钾通道开放剂 【技术领域】
本发明涉及一种钾通道开放剂。
背景技术
钙依赖性钾通道(也称为“BK通道”)是一种存在于细胞膜上并且选择性地使钾离子透过的蛋白质。该通道蛋白质，在面向细胞内的氨基酸序列上具有钙结合部位，具有通过钙的结合而增大通道活性的性质。即，由于细胞内的钙离子浓度上升，单位时间内各个钙依赖性钾通道开放的几率(开放几率)增大，从而引起细胞膜的钾透过性上升。目前已知有三种钙依赖性钾通道，但是其中高电导性·钙依赖性钾通道存在于血管、膀胱、支气管、消化道等作为各种脏器构成要素的平滑肌以及中枢·末梢神经中，但是在心肌中没有发现。
由于细胞膜电位受钠、钾、氯、钙等离子的细胞膜透过性的平衡决定，因此一旦钾通道开放几率有选择性上升，则钾的透过性变得优先，细胞超极化。因此，钙依赖性钾通道开放，例如使平滑肌细胞超极化，使电位依赖性钙通道的活性降低，抑制钙从细胞外液的流入。其结果，细胞内钙浓度减少，平滑肌舒张。因此，钙依赖性钾通道的开放，对于原发性高血压症、自发收缩性膀胱、呼吸道过敏性等症状，稳定地使收缩性(过紧张)的平滑肌组织舒张。
另外，对于施加强的刺激，由于过剩活动(过兴奋)钙浓度上升的神经细胞，也显示经过超极化的兴奋抑制作用。相反，向小鼠中枢神经给予具有BK通道关闭作用的化合物时会产生痉挛。这样，由于基于含有钙依赖性钾通道的钾通道活性变化而引起的疾病近年来逐渐明确，因此基于钾通道作用药的治疗地可能性也逐渐变大。其中，钙依赖性钾通道开放剂是目前最受瞩目的药物之一(Shiech，C.C.，et al.，Pharmacol.Rev.，52，pp.557～593，2000)。
作为具有钙依赖性钾通道活化作用的物质，已知有从天然物质分离的Maxikdiol(Singh，S.，et al.，J.Chem.Soc.Perkin.Trans.I，pp.3349～3352，1994)、Dehydrosoyasaponin-I(McManus，O.B.，et al.，Biochemistry，32，pp.6128-6133，1993)、L-735，334(Lee，S.H.，J.Nat.Prod.，58，pp.1822～1828，1995)；作为合成化合物的DENMARK的NEROSACH社或美国的BRISTORMAYERSSKUIB社开发的NS-1619以及相关化合物(Olesen，S.P.et al.，欧洲专利公开0477819A2、Olsen，S.P.et al.，Euro.J.Pharmacol.，251，pp.53～59，1994)等。
但是存在Dehydrosoyasaponin-I与L-735，334分子量比较高并且作用方式不明确，以及NS-1619相关化合物活性低并且作用没有特异性的问题。另外，Maxikdiol虽然具有优良的活性，但是为天然物质难以获得。因此，人们期望开发出具有与Maxikdiol同等或比其高的BK通道开放活性并且作用的特异性高的药物。
【发明内容】
本发明的课题在于提供一种钾通道开放剂、优选钙依赖性钾通道开放剂。更具体地说，本发明的课题在于提供具有与Maxikdiol同等或比其高的BK通道开放活性并且作用的特异性高的钾通道开放剂、优选钙依赖性钾通道开放剂。本发明人等为了解决本发明的课题进行了锐意研究，结果发现Pimaric acid及其类似物具有极其优良的钾通道开放作用并且其作用具有特异性。本发明是基于以上发现而完成的。
即，本发明提供一种作为有效成分含有下述通式(1)所示的化合物或其生理学上可接受的盐的钾通道开放剂，
(式中：R1、R2、R3、R4、R5、R6、以及R7各自独立表示烷基、链烯基、卤原子、羟基、卤代烷基、羟烷基、氨基烷基、烷氧基、芳基、酰基、羧基、烷氧基羰基、异羟肟酸基(-C(O)NH2OH)、磺酸基(-SO3H)、氨基甲酰基(-CONH2)、磺酰胺基(-SO2 NH2)、醛基、或者腈基，R4和R5可以相互键合形成环，R6和R7可以相互键合形成环， ＝表示的三个键中可以均是单键，或者三个键中一个为双键其它两个为单键)。
根据本发明的优选方式，提供作为有效成分含有R1、R3、R4以及R5为烷基或链烯基、R6和R7为氢原子、R2为羧基的化合物或其生理学上可接受的盐的上述钾通道开放剂。作为更优选的方式，提供作为有效成分含有选自下述化合物的上述钾通道开放剂，即，(1)R1为烷基、R2为羧基、R3为烷基、R4为链烯基、R5为烷基、R6和R7为氢原子的化合物； (2)R1为烷基、R2为羧基、R3为烷基、R4为烷基、R5为链烯基、R6和R7为氢原子的化合物；(3)R1为烷基、R2为羧基、R3为烷基、R4为烷基、R5为烷基、R6和R7为氢原子的化合物；以及其生理学上可接受的盐，作为特别优选的方式，提供作为有效成分含有选自由海松酸、二氢海松酸、山达海松酸、异海松酸、二氢异海松酸、以及其生理学上可接受的盐构成的一组中的物质的上述钾通道开放剂。
另外，根据本发明提供一种作为有效成分含有下述通式(II)所示的化合物或其生理学上可接受的盐的钾通道开放剂，
(式中：R11，R12，R13，R14，R15，R16，R17，R18，R19，R20以及R21各自独立表示烷基、链烯基、卤原子、羟基、卤代烷基、羟烷基、氨基烷基、烷氧基、芳基、酰基、羧基、烷氧基羰基、异羟肟酸基、磺酸基、氨基甲酰基、磺酰胺基、醛基、或者腈基，R20和R21可以相互键合形成氧代(oxo))。
根据本发明的优选方式，提供作为有效成分含有R11、R13以及R18为烷基、R12为羧基、R14、R15以及R16为氢原子的化合物或其生理学上可接受的盐的上述钾通道开放剂。作为更优选的方式，提供作为有效成分含有R11、R13以及R18为烷基、R12为羧基、R14、R15、R16、R20以及R21为氢原子、以及R17和R19为卤原子的化合物或其生理学上可接受的盐的上述钾通道开放剂。
根据本发明提供的上述钾通道开放剂，优选为钙依赖性钾通道开放剂，例如可以用于原发性高血压症、自发收缩性膀胱、呼吸道过敏性等症状、或缺血性中枢神经障碍的预防和/或治疗。
从另外的观点来看，根据本发明可以提供上述通式(I)或通式(II)所示化合物或生理学上可接收盐的用于制备上述钾通道开放剂的用途；原发性高血压症、自发收缩性膀胱、呼吸道过敏性等症状、或缺血性中枢神经障碍的预防和/或治疗方法即含有给予包括人在内的哺乳动物的预防和/或治疗有效量的上述通式(I)或通式(II)所示化合物或生理学上可接收盐的工序的方法；以及在包括人在内的哺乳动物中使钾通道优选钙依赖性钾通道开放的方法即含有给予包括人在内的哺乳动物的有效量的上述通式(I)或通式(II)所示化合物或生理学上可接收盐的工序的方法。
另外，还提供使包括人在内的哺乳动物的平滑肌舒张的方法即含有给予包括人在内的哺乳动物有效量的上述通式(I)或通式(II)所示化合物或生理学上可接收盐的工序的方法；保护包括人在内的哺乳动物的中枢神经的方法即含有给予包括人在内的哺乳动物有效量的上述通式(I)或通式(II)所示化合物或生理学上可接收盐的工序的方法；使包括人在内的哺乳动物的平滑肌超极化的方法即含有给予包括人在内的哺乳动物有效量的上述通式(I)或通式(II)所示化合物或生理学上可接收盐的工序的方法；以及使包括人在内的哺乳动物的中枢神经细胞超极化的方法即含有给予包括人在内的哺乳动物有效量的上述通式(I)或通式(II)所示化合物或生理学上可接收盐的工序的方法。
【附图说明】
图1表示给予海松酸时的通道活化的结果。上面和下面分别表示随着时间的快速流逝的痕迹以及随着时间缓慢流逝的痕迹。
图2表示给予海松酸之前、给予1μM后、给予10μM后、以及清洗后的单一BK通道电流值(横轴)与单位时间的出现频率(横轴)之间的柱形图。图中CONTROL表示对照的结果，1μM表示给予1μM后的结果，10μM表示给予10μM后的结果，WASHOUT表示清洗后的结果。
图3表示海松酸的浓度与BK通道活化作用之间的关系。横轴表示开放概率(Npo)，纵轴表示海松酸的浓度。
图4表示给予作为通式(II)所示化合物的代表化合物的二氯脱氢松香酸时的通道活化的结果(Whole-cell电流记录)。图中A表示给药后的随时间变化，B表示图A所示各点电流的原始痕迹，C是表示对于三种受试物的BK(α+β1)电流增强作用的量效关系图。图C中○表示二氯脱氢松香酸(2Cl·DhA)的结果，□表示松香酸(AbA)结果，▲表示海松酸(PiA)的结果。
图5表示给予作为通式(II)所示化合物的代表化合物的二氯脱氢松香酸时的通道活化的结果(single-channel电流记录)。图中A表示观察将保持电位维持在+40mV时的通道开放概率的变化的结果，B表示由原始痕迹制作的开闭现象的柱图，C表示量效关系。
【具体实施方式】
本说明书中所用术语的意思如下。
在称为“烷基”时可以使用直链状、支链状、环状或它们组合的例如碳数1～12、优选碳数1～8、更优选碳数1～6、特别优选1～4左右的烷基。在本说明书中所述的具有烷基部分的取代基(例如链烯基、卤代烷基、烷氧基、羟烷基等)的烷基部分也相同。
链烯基中所含的双键的位置以及个数不作特别限定，双键的个数优选为1～3个，更优选1～2个，特别优选为1个。作为链烯基优选烯丙基或乙烯基，特别优选为乙烯基。对于双键在存在几何异构时，双键的构型可以是Z也可以是E。
在称作“卤原子”(或“卤素”)时，可以是氟原子、氯原子、溴原子或碘原子中的任一种。存在于“卤代烷基”上的卤原子的种类、个数、以及取代位置不作特别限定，但是作为卤原子可以是氟原子、氯原子、溴原子或碘原子中任一种，优选氟原子或氯原子。作为卤代烷基例如优选三卤代甲基，特别优选三氟甲基或三氯甲基。
存在于“羟烷基”上的羟基的个数以及取代位置不作特别限定，但是优选1～4个左右，更优选1或2个，特别优选为1个。作为羟烷基例如优选羟甲基。存在于“氨基烷基”上的氨基的个数以及取代位置不作特别限定，但是优选为1～4个左右，更优选1或2个，特别优选1个。作为氨基烷基优选氨基甲基。
作为“芳基”可以为单环或稠环的芳基，例如可以使用苯基或萘基等。作为芳基中的环构成原子可以含有1个或2个以上的杂原子。作为这种例子可以举出吡啶基、呋喃基、噻酚基、或吡咯基等。“酰基”可以是苯甲酰基等的芳基羰基、或乙酰基等的烷酰基等。
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、以及R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、以及R21所示的烷基、链烯基、卤代烷基、羟烷基、烷氧基、芳基、酰基、烷氧羰基、羟肟酸基、氨基甲酰基或磺酰胺基可以进而含有1个或2个以上的取代基。取代基的种类、取代位置以及个数不作特别限定，在具有2个以上的取代基时，它们相同不同均可。例如芳基作为具有取代基的情况，可以举出氟代苯基、羟基苯基等，酰基作为具有取代基的情况，例如可以举出氯代苯甲酰基、三氯乙酰基等，取代基的例子不限于这些。
在本说明书中所示的上述通式(I)或通式(II)表示的化合物中，在没有特别表示立体化学时，意味着任意的立体异构体，除了单纯的任意立体异构体之外，立体异构体的任意混合物、外消旋体、非对映异构体的混合物等也包括在本发明的范围内。作为通式(I)所示混合物的优选例子，可以举出以下化合物组A1至A4。下述A1至A4式中的立体构型表示绝对构型。
R1、R3、R4以及R5各自独立优选为烷基或链烯基。更优选R1为烷基、R3为烷基、R4为链烯基并且R5为烷基或R1为烷基、R3为烷基、R4为烷基并且R5为链烯基，特别优选R1为甲基、R3为甲基、R4为乙烯基或乙基并且R5为甲基或者R1为甲基、R3为甲基、R4为甲基并且R5为乙烯基或乙基。
优选R2为羧基、烷氧基羰基、羟肟酸基、磺酸基、氨基甲酰基、磺酰胺基、醛基或腈基，更优选为羧基或烷氧基羰基。优选R6和R7均为氢原子。特别优选以下化合物。
在上述所示的特别优选的化合物中，海松酸(Pimaric acid)作为树脂酸性成分为公知的化合物。并且山达海松酸(Sandaracopimaric acid)、异海松酸(Isopimaric acid)以及二氢异海松酸(dihydroisopimaric acid)也可以获得市售品。上述通式(I)所示的化合物例如可以将上述的海松酸、二氢海松酸、山达海松酸、异海松酸或二氢异海松酸作为起始原料，通过所述领域的技术人员周知的官能基变换而制备。例如在海松酸中作为R4存在的乙烯基可以通过普通的方法进行还原而制备R4为乙基的二氢海松酸，作为R2存在的羧基可以通过酯化而制备R2为烷氧基羰基的化合物。
另外，在通式(II)所示的化合物中，优选的立体化学如下所示(式中的立体表示绝对构型)，优选R11、R13以及R18为烷基、R12为羧基、R14、R15以及R16为氢原子，更优选R11、R13以及R18为烷基、R12为羧基、R14、R15、R16、R20以及R21为氢原子、R17以及R19卤原子。作为R11、R13表示的烷基优选甲基，作为R18表示的烷基优选乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基等。作为R18表示的烷基特别优选异丙基。作为R17、R19表示卤原子优选氯原子。
另外，在以通式(II)表示的化合物中，也优选R20为羟基并且R21为氢原子的化合物以及R20和R21一起形成氧代基的化合物。例如优选R11、R13以及R18为烷基、R12为羧基、R14、R15以及R16为氢原子、R17和R19为卤原子或氢原子、R20为羟基、R21为氢原子的化合物，以及R11、R13和R18为烷基、R12为羧基、R14、R15和R16为氢原子、R17和R19为卤原子或氢原子、R20和R21一起形成氧代基的化合物。更具体地说作为优选通式(II)的化合物可以举出下述的化合物，特别优选它们中(1)所示的化合物。下述(1)～(3)中任一化合物均有市售。
作为本发明钾通道开放剂的有效成分除了上述通式(I)或通式(II)所示的化合物外，还可以根据取代基的种类使用其生理学上可接受的盐。盐的种类只要是生理学上可接受的盐就不作特别限定，可以是酸加成盐或碱加成盐。作为酸加成盐例如可以举出盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐等的无机酸盐；对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、草酸盐、马来酸盐、酒石酸盐等的有机酸盐，作为碱加成盐可以举出钠盐、钾盐、钙盐等的金属盐；铵盐、三乙胺盐、乙胺盐等的有机胺盐。也可以使用甘氨酸等的氨基酸的盐。
作为本发明的钾通道开放剂的有效成分，除了游离形态的化合物或其生理学上可接受的盐之外，也可以使用它们的任意水合物或溶剂化物。形成溶剂化物的溶剂的种类不作特别限定，例如可以举出丙酮、乙醇、四氢呋喃等。另外，上述通式(I)或通式(II)所示的化合物，除了上述式中含有的手性碳外，根据取代基的种类有时还含有1个以上的手性碳。因此，根据这种手性碳的存在，有时存在光学异构体或非对映异构体等的立体异构体，但是作为本发明的钾通道开放剂的有效成分也可以使用单纯的立体异构体、立体异构体的任意混合物、外消旋体等。
虽然并不拘泥于所谓特定的理论，但是本发明的钾通道开放剂作用于在血管、膀胱、支气管、消化道等各种脏器构成要素的平滑肌以及中枢·末梢神经中存在的钙依赖性钾通道蛋白质，使单位时间内各个钙依赖性钾通道的开放的概率(开放概率)增大，从而引起细胞膜的钾透过性上升。作为其结果，使平滑肌细胞超极化，电位依赖性钙通道的活性降低。并且通过抑制钙的内流使平滑肌舒张，从而保护神经细胞的基于钙过负荷的损伤。
因此，本发明的钾通道开放剂，在包括原发性高血压症在内的高血压症、自发收缩性膀胱、末梢循环障碍、呼吸道过敏症、感觉神经过敏症、中枢性痉挛等的疾病中可以稳定地使收缩性(过紧张)的平滑肌组织舒张，可以有效作为这些疾病的预防和/或治疗用的药物。另外，即使作为用于保护中枢以及末梢神经细胞、尤其中枢神经细胞的药物也是有效的。尽管如上所述，本发明的钾通道开放剂的适用对象并不限于上述特定的疾病，对于通过使平滑肌舒张而能够预防和/或治疗的各种疾病或者通过保护神经细胞而能够预防和/或治疗的各种疾病都可以适用。
本发明的钾通道开放剂，作为有效成分可以含有选自由上述通式(I)或通式(II)所示化合物和其生理学上可接受的盐以及它们水合物或溶剂化物构成一组中至少一种或两种以上。作为本发明的药物可以给予上述物质自身，但是优选给予可以通过所述领域的技术人员周知的方法制备的口服或非口服用的药物组合物。作为适合口服的药物组合物例如可以举出片剂、胶囊剂、散剂、细颗粒剂、颗粒剂、液剂以及糖浆剂等，作为适用于非口服的药组合物，例如可以举出注射剂、点滴剂、栓剂、吸入剂、滴眼剂、滴鼻剂、滴耳剂、软膏剂、乳膏剂、透皮吸收剂、粘膜吸收剂以及贴剂等。
上述的药物组合物可以添加一种或两种以上的制剂用添加物而制备。作为制剂用添加物，例如可以举出赋形剂、崩解剂或崩解辅助剂、粘合剂、润滑剂、被覆剂、色素、稀释剂、基质剂、溶解剂或溶解辅助剂、等参剂、pH调节剂、稳定剂、喷射剂以及粘接剂等，所述领域的技术人员可以根据药物组合物的形态对它们进行适宜的选择。
本发明的钾通道开放剂的给药剂量不作特别限定，可以根据其作用的种类或作用强弱等进行适宜选择，进而也可以根据患者的体重或年龄、疾病的种类或症状以及给药途径等通常应该考虑的各种因素进行适宜地增减。一般来说口服给药时成年人可以一日服用0.01～1.000mg左右的范围。
实施例
以下根据实施例对本发明进行详细说明，但本发明不限于以下的实施例。实施例中所用的海松酸是从美国ICN公司购买。
实施例1
(A)试验系统
钙依赖性钾通道(以下，在实施例中简略为“BK通道”)是两种蛋白质α(BKα)和β(BKβ)亚型各四个组合而发挥作用。BKα形成通道主体，BKβ为活性调节因子。为了选择性检测BK通道开放作用，在本来不含有BK通道的培养细胞(来源于人胎儿肾脏的培养细胞HEK293细胞)中引入BK通道基因并使其人为表达，从而构建探索试验系统。根据Ahring等的方法(Ahring P.K.，et al.，FEBS Lett.，415，PP.67～70，1997)，通过磷酸钙沉淀法将来自大鼠子宫平滑肌的BKα和BKβ基因cDNA(GenBank accession numbers；U559955以及AF020712)引入HEK293细胞，使稳定地高度表达BKα或BKβ。
(B)测定方法与结果
(a)基于Inside-out patch clamp法的单一通道电流记录
根据Inside-out patch clamp法分离含有通道的细胞膜片段，可以边人为地调节细胞内侧的环境边直接观察单一通道的开闭。该方法的充分确立不仅为了确立通道功能解析方法，而且也是为了进行通道作用药的定量效价检测(Hamil，O.P.，et al.，Pflgers Archiv.，391，PP.85～100，1981)。在本测定所用的HEK293细胞中表达的BKα和BKβ，在patch膜内外的溶液含有140mMK时，单一通道电导值均显示230～240pS，确认具有与目前文献十分一致的性质。
在该条件下测定了海松酸对BKα的作用和效价。图1的上部分表示细胞内面相对于外面在patch膜电位为+40mV的状态下细胞内面的Ca浓度为0.1μM时的BKα单一通道记录(上部分中的向下矩形表示基于通道开放的电流)。若在细胞内面侧的溶液中以1μM以下的浓度添加海松酸时，通道活性显著升高(中间部分)、通过除去海松酸，其作用消失。
图2中用柱图表示连续30秒钟进行这种电流记录的结果。CurrentAmplitude的0pA表示关闭。通过以1μM或10μM的浓度添加海松酸，开放状态的时间增加，尤其在10μM的浓度情况下有时显示2个通道同时开放。图3表示该条件下的海松酸的浓度与BK通道活化作用的关系。确认了海松酸在3μM以上的浓度开放概率显著上升。另外，在细胞内面侧Ca浓度为3μM、Patch膜电位为+40mV时，开放概率是1μM浓度的3倍。
(b)基于Whole cell voltage-clamp法的膜电流记录
通过Whole cell voltage-clamp法记录基于BKα通道开放的整个细胞的膜电流。为了探讨在细胞膜上表达的很多离子通道作为总和究竟起到什么样的作用多次使用了该方法，仍然是充分确立的方法(Hamill，O.P.上面所述书)。在使BKα通道表达的单一HEK293细胞中使用该方法，结果在细胞外液中加入1μM的化合物IV使+60mV中的BKα电流大致增大50％，显示显著的开放作用。海松酸的作用被BK通道阻断药的1mM四乙铵完全抑制，由此也确认了BK通道开放作用。
由以上结果发现海松酸在BKα发挥作用并显示BK通道开放作用，通过在细胞外液中给药而起作用，通过清洗作用消失，其作用与的文献上Maxikdiol效价相比至少为3倍以上。与公知具有BK通道开放作用的公知化合物NS-1619相比，认为具有10倍以上的效价。由这些结果可以定论海松酸作为BK通道开放药非常有效。
实施例2
作为通式(II)所示的化合物，利用上述所示的化合物(1)(二氯脱氢松香酸：dichrolodehydroabietic acid)探讨BK通道开放作用。
(1)材料与方法
(a)Whole cell
通过Whole cell voltage-clamp法对稳定表达来自大鼠的BKα+BKβ 1亚型的HEK293整个细胞的电流进行记录。试验全部是在22-24C下进行。
溶液：
吸液管内液(mM)140 KCl、4 MgCl2、5ATP、10 HEPES、5 EGTA(为了固定pCa添加适量的Ca Cl2调整为pCa6.5)。利用KOH调节pH为7.2。细胞外液(mM)137 NaCl、5.9 o、2.2 CaCl2、1.2 MgCl2、14Glucose、10 HEPES。用NaOH调节pH为7.4。
(b)Single-channel电流记录
通过inside-out patch clamp法对稳定表达来自大鼠的BKα+BKβ1亚型的HEK293整个细胞的电流进行记录。试验全部是在22-24℃下进行。
溶液：
细胞内液(mM)140 KCl、1.2MgCl2、14Glucose、5EGTA(为了固定pCa添加适量的CaCl2调整为pCa7)。用NaOH调节pH为7.2。
细胞外液(mM)140KCl、4MgCl2、5ATP、10HEPES、0.05EGTA。利用KOH调节pH为7.2。
由于受试药物脂溶性高并且在水中难溶，因此用DMSO溶解并作为30mM的保存溶液保存。在给药时将DMSO溶液中的最终浓度最高调节为0.03％。另外，确认了DMSO在0.3％以下对BK电流没有任何影响。
(2)结果
对于使BK(α+β1)通道稳定表达的细胞通过Whole cell patch-clamp法记录整个细胞的电流。此时细胞内液的Ca2+浓度利用Ca2+-EGTA固定至pCa为6.5。施加去极化脉冲150微秒至保持电位-60mV～+10mV，观察引起的电流。通过去极化刺激，观察到BK(α+β1)通道特有的延迟外向电流(图4B的对照)。确立Whole-cell后，在大致20分钟后测定到稳定电流时开始记录。给予100nM的受试药物，结果电流马上增强，若继续增加药物浓度，则与此相对应发现电流也变大。之后，通过清洗，电流技术返回至给药前水平(图4A)。以4例记录为基础对该活化作用进行解析，结果以100nM浓度电流活化1.90□0.21倍、以300nM浓度电流活化2.54□0.14倍、以1μM浓度电流活化1.92□0.24倍。这与1μM浓度海松酸使电流活化1.92□0.24倍相比，表明有很强的效价(图4c)。
BK通道由于细胞内的Ca2+浓度上升而被活化。因此只要受试物具有使细胞内Ca2+上升的作用，则会由此引起通道的活化。因此，在整个细胞记录时，通过在吸液管内液中添加5mM EGTA和CaCl2使细胞内的浓度接近pCa6.5，从而基本消除影响。
为了进而确认这一点，对单一通道的电流进行测定。对于使BK(α+β1)通道稳定表达的细胞，根据Inside-out patch clamp法记录单一通道的电流。此时细胞内液(与细胞膜内侧接触的液)固定为pCa7.0。将保持电位维持在+40mV并且观察通道开放概率的变化。若在细胞内膜侧给予受试药物，则发现100nM以上的浓度通道活化，通过清洗作用消失(图5A)。由于原始痕迹制作开闭现象的柱图。伴随给药而显示通道开放的10pA附近的峰变大，通过清洗作用消失(图5B)。以该柱图为基础计算通道开放概率，得到量效关系的图5C。由该结果可知受试药物的作用具有浓度依赖性。
本发明的药物具有及其优异的钾通道开放作用，并且其作用具有特异性，由此可以推断在原发性高血压症、自发收缩性膀胱、呼吸道过敏性症、或缺血性中枢神经障碍的预防和/或治疗中是有效的。