血管内皮细胞异种免疫疫苗及其制备方法 本发明涉及基因工程技术是抗肿瘤血管生成治疗肿瘤的新方法：即利用血管内皮细胞制备异种免疫疫苗。
恶性肿瘤是严重危害人类健康和生命的疾病，全世界每年死于恶性肿瘤的病人约700万，其中中国占100万人，在各种疾病所致的死亡中，居第二位，并有进一步增高趋势。因此，肿瘤的防治已成为全世界科学家密切关注的课题。
手术、化疗和放疗是治疗恶性肿瘤的三大传统治疗方法。由于恶性肿瘤的生物学特性，使这些方法的疗效受到限制。手术治疗尽管能有效去除肉眼可见的肿瘤，但不能保证切除所有肿瘤细胞，因此一直未能解决术后复发问题。放疗和化疗严重的毒副作用，以及许多肿瘤对其不敏感，或耐受性增强，降低了其疗效。临床研究发现，获得性抗药性在所有肿瘤患者中的比例高达30％，肿瘤细胞基因组的不稳定性和对环境适应性都会使抗癌药物无能为力，前列腺、黑色素瘤对大多数抗肿瘤药有天然的抗性，卵巢癌、小细胞肺癌在化疗后也会获得抗药性。
近年来，抗肿瘤血管生成治疗已成为肿瘤治疗研究的热点。肿瘤的发生、发展和转移与肿瘤血管生成(Tumor Angiogenesis)密切相关。早在七十年代中期，J.Folkman在大量的研究基础上提出：肿瘤血管生成可能是肿瘤生长的控制点。在肿瘤生长的无血管期，肿瘤细胞依靠扩散作用获得营养，肿瘤直径限于1～2mm，肿瘤细胞处于休眠状态，一旦肿瘤超过这一大小，肿瘤生长将依赖新生毛细血管和小血管的长入，以提供肿瘤迅速生长所需要的氧气和营养物质。因此，肿瘤新生血管生成是肿瘤迅速增殖和转移的重要条件。相对肿瘤细胞而言，血管内皮细胞遗传稳定，突变率低。所以从理论上讲，针对肿瘤血管为靶向抗血管生成治疗，不会或只会引起微乎其微地抗药性。故以血管为靶向的抗肿瘤血管生成治疗，以其明显优势成为众多科学家关注、探索的治疗肿瘤的新途径。因各肿瘤区的血管具有相同的特点，抗肿瘤血管生成治疗适用于多种肿瘤。
二十多年来，实体肿瘤血管形成的研究已取得较大的进展，发现了许多血管生长因子，包括血管内皮细胞生长因子(VEGF)，酸性及碱性成纤维细胞生长因子(aFGF及bFGF)、血管生长素(angiogenin)、转化生长因子(TGF)等。同时也发现许多血管生长抑制因子，如thrombospondin、干扰素α(IFN-α)、血管抑素(angiostatin)、内皮抑素(endostatin)等。一些抑制血管增生的药物已陆报道，苏拉明(suramin)可抑制bFGF和其他促血管生长因子与受体的结合，已用于前列腺癌的临床治疗，存在的问题是毒副作用太大。戊聚糖也在动物实验中证实有抑制肿瘤生长作用，但在临床应用时只对小的肿瘤有效，而对大肿瘤无效。另一大类是抗生素，如烟曲霉素及其衍生物TNP-470已用于临床，其可能发生的毒副作用是体重下降。此外，干扰素α已用于临床治疗小儿血管瘤，但用于成人时，发现有较大的毒副作用。另外，以上的治疗策略都是基于阻断促血管生长因子及其受体结合，抑制血管内皮细胞增殖，但是，诱导血管内皮细胞增生的因子是多种多样的，给抗肿瘤的血管生成治疗带来一定难度。
发明的目的：
本发明为肿瘤抗血管生成治疗提供新的治疗手段，利用异种血管内皮细胞疫苗作为交叉抗原诱导机体对肿瘤血管产生免疫应答，破坏肿瘤新生血管，从而抑制肿瘤的发生、发展和转移。为此设计并制作了血管内皮细胞异种免疫疫苗。发明的主要技术内容：
我们利用血管内皮细胞疫苗异种免疫，诱导机体对肿瘤新生血管产生免疫应答，破坏肿瘤血管生成，有效地抑制了肿瘤生长。
在正常情况下，机体对自身抗原不产生免疫应答，即自身耐受性；但当机体内隐蔽抗原释放，生物、物理、化学因素使自身抗原成分改变；交叉抗原，非特异性免疫细胞刺激剂等均可导致自身免疫形成。并通过多种途径作用于靶抗原所在的组织、细胞，造成相应组织器官的病理性损伤和功能障碍。
异种血管内皮细胞间有交叉抗原，我们用人脐静脉内皮细胞株ECV-304制备成血管内皮细胞疫苗，免疫BALB/c小鼠，成功诱导出小鼠抗血管生成的自身免疫反应，通过体液免疫和细胞免疫，破坏荷瘤鼠肿瘤血管形成，达到治疗肿瘤的目的。有理由推测血管内皮细胞疫苗异种免疫肿瘤病人，同样可能取得有效的抗肿瘤作用。
抑制肿瘤中的血管生成，阻断肿瘤生长所需的氧气和营养物质供应，可以抑制肿瘤的发生、发展和转移。现已有多种抗血管生成药物应用于治疗肿瘤的临床和临床前期研究。并取得较好的治疗效果。我们制备出血管内皮细胞疫苗，作为交叉抗原异种免疫激发机体免疫系统对肿瘤血管产生主动免疫应答。通过B淋巴细胞介导的体液免疫和T淋巴细胞介导的细胞免疫等多种途径破坏肿瘤新生血管，抑制肿瘤生长，因其激活了机体自身免疫应答，产生自身抗体和自身致敏淋巴细胞，造成肿瘤新生血管病理性损伤，其抗肿瘤效果大大强于抗血管生成治疗的药物。
本发明的血管内皮细胞疫苗，是用异种动物，人、鼠、牛内皮细胞株作为血管内皮细胞来源，制作血管内皮细胞疫苗，作为交叉抗原异种免疫，激发机体免疫系统，对肿瘤中的新生血管产生免疫应答。血管内皮细胞疫苗的制备方法：血管内皮细胞可来源于体外培养的人、鼠、牛血管内皮细胞株，如用人内皮细胞株(ECV-304)制备内皮细胞疫苗，用含有10％小牛血清和青霉素、链霉素的DMEM培养基，置于培养箱中培养，收集扩增后的ECV-304细胞于离心管中，经洗涤、固定液固定，制成细胞悬液，除去固定液，用计数板计数，再用生理盐水制备细胞悬液，即制备出血管内皮细胞疫苗，将疫苗进行异种免疫抗肿瘤，用流式细胞仪检测免疫后血管内皮细胞抗体，再对淋巴细胞杀伤活性检测。上述洗涤液是磷酸盐缓冲液，固定液是多聚甲醛液或福尔马林。血管内皮细胞疫苗制备方法详述如下：一、制备血管内皮细胞疫苗
血管内皮细胞可来源于体外培养的人、鼠、牛等血管内皮细胞株。我们将人脐静脉内皮细胞株ECV-304、牛血管内皮细胞株GEN-T和鼠血管内皮细胞株SVEC4-10分别用含有10％小牛血清和青霉素(100U/ml)，链霉素(100U/ml)的Dulbecco's modified Eagle Medium(DMEM)培养基培养，将其置于含5％CO2、37℃培养箱中大量扩增。收集扩增后的ECV-304细胞于离心管中，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，细胞沉淀加入1～3％多聚甲醛或1～10％甲醛固定，于4℃冰箱内作用24小时，用PBS洗涤后，加PBS液制成细胞悬液，4℃冰箱内放置24小时，再用PBS液洗涤，以除去固定液，用血细胞计数板计数细胞后，用0.9％生理盐水制备细胞悬液，浓度为2×106/ml。即制备出血管内皮细胞疫苗。二、血管内皮细胞疫苗异种免疫抗肿瘤作用
将6～8周龄、雌性BALB/c小鼠随机分为治疗组和对照组(每组10只)，治疗组小鼠每只腹腔内注射200μl，分别含有1×106ECV-304细胞疫苗、GEN-T疫苗和SVEC4-10疫苗，同时对照组小鼠每只腹腔内注射0.9％生理盐水200μl，每周一次，共4次。最后一次血管内皮细胞疫苗免疫后的第7天于治疗组和对照组小鼠背侧接种100μl，1×107个纤维肉瘤细胞株(MethA)细胞。每隔2天，用游标卡尺测量小鼠肿瘤大小，并观察小鼠体重变化及记录小鼠生存时间。
将治疗组和对照组中小鼠的肿瘤体积对时间作曲线，其结果见图2。
治疗组和对照组小鼠生存曲线见图3。
可以看出，经异种ECV-304和GEN-T细胞疫苗免疫后的小鼠其肿瘤生长得到明显抑制。而同种鼠内皮细胞(SVEC4-10)疫苗免疫后的小鼠不具有抗肿瘤作用。
治疗组生存时间较对照组明显延长。
同时，还对其它原发瘤模型——Lewis肺癌、B16F1黑色素瘤及H22肝癌进行了类似实验，也取得了同样的结果。三、用流式细胞仪检测免疫后小鼠血清中抗血管内皮细胞抗体
免疫组和对照组小鼠于第三次免疫后的第5天经眼眶采血，收集小鼠血清，分别取ECV-304、SVEC4-10、MethA培养细胞1×106个细胞移入流式样品管，用PBS液洗涤，每管加入稀释度为1∶500的小鼠治疗组和对照组血清100μl。以PBS液代替小鼠血清作为一抗空白对照。于4℃冰箱内孵育1小时，用PBS液洗涤，每管又分别加入羊抗鼠Goat F(ab')2 Fragmentmouse IgG(H+L)-FITC(ImmunoTECH)，工作浓度1∶50，室温避光作用30分钟，用PBS液洗涤3次，细胞沉淀加PBS液1ml，用流式细胞仪(CoulterElite ESP)检测，分析其抗ECV-304，SVEC4-10，MethA抗体表达水平和平均荧光强度。
流式细胞仪检测抗体结果见图4。
从ECV-304(C)和SVEC4-10(D)可以看出，用免疫组血清染色ECV-304和SVEC4-10细胞阳性，而MethA细胞染色阴性，说明免疫组小鼠产生了抗ECV-304和SVEC4-10细胞抗体。未免疫组小鼠血清染色上述细胞均阴性。四、免疫后小鼠脾淋巴细胞杀伤活性检测
分离小鼠脾淋巴细胞，然后测定其杀伤ECV-304、SVEC4-10、MethA等靶细胞的活性，具体方法如下。
(1)治疗组和对照组小鼠第三次免疫后第5天断颈处死。然后把整个小鼠浸入盛有75％酒精的烧杯中，2～3秒后，取出置于无菌的平皿中，剖腹取出小鼠脾脏。
(2)同RPMI 1640培养基洗净脾脏，剔除脂肪和结缔组织，并移入盛有RPMI 1640的无菌平皿中，剪成2～3mm3大小的碎块，吹打后用200目不锈钢网过滤制成单细胞悬液，经淋巴细胞分离液(Ficoll比重1.077)分离淋巴细胞，用RPMI 1640洗涤，血球计数板计数，用含10％小牛血清的RPMI1640制成细胞悬液，浓度2×106/ml。
(3)将2×106/ml淋巴细胞以及2×105/ml ECV-304细胞、SVEC4-10细胞、MethA细胞以10∶1的效/靶比例接种于96孔板，每孔200μl，设3个复孔，置37℃，5％CO2孵箱中培养4小时。设仅有淋巴细胞和仅有ECV-304细胞、SVEC4-10细胞、MethA细胞对照孔。
(4)培养4小时后加10μl噻唑蓝(MTT，5mg/ml)，置37℃，5％CO2孵箱中培养4小时。
(5)4小时后，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100μl溶解紫蓝色颗粒。
(6)半小时后用酶标仪(Bio-Rad：Model 3550-UV)测量595nm的光密度值(OD595nm)，并计算细胞毒百分率。
结果见图5。
结果显示免疫组小鼠脾细胞对SVEC4-10细胞株和ECV-304细胞株有较强的杀伤活性。本发明的优点：
1.可抑制多种肿瘤发生、发展和转移。
2.扩大并充实了肿瘤抗血管生存治疗和方法。
3.开辟肿瘤治疗的新途径。
附图及图片说明
图1血管内皮细胞疫苗制作流程图
图2显示ECV-304、GEN-T、SVEC4-10细胞疫苗免疫后接种MethA肿瘤细胞，治疗组与对照组的肿瘤大小与时间关系。
横坐标表示皮下接种MethA后时间(天数)，纵坐标表示肿瘤平均直径(mm)。
(A)表示用PBS作为对照。
(B)和(C)表示分别用ECV-304和GEN-T免疫小鼠。
(D)表示用SVEC4-10免疫小鼠。
图3显示ECV-304细胞疫苗治疗MethA荷瘤鼠，治疗组与对照组小鼠生存曲线比较：
横坐标表示皮下接种MethA后时间(天数)
纵坐标表示生存率(％)
图4显示流式细胞仪检测治疗组与对照组血清抗血管内皮细胞抗体
横坐标表示平均荧光强度。
纵坐标表示细胞数。
(C)表示用免疫组血清染色ECV-304细胞
(D)表示用免疫组血清染色SVEC4-10细胞
(E)表示用免疫组血清染色MethA细胞
(F)表示用未免疫组血清染色ECV-304细胞
(G)表示用未免疫组血清染色SVEC4-10细胞
(H)表示用未免疫组血清染色MethA细胞
图5显示免疫后小鼠脾淋巴细胞杀伤活性检测
横坐标表示细胞株种类。
纵坐标表示细胞毒百分率。
实施例1 制备血管内皮细胞疫苗
血管内皮细胞可来源于体外培养的人、鼠、牛等血管内皮细胞株。我们将人脐静脉内皮细胞株ECV-304用含有10％小牛血清和青霉素(100U/ml)，链霉素(100U/ml)的Dulbecco's modified Eagle Medium(DMEM)培养基，置于含5％CO2、37℃培养箱中培养，大量增殖。收集大量扩增后的ECV-304细胞于离心管中，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，细胞沉淀加入3％多聚甲醛固定，于4℃冰箱内作用24小时，用PBS洗涤4次后，加PBS液制成细胞悬液，4℃冰箱内放置24小时，再用PBS液洗涤2次，以除去固定液，用血球计数板计数细胞后，用0.9％生理盐水制备细胞悬液，浓度为2×106/ml。即制备出血管内皮细胞疫苗。
实施例2 血管内皮细胞疫苗异种免疫抗肿瘤作用
将6～8周龄、雌性BALB/c小鼠随机分为治疗组和对照组(每组10只)，治疗组小鼠每只腹腔内注射200μl，分别含有1×106 ECV-304细胞疫苗和牛血管内皮细胞(GEN-T)疫苗，同时对照组小鼠每只腹腔内注射0.9％生理盐水200μl，每周一次，共4次。最后一次血管内皮细胞疫苗免疫后的第7天于治疗组和对照组小鼠背侧接种100μl，1×107个纤维肉瘤细胞株(MethA)细胞。每隔2天，用游标卡尺测量小鼠肿瘤大小，并观察小鼠体重变化及记录小鼠生存时间。
将治疗组和对照组中小鼠的肿瘤体积对时间作曲线，其结果见图2。
治疗组和对照组小鼠生存曲线见图3。
可以看出，经异种ECV-304和GEN-T细胞疫苗免疫后的小鼠其肿瘤生长得到明显抑制。而同种鼠内皮细胞(SVEC4-10)细胞疫苗免疫后的小鼠不具有抗肿瘤作用。
治疗组生存时间较对照组明显延长。
同时，还对其它原发瘤模型——Lewis肺癌、B16F1黑色素瘤及H22肝癌进行了类似实验，也取得了同样的结果。
实施例3 用流式细胞仪检测免疫后小鼠血清中抗血管内皮细胞抗体
免疫组和对照组小鼠于第三次免疫后的第5天经眼眶采血，收集小鼠血清，分别取ECV-304、SVEC4-10、MethA培养细胞1×106个细胞移入流式样品管，用PBS液洗涤3次，每管加入稀释度为1∶500的小鼠治疗组和对照组血清100μl。以PBS液代替小鼠血清作为一抗空白对照。于4℃冰箱内孵育1小时，PBS液3次，每管又分别加入Goat F(ab')2 Fragmentmouse IgG(H+L)-FITC(Immuno TECH)，工作浓度1∶50，室温避光作用30分钟，用PBS液洗涤3次，细胞沉淀加PBS液1ml，用流式细胞仪(CoulterElite ESP)检测，分析其抗ECV-304，SVEC4-10，MethA抗体表达水平和平均荧光强度。
流式细胞仪检测抗体结果见图4。
从ECV-304(C)和SVEC4-10(D)可以看出，用免疫组血清染色ECV-304和SVEC4-10细胞阳性，而MethA细胞染色阴性，说明免疫组小鼠产生了抗ECV-304和SVEC4-10细胞抗体。未免疫组小鼠血清染色上述细胞均阴性。
实施例4 免疫后小鼠脾淋巴细胞杀伤活性检测
分离小鼠脾淋巴细胞，然后测定其杀伤ECV-304、SVEC4-10、MethA等靶细胞的活性，具体方法如下。
(1)治疗组和对照组小鼠第三次免疫后第5天断颈处死。然后把整个小鼠浸入盛有75％酒精的烧杯中，2～3秒后，取出置于无菌的平皿中，剖腹取出小鼠脾脏。
(2)同RPMI 1640培养基洗净脾脏，剔除脂肪和结缔组织，并移入盛有RPMI 1640的无菌平皿中，剪成2～3mm3大小的碎块，吹打后用200目不锈钢网过滤制成单细胞悬液，经淋巴细胞分离液(Ficoll比重1.077)分离淋巴细胞，用RPMI 1640洗涤3次，血球计数板计数，用含10％小牛血清的RPMI 1640制成细胞悬液，浓度2×106/ml。
(3)将2×106/ml淋巴细胞以及2×105/ml ECV-304细胞、SVEC4-10细胞、MethA细胞以10∶1的效/靶比例接种于96孔板，每孔200μl，设3个复孔，置37℃，5％CO2孵箱中培养4小时。设仅有淋巴细胞和仅有ECV 304细胞、SVEC4-10细胞、MethA细胞对照孔。
(4)培养4小时后加10μl MTT(5mg/ml)，置37℃，5％CO2孵箱中培养4小时。
(5)4小时后，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100μl溶解紫蓝色颗粒。
(6)半小时后用酶标仪(Bio-Rad：Model 3550-UV)测量OD595nm值，并计算细胞毒百分率。
结果见图5。
结果显示免疫组小鼠脾细胞对SVEC4-10细胞株和ECV-304细胞株有较强的杀伤活性。