和在室温进行1小时之后，将粗反应介质在RP下浓缩至干燥，并用0.5ml的THF和0.8ml水稀释。在室温，然后将
30.6mg的LiOH添加到反应介质中。使粗反应介质在室温保持2小时，在-20℃保持16小时，然后通过快速色谱法在30g的C18-接枝的硅胶上纯化(洗脱梯度：水:乙腈的体积比为95:5至5:95)。在RP下浓缩包含所需产物的级分之后，115.3mg的3-(2-{2-[2-(2-甲基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸以黄色油的形式获得。
[0195] 2.5.制备3-[2-(2-{2-[2-(2,2,2-三氟-乙酰氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸甲酯
[0196]

[0197]在Ar的惰性气氛下，在圆底烧瓶中，伴随磁力搅拌，接连添加230mg的
3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸(CA(PEG)4，Pierce)、
2ml的DCM和1ml甲醇。在室温，将1ml三甲基甲硅烷基重氮甲烷(在己烷中的2M溶液)缓慢添加到反应介质中。在室温进行2小时之后，过量的三甲基甲硅烷基重氮甲烷通过添加乙酸中和。然后在RP下蒸发粗产物至干燥。所获得的残留物用2ml的DCM稀释，用水-冰浴冷却至0℃，然后接连添加363μl的TEA和300μl的TFAA。在室温进行2小时30分钟之后和在-20℃进行19小时之后，接连添加363μl的TEA和300μl的TFAA。在室温的4小时30分钟之后，在-20℃存放粗产物，然后通过快速色谱法在30g的C18-接枝的硅胶上纯化(洗脱梯度：水:乙腈的体积比为95:5至5:95)。在RP下浓缩包含所需产物的级分之后，123mg的3-[2-(2-{2-[2-(2,2,2-三氟-乙酰氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸甲酯以浅黄色油的形式获得。质谱(A)：RT=0.90min；[M+H]+：m/z376；[M-H]-：m/z374。
[0198]实施例3
[0199]

[0200]3.1.制备缀合物hu2H11R35R74-PEG8-NHAc-DM4
[0201] 在室温进行磁力搅拌下，添加4ml的hu2H11R35R74(14.36mg/ml在缓冲液A中)，然后添加7.5ml的缓冲液A、1.45ml的HEPES1M、1.05ml的DMA，然后添加0.405ml的
L-DM4-AcNMe-PEG8-CONHS活化酯的10mMDMA溶液。在室温进行30分钟之后，添加额外
0.1ml的L-DM4-AcNMe-PEG8-CONHS活化酯的10mMDMA溶液。在室温进行1小时45分钟之后，粗缀合物介质用60ml的HGS缓冲液稀释并且通过TFF在Pellicon3cassettes上纯化。使样品逆着～10倍样品体积的HGS缓冲液渗滤，然后收集样品。TFF容器和线路用额外10ml的HGS缓冲液清洗。将两种溶液混合，在Amicon15上浓缩并通过0.22μmPVDF过滤-灭菌。由此得到7.0ml的hu2H11R35R74-PEG8-AcNMe-DM4缀合物(c=6.95mg/ml)。然后针对最终药物载量和单体纯度分析缀合物。SEC分析(H)：DAR(SEC)=5.0；RT=16.593min；单体纯度=99.5%；HRMS数据：参见图3。
[0202] 3.2.制备L-DM4-AcNH-PEG8-CONHS活化酯
[0203]在室温进行磁力搅拌下，将65mg的3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(3-溴-丙酰氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯装入玻璃小瓶中。然后添加67.7mg的L-DM4在
0.85mlDMA中的溶液和16.5μl的DIEA。在室温进行48小时之后，使反应介质通过快速色谱法在10g硅胶上纯化(洗脱梯度：DCM:MeOH的体积比为100:0至90:10)。在RP下浓缩级分18至26之后，17mg的L-DM4-AcNH-PEG8-CONHS活化酯以无色玻璃的形式获得。质谱(B)：RT=4.08min；[M+H-H2O]+：m/z1340(主信号)；[M+Na]+：m/z1380；[M-H+HCO2H]-：m/z1402；1HNMR(400MHz，以ppm计的δ，氯仿-d)：0.81(s，3H)；1.22(s，3H)；1.23(s，
3H)；1.26(m，1H)；1.30(d，J＝6.8Hz，6H)；1.41至1.52(m，1H)；1.65(s，3H)；1.80(m，1H)；
1.89至1.99(m，1H)；2.19(m，1H)；2.37(m，1H)；2.47至2.67(m，2H)；2.81至2.93(m，10H)；
2.99(d，J＝16.6Hz，1H)；3.04(d，J＝9.8Hz，1H)；3.16(宽d，J＝13.7Hz，1H)；3.23(s，
3H)；3.32(宽s，1H)；3.37(s，3H)；3.44(m，2H)；3.51(d，J＝9.1Hz，1H)；3.54(t，J＝
5.4Hz，2H)；3.59至3.73(m，29H)；3.86(t，J＝6.6Hz，2H)；4.00(s，3H)；4.22至4.33(m，
1H)；4.78(dd，J＝2.9和12.2Hz，1H)；5.43(q，J＝6.8Hz，1H)；5.67(dd，J＝9.0和15.2Hz，
1H)；6.23(s，1H)；6.44(dd，J＝11.2和15.2Hz，1H)；6.65(d，J＝1.5Hz，1H)；6.75(d，J＝
11.2Hz，1H)；6.86(d，J＝1.5Hz，1H)；7.02至7.13(m，1H)。
[0204]3.3.制备3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(3-溴-丙酰氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯：
[0205]

[0206] 在室温进行磁力搅拌下，接连添加100mg的3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸(CA(PEG)4，Pierce)，2ml的DCM和53.5mg溴-乙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯到玻璃小瓶中。在室温进行1小时之后，添加35.1μl的DIC。在1小时之后，使粗反应介质在烧结玻璃上过滤，在RP下浓缩至干燥，用10ml的AcOEt稀释，在烧结玻璃上过滤并在RP下浓缩至干燥。76.5mg的3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(3-溴-丙酰氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯以无色油的形式获得。质谱(A)：RT=0.80min；[M+H]+：m/z659/661；[M-H+HCO2H]-：m/z703/705
[0207] 实施例4
[0208]

[0209] 4.1.制备缀合物hu2H11R35R74-PEG4-烯丙基-DM4
[0210] 在室温进行磁力搅拌下，添加4ml的hu2H11R35R74(14.36mg/ml在缓冲液A中)，然后添加7.5ml缓冲液A、1.45ml的HEPES1M、1.14ml的DMA，然后添加0.3ml的L-DM4-烯丙基-PEG4-CONHS活化酯的10mMDMA溶液。在室温进行30分钟之后，添加额外0.125ml的
L-DM4-烯丙基-PEG4-CONHS活化酯的10mMDMA溶液。在室温进行1小时25分钟之后，粗缀合物介质用65ml的HGS缓冲液稀释并且通过TFF在Pellicon3cassettes上纯化。使样品逆着～10倍样品体积的HGS缓冲液渗滤，然后收集样品。TFF容器和线路用额外10ml的HGS缓冲液清洗。将两种溶液混合，在Amicon15上浓缩并通过0.22μmPVDF过滤-灭菌。由此得到8.0ml的hu2H11R35R74-PEG4-烯丙基-DM4缀合物(c=5.22mg/ml)。然后针对最终药物载量和单体纯度分析缀合物。SEC分析(H)：DAR(SEC)=5.3；RT=16.767min；单体纯度=99.4%；HRMS数据：参见图4.
[0211] 4.2.制备L-DM4-烯丙基-PEG4-CONHS活化酯
[0212] 在室温进行磁力搅拌下，接连添加70mg的L-DM4、45mg的
3-(2-{2-[2-(4-溴-丁-2-烯氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(溴-烯丙基-PEG4-CONHS)、0.5ml的DMA和23.5μl的DIEA到玻璃小瓶中。在室温进行2小时之后和在-20℃的17小时之后，添加50μl的DIEA。在室温进行24小时之后，使反应介质通过快速色谱法在30g的C-18接枝的硅胶上纯化(洗脱梯度：水:乙腈的体积比为95:5至5:95)。在RP下浓缩包含预期产物的级分之后，47.1mg的L-DM4-烯丙基-PEG4-CONHS活化酯以白色固体的形式获得。质谱(D)：RT=1.06min；[M+Na]+：m/z1173；
1HNMR(500MHz，以ppm计的δ，氯仿-d)：0.81(s，3H)；1.18至1.39(m，13H)；1.42至
1.52(m，1H)；1.58(d，J＝13.4Hz，1H)；1.65(s，3H)；1.73至1.82(m，1H)；1.86至1.95(m，
1H)；2.19(d，J＝14.3Hz，1H)；2.40(m，1H)；2.51至2.65(m，2H)；2.82至2.95(m，9H)；2.98
至3.07(m，2H)；3.12(d，J＝12.6Hz，1H)；3.18至3.27(m，1H)；3.23(s，3H)；3.36(s，3H)；
3.51(d，J＝9.1Hz，1H)；3.54至3.82(m，13H)；3.86(t，J＝6.4Hz，2H)；3.91至3.95(m，
2H)；3.99(s，3H)；4.28(t，J＝11.0Hz，1H)；4.78(dd，J＝2.6和11.9Hz，1H)；5.44(q，J＝
6.7Hz，1H)；5.49至5.63(m，2H)；5.68(dd，J＝9.1和15.0Hz，1H)；6.24(s，1H)；6.43(dd，
J＝11.1和15.0Hz，1H)；6.66(s，1H)；6.77(d，J＝11.1Hz,1H)；6.83(s，1H)。
[0213] 4.3.制备3-(2-{2-[2-(4-溴-丁-2-烯氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙
酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯
[0214]

[0215]在室温，接连添加200mg的3-(2-{2-[2-(4-溴-丁-2-烯氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸，4ml的DCM和232.3mg的负载型DCC(2当量)到玻璃小瓶中。在室温进行1小时之后，添加64.8mg的NHS。在室温进行5小时之后，使粗产物在烧结玻璃上过滤，固体用DCM洗涤，将合并的滤液在RP下浓缩至干燥。通过快速色谱法在15g硅胶上纯化(洗脱梯度：MeOH:DCM体积比为0:100至10:90)，在RP下浓缩包含预期产物的级分，得到
46mg的3-(2-{2-[2-(4-溴-丁-2-烯氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(溴-烯丙基-PEG4-CONHS)，其以浅黄色油的形式获得。质谱(A)：RT=1.02min；[M+H]+：m/z454/456；[M+Na]+：m/z476/478；[M-H+HCO2H]-：m/z498/500。[0216] 4.4.制备3-(2-{2-[2-(4-溴-丁-2-烯氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸
[0217]

[0218]在室温，将1g的3-(2-{2-[2-(4-溴-丁-2-烯氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸叔丁酯的溶液(可商购)、6ml的TFA和3ml的DCM搅拌3小时，然后在RP下浓缩至干燥。油状残留物用甲苯稀释并在RP下浓缩至干燥，得到呈棕色油形式的853mg的
3-(2-{2-[2-(4-溴-丁-2-烯氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸。
[0219]实施例5
[0220]5.1.制备缀合物hu2H11-PEG4-NHAc-DM4
[0221] 缀合物hu2H11-PEG4-NHAc-DM4可以按照类似于实施例1的方式制备：在搅拌下，在室温，添加1ml的hu2H11(8.52mg/mlin缓冲液A)，然后添加0.7ml缓冲液A、0.213ml的HEPES1M、0.7ml的DMA，然后添加0.085ml的L-DM4-AcNH-PEG4-CONHS活化酯的10mMDMA溶液(用0.128mlDMA稀释)。在室温进行2小时之后，粗介质在Amicon4上在7000G浓缩，用HGS缓冲液在Nap-10柱上交换缓冲液，最后在5mlZeba柱上纯化。由此获得1.15ml的hu2H11-PEG4-NHAc-DM4缀合物(c=3.78mg/ml)。针对最终药物载量和单体纯度分析。缀合物SEC分析(方法H)：DAR(UV)=6.6；DAR(SEC)=5.6；RT=15.387min；单体纯度=99.7%；HRMS数据：参见图5。
[0222]同样，制备包括hu2H11的其它缀合物，并且描述于实施例6-8(参见表IIa)。
[0223]实施例9：抑制MDA-MB231肿瘤细胞(来自ECAACref.#92020424)的生长
[0224]使处于指数生长阶段的细胞受胰蛋白酶作用并重新悬浮在适当的培养基中(DMEM/F12Gibco#21331；10%SVFGibco#10500-056；2nMGlutamineGibco#25030)。将细胞混悬液以5000细胞/孔的密度在包含血清的完全培养基中接种到Cytostar96-孔培养平板(GEHealthcareEurope，#RPNQ0163)。在培养4小时之后，将缀合物的系列稀释物按从10-7至10-12M的浓度添加到各孔中(对各浓度，重复三次)。将细胞在37℃/5%CO
2
在缀合物存在下培养3天。在第4天，将10μl的14C-胸苷溶液(0.1μCi/孔，Perkin
Elmer#NEC56825000)添加到各孔中。在实验开始96小时之后，使用MicroBeta放射性计数器(PerkinElmer)测量14C-胸苷的摄取。将测试孔读数减去无细胞试剂空白值，将数据作为通过使缀合物-处理的细胞的读数除以来自媒介物-处理的细胞的对照孔的读数的平均值获得的存活率分数绘制成图。在这些实验中，在实验开始时，将裸抗体(hu2H11或hu2H11R35R74)以1μM的浓度添加到孔中，并按照以上描述测量对增殖的抑制作用。[0225] 表IIa和IIb中报告的结果表明，缀合物对MDA-MB231细胞表现出强的体外增殖抑制性质，根据在裸hu2H11或/hu2H11R35R74存在下进行的竞争研究，缀合物通过结合抗原起作用。
[0226] 表IIa
[0227] [0228] 表IIb
[0229] [0230] 实施例10：L-DM4-AcNH-PEG4-COOMe
[0231]

[0232] 10.1.制备游离-药物L-DM4-AcNH-PEG4-COOMe
[0233]

[0234]在磁力搅拌下，在室温，在Ar的惰性气氛下，在玻璃小瓶中，接连添加57.4mg的
3-[2-(2-{2-[2-(2-溴-乙酰氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸甲酯、
80mgL-DM4在0.44mlDMA中的溶液，和最后的19.6μl的DIPEA。在室温进行18小时之后，粗产物用10ml水稀释，用3x7ml的AcOEt萃取。收集有机相，用MgSO4干燥，过滤并在RP下浓缩至干燥。得到124mg的无色油，该产物用最小量的DMA稀释并通过快速色谱法在C18-接枝的硅胶上纯化(Merck，C18，5g，25-40μm，18ml/min，洗脱梯度：水:乙腈体积比为100:0至5:95)。在RP下浓缩包含预期化合物的级分之后，12.8mg甲酯L-DM4-AcNH-PEG4-COOMe以无色膜的形式获得。质谱(C)：t=0.97min；[M+H]+：m/z1099；[M-H]-：m/z1097；1HNMR(500MHz，以ppm计的δ，氯仿-d)：0.80(s，3H)；1.21(s，3H)；1.22(s，3H)；1.24至1.35(m，
7H)；1.46(td，J＝6.4和10.2Hz，1H)；1.57(d，J＝13.4Hz，1H)；1.64(s，3H)；1.80(ddd，J
＝4.9和11.5和14.6Hz，1H)；1.92(m，1H)；2.18(dd，J＝2.3et14.7Hz，1H)；2.36(ddd，
J＝4.8和11.4和16.2Hz，1H)；2.52(ddd，J＝5.1和11.3和16.3Hz，1H)；2.59(t，J＝
6.4Hz，2H)；2.63(m，1H)；2.86(s，3H)；2.88(m，1H)；2.98(d，J＝16.7Hz，1H)；3.03(d，J
＝9.6Hz，1H)；3.15(d，J＝12.6Hz，1H)；3.23(s，3H)；3.36(s，3H)；3.42(m，2H)；3.50(d，
J＝9.1Hz，1H)；3.54(m，2H)；3.63(m，13H)；3.68(s，3H)；3.75(t，J＝6.4Hz，2H)；3.99(s，
3H)；4.27(t，J＝11.3Hz，1H)；4.78(dd，J＝2.2et12.1Hz，1H)；5.42(q，J＝6.9Hz，1H)；
5.66(dd，J＝9.1和15,4Hz，1H)；6,21(s，1H)；6,43(dd，J＝11.0和15.4Hz，1H)；6.64(s，
1H)；6.74(d，J＝11,0Hz，1H)；6.85(s，1H)；7.05(t，J＝5.5Hz，1H)。
[0235] 10.2.制备3-[2-(2-{2-[2-(2-溴-乙酰氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸甲酯
[0236]

[0237]在磁力搅拌下，在室温，接连添加100mg的3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸(CA(PEG)4，Pierce)、89mg溴-乙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯和2ml的DCM到玻璃小瓶中。在室温的1小时之后，添加0.7ml的MeOH和
0.38ml的在己烷中的2M三甲基甲硅烷基重氮甲烷。在室温的1小时之后，将粗反应混合物在RP下浓缩至干燥，然后用最小量的DMA稀释并通过快速色谱法在C18-接枝的硅胶上纯化(Merck，C18，5g，25-40μm，18ml/min，洗脱梯度：水:乙腈的体积比为100:0至5:95)。在RP下浓缩包含预期化合物的级分之后，58mg的3-[2-(2-{2-[2-(2-溴-乙酰氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸甲酯以无色油的形式获得。质谱(A)：tR=0.75min；
[M+H]+：m/z400/402
[0238] 溴-乙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯可以按照公开的过程制备(Biochemistry
1974，481)。
[0239] 实施例11：L-DM4-AcNMe-PEG4-COOMe
[0240]

[0241] 11.1.制备游离-药物L-DM4-AcNMe-PEG4-COOMe
[0242]

[0243] 在磁力搅拌下，在室温，在玻璃小瓶中，接连添加30mg的L-DM4、20.8mg
3-{2-[2-(2-{2-[(2-溴-乙酰基)-甲基-氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸甲酯在0.3mlDMA中的溶液、和7.4μl的DIPEA。在室温的18小时之后，反应介质用7ml的AcOEt稀释并用5ml水洗涤两次。有机相用盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并在RP下浓缩至干燥。得到39mg的无色玻璃，该产物用最小量的DMA/MeOH混合物稀释并通过快速色谱法在C18-接枝的硅胶上纯化(XTerraC18，5μm，50x30mm，30ml/min，洗脱梯度：水:乙腈的体积比为95:5至5:95)。在减压下浓缩包含预期化合物的级分之后，7.8mg甲
酯L-DM4-AcNMe-PEG4-COOMe以无色固体形式获得。质谱(C)：tR=1.00min；[M+H-H2O]+：m/
z1095；[M+Na+]+：m/z1135；[M-H+HCOH]-：m/z1157；[M-H]-：m/z1111。1HNMR(500MHz，以ppm计的δ，DMSO-d6)：0.78(s，3H)；1.12(d，J＝6.6Hz，3H)；1.16(m，9H)；1.26(m，1H)；
1.40至1.51(m，2H)；1.59(s，3H)；1.62(m，1H)；1.87(m，1H)；2.04(m，1H)；2.28(m，1H)；
2.47至2.58(部分掩蔽m，4H)；2.73(s，3H)；2.76(s，1H)；2.80(d，J＝9.6Hz，1H)；2.95(s，
2H)；3.10(s，3H)；3.16至3.48(部分掩蔽m，21H)；3.25(s，3H)；3.59(s，3H)；3.63(t，J
＝6.4Hz，2H)；3.93(s，3H)；4.08(m，1H)；4.53(dd，J＝2.9至11.9Hz，1H)；5.32(q，J＝
6.6Hz，1H)；5.58(dd，J＝9.3至15.1Hz，1H)；5.89(s，1H)；6.49至6.58(m，2H)；6.62(m，
1H)；6.84(s，1H)；7.19(s，1H)。
[0244]11.2.制备3-{2-[2-(2-{2-[(2-溴-乙酰基)-甲基-氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸甲酯
[0245]

[0246]在磁力搅拌下，在室温，在Ar的惰性气氛下，接连添加127mg的3-(2-{2-[2-(2-甲基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸甲酯、102.2mg的溴-乙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯和1.2ml的DCM。在45分钟之后，将粗产物在RP下浓缩并通过快速色谱法在5g的CN-接枝的硅胶上纯化(洗脱梯度：正庚烷/iPrOH/AcOEt，其中增加iPrOH部分)。在RP下浓缩包含预期化合物的级分之后，122mg的3-{2-[2-(2-{2-[(2-溴-乙酰基)-甲基-氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸甲酯以无色油的形式获得。质谱(A)：tR=0.84min；[M+H]+：m/z414/416。
[0247]溴-乙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯可以按照公开的过程制备(Biochemistry
1974，481)。
[0248]11.3.制备3-(2-{2-[2-(2-甲基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸甲酯
[0249]

[0250]在磁力搅拌下，在室温，在Ar的惰性气氛下，使271.7mg的3-[2-(2-{2-[2-(叔丁氧基羰基-甲基-氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸甲酯溶解在2ml氢氯酸在二氧杂环乙烷中的4N溶液中。在18小时之后，将粗反应介质在RP下浓缩，溶解于
4ml的MeOH中并经过3gSCXSPE柱(用10mlMeOH调节，用10mlMeOH洗涤和用在MeOH中的2N氨洗脱)。在RP下浓缩洗脱级分之后，得到146mg的无色油。将该油溶解在AcOEt中，用MgSO4干燥，过滤并在RP下蒸发。127mg的3-(2-{2-[2-(2-甲基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸甲酯作为无色油获得。质谱(A)：tR=0.40min；[M+H]+：m/z294。
[0251]11.4.制备3-[2-(2-{2-[2-(叔丁氧基羰基-甲基-氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸甲酯
[0252]

[0253]在磁力搅拌下，在室温，在Ar的惰性气氛下，用水-冰-氯化钠将227mg的
3-[2-(2-{2-[2-(叔丁氧基羰基-甲基-氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸在0.644mlDCM中的溶液和0.644ml的MeOH冷却至约0℃。添加0.449ml的三甲基甲硅烷基重氮甲烷在己烷中的2M溶液，在室温的17小时之后，添加乙酸在MeOH中的0.5M溶液从而达到pH为5至6。粗产物用AcOEt(30ml)稀释，用水(2x15ml)洗涤，用盐水(15ml)
洗涤，有机相用MgSO4干燥，过滤并在RP下蒸发。209.7mg的3-[2-(2-{2-[2-(叔丁氧基羰基-甲基-氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸甲酯作为无色油获得。质谱(A)：tR=1.18min；[M+H]+：m/z294，338，394。
[0254] 11.5.制备3-[2-(2-{2-[2-(叔丁氧基羰基-甲基-氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸
[0255]

[0256] 在磁力搅拌下，在室温，在Ar的惰性气氛下，用水-冰-氯化钠将330mg可商购的3-(2-{2-[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸在
4mlTHF中的溶液冷却至约0℃。缓慢添加72.2mg的NaH(70%，在油中)，在25分钟之后添加0.174ml的MeI。移除冷却浴，在室温的3小时之后，添加120mg的NaH和0.2ml的MeI。在室温的1.5小时之后，添加乙酸的稀释水溶液从而达到pH为5至6。粗的反应混合物用AcOEt(30ml)稀释，用水(2x20ml)洗涤，用盐水(10ml)洗涤，有机相用MgSO4干燥，过滤并在RP下蒸发。227mg的3-[2-(2-{2-[2-(叔丁氧基羰基-甲基-氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸作为无色油获得。质谱(A)：tR=1.02min；[M+H]+：m/z280，
380。
[0257] 实施例12：L-DM4-烯丙基-PEG4-COOMe
[0258]

[0259] 12.1.制备游离-药物L-DM4-烯丙基-PEG4-COOMe
[0260]

[0261] 在磁力搅拌下，在室温，在玻璃小瓶中，接连添加36.7mg的L-DM4、20.8mg的
3-(2-{2-[2-(4-溴-丁-2-烯氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸甲酯在0.37ml
DMA中的溶液、和最后的9.4μl的DIPEA。在室温的1.5小时之后，和在-18℃的18小时之后，反应介质通过快速色谱法在C18-接枝的硅胶上纯化(Merck，C18，5g，25-40μm，
18ml/min，洗脱梯度：水:乙腈体积比为100:0至5:95)。在RP下浓缩包含预期化合物的级分之后，18.2mg白色固体通过快速色谱法在CN-接枝的硅胶上纯化(洗脱梯度：正庚烷
/iPrOH/AcOEt，其中增加AcOEt部分)。4.02mg甲酯L-DM4-烯丙基-PEG4-COOMe以白色固体形式获得。质谱(C)：t=1.09min；[M-H+HCOOH]-：m/z1112；[M+Na]+：m/z1090。1HNMR(500MHz，以ppm计的δ，氯仿-d)：0.80(s，3H)；1.18至1.26(m，7H)；1,27至1.31(m，
6H)；1.40à1.50(m，1H)；1.57(d，J＝13.7Hz，3H)；1.64(s，3H)；1.77(ddd，J＝4.8和11.7
和14.5Hz，1H)；1.91(ddd，J＝4.8和11.7和14.5Hz，1H)；2.18(dd，J＝2.5和14.3Hz，
1H)；2.38(m，1H)；2.57(m，4H)；2.86(s，2H)；2.89(m，1H)；3.00(m，1H)；3.04(d，J＝9.9Hz，
1H)；3.11(d，J＝12.3Hz，1H)；3.23(s，3H)；3.35(s，3H)；3.50(d，J＝9.1Hz，1H)；3.55(m，
2H)；3.63(m，10H)；3.69(s，3H)；3.75(t，J＝6.4Hz，2H)；3.92(d，J＝5.2Hz，2H)；3.98(s，
3H)；4.27(ddd，J＝1.6和10.4和12.3Hz，1H)；4.78(dd，J＝3.0和11.8Hz，1H)；5,43(q，
J＝6.8Hz，1H)；5.48à5,61(m，2H)；5.67(dd，J＝9.2和15.2Hz，1H)；6.20(d，J＝0.5Hz，
1H)；6.42(dd，J＝11.3和15.4Hz，1H)；6.65(d，J＝1.9Hz，1H)；6.77(d，J＝11.3Hz，1H)；
6.82(d，J＝1.1Hz，1H)。
[0262] 12.2.制备3-(2-{2-[2-(4-溴-丁-2-烯氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸甲酯
[0263]

[0264]在磁力搅拌下，向50mg的3-(2-{2-[2-(4-溴-丁-2-烯氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸在1mlDCM和0.25mlMeOH中的冷却溶液(水-冰浴)中，添加0.11ml在己烷中的2M三甲基甲硅烷基重氮甲烷溶液。在移除水-冰浴之后，将粗的反应混合物在室温搅拌1.5小时，用2滴乙酸中和并在RP下浓缩至干燥。在用甲苯共沸蒸发之后，47mg的3-(2-{2-[2-(4-溴-丁-2-烯氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸甲酯以琥珀色油的形式获得。质谱(A)：tR=1.12min；[M+H]+：m/z369/371。
[0265] 3-(2-{2-[2-(4-溴-丁-2-烯氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸的制备已经在实施例4中描述。
[0266]实施例13：L-DM4-AcNH-PEG8-COOMe
[0267]

[0268]13.1.制备游离-药物L-DM4-AcNH-PEG8-COOMe
[0269]

[0270]在磁力搅拌下，在室温，在玻璃小瓶中，接连添加60mg的L-DM4、11.4mg碳酸钾、和
75mg的3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-溴-乙酰氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸甲酯在0.7mlDMA中的溶液。在室温的22小时之后，反应介质用12ml水稀释，用2x10ml的AcOEt萃取。收集有机相，用MgSO4干燥，过滤并在RP下浓缩至干燥。得到50mg的无色油，该产物用最小量的DMA稀释并通过快速色谱法在5g的CN-接枝的硅胶上纯化(洗脱梯度：正庚烷/iPrOH/AcOEt，其中增加iPrOH部分)。在减压下浓缩包含预期化合物的级分之后，残留物用最小量的DMA稀释并并通过快速色谱法在C18-接枝的硅胶上纯化(Merck，C18，5g，25-40μm，12ml/min，洗脱梯度：水:乙腈的体积比为100:0至5:95)。在RP下浓缩包含预期化合物的级分之后，3.3mg的甲酯L-DM4-AcNH-PEG8-COOMe以无色膜的形式获得。质谱(C)：tR=0.97min；[M-H]-+HCOOH:m/
z1319。1HNMR(400MHz，以ppm计，氯仿-d)：0.73(s，3H)；1.10至1.19(m，7H)；1.21(s，
3H)；1.23(s，3H)；1.39(td，J＝6.1和10.1Hz，1H)；1.50(d，J＝13.2Hz，1H)；1.57(s，
3H)；1.71(m，1H)；1.85(m，1H)；2.11(dd，J＝3.4和14.2Hz，1H)；2.29(ddd，J＝5.1和
11.1和16.0Hz，1H)；2.45(ddd，J＝5.4和11.2和16.1Hz，1H)；2.52(t，J＝6.6Hz，3H)；
2.79(s，3H)；2.82(m，1H)；2.90(m，1H)；2.96(d，J＝9.3Hz，1H)；3.07(d，J＝13.2Hz，1H)；
3.15(s，3H)；3.28(s，3H)；3.35(m，2H)；3.44(m，3H)；3.56(s，29H)；3.61(s，3H)；3.68(t，J
＝6.6Hz，2H)；3.91(s，3H)；4.20(t，J＝12.0Hz，1H)；4.70(dd，J＝3.2和12.0Hz，1H)；
5.35(q，J＝7,0Hz，1H)；5.59(dd，J＝9.0和15.4Hz，1H)；6.13(s，1H)；6.35(dd，J＝11.0
和15.4Hz，1H)；6.57(d，J＝1.5Hz，1H)；6.67(d，J＝11.2Hz，1H)；6.78(d，J＝1.5Hz，1H)；
6.96(t，J＝5.6Hz，1H)。
[0271] 13.2.制备3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-溴-乙酰氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸甲酯
[0272]

[0273]在磁力搅拌下，在Ar的惰性气氛下，在室温，将200mg的
3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸(CA(PEG)8，Pierce)、1.7ml的DCM、0.9ml的MeOH、和
0.34ml的2M三甲基甲硅烷基重氮甲烷在己烷中的溶液接连添加到玻璃小瓶中。在室温的
30分钟之后，添加0.1ml的2M三甲基甲硅烷基重氮甲烷在己烷中的溶液。在室温的25分
钟之后，反应混合物通过添加几滴乙酸中和，在RP下浓缩至干燥，与甲苯共沸。由此得到的无色油用106.9mg溴-乙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯在0.7mlDCM中的溶液稀释。在室温的30分钟之后和在4℃的16小时之后，粗产物通过快速色谱法在20g的CN-接枝的硅胶上纯化(洗脱梯度：正庚烷/iPrOH/AcOEt，其中增加iPrOH部分)。在RP下浓缩包含预期化合物的级分之后，175mg的3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-溴-乙酰氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸甲酯以无色油的形式获得。质谱(B)：tR=2.79min；[M+H]+：m/z576/578。
[0274] 溴-乙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯可以按照公开的过程制备(Biochemistry，
1974，481)。
[0275] 实施例14：L-DM4-Mal-PEG4-COOMe
[0276]

[0277] 14.1.制备游离-药物L-DM4-Mal-PEG4-COOMe
[0278]

[0279] 在磁力搅拌下，在室温，接连添加160mg的L-DM4、115.8mg的
3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(可商购，SM(PEG)4，Pierce)、0.6ml的DMA、55.1mg的负载型DIPEA(3.72mmol/g)、0.3ml的额外DMA和6μl的DIPEA。在室温的1小时之后和在-20℃的16小时之后，将粗的反应混合物过滤，用DCM洗涤，通过快速色谱法在20g硅胶上纯化(洗脱梯度：DCM:MeOH，其中增加MeOH的比例)。在RP下浓缩包含预期产物的级分之后，得到110mg的无色膜，在10g硅胶上纯化(洗脱梯度：DCM:MeOH，其中增加MeOH的比例)。在RP下浓缩包含预期产物的级分之后，19.6mg的甲酯L-DM4-Mal-PEG4-COOMe以无色玻璃的形式获得。质谱(A)：tR=1.31/1.32分钟(2个非对映异构体)；[M-H]-：m/z1208。1HNMR(500MHz，以ppm计，氯仿-d)：0.73(s，3H)；
1.22(m，13H)；1.39(m，1H)；1.52(d，J＝13.7Hz，1H)；1.57(s，3H)；1.78(m，1H)；1.99(m，
1H)；2.11(ddd，J＝1.8和1.9et14.1Hz，1H)；2.24(ddd，J＝4.7和11.5和15.9Hz，
1H)；2.38(m，3H)；2.46(m，1H)；2.53(m，3H)；2.69(s，1H)；2.82(s，3H)；2.94(dd，J＝4,7
和9.6Hz，1H)；3.08(m，3H)；3.14(s，3H)；3.29(s，3H)；3.34(q，J＝5.3Hz，2H)；3.43(d，J
＝9.1Hz，1H)；3.48(td，J＝1.8和5.1Hz，2H)；3.58(s，13H)；3.67(m，7H)；3.91(s，3H)；
4.22(t，J＝11.3Hz，1H)；4.70(m，1H)；5.29(m，1H)；5.59(m，1H)；6.30(大s，1H)；6.35(dd，
J＝11.0和15.4Hz，1H)；6.61(m，2H)；6.76(s，1H)。
[0280]实施例15：抑制MDA-MB-231和HCT116肿瘤细胞的生长
[0281] 使处于指数生长阶段的细胞受胰蛋白酶作用并重新悬浮在它们各自的培养基中(对于MDA-MB231&MDA-A1细胞为DMEM/F12Gibco#21331，10%SVFGibco#
10500-056，2nMGlutamineGibco#25030；对于HCT116细胞，DMEM(Gibco#11960)10%SVFGibco#10500-056，2nMGlutamineGibco#25030)。将细胞混悬液以5000细胞/孔的密度(MDA-MB-231，HCT116)在包含血清的完全培养基中接种到Cytostar96-孔培养平板(GEHealthcareEurope，#RPNQ0163)。在培养4小时之后，将系列稀释物添加到孔中，对于各浓
14
度，重复三次。将细胞在37℃/5%CO2在药物存在下培养3天。在第4天，将10μl的
C-胸
苷溶液(0.1μCi/孔，PerkinElmer#NEC56825000)添加到各孔中。在实验开始96小时之后，使用MicroBeta放射性计数器(PerkinElmer)测量14C-胸苷的摄取。将测试孔读数减去无细胞试剂空白样，将数据作为通过使缀合物-处理的细胞的读数除以来自媒介物-处理的细胞的对照孔的读数的平均值获得的存活率分数绘制成图。
[0282]表III：细胞的抑制增殖(以nM计的IC50)
[0283]
实施例
游离-药物
MDA-MB231
HCT116

10
L-DM4-AcNH-PEG4-COOMe
15.3
13

11
L-DM4-AcNMe-PEG4-COOMe
28,3
18,5

12
L-DM4-烯丙基-PEG4-COOMe
1,5
0,8

14
L-DM4-Mal-PEG4-COOMe
31,7
33,6

[0284]可见，以酯-COOMe的形式测试的产物对于两种不同的细胞系表现出强的体外增
殖抑制性质。
[0285]实施例16：hu2H11和hu2H11R35R74的缀合物的体内评价
[0286]关于评价缀合物的抗肿瘤活性，每天称重动物，使用卡尺每周测量肿瘤两次。肿瘤的重量使用下式计算：重量(mg)=[长度(mm)×宽度(mm)2]/2。抗肿瘤活性评价在最高非毒性剂量(HNTD)进行。
[0287]认为产生最低20%的身体重量损失(小组平均值)或10%或更大药物致死的剂量是过分毒性的剂量。动物的身体重量包括肿瘤的重量。主要功效端点是ΔT/ΔC、恢复的平均百分比、部分恢复和完全恢复(PR和CR)和无肿瘤存活者(TFS)。
[0288]针对各肿瘤，各处理的动物(T)和对照动物(C)的肿瘤体积的变化通过第一次处理那天(开始那天)的肿瘤体积减去指定观察那天的肿瘤体积而计算。平均ΔT针对各处理组计算，平均ΔC针对对照组计算。然后计算比率ΔT/ΔC并将其表示为百分比：

[0289]当ΔT/ΔC小于40%时，认为剂量是有治疗活性的，当ΔT/ΔC小于10%时，认为剂量是非常有治疗活性的。当ΔT/ΔC小于0时，认为剂量是高度活性的，然后注明恢复的百分比的日期(ref1)：
[0290]肿瘤恢复的百分比：定义为处理的组在指定观察那天的肿瘤体积与其在第一次处理的第一天的体积相比肿瘤体积降低的百分比。针对各动物和在
具体时间点，计算恢复的百分比。然后针对该组计算恢复的平均百分比

[0291]部分恢复(PR)：当肿瘤体积的降低量达到处理开始时肿瘤体积的50%时，该恢复定义为部分恢复。
[0292]完全恢复(CR)：当肿瘤的体积=0mm3时，得到完全恢复(当肿瘤的体积无法测量时，认为存在CR)。
[0293]TFS：无肿瘤定义为动物在研究结束时未表现出可察觉的肿瘤。
[0294]hu2H11-缀合物和hu2H11R35R74-缀合物之间的比较
[0295]

[0296] hu2h11-缀合物和hu2h11R35R74-缀合物的抗肿瘤活性在2个剂量水平对抗可测量的原发性结肠肿瘤评价，该肿瘤为CR-LRB-004P，强烈表达目标，皮下植入到SCID雌性小鼠。对照组未处理。剂量表示为毫克蛋白质每千克。hu2h11R35R74-缀合物在第15天通过静脉注射(IV)大丸剂型以40mg/kg和10mg/kg对它们进行给药。为给相等剂量的DM4，hu2h11-缀合物以44mg/kg和11mg/kg对它们进行给药。结果如表IV所示。
[0297]使用CR-LRB-004P肿瘤中的单次给药时间表，hu2h11R35R74-缀合物在40mg/kg和
10mg/kg是活性的，其中ΔT/ΔC分别为28%和39%，而hu2h11-缀合物仅在40mg/kg是活性的，其中ΔT/ΔC为26%。在10mg/kg，hu2h11-缀合物在该模型中不是活性的。从这些结果，在较低剂量，hu2h11R35R74-缀合物比hu2h11-缀合物显示出较好的活性。
[0298]缀合物最优化，选择最佳药物抗体比率DAR-DAR对hu2H11R35R74-缀合物对抗
SCID雌性小鼠中的前列腺癌PC-3的抗肿瘤活性的影响
[0299]DAR对hu2H11R35R74-缀合物的抗肿瘤活性的影响通过比较在皮下植入到雌性SCID中的前列腺PC-3肿瘤上的两种低有效剂量在六种不同的药物抗体比率(DAR)评价。对照组未处理。剂量表示为毫克蛋白质每千克。DAR通过UV方法确定。hu2H11R35R74-缀合
物在第16天通过静脉注射(IV)大丸剂型以10mg/kg和5mg/kg对它们进行给药，其中DAR
分别在3.4、4.4、5.9、6.2、7.4和8.4。结果如表V所示。
[0300]

[0301]

[0302] 使用单次给药时间表，hu2H11R35R74-缀合物在10mg/kg在DAR为4.4至8.4时表现出活性。在5mg/kg，hu2H11R35R74-缀合物在DAR为5.9至4表现出活性。总之，DAR
对hu2H11R35R74-缀合物的肿瘤活性有影响。从具体肿瘤的这些结果可见，DAR(UV)应该高于4。最佳DAR至少等于5.9。
[0303]实施例17：评价DAR对hu2H11R35R74-缀合物的PK参数的影响
[0304]hu2H11R35R74-缀合物在不同药物-抗体比率(DAR)的药代动力学在雄性CD-1小鼠中在单次静脉注射(IV)给药20mg/kg缀合物之后评价。测量缀合物的血浆水平以确定在标准条件下的基础单次剂量药代动力学参数。将PK参数与裸母抗体的PK参数比较。缀合物和它们的抗体组分(全部抗体，缀合物抗体和任何解偶联的(de-conjugated)抗体之和)的血浆浓度通过特定ELISA技术测量。结果如图7所示。
[0305]结果表明，DAR值和暴露于全部抗体组分之间存在反比关系，其中对于DAR为
0，3.4，4.3，5.9，6.6和7.4，AUC0-∞值分别为83,000,000，61,000,000，48,000,000，
46,000,000，41,000,000和27,000,000ng□h/mL。
[0306]类似地，在DAR值和暴露于缀合物之间存在反比关系，其中对于DAR为3.4，4.3，
5.9，6.6和7.4，AUC0-∞值分别为39,000,000，30,000,000，27,000,000，29,000,000和
20,000,000ng□h/mL。
[0307] 在DAR值和消除抗体组分之间存在理想关系，其中对于DAR为0，3.4，4.3，5.9，6.6和7.4，Cl值分别为0.00024，0.00033，0.00042，0.00043，0.00049和0.00074L/h/kg。[0308] 类似地，在DAR值和消除缀合物之间几乎存在理想关系，其中对于DAR为3.4，4.3，
5.9，6.6和7.4，Cl值分别为0.00051，0.00066，0.00075，0.00069，0.00099L/h/kg。
[0309] 总之，DAR对PK参数具有影响，当DAR增加时，暴露降低，而消除增加。根据得自功效和PK评价的结果，最佳DAR将为5.9至7.4。
[0310] 实施例18：评价hu2H11R35R74缀合物对抗SCID雌性小鼠中的前列腺癌PC-3[0311] DAR=5.9的抗体药物缀合物hu2H11R35R74-缀合物的抗肿瘤效果在8个剂量水平对抗可测量的前列腺PC-3肿瘤评价，该肿瘤强烈表达目标，皮下植入到雌性SCID小鼠。对照组未处理。剂量表示为毫克蛋白质每千克。在第17天通过静脉注射(IV)大丸剂型以
160、120、80、40、20、10、5和2.5mg/kg对它们进行给药。为给相等剂量的DM4，hu2h11-缀合物以44mg/kg和11mg/kg对它们进行给药。结果如表VI所示。
[0312]使用单次给药时间表，发现测试的缀合物的最高剂量(160mg/kg)是毒性的，诱导身体重量损失和药物-相关的致死。在HNTD(120mg/kg)和其它最低剂量，化合物是高度活性的。对于除了2.5mg/kg之外的全部剂量，hu2H11R35R74-缀合物诱导部分恢复，对于120、
80和20mg/kg，其诱导完全恢复。而且，肿瘤模型是衰弱期(cachexic)，与对照相比，化合物的给药降低了最小身体重量损失。总之，hu2H11R35R74-缀合物对前列腺PC-3肿瘤模型表现出高活性，其中具有良好的剂量效应。
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