含壳寡糖的农药组合物及应用 【技术领域】
本发明涉及农业领域，更具体地涉及含壳寡糖的农药组合物及其制备方法。
背景技术
植物与病原菌之间依照“基因对基因”的模式，通过信号相互识别及传导(Flor，H.H.(1971)Current status of the gene-for-gene concept.Annu.Rev.Phytopathol.9，275-296)，并调动各自的应答系统，其相互竞争的结果导致植物对病原感病、耐病或抗病。
从信号传导途径来说，对应的R和Avr蛋白的互作符合受体-配体的机制(Baker B，Zambryski P，Staskawicz B，Dinesh-Kumar SP(1997)Signalingin plant-microbe interactions.Science，276：726-733；Lamb CJ(1996)Ligand-receptor mechanism in plant-pathogen recognition.Science，274：2038-2039；Martin GB(1999)Functional analysis of plant diseaseresistance genes and their downstream effectors.Curr Opin Plant Biol，2：273-279；Staskawicz BJ(2001)Genetics of Plant-Pathogen Interactionsspecifying plant disease resistance.Plant Physiol，125：73-76)。
植物和病原菌之间的互作表现为高度复杂的生物学过程，细胞死亡作为在植物感染位点发生的超敏反应的典型特征，能进一步引发远处组织作出系统应答，即系统获得性抗性。这种细胞死亡被认为是植物对抗病原菌的一种主动的自杀性行为。
目前认为，植物中超敏反应所涉及的细胞死亡同动物中所说的程序性细胞死亡有相似之处(Gilchrist，D.G.(1998)Programmed cell death in plantdisease：the purpose and promise of cellular suicide.Annu.Rev.Phytopathol.36，393-414)。防卫反应发生分为三步完成：植物和病原物之间的相互识别、信号传导及应答过程。因此，探究这三步的详细机理，已成为阐明植物对病原微生物的抗性机制的关键之一。
一般认为，植物通过诱导子信号的传导作用产生防卫反应。诱导子(elicitor)是植物抗病生理过程中诱发植物产生植保素(phytoalexins)和过敏反应(hypersensitive reaction，HR)的因子。包括有各种生物大分子(源于细菌、真菌和植物的寡糖素、糖蛋白、蛋白和多肽等)和小分子物质(水杨酸、茉莉酸等)。诱导子在植物与微生物地相互作用中，能够高度专一、快速的诱导特定基因的表达。
几丁质是是构成病原真菌细胞壁的主要成分，有研究表明其降解产生寡聚糖胺(壳寡糖)能够激发植物产生防卫反应。然而，迄今为止，尚没有将壳寡糖用于农用的报道。
另一方面，各种化学农药对环境和人类都或多或少地造成各种不利影响，因此，本领域迫切需要开发新的能够提高植物抗病性的生物农药。
【发明内容】
本发明的一个目的是提供一种新型的提高植物抗病性的生物农药。
本发明的另一目的是提供所述生物农药制备方法及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种农药组合物，它含有防治有效量的壳寡糖和载体。
在一优选例中，壳寡糖的含量为组合物总重量的0.0005-99％，较佳地为0.005-95％，更佳地为0.01-90％。。
在另一优选例中，所述的组合物为选自下组的剂型：可湿粉剂，可乳化浓缩物，水溶液，乳液，可喷洒溶液，油性或水性分散系，悬浮剂，粉剂，颗粒剂，微胶囊。
在另一优选例中，所述的组合物为粉剂，且所述的壳寡糖的含量为组合物总重量的80-90％。
在另一优选例中，所述的组合物为水溶液，其中壳寡糖的含量为组合物总重量的0.0005-0.05％。
在另一优选例中，所述组合物还含有选自下组的物质：单分子糖胺、氯化钠、Tween-20和水。
在本发明的第二方面，提供了一种提高植物抗病性的方法，包括步骤：给所述植物施用有效量的壳寡糖。
在一优选例中，所述的植物选自下组：水稻、小麦、蔬菜、花卉，且所述的抗病性是抗植物真菌病害。
在另一优选例中，壳寡糖的施用有效量为5ppm(0.005g/L)至1000ppm(1g/L)。
在本发明的第三方面，提供了一种制备壳寡糖的方法，包括以下步骤：
(a)提供固体几丁质或蚌壳、虾壳经清洗干燥粉碎后的粉末；
(b)于密封并有降温设施的搅拌器中按1∶5-1∶10的比例加入浓盐酸；
(c)30-45℃搅拌3-12小时至几丁质全部溶解；
(d)在低温容器中冷却上清悬浮液至10-20℃；
(e)加入NaOH至pH3.0±0.5，产生NaCl沉淀，而可溶性寡聚糖胺于上清中；
(f)过滤去盐，回收寡聚糖胺溶液；
(g)脱水干燥。
【附图说明】
图1壳寡糖诱导水稻细胞死亡的剂量效应。
图2壳寡糖诱导水稻细胞死亡的时间效应。
图3不同处理诱导水稻细胞活性氧的产生。
图4不同浓度壳寡糖诱导防卫基因的表达。
图5壳寡糖诱导防卫基因表达的时间动态。
图6不同浓度壳寡糖处理后的水稻叶片Trypan blue染色结果。
图7不同浓度壳寡糖处理后的水稻叶片DAB-uptaking结果。
图8壳寡糖处理后的不同日期的抗瘟性结果。
图9壳寡糖处理后水稻植株抗性增强。
【具体实施方式】
本发明对壳寡糖的作用机理进行了广泛而深入的研究，首次发现壳寡糖可引起水稻过敏性样细胞死亡，强烈激活水稻等植物的防卫反应，从而增强了植物的抗病性。因此，壳寡糖可作为诱导植物抗病的诱导剂而用于农业。在此基础上完成了本发明。
本发明农用组合物的活性成分是壳寡糖(Oligo-GlcNAc)。以水稻为例，壳寡糖能够诱导悬浮培养的水稻细胞和幼叶细胞发生过敏性反应死亡，并强烈激活防卫反应基因RCH10、PAL等表达，产生氧进发。处理的水稻植株明显增强了对稻瘟病等的抗性。
壳寡糖的制备方法是已知的，一种优选的方案如下：固体几丁质或蚌壳、虾壳经清洗干燥粉碎后的粉末→于密封并有降温设施的搅拌器中按1∶10的比例加入浓盐酸→30-45℃搅拌3-12小时至几丁质全部溶解→在低温容器中冷却上清悬浮液至10-20℃→逐步加入5N NaOH至pH3.0产生NaCl沉淀，而可溶性寡聚糖胺于上清中→过滤去盐(盐可回收作为工业用盐)→寡聚糖胺溶液脱水干燥即为成品→粉末干燥保存。
本发明组合物通常含总量0.0005-99wt％的活性成分(即壳寡糖)。浓缩型的农药中活性成分的含量较高，如80-90％，而稀释型农药和实际使用的组合物中活性成分含量较低，通常为0.0005-0.05％。此外，还可以包含其他合适的化学杀菌剂、、增效剂、微量元素、稳定剂、粘合剂、润湿剂、分散剂、乳化剂、渗透剂、溶剂、充填剂等常用组分。
本发明组合物中还可以含有例如选择性除草剂和其他具有杀虫活性的物质，化肥和/或生长调节剂。
本发明组合物在用于提高植物的抗病性。组合物适用的形式包括适合喷洒、喷雾和低容量或超低容量喷洒的气雾剂和水性或非水性溶液或分散系。优选方式是水性母液和易溶于水的颗粒形式。
在制备组合物时合适的固体稀释剂包括硅藻土，玉米壳，磷酸三钙，软木粉，高岭土、膨润土或硅镁土等粘土，和水溶性聚合物。
此外，固体组合物还可以含有一种或多种相容性润湿剂，分散剂，乳化剂或色素，这些成分在固态时也可起稀释剂的作用。
这样的固体组合物可以是粉剂，颗粒剂或可湿粉剂的形式。通常通过研磨获得粉剂，通过造粒或压片获得颗粒剂、片剂或砖型剂。
液体组合物的形式可以是溶液，悬浮液和乳液，也可以将其包在天然或合成聚合物中，并可以包含润湿剂、分散剂或乳化剂。这样的乳液、悬浮液或溶液可用水性、有机或水-有机稀释剂来制备水溶性聚合物(以及上述稀释剂的混合物)。此外，所述稀释剂中可含有例如以上所述离子型或非离子型的润湿剂、分散剂或乳化剂或它们的混合物。
可用多种方法将组分配成制剂。合适的制剂可选自例如：水溶液(SL)，可湿粉剂(WP)，可乳化浓缩物(EC)，可喷洒溶液或乳液，油性或水性分散剂，悬浮剂，粉剂(DP)，颗粒剂。
各种制剂的原理都是已知的，并在例如以下文献中有所描述：Winnacker-Kuchler，“Chemische Technologie″化学技术，Vol.7，C.Hauser Verlag Munich，第4版，1986；van Valkenburg，“农药剂型”，Marcel Dekker N.Y.，第2版，1972-73；K.Martens，“喷雾干燥手册”，第3版，G.Goodwin Ltd.London。
用于本发明组合物的所需的配制助剂，(例如惰性物质，表面活性剂，溶剂和其他添加剂)，也是已知的，其描述例如：Watkins“杀虫粉剂稀释剂和载体手册”第2版，Darland Books，Caldwell N.J.；H.v.Olphen，“粘土胶体化学导引”第2版，J.Wiley & Sons，N.Y.，Marsden，“溶剂指南”第2版，Interscience，N.Y.1950；McCutcheon′s，“除垢剂和乳化剂年刊”，MC Publ.Corp.，RidgewoodN.J.；Sisley和Wood，“表面活性剂百科全书”，Chem.Publ.Co.Inc.，N.Y.1964；Schonfelt，“Grenzflachenaktive Athylenoxidaddukte”表面活性环氧乙烷加成产物，Wiss.Verlagsgesell.，Stuttgart 1976；Winnacker-Kuchler，“ChemischeTechnologie″化学技术，Vol.7，C.Hauser Verlag Munich，第4版，1986。
可湿粉剂可均匀分散于水。除活性物质之外，可湿粉剂还可包含润湿剂，分散剂，稀释剂等无环境公害的物质。粉剂的制备可以是：将活性物质与精细粉碎后的滑石、高岭土、膨润土之类天然粘土或硅藻土等固体物质一同研磨。颗粒剂的制备可以是用活性物质喷涂吸附于惰性物质颗粒，或将活性物质溶液通过粘合剂(例如聚乙烯醇、聚丙烯酸钠，或矿物油)施加于载体(例如砂、高岭土或惰性物质颗粒)表面。如果欲与化肥混合施用，则可将合适的活性物质象制备化肥颗粒那样制备成颗粒。
在本发明的一个实例中，提供了一种母液。它是用如下方法制备的：壳寡糖粉末→按10或20mg/ml(1％或2％)制成水溶液→过滤灭菌→室温保存有效期可达半年以上，低温4℃保存有效期达两年以上。
原则上，本发明的农用制剂包含0.0005-2wt％壳寡糖，较佳地0.005-1wt％，更佳地0.05-0.5wt％。例如，可湿粉剂中，活性物质的浓度约为0.005-2wt％；其余为常规制剂组分。如果是可乳化浓缩物，活性物质的浓度可以约为0.5-2wt％，以0.5-1wt％为佳。粉剂型制剂中，活性物质占约0.005-2wt％，以0.005-0.5wt％为佳；可喷洒溶液中，活性物质占约0.0005-2wt％，以0.0052-1wt％为佳。如果是颗粒剂，原则上，水可分散的颗粒含约0.005-1wt％活性物质，播撒颗粒中含0.005-0.5wt％。施用浓度在5ppm(0.005g/L)至1000ppm(1g/L)之间，较佳地50-200ppm，更佳地100-500ppm。
可用本发明组合物保护的植物种类
可本发明组合物和方法保护的植物没有特别限制，可以是谷类作物(如玉米，小麦，稻，高粱)，尤其是稻类；田间、林间、种植院、暖房、果园和葡萄园中的观赏作物、种植院作物和林木，例如：棉花，烟草，蔬菜(例如豆类，油菜，葫芦，莴苣，洋葱，西红柿和胡椒)，田间作物(如马铃薯，甜菜，落花生，大豆，油菜)，甘蔗，草地和林木(如玉米，高粱，紫花苜蓿)，种植院作物(茶叶，咖啡，可可，香蕉，油棕，椰子，橡胶，香料)，果园和小树林(如核果，柑橘，猕猴桃，鳄梨，芒果，橄榄和胡桃)，葡萄园，暖房、花园或公园中的观赏作物，花卉和灌木，树林、种植院和花圃中的林木(包括落叶林木和常青林木)。
可防治的病害种类
可用本发明方法防治的病害主要是各类真菌引起的病害，例如稻瘟病。
防治方法
将组合物施用于生长中的作物的合适方法包括：叶面喷洒剂，粉剂，颗粒剂，用液体灌溉、粉剂、颗粒剂、和泡沫剂处理土壤和根。此外，本发明组合物可用于防治受植物病害侵食的植株部位，例如将本发明化合物施用于水稻叶面可防治稻瘟病。优选的施用方式是对叶施用。
本领域技术人员可以看出，组合物的施用比需随例如温度、湿度、待处理区域和待处理植物等外界条件而改变。因此，施用比应可在一较宽的范围内变化。本发明组合物的使用频率可由农民、病害防治专业人士或其他本领域技术人员根据预期效果来选择。
一种优选的方案如下：对于植物真菌病害的防治，将1％或2％的母液按1∶100至1∶1000配成使用液，苗期至成株期均可喷洒。一般作物在苗期至开花期间用此药液共喷3次，每间隔15天喷一次，防病率达50％以上。发病期间配合使用少量化学农药效果更佳。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
水稻悬浮细胞的准备
水稻悬浮细胞在N6液体培养基中于26℃摇床(80rpm)暗培养，每7～10天换一次新鲜培养液。
N6液体培养基配方如下：
KNO3 2.83g/L (NH4)2SO4 0.463g/L
KH2PO4 0.4g/L MgSO4·7H2O 0.185g/L
CaCl2·2H2O 0.166g/L MnSO4·H2O 3.3mg/L
ZnSO4·7H2O 1.5mg/L H3BO3 1.6mg/L
KI 0.8mg/L
FeSO4·7H2O 28mg/L Na2EDTA 37mg/L
烟酸(B5) 0.5mg/L 硫胺素·HCl(B1) 0.1mg/L
吡哆酸·HCl(B6) 0.5mg/L 肌醇酯 100mg/L
蔗糖 30g/L 2，4-D 2mg/L
脯氨酸 2.3g/L 色氨酸 50mg/L
pH5.8
实施例2
壳寡糖和母液的制备
壳寡糖制备过程如下：
固体几丁质或蚌壳、虾壳经清洗干燥粉碎后的粉末→于密封并有降温设施的搅拌器中按1∶10的比例加入浓盐酸→45℃搅拌3-12小时至几丁质全部溶解→在低温容器中冷却上清悬浮液至10-20℃→逐步加入5N NaOH至pH3.0产生NaCl沉淀，而可溶性寡聚糖胺于上清中→过滤去盐(盐可回收作为工业用盐)→寡聚糖胺溶液脱水干燥即为成品→粉末干燥保存。
例如，几丁质(Sigma)0.2g经过盐酸降解过夜，用5N的NaOH调节pH3-4，经过过滤去盐脱水干燥后，制成10mg/ml的寡聚糖水溶性母液，0.45um的微孔滤膜过滤，于-20℃保存备用。
实施例3
壳寡糖诱导水稻悬浮细胞死亡
分别以0、100、200、500、1000ng/ml浓度的壳寡糖处理换培养基4天后的水稻悬浮细胞，于26℃摇床(80rpm)暗培养24小时，经0.05％的Evans blue染色15min，水洗6次将未结合的染料去除。从中称取100mg细胞，用50％的甲醇(含1％SDS)1.5ml于50℃水浴30min，期间要不断的摇动，以便充分脱色，测量洗脱液600nm的光吸收值。同时，以80℃水浴处理10min作为细胞完全死亡的对照，分析细胞死亡的剂量效应。以1μg/ml浓度的壳寡糖对水稻悬浮细胞做同样的处理，分别在12小时和24小时后，经过染色和脱色处理，测量洗脱液600nm的光吸收值，分析细胞死亡出现的进程。
结果如图1和图2所示。过敏性细胞死亡是植物与病原菌非亲和互作的典型特征。通过不同剂量的壳寡糖处理水稻细胞24小时后发现，细胞的死亡是随着壳寡糖浓度的增加而增加的，以1μg/ml的壳寡糖处理水稻细胞，就能够将其完全杀死(见图1)。用1μg/ml壳寡糖分别对水稻细胞进行12和24小时的处理，结果表明：处理12小时后细胞死亡就明显产生，至24小时即完全死亡(见图2)。因此得出，壳寡糖是一种水稻细胞死亡的强烈激发子。
实施例4
抗病信号的产生与防卫基因的激活
(a)H2O2的产生
新鲜的水稻悬浮细胞(转接第4天)用于活性氧的测定。 以1μg/ml浓度的壳寡糖处理的水稻悬浮细胞，分别于26℃摇床(80rpm)暗培养0、30min、1hr、3hr、6hr、12hr、24hr，用0.2μm孔径的针筒式漏斗过滤培养液，取其200μl加入5μl 1mmol/LHPTS底物，5分钟混合后，在荧光仪(Perkin ElmerLS50B)上测定活性氧的浓度(参数为：激发波长405nm，发射波长512nm)。
结果如图3所示。活性氧的产生是植物主要防卫反应之一。实验结果表明，以1μg/ml浓度的壳寡糖处理的水稻悬浮细胞，在0.5小时左右开始产生一个H2O2小峰，6小时达到另一个高峰(见图3)。此后，壳寡糖诱导的活性氧产生逐渐减弱。该结果非常类似病原菌或激发子产生的两次氧进发现象。
(b)防卫基因的表达
以不同浓度的壳寡糖处理水稻悬浮细胞，于26℃摇床(80rpm)暗培养12小时后提取细胞的总RNA(Trizol法)，Northern blot检测防卫抗病基因RCH10，PAL的表达。以1μg/ml浓度的壳寡糖处理水稻细胞，分别于26℃摇床(80rpm)暗培养0min、30min、1hr、3hr、6hr、12hr、24hr后，提取细胞的总RNA(Trizol法)，Northern blot检测防卫基因RCH10，PAL，CatB的表达动态。
结果如图4和5所示。以不同浓度的壳寡糖处理水稻悬浮细胞，12小时后0.01ug/ml的壳寡糖便能够强烈激活防卫基因RCH10和PAL的表达，0.5ug/ml的处理量就可达到防卫基因的表达量最大(见图4)。以1μg/ml浓度的壳寡糖处理水稻细胞，进行防卫基因激活的时间动态研究。2小时后能够激活防卫基因RCH10和PAL的表达，在8-12小时的表达量就可以达到最大；防卫基因CatB在壳寡糖处理2小时后能够被抑制表达(见图5)，再次证实CatB可能是一个抗病反应的负调控因子(He，Z.Et al.(2000)Perception of brassinosteroidsby the extracellular domain of the receptor kinase BRIl.Science.288，2360-2363)。
实施例5
壳寡糖诱导水稻叶片产生过敏性反应
(a)壳寡糖诱导水稻叶片细胞死亡
分别以0、1、5、10、100ug/ml浓度的壳寡糖喷洒到三叶期感病水稻H7S的植株上，24小时后，剪取叶片，放入沸水浴状态下的0.1mg/ml的Trypan blue染色液(乳酸∶甘油∶酚∶水＝1∶1∶1∶1，再加入等体积的96％乙醇)中染色5min，室温下放置1hr，将叶片于2.5mg/ml的水合氯醛中脱色过夜。保存于50％的甘油中，观察细胞死亡产生情况并拍照记录。
不同剂量壳寡糖处理的三叶期水稻幼苗，其叶片经Trypan blue染色，发现有明显的细胞死亡斑点，且随着处理剂量的不同细胞死亡的产生有一定差异，5ug/ml壳寡糖处理的水稻叶片即产生明显的细胞死亡(见图6)。结果表明壳寡糖诱导叶片细胞死亡产生所需剂量要高于悬浮细胞。
(b)壳寡糖诱导水稻叶片细胞产生H2O2沉积
在过氧化物酶存在下，DAB(diaminobenzidine)一旦与H2O2接触，迅速形成红褐色聚合物沉积。分别以0、1、5、10、100ug/ml浓度的壳寡糖喷洒到三叶期感病水稻H7S的植株上，24小时后，切取叶片浸泡在1mg/ml的3，3’-diaminobenzidine-HCl(pH3.8)中置25℃、光照8小时，取出后置于96％乙醇中沸水浴煮沸10min脱色，在新鲜的乙醇中泡4小时(25℃)后观察叶片中的红褐色沉淀并拍照记录。
不同浓度壳寡糖处理后的水稻，其叶片经DAB染色，发现有明显的H2O2沉积的斑点(见图7)，从而证明壳寡糖能引起水稻细胞产生过敏性反应(Hypersensitive Response，HR)的氧进发(Oxidative burst)。因而可以初步断定，上述细胞死亡的产生是基于一种过敏性反应的机理。
实施例6
壳寡糖诱导水稻抗病性检测
以5μg/ml的壳寡糖(0.01％Tween20)处理市售的水稻植株H7S，水处理作为阴性对照。8小时后接种稻瘟病(以每个视野BLAST的孢子数为50左右为佳)，28℃暗培养24小时后，光照14小时、黑暗10小时继续培养6天，观察抗病性并统计发病情况。同时，以抗病品系H7R作为抗病对照。
结果如图8和9所示。重复实验证实，经过5ug/ml的壳寡糖处理的水稻植株对稻瘟病的抗性明显增强，其病斑级数为2-3级，抗病植株为1-2级，而未经处理的植株极大部分病斑为感病病斑，发病级数在4-5级。结果表明5ug/ml壳寡糖的处理防病效果可以达到50％以上(见图8，9)。
讨论
植物诱导抗病反应是一个相当复杂的过程。研究表明，作为真菌细胞壁的主要成分之一，壳寡糖能够强烈诱导水稻细胞发生防卫反应，进而引发系统抗病性的增强。本发明的细胞、生化和分子生物学上证实了壳寡糖诱发的这些反应，非常类似于病原菌引起的过敏性反应：包括细胞死亡、氧进发和防卫基因的激活。
本发明的研究结论认为，壳寡糖可以作为一种强烈的细胞死亡和系统诱导抗病性的激发子。壳寡糖的这种激发作用可能在不同植物上表现不同，有必要对不同植物进行相应的机理研究。
用壳寡糖处理后，水稻植株抗病性明显增强。表现为水稻叶片出现细胞死亡斑点，也即发生了HR反应；并且经过DAB染色的水稻叶片会在防卫反应中由于产生了H2O2而出现红褐色斑点；稻瘟病接种后，经过壳寡糖处理后的水稻植株抗性明显增强，其病斑级别下降，侵染速度减慢。与感病对照相比，病害指数下降了50％。本发明表明，壳寡糖作为一种来源广泛的有机制剂，作为生物农药有广阔的应用前景，预计可诱导植物产生针对不同的真菌细菌、和病毒病的抗性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。