环杷明在银屑病治疗中的应用 【发明背景】
银屑病是一种常见慢性病，其发病率约2％，婴儿至老年人皆可发病。银屑病病因学及发病机理机制不明。家族及双胞胎研究表明有多基因的影响，但涉及的基因性质及作用机制不明(Elder JT等(2001)Arch.Dermatol.137：1447-1454)。诸如链球菌感染及皮肤外伤等环境因素也与银屑病损伤的形成有关。这些环境因素对银屑病形成的贡献仍然未明。然而，银屑病与链球菌感染的关联，以及目前绝大多数治疗银屑病药物的免疫抑制作用及其它发现普遍用来显示出银屑病为自身免疫疾病且由T淋巴细胞引发。(Gotüieb S.L.等(1995)Nat.Med.1：442-447；Nickoloff B.J.(1999)Arch.Dermatol.135：1104-1110；Krueger J.G.(2002)J.Am.Acad.Dermatol.46：1-23)。
寻常型银屑病是银屑病最常见的形式，其特征在于各处皮肤上存在着不同大小界限明显鳞片状红斑块，银屑病皮肤损伤的组织病理学检查表明存在包括以下变化的典型表皮及真皮变化。
伴有表皮突延长及增厚的表皮增生。
乳头上表皮变薄。
表皮颗粒层变薄或焦点损失。
真皮的表皮下区域出现嗜中性白细胞及单核炎症细胞浸润。
乳头真皮毛细血管的扩张及屈曲，常伴有乳头水肿。
″芒罗微脓肿＂定义为角质层内(intracorneal)小灶性嗜中性白细胞聚集。
银屑病皮肤损伤通常包括大部分上述组织病理学改变以及可见于完全形成的银屑病损伤中的所有改变。此外，增生细胞的免疫组化及其它指征显示，在银屑病损伤皮肤上基底层(suprabasal layer)存在增生角质细胞(增生细胞通常局限于健康皮肤的表皮基底层)。
银屑病病因学及发病机理的不明确由其各种各样的治疗策略可以反映出来(Spuls P.I.等(1997)Br.J.Dermatol.137：943-949；Ashcroft D.M.等(2000)J.Clin.Pharm.Ther.25：1-10；Al-Suwaidan S.N.等(2000)J.Am.Acad.Dermatol.42：796-802；Lebwohl M.等(2001)J.Am.Acad.Dermatol.45：487-498；Lebwohl M.等(2001)J.Am.Acad.Dermatol.45：649-661)。当前常用的治疗包括局部应用皮质类固醇、全身使用免疫抑制剂(常用环孢霉A)，在加用或不用补骨脂素的情况下对受累皮肤进行紫外线照射、全身应用维甲酸类及全身应用氨甲蝶呤(Spuls P.I.等(1997)Br.J.Dermatol.137：943-949；Ashcroft D.M.等(2000)J.Clin.Pharm.Ther.25：1-10；Lebwohl M.等(2001)J.Am.Acad.Dermatol.45：487-498；Lebwohl M.等(2001)J.Am.Acad.Dermatol.45：649-661)。目前，银屑病仍不可治愈，患者必需终身用药。因而，首选较简单的疗法(通常局部使用角质分离剂(keratolitics)及皮质类固醇)，失败后，再尝试采用具有更严重副作用的更有效的全身治疗。当治疗目标定为清除损伤时，据报道，即使是最有效的全身用药疗法在大型测试中有多达四分之一地患者治疗失败(Spuls P.I.等(1997)Br.J.Dermatol.137：943-949)，而且，由于严重的副作用，患者和医师被忠告目前“完全清除银屑病不现实”(Al-Suwaidan S.N.等(2000)J.Am.Acad.Dermatol.42：796-802)。在临床实践中，由于副作用的存在，更有效的治疗通常限于短期治疗[环孢霉素A具有肾毒性及强烈的免疫抑制作用，氨甲蝶呤具有肝毒性，紫外线照射-补骨脂素方法具有致突变/致癌变性(Lebwohl M.等(2001)J.Am.Acad.Dermatol.45：649-661)]。然而，从长远观点来看，局部使用皮质类固醇也不是全无副作用(Lebwohl M.等(2001)J.Am.Acad.Dermatol.45：487-498)。现有疗法从开始治疗到出现客观的临床转归通常需要数周(典型地为6-8周)(Al-Suwaidan S.N.等(2000)J.Am.Acad.Dermatol.42：796-802；Lebwohl M.等(2001)J.Am.Acad.Dermatol.45：649-661)。
环杷明为天然存在于藜芦植物中的甾体类生物碱。由于这些植物对孕期放牧动物的致畸作用导致了活性化合物环杷明的发现(Keeler R.F.(1969)Phytochemistry 8：223-225)。已经发现，环杷明的致畸作用源于其为hedgehog/smoothened信号转导通路抑制剂(Incardona J.P.等(1998)Development 125：3553-3562；Cooper M.K.等(1998)Science 280：1603-1607)。sonic hedgehog蛋白为hedgehog蛋白家族的一员，已发现其可诱导目标细胞的分化，包括在发育的中枢神经系统中的腹细胞前体(Goodrich L.V等(1998)Neuron 21：1243-1257)。在发育的小鸡大脑中，环杷明对hedgehog/smoothened通路的抑制可阻止腹细胞的形成，并可导致前脑无裂畸形(Incardona J.P.等(1998)Development 125：3553-3562；Cooper M.K.等(1998)Science280：1603-1607)，常见的畸形可在牧食藜芦的羊羔中观察到(Binns W.等(1963)Am.J.Vet.Res.24：11641175)。据报道，环杷明还抑制了其它系统的细胞分化，包括骨髓细胞到红细胞的分化(DetmerK.等(2000)Dev.Biol.222：242)以及泌尿生殖窦向前列腺的分化(Berman D.M.等(2000)J.Urol.163：204)。
发明概述
本发明涉及环杷明，一种已发现30多年的天然甾体类固醇生物碱，在银屑病治疗并实现从患者皮肤上快速清除银屑病损伤中的用途，同时无可检测到的副作用。
附图概述
图1A显示了在一位57岁男性患者的手背上治疗前的银屑病损伤外观(约11×13mm)。
图1B显示了图1A同样的损伤，将环杷明乳膏用于近身体端的一半(附图上部)并覆盖以防不慎污染及流失。
图1C显示了图1A同样的损伤在暴露于环杷明乳膏24小时后的情况。经环杷明治疗的近身体端的一半(附图上部)的银屑病斑退化明显。
图1D显示了在一位54岁男性患者的左肩胛区域上环杷明治疗前的银屑病损伤外观(约7×9mm)。
图1E显示了图1A同样的皮肤区域，其为治疗1天后及7天后后续的情况。除轻微的红斑，损伤不再明显。
图1F显示了图1E同样的皮肤区域，其为第14天后续的情况。无明显损伤，皮肤外观正常。
图2A～图2W显示了图1A～图1C所示患者的无损伤皮肤、未经治疗的银屑病损伤皮肤及经环杷明治疗的损伤皮肤组织。
图2A显示了无损伤皮肤组织的切片。苏木精-伊红(H&E)染色，放大200倍。
图2B显示了未经治疗的银屑病损伤皮肤的切片。H&E染色。放大100倍。
图2C显示了经环杷明治疗24小时后的那一半银屑病损伤的组织切片。H&E染色。放大200倍。
图2D显示了经环杷明治疗24小时后的那一半银屑病损伤的另一区域。H&E染色。放大400倍。
图2E显示了经环杷明治疗及未经治疗24小时后的银屑病损伤的连接区域的组织切片。H&E染色。放大200倍。
图2F显示了经环杷明治疗及未经治疗24小时后的银屑病损伤的连接区域的另一组织切片。H&E染色。放大100倍。环杷明乳膏敷药的银屑病损伤区域对应图左(锯齿状的左侧)。
图2G显示了以免疫组化方法检测无损伤皮肤组织中Ki-67抗原的情况。放大400倍。表皮中显示Ki-67的细胞局限于基底层。
图2H显示了以免疫组化方法检测未经治疗的银屑病损伤皮肤组织中Ki-67抗原的情况。放大200倍。大量的Ki-67细胞显示可见于表皮上基底层。
图2I显示了经环杷明治疗24小时后的那一半银屑病损伤的组织切片，以免疫组化方法进行Ki-67抗原染色。放大200倍。观察到显示Ki-67的细胞出现在表皮基底层。
图2J显示了经环杷明治疗及未经治疗24小时后的银屑病损伤的连接区域的组织切片，以免疫组化方法进行Ki-67抗原染色。放大200倍。接受环杷明治疗的组织位于图左。
图2K显示了无损伤皮肤组织及经环杷明治疗24小时后的那一半银屑病损伤组织的连接区域Ki-67染色的组织切片。放大100倍。无损伤皮肤位于图左。
图2L显示了以Ber-EP4抗体对无损伤皮肤组织的上皮抗原进行免疫组化染色的结果。放大100倍。观察到表皮基底层细胞显示上皮抗原。
图2M显示了以Ber-EP4抗体对未经治疗的银屑病损伤皮肤组织的上皮抗原进行免疫组化染色的结果。放大100倍。在银屑病损伤表皮中，Ber-EP4可检测到的上皮抗原极大地降低至不存在。
图2N显示了经环杷明治疗的那一半银屑病损伤的组织24小时后的组织切片，以Ber-EP4抗体进行上皮抗原的免疫组化染色。放大400倍。观察到表皮基底层细胞显示上皮抗原。
图2O显示了经环杷明治疗及未经治疗24小时后的银屑病损伤连接区域的组织切片，以Ber-EP4抗体进行上皮抗原的免疫组化染色。放大100倍。环杷明乳膏覆盖的银屑病损伤区域对应图左(锯齿状的左侧)。
图2P显示了无损伤皮肤及经环杷明治疗24小时后的那一半银屑病损伤组织的连接区域的切片，以Ber-EP4抗体进行上皮抗原的免疫组化染色。放大100倍。无损伤皮肤位于图左。
图2R显示了以C8/44B抗体对无损伤皮肤组织进行的免疫组化染色结果，该抗体与人CD8抗原及细胞角蛋白15结合。放大400倍。
图2S显示了无损伤皮肤及未经治疗皮肤连接区域的组织切片。以C8/144B抗体进行免疫组化染色。放大100倍。无损伤皮肤位于图左。
图2T显示了经环杷明治疗24小时后的那一半银屑病损伤的组织切片，以C8/144B抗体进行免疫组化染色。放大400倍。
图2U显示了经环杷明治疗24小时后的损伤皮肤及无损伤皮肤的连接区域的组织切片，以C8/144B抗体进行免疫组化染色。放大100倍。无损伤皮肤位于图左。
图2V显示了未经治疗的银屑病损伤皮肤用MT310抗体进行的免疫组化染色结果，MT310抗体与人CD4抗原结合。放大100倍。可见大量的CD4阳性淋巴细胞浸润真皮。
图2W显示了经环杷明治疗的及未经治疗24小时后损伤皮肤的连接区域的组织切片，以MT310抗体进行免疫组化染色。放大40倍。观察到CD4阳性淋巴细胞自治疗区域的真皮部位消失(对应图左)。
图3A～图3L显示了不同寻常型银屑病患者(年龄29～57岁，病程5～6年)的无损伤皮肤区域、未经治疗的银屑病损伤皮肤及经环杷明治疗的损伤皮肤的皮肤组织切片。
图3A显示了银屑病病人的无损伤皮肤组织的苏木精-伊红(H&E)染色结果。放大200倍。
图3B显示了图3A中同一患者未经治疗的银屑病损伤皮肤的H&E染色结果。放大200倍。
图3C显示了图3A中同一患者的经环杷明治疗24小时后的银屑病损伤皮肤组织切片的H&E染色结果。放大200倍。
图3D显示了对寻常型银屑病患者的无损伤皮肤组织切片进行Ki-67抗原染色的免疫组化结果。放大400倍。
图3E显示了图3D中同一患者的未治疗银屑病损伤的组织切片进行Ki-67抗原染色的免疫组化结果。放大400倍。大量显示Ki-67的细胞可见于表皮上基底层。
图3F显示了图3D中同一患者的经环杷明治疗24小时后的银屑病损伤的组织切片进行Ki-67抗原染色的免疫组化结果。放大400倍。显示Ki-67的细胞可见于表皮基底层。
图3G显示了以Ber-EP4抗体对银屑病病人的无损伤皮肤组织进行上皮抗原免疫组化染色的结果。放大100倍。
图3H显示了图3G中同一患者未经治疗的银屑病损伤皮肤的组织切片，以Ber-EP4抗体进行上皮抗原免疫组化染色。放大100倍。
图3I显示了图3G中同一患者经环杷明治疗24小时后的银屑病损伤皮肤的组织切片，以Ber-EP4抗体进行上皮抗原免疫组化染色。放大100倍。
图3J显示了以C8/144B抗体对银屑病病人无损伤皮肤组织进行免疫组化染色，该抗体与人CD8抗原及细胞角蛋白15结合。放大100倍。
图3K显示了图3J中同一患者的未经治疗的银屑病斑块的组织切片，以C8/144B抗体进行免疫组化染色，该抗体与人CD8抗原及细胞角蛋白15结合。放大200倍。
图3L显示了图3J中同一患者的经环杷明治疗24小时后的银屑病损伤皮肤的组织切片，以C8/144B抗体进行免疫组化染色，该抗体与人CD8抗原及细胞角蛋白15结合。放大200倍。
彩图
与在第17、18、19、20、21、22、23页上附图(图1A、图1B、图1C、图1D、图1D、图1E、图IF、图2A、图2B、图2C、图2D、图2E、图2F、图2G、图2H、图21、图2J、图2K、图2L、图2M、图2N、图20、图2P、图2R、图2S、图2T、图2U、图2V、图2W、图3A、图3B、图3C、图3D、图3E、图3F、图3G、图3H、图3I、图3J、图3K、图3L)同样附图的彩图，其页码在此增补为17a、18a、19a、20a、21a、22a、23a，这是由于基于免疫组化方法的数据及资料的性质，彩图比灰图能更好地传递信息；我们真诚地希望专利局能够考虑这些事实，将这几页保留作为专利申请的一部分。然而，若专利局考虑没有必要也可从专利申请中删除17a、18a、19a、20a、21a、22a、23a。
发明描述
本发明涉及环杷明，一种已发现30多年的天然甾体类固醇生物碱，在银屑病治疗并实现从患者皮肤上快速清除银屑病损伤中的用途，同时无可检测到的副作用。环杷明在使包括红斑及疤痕等银屑病临床指征从患者皮肤消失的同时，实现了银屑病组织病理学指征逆转至正常，局部治疗可实现银屑病临床指征的消失。数月随访表明，经过治疗的皮肤区域显示出健康的正常皮肤。这些特征使环杷明适合用于银屑病的治疗，并为长期困扰的银屑病治疗提供了一种解决方案。
在局部应用时，可将环杷明溶于乙醇或其它合适的溶剂中，再与合适的基质乳膏、软膏或凝胶混合。也可将环杷明固定于水凝胶上或制成能控释的其它剂型，且可吸附到皮肤贴片上。如图1A～图1F(临床图片)、图2A～图2W及图3A～图3L(组织病理学及免疫组化方法资料)所示的效果为乳膏制剂得到的效果，该制剂为将环杷明乙醇溶液与乳膏基质混合得到终浓度为18mM的环杷明乳膏。使用的乳膏基质主要由重石蜡油(10％w/w)、凡士林(10％w/w)、十八烷醇(8％w/w)、polyoxylsteareth-40(3％w/w)及水(68％w/w)组成，然而，也可使用其它合适的制剂乳膏基质。环杷明在剂型中的最佳浓度、最佳剂量及应用方案将明显受具体剂型、皮肤损伤的位置及特性等因素影响；然而，这些因素可用已经发表的优化方法确定。用于治疗图A(银屑病斑块在手背)所示损伤的剂量及方案如下：每4小时借助钢刮刀将约30μl乳膏直接用于损伤部位，连续使用24小时。为防止使用乳膏部位的污染及乳膏流失，可敷上铝箔(图1B)。用于图1D(肩胛区域的银屑病斑块)所示损伤的治疗剂量及使用方案如下：每4直接使用30μl乳膏于损伤部位，连续使用24小时。乳膏使用部位进行类似的覆盖以防污染及流失。其它经治疗的患者或损伤，若方便且合适时每处损伤每3～5小时接受约30～35μl的乳膏。安慰剂乳膏(乳膏基质仅与乙醇混合而不添加环杷明)用于环杷明治疗的损伤同样大小的斑块，使用剂量、应用方案及损伤的覆盖均一样；安慰剂处理的银屑病斑块未显效或改善(数据未显示)。如我们稍早些的专利申请(Tas S.等(2001)PCT/TR01/00027)以及本发明中所述的暴露于环杷明的正常表皮及毛囊的未分化细胞得到保持，提供了环杷明其他可能剂型，如损害部内注射或用合适皮肤贴片覆盖及时控释放制剂的耐受剂量的信息。
图1A及图1C显示了暴露于环杷明前后的银屑病斑块以及快速临床转归。将环杷明乳膏用于57岁的斑块型银屑病患者的右手背损伤的近身体侧。每4小时直接将约30μl乳膏使用于损伤部位，并将乳膏使用部位进行覆盖以防污染及流失(图1B)。经过4小时的治疗后，使用乳膏的那一半银屑病斑块红斑轻微减少。经过12小时后，使用环杷明的那一半损伤斑块不再明显，而在24小时时，红斑及疤痕明显地消失(图1C)，在先前的疤痕部位(包括经治疗及未经治疗的两部分)中，与约5mm地无关皮肤边缘一起切除。
图2A～图2W显示了无损伤皮肤、未经治疗的损伤皮肤及经环杷明治疗的损伤皮肤地组织切片的组织病理学及免疫组化检测发现。与无损伤皮肤(图2A)相比，未经治疗的损伤皮肤(图2B)显示出“发明背景”所述的典型银屑病皮肤表征。然而，环杷明处理的那一半损伤组织的切片显示了明显的改善，回归正常。这些回归正常的组织病理学指征，如图2C及图2D(实例源于后述的经环杷明治疗的损伤及患者)所示，包括下面这些：
增厚延长的表皮突回归至正常水平，表皮增生明显减少(图2C与图2B)。
变薄的乳头上表皮回归正常，乳突水肿消失(图2C与图2B比较)。
与未经治疗的损伤表皮的焦点损失或缺失的颗粒细胞层相比(图2B)，环杷明治疗的表皮中表皮的颗粒层再现明显(图2C及图2D)。
浸润未经治疗的损伤皮肤表皮下真皮的绝大多数炎症细胞，经环杷明治疗后消失(图2C与图2B比较)。
见于未经治疗的损伤皮肤(图2B)角质层内的过度角化及角化不全减少了，但在经环杷明治疗24小时后，这种最老的表皮层并未完全恢复正常(图2C、图2D)。
经环杷明治疗及未经治疗的连接区域的银屑病损伤皮肤组织区域表明，接受较小浓度的环杷明治疗后，损伤皮肤区域仍然显示了回归正常的迹象，但相对不太明显(图2E、图2F)。
上述组织的相关免疫组化发现总结如下，并以图2G～图2W进行举例说明。进行免疫组化研究的所有抗体及试剂均购自DAKO(Glostrup，Denmark)；人Et-67抗原以单克隆抗体M7187检测，人上皮抗原以单克隆抗体Ber-EP4检测，人CD4抗原以单克隆抗体M0716检测，人CD8抗原以单克隆抗体C8/144B检测。除了CD8抗原，已知单克隆抗体C8/144B可识别并结合在毛发干细胞中表达的细胞角蛋白15(Kanitakis J.等(1999)Eur.J.Dermatol.9：363-365)。DAKO的＂通用显色试剂盒″(LSAB2)用于显色反应，该试剂盒使用生物素化的二级抗体以及过氧化物酶偶联的链亲和素(需要预先稀释以与DAKO提供的一级抗体的稀释相匹配)。所有的反应均在制造商推荐的条件下进行。
Ki-67抗原为增生细胞的标记物。如图2G所示，在无损伤皮肤中，Ki-67显示细胞大部分被限制于表皮的基底层。另一方面，未经治疗的损伤皮肤显示在表皮中Ki-67阳性细胞数目增加，在表皮上基底层有大量的Ki-67阳性细胞(图2H)，这些为银屑病的已知特征。图2I显示，在经环杷明治疗的损伤中，Ki-67抗原阳性细胞的出现频率及位置均恢复正常。经环杷明治疗的损伤皮肤与未治疗的损伤皮肤的交界区域的组织切片(图2J)以及与未损伤皮肤交界区域的组织切片(图2K)，又显示环杷明对Ki-67抗原阳性细胞的出现频率及位置恢复正常的效果，提供了环杷明的浓度依赖性治疗效果的证明。
已知单克隆抗体Ber-EP4可标记正常表皮的基底层细胞。毛囊根鞘外部据信为毛发干细胞存在的地方，根鞘外部已知可用Ber-EP4标记。图2L显示无损伤皮肤表现出Ber-EP4标记的正常图案(即标记基底层细胞)。另一方面，未经治疗的银屑病损伤表皮，在同样条件下，没有出现Ber-EP4标记基底层(图2M)。银屑病损伤表皮中，基底层细胞的Ber-EP4检测异常，此前未有述及，为经环杷明治疗后损伤恢复正常(图2N)。
图2O显示了来自经环杷明治疗及未经治疗的银屑病损伤连接区域的组织切片的Ber-EP4染色。环杷明对间隔一定距离的银屑病损伤的正常化作用表明，Ber-EP4对环杷明异常检测的敏感性。早已发现基底癌细胞暴露于环杷明可引起分化以及Ber-EP4染色的缺失(Tas S.等，(2001)PCT/TR01/00027)。然而，在同样的条件下，将正常的基底细胞暴露于环杷明，继续为Ber-EP4阳性(Tas S.等，(2001)PCT/TR01/00027)。图2P显示银屑病病人中未损伤皮肤的基底细胞暴露于环杷明后也保持Ber-EP4阳性；基底细胞的特征保持完好。
C8/114B抗体识别的细胞角蛋白15，在毛囊及正常表皮的基底层细胞中都正常存在(Kanitakis J.等(1999)Eur.J.Dermatol.9：363-365)。图2R显示了在无损伤皮肤中以C8/144B进行的基底层细胞标记。与此相反，未经治疗的银屑病损伤皮肤的基底层细胞以C8/144B抗体染色非常微弱或完全不染色(图2S)。另一方面，环杷明治疗的那一半损伤皮肤的基底层细胞正常化，可用C8/144B抗体标记(图2T)。由于C8/144B及Ber-EP4两者均可检测外部根鞘细胞及正常表皮基底层细胞，在银屑病损伤的表皮处，这两种抗体显示的基底细胞异常可能相关或完全一致。环杷明并不损害无损伤皮肤，并且与Ber-EP4的情形类似，暴露于环杷明的无损伤表皮的基底细胞，继续呈细胞角蛋白15阳性(图2U)。
CD4阳性淋巴细胞浸润真皮是银屑病斑块相当明了的特征，可在未经治疗的银屑病损伤皮肤中显示出来(图2V)。另一方面，CD4阳性淋巴细胞浸润的银屑病损伤皮肤与经环杷明治疗的那一半损伤皮肤有极明显的分界(图2W)。
通过对不同年龄阶段的银屑病患者和遗传异质性以及全身的银屑病损伤位置异质性，来考察环杷明对不同病人以及损伤治疗的效果。在本发明中，对无关联的29～57岁患者的治疗，以及对遍布从四肢到躯干各个部位的银屑病损伤的治疗，结果表明，环杷明对各种银屑病治疗高度有效，导致明显好转或消失(在起草本发明的时候，已经治疗了不同患者身体上7处不同损伤)。图1D、图1E及图1F表明即使环杷明只使用一天即终止，经治疗的银屑病损伤依然好转并完全清除。在该特定的实例中，经治疗12小时后，银屑病红斑即减少。尽管有明显好转，然而在后续的第四天仍然可见。损伤在8天后清除，在书写本发明时治疗后超过一个月，损伤部位的皮肤显示出健康的正常皮肤外观。如本发明及较早专利(Tas S.等，(2001)PCT/TR01/00027)所述，环杷明局部应用于健康皮肤无可检测到的副作用。环杷明用于正常皮肤发生可能副作用的最长后续期为书写本发明时的14个月，没有发现副作用。
图3C～图3L显示了不同患者的无损伤皮肤、未经治疗的银屑病损伤皮肤及经环杷明治疗的损伤皮肤(患者不是图2A～图2W描述的患者)，并进一步举例说明了本发明的用途及发现。图3A、图3B及图3C显示了治疗24小时后无损伤皮肤组织、未经治疗的银屑病损伤皮肤组织及经环杷明治疗的损伤皮肤组织的组织病理学发现，并表明环杷明诱导患者银屑病斑块的退化。
图3D、图3E及图3F显示了治疗24小时后的无损伤皮肤、未经治疗的银屑病损伤皮肤及经环杷明治疗的损伤皮肤的对Ki67抗原免疫组化染色结果，并表明环杷明诱导另一处银屑病斑块的退化。
图3G、图3H及图31显示了治疗24小时后的无损伤皮肤、未经治疗的银屑病损伤皮肤及经环杷明治疗的损伤皮肤用Ber-EP4抗体进行的免疫组化染色结果，并举例说明了另一例银屑病患者的银屑病损伤皮肤基底层细胞Ber-EP4检测异常，以及环杷明诱导的正常逆转。
图3J、图3K及图3L显示了治疗24小时后的无损伤皮肤、未经治疗的银屑病损伤皮肤及经环杷明治疗的损伤皮肤的C8/144B抗体免疫组化染色结果，并举例说明另一例银屑病患者的银屑病损伤皮肤基底层细胞Ber-EP4检测异常，以及环杷明诱导的正常逆转。
现有研究报道环杷明可以阻断细胞分化，并认为环杷明可用于阻止细胞分化(DetmerK.等(2000)Dev.Biol.222：242；Berman D.M.等(2000)J.Urol.163：240)。然而，我们发现银屑病损伤皮肤暴露于环杷明诱导的正好是表皮细胞的分化。环杷明治疗银屑病损伤皮肤的表皮颗粒细胞层的再现表明，对银屑病斑决分化的阻断被环杷明的治疗作用所克服。尽管我们不希望受任何具体理论所束缚，在环杷明治疗的银屑病损伤皮肤的表皮细胞的Ki-67抗原表达的本发明发现，可能也与环杷明的诱导分化有关。使用环杷明后，银屑病损伤表皮上基质层的增生细胞消失(图2H与2I、图3E与图3F)，可能也源于已终止分化潜力的重新获得。不管其准确的机制如何，暴露于环杷明后，银屑病损伤表皮的过度增生活性恢复至正常水平本身是有益的(具有治疗价值)。
与本发明所述的银屑病斑块的快速清除(快达一天)，与传统治疗银屑病方法显效平均需6～8周的治疗(Al-Suwaidan S.N.等(2000)J.Am.Acad.Dermatol.42：796-802；Lebwohl M.等(2001)J.Am.Acad.Dermatol.45：64661)形成了鲜明相比。因而，本发明所述的治疗是这一长期困扰临床的疾病治疗的一大进步及解决方案。此外，对环杷明的快速反应表明，为对涉及银屑病斑块形成的主要或最接近因果事件的干扰。
由于有证据表明hedgehog/smoothened信号转导通路参与了表皮干细胞的保持，因而可推断环杷明对皮肤的副作用是可能的，必须被排除。如本发明及较早专利(Tas S.等，(2001)PCT/TR01/00027)所述，在所述的浓度及剂量条件下未检测到环杷明的副作用。所述治疗没有明显副作用，以及迄今为止不曾取得的高度局部效力，表明其为目前银屑病治疗尴尬境地的解决方案，此前的治疗困难在于传统治疗的积极的(aggressive)使用通常会引起难以接受的副作用，而稍差的积极治疗对患者的银屑病损伤无效(Al-Suwaidan S.N.等(2000)J.Am.Acad.Dermatol.42：796-802)。