批量高压灭菌方法 【技术领域】
本发明涉及用于批量高压灭菌多糖的方法，尤其涉及批量高压灭菌透明质酸的方法。
【发明背景】
多糖可用于医药产品。添加多糖的一个目的是使医药产品具有较高的粘度。例如，组织处置组合物(例如粘合剂组合物)即有此需要，以便于使其易于处置。在某些情况下，当多糖与蛋白质混合并用于医药产品时，通常需要灭菌。
蛋白质热敏，不能采用加热灭菌，通常采用过滤法灭菌。然而，由于多糖的高粘度和高分子量，无法对多糖进行过滤灭菌。因此，需要对多糖进行灭菌以使之能用于医药产品。然而，多糖也是热敏性的，加热会使其降解，尤其是经历长时间热处理的情况下。一旦降解，它们的粘度丧失并且不再有用或根本不能使用。
可采用不同的方式对热敏产品进行灭菌。WO00/24433描述了降低医药物质中热敏成分(例如葡萄糖)在热力灭菌法期间降解的方法。该方法包括：采用多室接收器，其中包括含有第一医药物质的第一室，和包含一定量第二医药物质(少于第一医药物质)的至少一个第二室。将第一室加热至预定温度，对医药物质进行灭菌，而第二室在多室接收器被加热期间是绝热的。撤去第二室的隔热，使第二室在灭菌温度下保持确定的时间。然后混合不同室的内容物。
本发明方法尤其涉及透明质酸的高压灭菌。US5621093描述了对固体透明质酸进行蒸汽灭菌的方法，该方法克服了对溶液形式的透明质酸进行化学灭菌、干热灭菌和对溶液形式的透明质酸灭菌的缺点(可引起化学污染和分子量的降低)。
Healon是一种含有透明质酸的产品的商标名(Phannacia AB公司制造)，Healon是在容量约1ml的小玻璃容器中灭菌的。因此，这些容器是非常小的。目前需要对多糖尤其是透明质酸进行批量高压灭菌。本发明旨在解决上述问题，并减少批量高压灭菌中粘度的下降，而在此之前是不可能实现的。
发明概述
本发明涉及批量高压灭菌多糖地方法，包括将多糖溶于溶液中，将所得溶液置于容器中，其中溶液的量使包含该溶液的容器的厚度小于15mm；对填充后的容器进行高压灭菌，其中高压灭菌包括将溶液加热到预定温度，当F0＞8时开始冷却。溶液在预定时间内保持高于预定温度的温度。
业已发现，经本发明方法高压灭菌后，多糖的粘度略有降低，但是可接受的。粘度的降低很小，仍然符合要求。因此，灭菌后的溶液仍可用于其各种应用，因为该方法对分子量的影响是温和的。
附图简述
附图1为容器(塑料袋)的俯视图。
附图2为附图1中包含溶液的本发明塑料袋延线I-I的横切面。
附图3为图1中包含溶液的常规塑料袋延线I-I的横切面。
附图4为实施例1中高压灭菌室的温度曲线图、容器中传感器的温度和F0值对时间作图所得曲线。
附图5是实施例2中高压灭菌的透明质酸钠和Healon粘度对切变速率作图所得曲线。
发明详述
本发明涉及用于批量高压灭菌多糖的方法，该方法包括：
将多糖溶于pH约为6-8的水溶液中，并混合至得到均匀溶液，
将所得溶液置于至少一个容器中，其中溶液的量使包含该溶液的容器的厚度小于15mm，
将包含该溶液的容器置于高压灭菌器中，
在至少一个容器中放置传感器，和
对包含溶液的容器进行高压灭菌，其包括将该溶液加热预定温度，当F0＞8时开始冷却，和均匀溶液在预定时间内保持高于预定温度的温度。
可采用任何种类的高压灭菌器，只要能将溶液加热至预定温度，当F0＞8时开始冷却。冷却包括冷却高压灭菌器和同时冷却溶液。然而，溶液的冷却要慢于高压灭菌器，如图4显示了本发明方法的温度。在操作期间，F0值最大可高达10-12，然后用尽量短的时间快速完成操作。这样就减少了多糖的降解。
F是指灭菌方法杀灭微生物的能力的指标，或者是灭菌方法灭菌能力的指标。它是一种比较指标，用来表示微生物在灭菌方法中被杀灭的特定速度，F代表121℃时达到这一特定杀灭速度所需的时间。
F0的概念应用于药物灭菌始于1976年，当时由FDA在“ProposedRules For LVP”中提出了这一概念。与121.11℃的恒定温度下时间t121.11℃的理论灭菌相比，即可计算出灭菌的致死效果(精确的说，121.11℃相当于250°F；但是为了方便起见，我们将Fo视作相当于121.0℃)。这样计算出的时间即为F0。即使在时间t期间灭菌温度不保持恒温T(在其左右波动)的情况下，也可进行这种计算，只多一点复杂性。可用下面的数学公式表示F0：
插入原文4页式
其中Δt＝测定T的时间间隔
T＝在时间t所测定灭菌产品的温度
Z＝温度系数，设为10。
容器1如附图1所示，其中附图1是塑料袋1的俯视图，本发明容器优选为塑料袋。容器上有图中所示的阀口3。附图1中包含溶液的本发明塑料袋1延I-I的横切面如附图2所示。而包含溶液的常规塑料袋2的横切面如附图3所示。
附图2中包含溶液的容器的厚度t优选小于10mm，最优选小于7mm。容器优选为塑料袋1，适于用作塑料袋的材料是聚四氟乙烯或其他能耐高温的聚合材料。
优选实施方案中的容器1是塑料袋1，它在空间上有三个尺寸，即具有宽度w、长度l和厚度t。在上下文中，厚度t具有最小值。因此，当塑料袋1平放于支持物上时(从附图1上方看)，厚度t是指反向垂直于支持物的尺寸。厚度t如附图2所示。宽度w和长度l均大于厚度t。然而，最重要的是，厚度t应小于15mm。袋1是易曲的，在填充了溶液后其厚度t变大，并且袋1的厚度t最大可达15mm。容器1优选为塑料袋1，但是也可采用其它容器。它们也应具有宽度w、长度l和厚度t，其中厚度t具有最小值。也可以采用其它形状诸如不规则形状的容器。但是容器的厚度t应在容器1空间上具有最小的尺寸，并且该厚度t小于15mm。容器可以是柔性或刚性的。
将进行高压灭菌的多糖可以约为250ml或更多。这在以前是不可能实现的。如果将如此量投入瓶中，待容器中部达到足够用于灭菌的温度的时间将会太长。这样长的时间将使多糖降解。高压灭菌中使用的塑料袋约为1或2升。如果这种袋中装入上述容量，达到高压灭菌温度所需的时间也太长，多糖也将降解。根据本发明，业已发现当向塑料袋1中填入较小量(例如使包含溶液的袋1的厚度t小于15mm)，达到高压灭菌所需温度的时间就不再那么长了。同时，多糖的降解也是可接受的。达到高压灭菌温度的时间较短，这是由于薄塑料袋中的热传递要易于填满料的塑料袋或包含相同量的瓶子。
可采用市售的1或2升的袋子，装量为250ml。也可采用其它容量的袋子，只要充液后容器的厚度小于例如15mm、优选小于10mm和最优选小于7mm即可。
多糖是水溶性的，这是其应用的一个必要特性。也可使用其它水溶性聚合物。它们在溶液中表现出增粘效力，这是其在医药物质中应用的重要特性。粘度取决于聚合物的浓度和分子量。
多糖可以例如是葡糖胺聚糖，和它们选自硫酸肝素、硫酸软骨素(chondroethin sulfate)或它们的盐或衍生物。
所述多糖也可选自透明质酸、羧甲基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、淀粉或它们的盐或衍生物。根据本发明，即使没有明确地提及，也可采用多糖的盐或衍生物。
多糖优选为透明质酸或其盐或衍生物，适宜的透明质酸是透明质酸钠。透明质酸在溶液中是增粘性的，当用于医药物质时也具有优良的治疗和药学效力。
经本发明方法高压灭菌的透明质酸或多糖适用于医药物质。为了简便起见，在下文中仅以透明质酸为例，但是可采用适宜的任何多糖。为了生产医药物质，可将透明质酸与蛋白质混合。这些是热敏的且不能高压灭菌处理的。蛋白质通常采用过滤法灭菌，然后与透明质酸混合。
示例蛋白质为凝血酶，它可与透明质酸混合。该混合物可用来与另一组分一起形成医药物质，例如粘合剂、伤口愈合物质、止血物质等。这些医药物质通常与纤维蛋白或纤维蛋白原混合。医药物质中也可包括其它常用组分。US5631011公开了一些医药物质，例如组织处置组合物，包括纤维蛋白或纤维蛋白原和增粘性聚合物例如透明质酸。组合物中也可含有凝血酶。该组合物为双组分组合物。在使用组合物之前(例如外科手术)，可将各组分直接混合。在该专利中并没有描述透明质酸的灭菌。然而，该发明医药物质的施用量通常较低，无需进行批量高压灭菌。
上述US5631011描述的组合物中使用透明质酸的一个优点是透明质酸改善了组织处置组合物的粘度特性。例如，在处置胶液时，具有水样流动性的粘合剂组分会导致困难。在溶液中，透明质酸形成一种非常延展的无规则卷曲构象，它在低浓度时即可缠绕成柔性分子网络，这为透明质酸盐提供了所需的流变学特性。另外，透明质酸还具有治疗和药用效力。当在处置组合物中使用透明质酸时，可改善组合物的粘度并使其处于适宜的水平。因此，需要能对大量透明质酸进行灭菌的方法，本发明即解决了该问题。US5631011中使用的透明质酸是Healon，它是唯一市售的透明质酸。填装Healon的容器非常小(约1ml)。目前，透明质酸与适宜蛋白质(例如凝血酶)的混合引起了关注，可经高压灭菌大量提供透明质酸，然后将其与凝血酶混合。接着，将混合后的凝血酶和透明质酸进一步分配到具有适宜尺寸的较小容器中。
透明质酸优选与蛋白质混合。尤其优选的蛋白质是凝血酶。凝血酶对碱和酸性的环境敏感，因此pH约6-8的高压灭菌缓冲液适于凝血酶。低含量的辅助(helping)盐类也是必要的，氯化钙可用于此目的。在高压灭菌之前，用缓冲液溶解透明质酸，使之适于凝血酶。这种环境并不是最适于透明质酸的，它可使透明质酸少量降解。然而，对于透明质酸的应用而言，这种降解作用是可以接受的。高压灭菌也会使透明质酸降解，但这种降解也是可以接受的。本发明的高压灭菌是首个能对如此大量透明质酸进行灭菌的方法。
优选地，透明质酸溶于包括以下组分的缓冲液中：
0.045-0.055M精氨酸，HCl
0.045-0.055M甘氨酸
0.045-0.055M赖氨酸，HCl
0.01-0.18M NaCl
0.035-0.045M CaCl2 2H2O
透明质酸盐的最大溶解量为23mg/ml。
优选地，透明质酸盐的溶解量为10-23mg/ml。大于23mg/ml则不能溶解，并且如果浓度低于10mg/ml，粘度则不够高。然而，在某些应用中，并不需如此高的粘度，因此透明质酸盐的溶解量可约为0.1-10mg/ml。在其他应用中，透明质酸盐的浓度可为5-15mg/ml。
将透明质酸盐溶于缓冲液中，并混合至获得均质溶液。该操作约需要2天。将溶液充入塑料袋1，将塑料袋置于高压灭菌器中，并且在至少一个袋中放置传感器。下面实施例中所用袋子的宽度w为170mm、长度l为170mm和厚度t为7mm。也可采用其它长度l和宽度w的袋子，但是厚度应始终小于15mm。首先，将溶液加热至预定温度，进行高压灭菌。所述温度约为121-130℃，在约3-7分钟内将该溶液加热至预定温度。只要高压灭菌器的程序能计算F0值并且当F0＞8时开始进行冷却，可以使用任何类型的高压灭菌器。冷却是指对高压灭菌器进行冷却。从附图4中可以看出，当F0约为8时开始对高压灭菌器进行冷却。从中也可看出，溶液同时也开始冷却。当溶液加热后，它将在预定温度上保持预定时间，例如约3-6分钟。为了防止袋子膨胀，可采用反压技术(counter pressure)。可通过氮气进行反压。为了防止降解，加热和冷却循环应尽可能短。在进行高压灭菌期间，F0值最大约达到10-12。约用时5-12分钟将溶液冷却至约65-90℃。由附图4可知，几乎在冷却高压灭菌器的同时对溶液进行冷却。整个操作约在11-25分钟后完成，这是有利的短时间。更优选的时段是11-20分钟。具体时限是指不再有杀死，这应由微生物学检定来确定。
根据本发明，当使用这种薄袋1时，能量传递是快速的并且可防止出现温度梯度。这使得对敏感材料的批量高压灭菌成为可能，而在以前是无法对如此量的材料进行批量高压灭菌的。
溶有透明质酸的缓冲液适于与上述凝血酶混合。这种缓冲液并不是最适于透明质酸的，其中的透明质酸略有降解。然而，缓冲液和高压灭菌所致的降解是可接受的。对于例如医药物质应用，其粘度仍然足够高。
也可在本发明描述的方法中对溶于其他缓冲液中的透明质酸进行高压灭菌。这种缓冲液可以是弱磷酸盐缓冲液。但是可采用任何适宜的缓冲液。
本发明方法的一个优点在于，整个操作约用时11-25分钟、优选为11-20分钟，和在F0＞8时终止灭菌循环，即当F0＞8时进行冷却。另外，尤为重要的是，在此之前根本不可能对约250ml量的透明质酸进行灭菌。
如果高压灭菌的透明质酸盐与凝血酶一起使用，则应将凝血酶与透明质酸盐混合并转动过夜。将混合物填充到适宜容量的容器中。这些操作应在无菌环境中进行。
除非另有定义，在此所用的所有技术和科学名词，均与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所能理解的含义相同。尽管存在着类似于或等同于在此所述方法和材料的许多方法和材料，它们亦可用于本发明实践或试验，下面将描述适宜的方法和材料。在此提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献，均完全引入作为参考。如有冲突，则以本说明书(包含定义)为准。另外，所述材料、方法和实施例仅为说明性的，没有限定作用。
下面的实施例旨在进一步描述本发明，对本发明的保护范围没有限定作用。
实施例
实施例1
该实施例描述了对溶于缓冲液中的透明质酸钠进行高压灭菌的方法。高压灭菌室的温度、包含透明质酸钠的容器的温度F0值对时间作图，显示于附图4。
18mg/ml透明质酸钠溶于包括以下组分的缓冲液中：
缓冲液
0.05M精氨酸，HCl
0.05M甘氨酸
0.05M赖氨酸，HCl
0.16M NaCl
0.04M CaCl2 2H2O
配制600ml溶液，并转动以得到均匀溶液。上述操作室温下约需要2天。两个塑料袋中填充250ml溶液，使含有内容物的袋子的厚度约为7mm。宽度w是170mm和长度l是170mm。袋的标称体积是1升。将传感器置于一个袋中，开始进行高压灭菌。采用反压技术，经旋转式高压灭菌器程序(fan autoclaving program)进行高压灭菌，和当F0＞8时进行冷却。附图4中的曲线表示高压灭菌室的温度、传感器A的袋温度以及计算的F0值对时间(分钟)作图。室的加热和冷却曲线取决于高压灭菌器。出于安全原因，高压灭菌器在袋子被冷却至80℃之前是关闭的，否则在容器温度低于100℃时就已经取出袋子。
如图4所示，袋中的温度在约4分钟后即迅速达到121℃。当F0＞8时开始冷却。溶液的温度在高于121℃的水平保持几分钟。温度由于室的冷却而降低。当袋中的温度达到约80℃时，打开高压灭菌器并取出袋子。加热时间非常短，冷却时间也相当短。常规的121℃灭菌时间约为30分钟(不计冷却和加热时间)，而该实施例方法用时17分钟。
实施例2
在该实施例中，对本发明高压灭菌的透明质酸盐的粘度与Healon的粘度进行了比较。
于不同时间，对透明质酸盐进行二轮高压灭菌。18mg/ml透明质酸盐溶于包括以下组分的缓冲液中：
0.05M精氨酸，HCl
0.05M甘氨酸
0.05M赖氨酸，HCl
0.16M NaCl
0.04M CaCl2 2H2O
将溶液转动约二天，获得均匀溶液。然后按照实施例1方法对溶液进行高压灭菌。高压灭菌后，再将溶液转动一天，然后测量溶液的粘度。于37℃，取0.6ml，在Stress Tech流速计上，以不同的切变速率，进行旋转粘度测量。
同样，测定Pharmacia AB公司制造的Healon的粘度。Healon含有浓度为10mg/ml的透明质酸。结果如附图5所示，其中以粘度对剪切速率作图。
Healon具有一定的粘度，适于医药应用。由附图5可知，经本发明高压灭菌处理的透明质酸盐的粘度水平与Healon相同，属于可接受的水平。因此，本发明高压灭菌对透明质酸盐的粘度和分子量的影响是温和的。
上述二实施例表明，可对透明质酸盐进行批量高压灭菌，灭菌后透明质酸盐的粘度和分子量的降低水平是可以接受的。该方法是新颖的，在此之前由于透明质酸的高度降解作用而不可能对其进行批量高压灭菌。现在，本发明新工艺使之成为可能，经本发明高压灭菌的透明质酸具有广泛的应用。