环戊烯酮的α-型晶体 本发明的技术领域
本发明涉及具有生理活性例如抗癌活性、并可用在药物、食品和饮料领域中的反-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的α-型晶体。
现有技术
反-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮具有生理活性例如抗癌活性，该化合物能用在药物、食品和饮料领域内。
制备反-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的化学合成方法是已知的[《碳水化合物研究》(Carbohydrate Research)，第217-222页(1993)]。另外，WO 98/13328公开了一种实际的制备方法，其中是将糖醛酸或糖醛酸衍生物加热，并从加热产物中收集反-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮。在上述方法中，没有任何关于所得反-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮中的晶体的描述。在《瑞士化学学报》Helvetica ChimicaActa，第55卷，第2838-2844(1972)中描述了制备顺-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的方法，并且所述化合物最终是作为升华物质获得的。
本发明所要解决问题
通过上述实际方法制得的反-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮水溶液的真空浓缩残余物和冷冻干燥产物是微红棕色糖浆状物质，并且通常含有10-20％的水，而且它们难以处理并且热稳定性不好。
本发明的目的是改善反-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的纯度、热稳定性和可处理性。解决问题的方法
本发明者们已经发现，通过下述制备方法可制得具有特定X-射线衍射图样的稳定晶体：用有机溶剂从反-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮(在下文中将其称为“环戊烯酮”)的水溶液中萃取环戊烯酮，并将真空浓缩的萃取液结晶；用有机溶剂从环戊烯酮水溶液的真空浓缩残余物或冷冻干燥物质中萃取环戊烯酮，并将萃取液结晶；或将环戊烯酮水溶液的真空浓缩残余物或冷冻干燥物质溶在醇等中，然后向所述醇溶液中加入有机溶剂使之结晶，于是本发明者们将所述晶体称为“环戊烯酮的α-型晶体”。
与环戊烯酮水溶液的常规真空浓缩残余物或冷冻干燥物质相比，已经发现该α-型晶体具有显著改善的纯度和极大改善的热稳定性，因此完成了本发明。
总而言之，本发明涉及反-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮地α-型晶体。
附图的简要说明
附图1是该环戊烯酮的α-型晶体的X-射线衍射图样。
附图2显示了本发明α-型晶体的差示扫描量热法分析结果。
附图3显示了在参照实施例1中获得的冷冻干燥产物的色谱图。
附图4显示了在实施例1中获得的本发明α-型晶体的色谱图。
附图5显示了在实施例3中获得的本发明α-型晶体的色谱图。
本发明的实施方案
下面将在下文中具体阐明本发明。
本发明所用的环戊烯酮可按照在上述《碳水化合物研究》(Carbohydrate Research)中描述的化学方法合成制得。附带说明一下，环戊烯酮是在通过将至少一种选自下述物质的物质加热所获得的产物中制得的化合物：糖醛酸、糖醛酸衍生物、含糖醛酸的糖类化合物、含糖醛酸衍生物的糖类化合物、含有包含糖醛酸的糖类化合物的物质、和含有包含糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质，并且在本发明中，可使用糖醛酸的纯化产物。
糖醛酸(uronic acid)有时又称为糖醛酸(glycuronic acid)，它是其中醛糖上的醛基维持其本身、同时仅是另一端上的伯醇基被氧化成羧基的羟基醛羧酸的俗称。在自然界中，糖醛酸是多种动物和植物多糖的构成组分。含糖醛酸的多糖的实例有果胶、果胶酸、藻酸、透明质酸、肝素、硫酸肝素、岩藻依聚糖、硫酸软骨素、软骨素、硫酸皮肤素等，并且已知它们表现出多种生理功能。
对于本发明所用糖醛酸没有特别限制。因此，糖醛酸的实例有半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、古洛糖醛酸(guluronic acid)、甘露糖醛酸和艾杜糖醛酸等，糖醛酸衍生物的实例有上述糖醛酸的内酯、酯、酰胺、盐等，并且本发明所述糖醛酸衍生物包括加热后能生成环戊烯酮的任一物质。糖醛酸内酯的实例有葡萄糖醛酸-6，3-内酯(下文中简称为葡萄糖醛酸内酯)、甘露糖醛酸-6，3-内酯和艾杜糖醛酸-6，3-内酯。糖醛酸酯的实例有可由糖醛酸制得的糖醛酸甲酯、糖醛酸乙酯、糖醛酸丙二醇酯和糖醛酸羧甲酯等。糖醛酸酰胺可通过将糖醛酸酰胺化制得。糖醛酸的盐可由常规方法制得。
在本说明书中，含糖醛酸或糖醛酸衍生物的糖类化合物是指，含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物。对于含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物没有特别限制，其适用的实例有果胶、果胶酸、藻酸、透明质酸、肝素、硫酸肝素、岩藻依聚糖、硫酸软骨素、软骨素和硫酸皮肤素，包括作为它们的化学、酶学或物理学处理产物的其分解产物、其分解产物的衍生物、其分解产物的盐。
在本发明中，含有包含糖醛酸的糖类化合物的物质和/或含有包含糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质是指，含有含糖醛酸的糖类化合物的物质和/或含有含糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质，对其没有特定限制，只要所述物质含有包含糖醛酸的上述糖类化合物和/或包含糖醛酸衍生物的糖类化合物就行。
例如，当使用D-葡萄糖醛酸作为糖醛酸，并且将其1％的溶液在121℃加热4小时时，在热处理物质中就生成了环戊烯酮。用有机溶剂萃取该加热物质中的环戊烯酮，并将萃取液浓缩。然后，通过硅胶柱层析法分离该浓缩萃取液，将洗脱下来的环戊烯酮部分浓缩，用氯仿从该浓缩物中萃取环戊烯酮，将该浓缩物的萃取液用正相柱层析法纯化，由此就纯化了该热处理物质中的环戊烯酮。
下面给出环戊烯酮的物理特征。附带说明一下，环戊烯酮的质谱分析是用质谱仪DX302(由日本电子制造)进行的。此外，以重氢氯仿作为溶剂的NMR测定是用JNM-A500(由日本电子制造)进行的。比旋度是用DIP-370旋光计(由日本分光制造)测定的；紫外吸收光谱是用UV-2500分光光度计(由岛津制作所制造)测定的；红外吸收光谱(IR)是用FTIR-8000红外分光光度计(由岛津制作所制造)测定的。
FAB-MSm/z 115[M+H]+
使用甘油作为基质。
1H-NMR(CDCl3)
δ4.20(1H，d，J＝2.4Hz，5-H)、4.83(1H，m，4-H)、6.30(1H，dd，J＝1.2，6.1Hz，2-H)、7.48(1H，dd，J＝2.1，6.1Hz，3-H)
附带说明一下，1H-NMR的化学位移值是以CHCl3的化学位移值为7.26ppm作为标准给出的。
这些值与《碳水化合物研究》(Carbohydrate Research)中描述的环戊烯酮的数据几乎一致。
旋光度：[α]D200°(c1.3，水)
IR(KBr法)：在3400、1715、1630、1115、1060、1025cm-1处记录有吸收。
UV：λmax215nm(水)
例如，本发明α-型环戊烯酮可按照下述方法制得：
对于环戊烯酮的制备方法没有特别限制，例如，其可按照在下文中提及的参照实施例1和2中的方法制得。
本发明所用有机溶剂的实例有乙酸乙酯、乙酸丁酯、氯仿、乙醚、正己烷、丙酮、甲醇、乙醇和乙酸，所述有机溶剂可单独使用，或者以其混合物的形式结合使用。当溶剂单独使用时，可使用乙酸乙酯、乙酸丁酯、氯仿、乙醚等，乙酸乙酯和乙酸丁酯是特别优选的。对于混合溶剂，当把乙酸乙酯、乙酸丁酯、氯仿、乙醚或正己烷加到环戊烯酮在甲醇、乙醇或丙酮中的溶液中时，结晶就发生了，将乙酸乙酯和正己烷加到环戊烯酮的乙醇溶液中以进行结晶是特别适合的。
当仅用一种有机溶剂来使环戊烯酮结晶时，出于对纯度和收率的考虑，优选将真空浓缩残余物或冷冻干燥物例如用乙酸乙酯萃取，并将所述萃取液浓缩以生成晶体。
例如，将在参照实施例1中获得的真空浓缩残余物或冷冻干燥物用乙酸乙酯萃取，并将萃取液浓缩，放置以生成α-型晶体。
当使用混合溶剂时，将真空浓缩残余物或冷冻干燥物溶解在少量甲醇或乙醇中，然后向其中加入乙酸乙酯和正己烷以生成晶体。
例如，将在参照实施例1中获得的环戊烯酮真空浓缩残余物或冷冻干燥物溶解在少量甲醇或乙醇中，然后向其中加入乙酸乙酯和正己烷，以生成α-型晶体。乙酸乙酯和正己烷的加入量可取决于用于溶解的甲醇或乙醇的量，对于乙醇溶液，乙酸乙酯和正己烷优选分别以是乙醇4倍和2倍的量使用。
或者，将乙酸丁酯和乙酸加到环戊烯酮的水溶液中并混合，这样环戊烯酮就转移到所得的上层溶液中，将所述上层溶液真空浓缩后，环戊烯酮就从中结晶出来。附带说明一下，环戊烯酮的萃取可以在例如(环戊烯酮的水溶液)∶(乙酸丁酯)∶(乙酸)＝1∶1～50∶0.1～10的条件下进行，或优选在(环戊烯酮的水溶液)∶(乙酸丁酯)∶(乙酸)＝1∶2～20∶0.5～4的条件下进行，(环戊烯酮的水溶液)∶(乙酸丁酯)∶(乙酸)的比例只要在能高效率地萃取环戊烯酮、以及可高效率地获得本发明α-型晶体的范围内即可。
只要能发生结晶，可采用任意的环戊烯酮浓度，但是其浓度优选为10-1000mg/ml。
放置温度没有特别限制，只要温度不引起环戊烯酮降解就行，但是温度实际上是-20℃-室温。结晶所需时间为1夜-3天，晶体通常是在1夜内获得的。当加入在前制得的α-型晶体时，能促进结晶过程。
将分离到晶体抽滤或离心过滤，然后干燥，由此可获得α-型晶体。
下面将解释本发明的环戊烯酮α-型晶体。
1.元素分析
用柳本CHN Coder Type MT-3对在下文实施例3中获得的本发明环戊烯酮α-型晶体进行元素分析。结果如表1所示。表1 元素 C H 理论值(％)C5H6O3 52.63 5.30 实测值(％)C5H6O3 52.39 5.23
2.X-射线衍射图样
用X-射线衍射仪(RU-200；由理学电机制造)测定在下文实施例1中获得的本发明的环戊烯酮α-型晶体的X-射线衍射图样，其中所述X-射线衍射仪装配有闪烁计数器和采用石墨单色仪的Cu辐射装置。所得结果如表2和附图1所示。
因此，附图1是本发明的环戊烯酮α-型晶体的X-射线衍射图样，其是以衍射角2θ(°，横座标)和衍射强度(cps，纵座标)之间的关系表示的。
本发明所用术语“基本上具有下述X-射线衍射图样”表示，本发明的环戊烯酮α-型晶体具有下表2所示特征图样，并且所述图样在由于测试仪器或制备样本的条件中的差异所导致的一定变异范围内。表2 d() I/I1 d() I/I1 10.91 5.46 5.43 3.94 3.60 3.59 89 100 100 30 4 6 3.01 2.72 2.18 2.17 2.11 2.02 12 64 22 12 10 43.热分析
该测定是用岛津制造的差示扫描量热仪(DSC-50)进行的。本发明的环戊烯酮α-型晶体的差示扫描量热法分析结果如附图2所示。
因此，附图2表示了本发明的环戊烯酮α-型晶体的差示扫描量热法分析结果，并且是以温度(℃，横坐标)和电流量(mW，纵坐标)之间的关系表示的。
4.纯度
在下述条件下，用岛津制造的高效液相色谱仪分析在参照实施例1中获得的环戊烯酮的冷冻干燥物、和在下文实施例1和3中获得的α-型晶体，由色谱图的面积百分比计算得纯度如表3所示。冷冻干燥物的色谱图如附图3所示。在实施例1中获得的α-型晶体的色谱图如附图4所示。在实施例3中获得的α-型晶体的色谱图如附图5所示。在附图3-附图5中，纵坐标表示折射强度，横坐标表示洗脱时间(分钟)。
色谱分析的条件：
柱：DAISOPAK SP-120-5-ODS-BP(由Daiso制造)4.6mm×25cm
柱温：40℃
流动相：0.01％的三氟乙酸水溶液
流速：0.5ml/分钟
检测器：差示折射计
进样量：1μl(10mg/ml)表3 冷冻干燥物(参照实施例1) α-型晶体 (实施例1) α-型晶体 (实施例3)纯度(％) 71.2 96.7 99.5
附带说明一下，“纯度(％)”是指，通过高效液相色谱法获得的色谱图中环戊烯酮的峰面积除以总峰面积之和再乘以100。因此，其表示环戊烯酮的量在不含水的固体中的比例。
如表3所示，与冷冻干燥物相比，本发明的环戊烯酮α-型晶体的纯度有显著改善。
5.热稳定性
为了比较在参照实施例1中获得的环戊烯酮冷冻干燥物和在实施例1中获得的α-型晶体的热稳定性，通过下述定量测定方法，在初期以及在40℃放置6天后定量测定环戊烯酮。结果如表4所示。
定量方法：将环戊烯酮样本(0.1g)溶解在100ml水中，取2ml所得溶液稀释5倍。在接近215nm波长的最大吸收波长处测定该溶液的吸收度(A)。通过下式计算环戊烯酮的量(mg/ml)。环戊烯酮的量(mg/ml)＝(A÷773.4)×50000表4 环戊烯酮含量 初期 在40℃放置6天 冷冻干燥物 α-型晶体 59.4 96.4 28.2 95.2
表4中的量(％)表示环戊烯酮的量在其中非环戊烯酮物质是水和杂质的样本中的比例(％)。
如表4所示，与冷冻干燥物相比，本发明的环戊烯酮α-型晶体的热稳定性有显著改善。
实施例
用下述实施例进一步阐明本发明的环戊烯酮α-型晶体的制备方法，但是本发明并不仅限于这些实施例。
参照实施例1.
将市售葡萄糖醛酸内酯(由Nacalai Tesque出产)(500g)溶解在38升水中，然后向其中吹入蒸汽以在125℃加热5小时。冷却后，将混合物真空浓缩，用NaOH把浓缩物的PH调至5.0。用已经用水预平衡过的Diaion SA-10A(三菱化学)将该溶液上阴离子交换柱(20升)，用水洗脱，以获得24升非吸附部分。
将该非吸附部分真空浓缩至2.8升，向其中加入NaCl使其终浓度为2M，将混合物分两部分过用2M氯化钠水溶液预平衡的合成吸附剂(SP-207；由三菱化学出产)柱(15升)。用2M氯化钠水溶液洗涤该柱，获得了用0.1M氯化钠水溶液洗脱的部分(总共78升)。
将该部分真空浓缩至11升，把该浓缩液按上述方法进行相同SP-207柱层析处理，以获得24升洗脱液。然而，在这种情况下，将所有样本都进行一次色谱处理，并且洗脱是用水进行的。
将洗脱液真空浓缩至100ml，用渗透膜(AC-110-1-；由旭化成)通过电渗析进行脱盐，以获得100ml 6％的环戊烯酮溶液。将该环戊烯酮溶液真空浓缩，获得了浅红棕色浓缩残余物。把该环戊烯酮溶液冷冻干燥，获得了浅红棕色冷冻干燥物。参照实施例2.
将市售葡萄糖醛酸内酯(500g)溶解在38升水中，然后向其中吹入蒸汽以在125℃加热5小时。冷却后，将混合物真空浓缩。用已经用水预平衡过的Diaion SA-10A将该溶液上阴离子交换柱(20升)，以获得总共73升的用水洗脱的非吸附部分和流过溶液。
将该非吸附部分真空浓缩至3升，向其中加入NaCl使其终浓度为2M，将混合物分两部分过用2M氯化钠水溶液预平衡的合成吸附剂(SP-207)柱(15升)。用2M氯化钠水溶液洗涤该柱，并用0.1M氯化钠水溶液洗脱，以获得总共78升收集部分。
将该部分真空浓缩至3升，把该浓缩液按上述方法进行相同SP-207柱色谱处理，以获得30升洗脱液。然而，在这种情况下，将所有样本都进行一次色谱处理，并且洗脱是用水进行的。
将洗脱液真空浓缩至150ml，用渗透膜(AC-110-1-；由旭化成)通过电渗析进行脱盐，以获得150ml 7.2％的环戊烯酮溶液。实施例1
将乙酸乙酯(1.5升)加到120g参照实施例1所得环戊烯酮冷冻干燥物中，并在60℃加热以进行萃取。把所得乙酸乙酯萃取液用无水硫酸镁干燥，并真空浓缩。在加热状态下，将该浓缩残余物溶解在0.5升乙酸乙酯中，然后在5℃放置过夜以结晶。抽滤出所得晶体，然后真空干燥，获得了50.9g浅黄色α-型晶体。实施例2
将在参照实施例1获得的环戊烯酮的真空浓缩残余物(10g)溶解在5ml乙醇中，然后向其中加入20ml乙酸乙酯和10ml正己烷，加入少量实施例1所得α-型晶体，之后在5℃放置过夜。抽滤出析出的晶体，真空干燥，获得了4.3g浅黄色α-型晶体。实施例3
将50ml乙酸乙酯加到10g实施例1所得α-型晶体中，并加热至溶解。冷却后，向其中加入实施例2所得α-型晶体，然后在10℃放置过夜以结晶。抽滤出所得晶体，真空干燥，获得了7.6g浅黄色α-型晶体。实施例4
将266ml乙酸丁酯和206.6ml乙酸的混合物与26.6ml参照实施例2所述7.2％环戊烯酮溶液混合，然后搅拌，于是环戊烯酮就被萃取到上层溶液中(初级萃取液)。将乙酸丁酯和乙酸的混合物(5∶1体积比)加到1份(体积份)下层溶液中并混合，然后搅拌，回收所得上层萃取液(次级萃取液)。将初级萃取液和次级萃取液合并，真空浓缩，以获得15.5ml浓缩萃取液。在5℃，将实施例1所得α-型晶体加到所述溶液中，当析出少量晶体时，将该溶液在-20℃放置过夜以结晶。抽滤出所得晶体，真空干燥，获得了492mg浅黄色α-型晶体。
本发明的优点
本发明的环戊烯酮α-型晶体能非常有效地以高纯度和高产量获得环戊烯酮，并且易于在制备环戊烯酮制剂的过程中操作。此外，与冷冻干燥物相比，它的颜色和热稳定性有了显著改善。