DNA扩增方法及其试剂盒 【技术领域】
本发明涉及DNA扩增方法，尤其是在DNA混合存在的情况下能选择性扩增RNA相对应的碱基序列的RT-PCR法，以及用于该DNA扩增方法的试剂盒。
背景技术
DNA扩增方法，尤其是聚合酶链式反应(PCR)是一种在试验管内扩增所要核酸片段的简便技术，现在不仅在基因相关的研究中而且在生物学、医学、农业等广泛领域内是不可缺少的实验方法。PCR原本是扩增DNA的技术，但开发了一种PCR方法，它能扩增具有与相应RNA相对应的碱基序列的DNA片段，将之称为RT-PCR法。该方法是DNA聚合酶的一种，它是用具有RNA依赖性DNA聚合酶活性、即具有逆转录活性地逆转录酶、或应用同时具有逆转录活性的DNA聚合酶合成与RNA相互补的DNA转录产物(cDNA)，然后以此为模板进行PCR，由此该方法是特异性扩增来源于RNA的cDNA的方法。RT-PCR法除用于制备由mRNA而来的cDNA克隆和cDNA文库外，还可用作检测特定的mRNA表达状态的方法。
但是当RT-PCR中所使用的RNA样品中混有DNA的时候，同时扩增出以编码RNA的DNA上区域和该基因作为PCR模板的产物，因此选择性地获取仅以RNA作模板的扩增产物是困难的。因此，为了防止生成由混合在RNA样品中的DNA而来的扩增产物，就有必要应用纯化的RNA样品，或应用通过DNA分解酶处理等除去掺杂的DNA的样品，操作很麻烦。
作为解决该问题的方法，有这样一设想：通过核苷酸类似物dITP存在下的逆转录反应合成Tm值，即融解温度低的RNA-cDNA双链核酸，再在相同核苷酸的存在下、在低温度性温度下进行RCR反应，由此该方法可抑制因样品中琨杂的DNA所引起的产物扩增，并能选择性扩增由与RNA互补的cDNA而来的DNA片段I核酸研究(Nucl.Acids.Res)第24卷，第5021～5025页(1996)。但是该方法有必要根据扩增的碱基序列的GC含量而改变dITP的添加量和反应温度，很难找到最佳条件。另外，反应性也不尽如意，有时不能以目的碱基序列为基础进行选择性扩增。
发明的公开
本发明的目的是提供一种DNA扩增方法，它能克服以往技术方法的缺点，能在混杂有DNA的情况下只选择性获得具有与RNA相对应的碱基序列的DNA片段，且该方法具有广泛应用性，重复性、检测敏感等优点。
本发明人简明使用上述核苷酸类似物的方法的问题点之一是通常的双链DNA不变性，且由整合了核苷酸类似物的cDNA和模板RNA构成的RNA-cDNA双链核酸变性温度条件的设定是一难点。他们发现该问题可这样解决：DNA扩增反应时加入降低RNA-cDNA双链核酸Tm值的化合物，例如甲酰胺等。
另外，本发明者们考虑到上述方法的另一个问题点是核苷酸类似物向上述方法中合成的DNA链的整合受目的RNA碱基序列，尤其是GC含量的影响本发明者们发现向反应液中加入以一定的频率结合到DNA的2种以上的核苷酸类似物，可不受目的RNA GC含量的限制进行DNA扩增，其重复性很好由此完成了本发明。
也就是说，本发明主要涉及：
(1)以含有核苷酸类似物的DNA片段作模板，在核苷酸类似物的存在下进行DNA扩增的方法，其特征在于，它在存在2种以上的核苷酸类似物的情况下或在降低双链核酸Tm值的化合物的存在下进行；
(2)以含有核苷酸类似物的DNA片段作模板，在核苷酸类似物的存在下扩增DNA的方法中，其特征在于，它在1种或2种以上的核苷酸类似物和降低双链核酸Tm值的化合物的存在下进行；
(3)用于以含有核苷酸类似物的DNA为模板，在核苷酸类似物的存在下进行DNA扩增的试剂盒，其特征在于，它含有2种以上的核苷酸类似物或降低双链核酸Tm值的化合物；以及
(4)用于以含有核苷酸类似物的DNA片段作模板，在核苷酸类似物的存在下扩增DNA的试剂盒，其特征在于它含有1种或2种以上的核苷酸类似物和降低双链核酸Tm值的化合物。实施本发明的最佳方式
本发明的DNA扩增方法是以含有核苷酸类似物的DNA片段作模板，在核苷酸类似物的存在下扩增DNA的方法，其最大的特征之一是它在存在2种以上的核苷酸类似物和/或存在降低双链核酸Tm值的化合物的条件下进行。
本发明方法中，作为扩增反应模板的DNA片段应用在1种或2种以上核苷酸类似物的存在下，以RNA为模板，通过逆转录反应而制备的cDNA。逆转录反应优选在存在降低双链核酸Tm值的化合物的条件下进行。
对包括用于本发明方法中的RNA的样品没有特殊限定，例如可应用来源于细胞、组织、血液等生物体的样品，食品、土壤、排水等有可能含有生物的样品。另外，也可以是通过用众所周知的方法处理前面的样品而得到的含有核酸的制备物。这些制备物，例如细胞破碎物和分离它们而得到的样品，该样品中的总RNA、或特定的RNA分子群，如富含mRNA的样品可用于本发明。并且，即便这些样品中含有DNA，也不受共存DNA的影响，它能选择性扩增与RNA相对应的DNA。另外，也可应用用众知的方法除去了DNA的样品。
用本发明的方法所扩增的RNA没有特别限制，可应用样品中的总RNA，mRNA、tRNA、rRNA等RNA分子，可应用能制备逆转录和扩增反应中所用引物的任意RNA。例如，假若以该目的RNA的有无和其含量的增减作为特定疾病的指标，那么应用本发明的方法可进行该疾病的诊断。另外，以微生物特异的RNA为目标，可检测样品中该微生物的存在。作为上述扩增对象的RNA，它在1次逆转录反应中的用量只要足以进行逆转录反应即可。例如，从灵敏的角度出发，优选0.1μg以上，更优选0.5μg以上，从反应抑制的角度出发，优选2μg以下，更优选1μg以下。
本发明中由目的RNA合成cDNA所使用的引物是具有与目的RNA互补碱基序列的寡核苷酸，只要是在所应用的反应条件下能与目的RNA退火即可。该引物也可以是寡(dT)等寡核苷酸和具有随机序列的寡核苷酸(随机引物)等。
从进行特异性退火的观点出发，上述引物的长度优选6个核苷酸以上，更优选10个核苷酸以上；从寡核苷酸合成的观点出发，优选100个核苷酸以下，更优选30个核苷酸以下。上述寡核苷酸可这样合成，例如，用ABI公司(Applied Biosystems Inc.)的394型DNA合成仅通过磷酰亚胺法进行合成。除此之外，也可用三磷酸盐法、H-膦酸脂法、硫代亚磷酸盐法等任一方法进行合成。另外也呆以是由生物样品而来的寡核苷酸，例如，从由该样品制备的DNA的限制性核酸内切酶消化物进行分离而制备的。上述引物在逆转录反应液中的使用量只要足以从目的RNA进行。cDNA合成即可，从合成效率的观点出发，优选0.1μM以上，更优选0.5μM以上，从抑制反应的观点出发，优选10μM以下，更优选5μM以下。
另外，在DNA扩增反应(PCR)中所使用的引物，只要是能以与目的RNA相对应的cDNA为模板进行DNA扩增则无特殊限定，可使用与上面相同的各种寡核苷酸。由上述目的RNA合成cDNA时使用的引物也可用于DNA的扩增反应。上述引物在PCR反应液中的使用量只要足以用以目的RNA为模板而得到的cDNA为模板进行DNA合成即可，从合成效率的观点来看，优选0.05μM以上，更优选0.1μM以上，从反应特异性的观点来看，优选2μM以下，更优选1μM以下。
本发明中所应用的具有逆转录活性的酶没有特殊限定，只要是具有以RNA为模板合成cDNA的活性即可，例如可应用禽类成髓细胞过多症病毒由来的逆转录酶(AMV-RTaze)、Moloney′s小鼠白血病病毒由来的逆转录酶(MMLV-RTaze)，Raus相关病毒2的由来的逆转录酶(RAV-2-RTaze)等各种起源的逆转录酶。除引之外，可应用同时具有逆转录活性的DNA聚合酶，例如也可应用栖热嗜热菌来源的DNA聚合酶(Tth DNA聚合酶)、热坚芽孢杆菌来源的DNA聚合酶(BcaDNA聚合酶)。优选AMV-RTaze或RAV-2-RTaze。这些酶既可以是从其本源物纯化得到的物质，又可以是通过基因工程学方法而生产的重组蛋白质。上述具有逆转录活性的酶的使用量只要足以进行逆转录反应即可。
本发明的DNA扩增方法的一大特征之一是，以通过上述逆转录反应生成的cDNA作模板进行DNA扩增反应，以此来扩增该DNA。作为DNA扩增反应优选PCR法(特公平4-67937号公报，特公平4-67960号公报)。
PCR中所应用的DNA聚合酶为各种耐热性DNA聚合酶，例如：来源于栖热嗜热菌的DNA聚合酶(Tth DNA聚合酶)、来源于水生嗜热菌的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)、来源于激烈热球菌的DNA聚合酶(Pfu DNA聚合酶)等热稳定性DNA聚合酶，这些酶可单独应用，亦可混合使用。这些酶既可以是从其本源物纯化出的蛋白质，亦可是基因工程学方法生产出的重组蛋白质。
另外，当逆转录酶使用同时具有上述逆转录活性的DNA聚合酶时，因为在PCR反应中也应用同一DNA聚合酶，所以逆转录反应及PCR反应可用1个反应管进行。
上述DNA聚合酶的量应用通常进行聚合酶反应时应用的量即可。
本说明书记载的核苷酸类似物是dATP、dCTP、dGTP、DTTP以外的物质，它掺入到以RNA为模板的cDNA合成反应中以及以该cDNA为模板进行的DNA扩增反应中所计合成的cDNA中，并且不终止这些反应。特别是，本发明中所使用的核苷酸类似物具有因它们的掺入而降低DNA Tm值的性质。本发明中使用的核苷酸类似物没有特殊限定，可应用7-Deaza-dGTP、7-Deaza-dATP、dITP、羟甲基dUTP等。
使用1种核苷酸类似物而进行的cDNA合成及DNA扩增中有时会因目的RNA中GC的含量而影响核苷酸类似物的掺入频率。例如，dITP取代dGTP掺入到DNA链中时，在同一反应条件下，目的RNA GC含量越多其掺入的频率越多，本发明中，联合应用适当的2种以上的核苷酸类似物，联合掺入这些核苷酸类似物的频率不受RNA中GC含量的影响，因此，可容易地设定选择性扩增与上述RNA相对应产物的条件。
这些核苷酸类似物的组合没有特殊限定，可适当组合能均一掺入的2种以上的核苷酸类似物使用。例如，本发明中可联合应用取代了dATP或dTTP的DNA链中所掺入的核苷酸类似物和取代了dCTP或dGTP的DNA链中所掺入的核苷酸类似物，特别优选联合应用7-Deaza-dATP和7-Deaza-dGTP。
从充分发挥降低Tm值的效果这一观点出发，逆转录反应液中核苷酸类似物的含有量优选50μM以上，更优选55μM以上，从反应效率的观点出发优选1.5μM以下，更优选200μM以下。此时，希望dNTP的含有量名为200μM以上，1mM以下。
本说明书中的“降低双链核酸Tm值的化合物”指在cDNA合成及DNA扩增反应时，作为基质掺入到核酸中的物质之外的物质，在它的存在下具有降低双链核酸，如双链DNA、RNA和由RNA和DNA所形成的RNA-DNA双链核酸等变性为单链的解离温度(Tm值)的作用。这样的化合物可应用甲酰胺、二甲基亚砜(DMSO)等有机溶剂，以三甲基甘氨酸为代表的两性电解质(内氨盐类)。据说甲酰胺对DNA聚合酶的延长活性没有恶影响，所以它特别适于本发明。另外，它们也可2种以上混合使用，例如甲酰胺与二甲基亚砜联合应用可获得良好效果。
另外，即便该核苷酸类似物为1种时也有因作为模板的RNA种类的不同而不受GC含量影响的情况。这种情况下，再应用能降低双链核酸Tm值的化合物可得到更良好的结果，这种方案亦在本发明的范围内。
降低双链核酸Tm值的化合物在逆转录反应液中的含有量，从反应抑制的观点来看优选20％重量百分比以下，更优选10％重量百分比以下。另外，PCR反应的过程中，上述化合物在PCR反应液中的含有量，从降低Tm值的角度出发优选0.5％重量百分比以上，更优选1％重量百分比以上；从反应抑制的角度出发，优选20％重量百分比以下，更优选15％以下。
具体而言，使用亚甲酰胺时，它在逆转录反应液中的含量从反应抑制的角度出发优选在20％重量百分比以下，更优选10％重量百分比以下。另外，从降低Tm值的角度出发，甲酰胺在PCR反应液中的含量优选在1％重量百分比以上，更优选1.5％重量百分比以上，从反应抑制的角度出发，优选在20％重量百分比以下，更优选在15％重量百分比以下。
从RNA向eDNA的逆转录在包含含有目的RNA的样品，具有与该目的互补碱基序列的寡核苷酸引物，4种脱氧核苷酸的三磷酸盐、具有逆转录活性的酶和至少一种核苷酸类似物的反应液中进行。通过该反应可合成含有核苷酸类似物、具有与上述目的RNA序列相互补碱基序列的DNA(cDNA)。另外，所得cDNA和由目的RNA形成的模板RNA-cDNA双链核酸与不含有核苷酸类似物的双链核酸相比，Tm值降低，例如与不含有核苷酸类似物的着通双链DNA相经，表现出在低温下解离或单链的优越性。
然后，以上述cDNA作模板进行DNA扩增反应，例如，实施PCR可扩增出来源于该cDNA的DNA片段。此时，上述的模板RNA-cDNA双链核酸变性，且在混在反应液中的不含核苷酸类似物的双链DNA不变性的条件下，例如设定PCR中变性程序的温度，通过上述核苷酸类似物存在下所进行的DNA扩增反应，可选择性扩增与cDNA相对应的DNA片段，即与目的RNA相对应的DNA片段。但是，以碱基序列和链长不同的多种RNA为目标的时候，因逆转录反应时核苷酸类似物的摄取频率因目的RNA而有所变动，所以很难设定较通用的条件。这种情况下，在DNA扩增反应液中加入上述的能降低双链核酸Tm值的化合物，例如，通过再加入甲酰胺等可容易地设定引起上述选择性扩增的条件。例如，添加终浓度为重量区分比1％-20％的甲酰胺进行PCR时，通过将变性温度设定为80℃～85℃可仅得到与RNA相对应的扩增产物。也就是说本发明的DNA扩增方法的实施方案是DNA扩增反应液中存在2种以上的核苷酸类似物，或存在降低双链核酸Tm值的化合物，特别优选核苷酸类似物与降低Tm值的化合物共同存在的实施方案。这种情况下所存在的核苷酸类似物可是1种，亦可为2种以上。在制备PCR反应液时将核苷酸类似物添加到上述浓度。当取逆转录反应后得到的溶液的一部分来制备PCR反应液的时候，若逆转录反应液中含有必要量的核苷酸类似物，则可只添加它以外的成分作为PCR反应液。
本说明的方法中，以上述RNA为模板进行的cDNA合成反应与以该cDNA为模板进行的DNA扩增反应连续进行，可应用同一反应液进行。这时使用同时包含具有逆转录活性的酶和PCR中应用的DNA聚合酶的反应液。可用众所周知的方法制备、使用该反应液[生物技术(BioTechniques)，第18卷，第678～687页(1995)]。再者，逆转录反应中所应用的具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶，可在cDNA合成反应、DNA扩增反应中应用这同一种酶。
本发明的试剂盒为用于上述方法的试剂盒，它是选择性扩增具有与RNA相对应的碱基序列的DNA的试剂盒。该试剂盒含有上述的1种或2种以上的核苷酸类似物和降低双链核酸Tm值的化合物，或者含有2种以上的核苷酸类似物或降低双链核酸Tm值的化合物。其中特别优选含有2种以上的核苷酸类似物和降低双链核酸Tm值的化合物的试剂盒。该试剂盒也可包含具有逆转录酶活性的酶，该酶反应中所应用的反应缓冲液，DNA扩增反应中所使用的DNA聚合酶和其它试剂。另外，为了使用时达到适当的浓度，上述核苷酸类似物和降你双链核酸Tm值的化合物可以加入到反应用缓冲液中的状态存在。通过应用该试剂盒，即便在混有DNA的情况下也可容易地从RNA样品中只选择性扩增具有与RNA相对应碱基序列的DNA片段。
实施例
接着，通过实施例对本发明进行更具体地说明，但本发明并不限定于这些实施例。实施例1 RNA及DNA的制备
以下的实验中所使用的RNA及DNA是使用TRIrol试剂(LifeTechrologies公司)，按照试剂的说明书进行操作，分别从人的培养细胞HL-60(ATCC CRL-1964)或人的培养细胞HT-29(ATCCHTB-38)中制备的。由人培养细胞HL-60而来的RNA的纯度达OD260/OD280 1.8以上，DNA的纯度达OD260/OD280 1.7以上。另外，由人培养细胞HT-29而来的RNA的纯度为OD260/OD280 1.8以上，DNA的纯度达OD260/OD280 1.7以上。实施例2 以各种RNA为目标进行RT-PCR
以链长和GC含量不同的mRNA为目标尝试选择性扩增。选择转铁蛋白受体mRNA的621个碱基区域(GC含量38％)、细胞角蛋白mRNA中的252个碱基区域(GC含量43％)和β-肌动蛋白mRNA中的273个碱基区域(GC含量58％)作为目标。转铁蛋白受体mRNA和β-肌动蛋白mRNA的扩增使用来源于人培养细胞HL-60的RNA作模板，细胞角蛋白mRNA的扩增以来自人培养细胞HT-29的RNA作模板。
作为用于扩增上述目标的引物，分别合成转铁蛋白受体的引物P5和引物P6(序列表的序列号1和2中分别显示引物P5和P6的碱基序列)，细胞角蛋白的引物P1和引物P2(序列表的序列号3和4中分别表示引物P1和P2的碱基序列)，β-肌动蛋白的引物P7和引物P8(序列表的序列号5和6中分别表示引物P7和P8的碱基序列)。
用RNA PCR Kit(AMV)Ver 2.1(宝酒造)制备20μl含有50ngRNA或50ng DNA，和添加剂上述试剂盒中的寡dT衔接引物的递转录反应液。作为底物核苷酸具有7种组份：如上述试剂盒的说明书所述的组分(反应液1)，dGTP置换成按表1组成的dGTP和dITP(BoehringerMannheim)混合物(反应液226，下面表1中)和向反应液1中分别加入62.5μM的7-Deaza-dATP和7-Deaza-dGTP(均为BoehringerMannheim)的组分(反应液7)。将这些反应液加入到PCR热循环PERSONAL(宝酒造)中，50℃20分～5℃5分进行逆转录反应。
表1
dGTP dITP
反应液2 1.75mM 0.25mM
反应液3 1.5mM 0.5mM
反应液4 1mM 1mM
反应液5 0.5mM 1.5mM
反应液6 0.25mM 1.75mM
然后使用上述试剂盒制备包含与各目标mRNA相对应的引物的PCR反应液。再准备向各PCR反应液中加入甲酰胺(各PCR反应液中甲酰胺的浓度为：转铁蛋白受体的为6.25％重量比，细胞角蛋白的7.3％重量比，β-肌动蛋白的为13.7％重量比)。将其中80μl加入到上述逆转录反应后得到的溶液中，总量达100μl，将该反应液中放置到PCR的热循环PERSONAL中，以82℃、1分钟～43℃、1分钟～72℃1分钟为1个循环进行30个循环的PCR。
将所得反应液中的8μl进行应用(Nuseive)3∶1琼脂糖(FMC公司)的3％琼脂糖凝胶电泳。用溴化2锭时电泳后的琼脂糖凝胶进行染色，通过比较因紫外线照解而发出的荧光强度来评价反应终止后各反应液中产物的量。所得结果中，逆转录反应液中加入了模板RNA的结果如表2所示。
表2目标 逆转录反应液 甲酰胺- 甲酰胺+转铁蛋白受体 反应液1 - ++
反应液2 - +
反应液3 - ++
反应液4 + ++
反应液5 + +
反应液6 - ±
反应液7 - ++细胞角蛋白 反应液1 - -
反应液2 - -
反应液3 - -
反应液4 - +
反应液5 - ±
反应液6 ± ±
反应液7 - +β-肌动蛋白 反应液1 - ++
反应液2 - ±
反应液3 - ++
反应液4 - ++
反应液5 - ±
反应液6 - -
反应液7 - ++-：未见到扩增±：稍微见到扩增+：见到扩增++：见到大量扩增
在未加甲酰胺的反应体系中进行PCR的时候，仅在非常有限的反应液中看到若干扩增产物，与此相对，在添加了甲酰胺的反应体系中，用反应液4进行逆转录反应可得到针对任一目的RNA的扩增产物。并且，在添加了甲酰胺的反应体系中，通过应用含有2种核苷酸类似物的反应液7进行逆转录反应，可得到针对所有目的RNA的扩增产物。另外，当目标为细胞角蛋白的时候，不使用核苷酸类似物进行PCR时，在添加甲酰胺时不能得到目的扩增产物。与反应液的组成无关，向逆转录反应液中加入模板DNA，也得不到扩增产物。
从这些结果可以看出，PCR时添加甲酰胺，作为核苷酸类似物，应用一定量的dITP或联合应用7-Deaza-dATP和7-Deaza-dGTP，在一定温度条件下可相当有效地扩增来源于各种RNA的DNA片段。另外，在该条件下，以DNA为模板不能引起扩增，这表明可选择性扩增以RNA作模板的DNA片段。实施例3 核苷酸类似物组合的比较
以转铁蛋白受体mRNA中约2kb的区域为目标进行以下实验。
使用RNA PCR Kit(AMV)Ver 2.1制备20μl含有来源于人HL-60细胞的50ng RNA或50ng DNA和上述引物P4(引物P4的碱基序列显示于序列表的序列号7中1，以及下述核苷酸类似物各62.3μM的逆转录反应液。
反应液1： 7-Deaza-dGTP
反应液2： 7-Deaza-dATP
反应液3： dITP
反应液4： dITP，7-Deaza-dATP
反应液5： 7-Deaza-dGTP，7-Deaza-dATP
将这些反应液放置到PCR热循环PERSONAL中，50℃、20分～5℃5分钟进行逆转录反应。
然后，使用上述RNA PCR试剂盒，制备含有引物P4、引物P9(序列表的序列号8中表示引物P9的碱基序列)的PCR反应液。将其中的80μl加入到上述得到的逆转录反应后的溶液中，使反应液的总量达100μl，将之放置到PCR热循环PERSONAL中，以84℃、1分钟～60℃、30秒～72℃、2分钟为1个循环，进行30个循环的PCR。
将所得反应液的8μl进行使用了琼脂糖L03(宝酒造)的1％琼脂糖凝胶电泳，与实施例2同样进行评价。结果，在所有的反应条件下仅看到以RNA为模板的扩增片段，在只添加了1种核苷酸类似物的反应体系中，使用反应液2时得到最高的扩增效率。由此表明，由于使用的核苷酸类似物的种类不同扩增效率有所不同。另外，使用了2种核苷酸类似物的反应液4和5，其扩增效率均比添加了1种核苷酸类似物的任何反应体系高。另外，以DNA为模板的反应液中，不论其组成如何均未见到扩增产物。实施例4 逆转录反应中使用各种酶的RT-PCR
应用RNA PCR Kit(AMV)Ver 2.1(AMV-RTazel BcaBEST RNA PCR Kit[来源于热坚芽孢杆菌的DNA聚合酶(BcaBEST)宝酒适]、MMLV-RTaze(Life Technologies)，按照各种酶的说明书制备包含从人HL-60细胞制备的RNA 500ng或DNA250ng和引物P4，添加了终浓度为62.3μm的7-Daza-dATP、7-Deaza-dGTP的20μl的逆转录反应液。将这些反应液放置到PCR热循环PERSONAL中，按如下程序进行逆转录反应。逆转录反应程序
AMV Rtaze ：50℃、20分钟～5℃5分
BcaBEST ：65℃、1分钟～30℃、1分钟的反应后，经15分
钟加热到65℃，65℃15分钟～80℃2分钟～
5℃、5分
MMLV-RTaze：42℃、50分～70℃、15分～5℃、5分
然后，用所得逆转录反应后溶液制备PCR反应液。使用BcaBEST进行逆转录反应时，应用BcaBEST RNA PCR Kit，应用除此之外的酶时应用RNA PCR Kit(AMV)Ver 2.1，参照各Kit的说明书制备含有引物P4和P3(序列表的序列号7和9中分别显示了引物P4和引物P3的碱基序列)，再添加了甲酰胺的PCR反应液。PCR反应液中甲酰胺的浓度是，使用BcaBEST RNA PCR Kit时为2.5％重量比，使用RNA PCR Kit(AMV)Ver 2.1时为6.23％重量比。将这些PCR反应液的80μl加入到上述逆转录反应后的溶液中使反应的总量达100μl，将之放置到PCR热循环PERSONAL中，以82℃、30秒～60℃30秒～72℃1分钟为1个循环进行30个循环的PCR。
反应终了后，将反应液的8μl进行应用琼脂糖L03(宝酒造)的1％琼脂糖凝胶电泳，与实施例2同样进行评价。结果，不论使用何种酶，以DNA为模板的反应液中未见到扩增片段，而在添加了RNA的反应液中均见到相同大小(964bp)的扩增片段。实施例5 反应液用于RT-PCR
以人细胞角蛋白mRNA中的252个碱基区域为目标，逆转录反应和PCR在，反应液中进行，进行RT-PCR。
应用GeneAmp EZ rTth RNA PCR Kit(Perkin-Elmer公司)制备3种反应液，(1)按试剂盒说明书中记载的组成；(2)添加终浓度300μm的DITP；(3)添加终浓度各150μm的7-Deaza-dATP和7-Deaza-dGTP，终浓度2％重量比的甲酰胺。向各反应液中加入上述引物P1和引物P2，来源于人HT-29细胞的RNA 1μg，和来源于该细胞的DNA。50、100、200ng。应用PCR热循环PERSONAL，按照以下2个条件分别对这些反应液进行RT-PCR。条件1：
逆转录反应 (60℃、30分钟) 1次
变性 (94℃、2分钟) 1次
PCR (94℃、30秒～60℃、30秒～72℃1分钟) 30次条件2：
逆转录反应 (60℃、3分钟) 1次
变性 (82℃、2分钟) 1次
PCR (82℃、30秒～60℃、30秒～72℃1分) 30回
将所得PCR反应液的8μl进行应用Nusieve 3∶1琼脂糖的3％琼脂糖凝胶电泳，对生成的扩增产物进行分析。结果发现，在条件1中，不论反应液的组成如何，可看到由RNA而来的扩增产物(251bp)以及由DNA而来的扩增产物(604bp)，其扩增量依赖于添加的DNA浓度。条件2时，用(1)的反应液未见到任何扩增产物，用(2)和(3)反应液仅得到以RNA为模板的扩增产物。此时，与(2)反应液相比(3)的反应液的扩增效率高。实施例6 联合应用甲酰胺和二甲基亚砜的RT-PCR。
比较反应液中只加入甲酰胺时和联合应用甲酰胺和二甲基亚砜时的RT-PCR。
目标mRNA及其扩增中应用的引物如下。β-肌动蛋白mRNA中的275个碱基区域(GC含量58％)：引物P7和引物P8。肿瘤坏死因子(TNF)mRNA中的325个碱基区域(GC含量61％)：引物P10和P11(序列表的序列号10和11中分别显示了引物P10和P11的碱基序列)。凋亡相关细胞因子Mcl mRNA中的448个碱基区域(GC含量51％)：引物P12和引物P13(序列表的序列号12和13中分别显示了引物P12和引物P13的碱基序列)。
应用One Step RNA PCR Kit(宝洒适)，按照Kit的说明书制备含有来自人培养细胞HI-60的RNA 1μg和与上面各目标相对应的引物，加入了各100μm 7-Deaza-dGTP和7-Deaza-dATP的反应液。除该反应液之外，再分别针对各目标物共准备7种反应液：向各反应液中添加终浓度分别为2、4、6、8、10％重量比的甲酰胺，以及添加终浓度为2％重量百分的甲酰胺和终浓度为3％重量比的二甲基亚砜的反应液。将各反应液放置到PCR热循环PERSONAL中，在以下条件下进行RT-PCR。
逆转录反应 (50℃、20分钟) 1次
变性 (83℃、2分钟) 1次
PCR (83℃、1分～43℃、1分～72℃、1分) 30次
将所得反应液中的8μl进行使用Nusieve 3∶1琼脂糖的琼脂糖凝胶电泳，与实施例2同样对生成的扩增产物进行分析。结果如表3所示。
表3目标 β-肌动蛋白 TNF Mc 1无有机溶剂添加 - - -甲酰胺 2％重量百分比 + - -
4％重量百分比 + ± +
6％重量百分比 + + -
8％重量百分比 ± - -
10％重量百分比 - - -2％甲酰胺及 ++ ++ ++3％二甲基亚砜-：未见到扩增±：稍微有扩增+：扩增++：大量扩增
如表3所示，为了在只使用甲酰胺时得到良好的扩增效率，有必要依据目标RNA调节其浓度，与此相对，在联合应用甲酰胺和二甲基亚砜时，用1种反应液就能有效地扩增任一种目标。实施例7 试剂盒
作为用于本发明的DNA扩增方法的试剂盒，制备如下能进行20个反应的试剂盒。10×逆转录反应缓冲液 40μl
100mM Tris-HCl(pH 8.3)
500mM KCl
100mM MgCl2
100mM DTT
500μm 7-Deaza-dGTP
500μm 7-Deaza-dATP
100mM dNTPAMV逆转录酶(5U/μl) 20μl2×PCR反应缓冲液 800μl
20mM Tris-HCl(pH 8.3)
100mM KCl
5％重量百分比 甲酰胺
5％重量百分比 二甲基亚砜Taq DNA聚合酶 (5U/μl) 20μl产业上利用的可能性
本发明可选择性扩增具有从RNA而来的碱基序列的DNA。应用本发明的方法可不用预先纯化样品中的RNA而扩增由RNA而来的DNA片段，因此使实验操作简单化，并且提高了重现性。
序列表<110>宝酒造公司<120>DNA扩增方法及其试剂盒<130>98-031-PCT<150>JP 9/231885<151>1997-8-14<150>JP 9/305016<151>1997-10-21<160>13<201>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1ccacagtgtc tgtatcggag 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2gtttccaact gccctatgac 20<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3cgtctaacag tggaagctga tc 22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>4catgacttca tacttctgcc tc 22<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>5caagagatgg ccacggctgc t 21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3tccttctgca tcctgtcggc a 21<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7gagactgtga gtagtgacac 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8ccatcccatc atcttggtac 20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>9ctaagaagcg agcactgacc 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>10cagagggaag agttccccag 20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>11ccttggtctg gtaggagacg 20<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>12cggcagtcgc tggagattat c 21<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>13tctaggtcct ctacatggaa g 21