一种降解乙草胺和/或丁草胺的微生物组合物及其应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201310042034.2	申请日：	2013.02.01
公开号：	CN103122312A	公开日：	2013.05.29
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C12N 1/00申请公布日:20130529\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 1/00申请日:20130201\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N1/00; C12N1/20; A62D3/02(2007.01)I; C02F3/34; B09C1/10; C12R1/01(2006.01)N; A62D101/04(2007.01)N; A62D101/26(2007.01)N; A62D101/28(2007.01)N; C02F101/38(2006.01)N; C02F101/34(2006.01)N	主分类号：	C12N1/00
申请人：	南京农业大学
发明人：	崔中利; 侯颖; 王飞; 黄艳
地址：	210095 江苏省南京市玄武区卫岗1号
优先权：
专利代理机构：	南京天华专利代理有限责任公司 32218	代理人：	徐冬涛;傅婷婷
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内容摘要

本发明属于生物处理技术领域，公开了一种降解乙草胺和/或丁草胺的微生物组合物及其应用。微生物组合物，包括：Rhodococcus sp.T3-1、Delftia sp.T3-6和/或Sphingobium sp.MEA3-1；均于2012年12月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号依次为：Rhodococcus sp.T3-1：CCTCC NO：M2012525，Delftia sp.T3-6：CCTCC NO：M2012526，Sphingobium sp.MEA3-1：CCTCC NO：M2012527。本发明所述的微生物组合物可在联合降解乙草胺和/或丁草胺中应用。

权利要求书

权利要求书一种微生物组合物，包括：Rhodococcus sp.T3‐1、Delftia sp.T3‐6和/或Sphingobium sp.MEA3‐1；均于2012年12月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号依次为：Rhodococcus sp.T3‐1：CCTCC NO：M 2012525，Delftia sp.T3‐6：CCTCC NO：M2012526，Sphingobium sp.MEA3‐1：CCTCC NO：M2012527。
权利要求1所述的微生物组合物在联合降解乙草胺和/或丁草胺中的应用。
权利要求1所述的微生物组合物在水体和土壤环境中乙草胺和/或丁草胺污染修复中的应用。
Rhodococcus sp.T3‐1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年12月17日，保藏编号为CCTCC NO：M2012525。
Delftia sp.T3‐6，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年12月17日，保藏编号为CCTCC NO：M2012526。
权利要求5所述的Delftia sp.T3‐6在降解苯胺和/或邻苯二酚中的应用。
Sphingobium sp.MEA3‐1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年12月17日，保藏编号为CCTCC NO：M2012527。
权利要求7所述的Sphingobium sp.MEA3‐1在降解邻苯二酚和/或对苯二酚中的应用。

说明书

说明书一种降解乙草胺和/或丁草胺的微生物组合物及其应用
技术领域
本发明属于生物处理技术领域，涉及一种降解乙草胺和/或丁草胺的微生物组合物及其应用。
背景技术
氯代乙酰胺类除草剂是一类高效、高选择性的触杀性除草剂，对禾本科杂草具有非常显著的杀除效果，其主要代表品种乙草胺和丁草胺是我国使用最多的三种除草剂中的两种，年使用量分别超过1万吨和5千吨。氯代乙酰胺类除草剂对鱼类有较强的毒性，乙草胺和丁草胺被美国环保局定为B‑2类致癌物，它们还有不易挥发、不易光解、土壤残留期长的特点，对生态环境和人体健康有着巨大威胁。另外，氯代乙酰胺类除草剂对作物存在隐性药害，对农业造成严重的损失。
生物降解是农药在环境中的一类重要转化过程。微生物由于大量存在于自然界、并且具有种类繁多、繁殖迅速和对环境适应性强等特点，在农药的生物降解过程中起到了重要作用。当前研究者已分离到一些能降解乙草胺的微生物，但普遍对乙草胺的降解能力不高：Xu等报道了Pseudomonas oleovorans LCa2对乙草胺的降解，该菌株在7d内能将7.6mg·L‑1的乙草胺降解98.03％。赵野等分离到一株Stenotrophomonas maltophilia，对50mg·L‑1乙草胺14d的降解率为29.2％。倪俊等分离到一株能以乙草胺为唯一碳源和能源生长的菌株Shinella sp.Y‑4，在48h内对50mg·L‑1乙草胺的降解率达到83.3％。董滨等分离到1株能以乙草胺为氮源生长的细菌Ensifer adhaerens A‑3，在10d内对10mg·L‑1乙草胺的降解率为33.6％。因此，筛选到能够高效降解乙草胺的菌株，对降解基因资源的开发利用和环境污染修复非常具有现实意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种降解乙草胺和/或丁草胺的微生物组合物。
本发明的另一目的是提供该微生物组合物的应用。
本发明的目的可以通过如下技术方案实现：
一种微生物组合物，包括：Rhodococcus sp.T3‑1、Delftia sp.T3‑6和/或Sphingobium sp.MEA3‑1；均于2012年12月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号依次为：Rhodococcus sp.T3‑1：CCTCC NO：M2012525，Delftia sp.T3‑6：CCTCC NO：M2012526， Sphingobium sp.MEA3‑1：CCTCC NO：M2012527。
菌株Rhodococcus sp.T3‑1能将乙草胺降解为2‑乙基‑6‑甲基‑N‑α‑氯代乙酰替苯胺（CMEPA），菌株Delftia sp.T3‑6再将CMEPA降解为2‑乙基‑6‑甲基苯胺(MEA)和氯代乙酸，而菌株Sphingobium sp.MEA3‑1则可将MEA完全降解。经Rhodococcus sp.T3‑1和Delftia sp.T3‑6联合处理后的乙草胺和丁草胺失去了对小旱稗、马唐等杂草的杀灭效果。
本发明所述的微生物组合物在联合降解乙草胺和/或丁草胺中的应用。
所述的微生物组合物在水体和土壤环境中乙草胺和/或丁草胺污染修复中的应用。
Rhodococcus sp.T3‑1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年12月17日，保藏编号为CCTCC NO：M2012525。
Rhodococcus sp.T3‑1在LB平板上可形成桔红色菌落，菌落边缘整齐，无光泽，突起，粘稠，干燥，粗糙，不透明。菌体成杆状（0.8×2.0μm），有荚膜，无鞭毛。
Rhodococcus sp.T3‑1在无机盐培养基中能利用乙草胺为唯一碳源对其进行降解，生成2‑乙基‑6‑甲基‑N‑α‑氯代乙酰替苯胺（CMEPA），在14h内即可将200mg·L‑1的乙草胺降解95％以上。同时Rhodococcus sp.T3‑1也能将丁草胺转化成为2，6－二乙基－N‑α‑氯代乙酰替苯胺。
Delftia sp.T3‑6，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年12月17日，保藏编号为CCTCC NO：M2012526。
Delftia sp.T3‑6在LB平板上形成乳白色菌落，菌落边缘整齐，无光泽，扁平，粘稠，湿润，光滑，半透明。菌体呈长杆状（0.8×2.5μm），无荚膜，有鞭毛。
Delftia sp.T3‑6，在无机盐培养基中能快速将2‑乙基‑6‑甲基‑N‑α‑氯代乙酰替苯胺（CMEPA）水解为2‑乙基‑6‑甲基苯胺(MEA)和氯代乙酸，当接种量为5％时，在8h即可将500mg·L‑1CMEPA降解99％以上。Delftia sp.T3‑6也可将2，6－二乙基－N‑α‑氯代乙酰替苯胺转化成为2，6－二乙基苯胺，并能降解苯胺和邻苯二酚，并使对苯二酚发生部分转化。
所述的Delftia sp.T3‑6在降解苯胺和/或邻苯二酚中的应用。
Sphingobium sp.MEA3‑1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年12月17日，保藏编号为CCTCC NO：M2012527。
Sphingobium sp.MEA3‑1在LB平板上生长较慢，30℃，72h可形成直径为2mm的黄色菌落，菌落边缘整齐，有光泽，突出，粘稠，湿润，光滑，不透明。菌体呈长杆状（0.8×1.8μm）。
Sphingobium sp.MEA3‑1在无机盐培养基中能利用2‑乙基‑6‑甲基苯胺和2，6－二乙基苯胺为唯一碳源对其进行降解，5％接种量的MEA3‑1在10h内即可将50mg·L‑1的MEA降解完毕。Sphingobium sp.MEA3‑1能使邻苯二酚和对苯二酚发生部分转化。
所述的Sphingobium sp.MEA3‑1在降解邻苯二酚和/或对苯二酚中的应用。
有益效果：
与现有技术相比，本发明菌株在无机盐培养基（MSM）中，对200mg/L乙草胺24h降解率达到80％。此外，菌株Rhodococcus sp.T3‑1对丁草胺也有一定的降解效果，菌株Delftia sp.T3‑6还可降解2，6－二乙基苯胺、苯胺和邻苯二酚，菌株Sphingobium sp.MEA3‑1还可使邻苯二酚和对苯二酚发生部分转化。利用这些特点，该组菌株可用于乙草胺和丁草胺的生物降解，或者用于乙草胺和丁草胺污染土壤的修复，并为利用乙草胺、丁草胺、苯胺、2，6－二乙基－N‑α‑氯代乙酰替苯胺、2，6－二乙基氯代乙酰替苯胺、2，6－二乙基苯胺邻苯二酚、对苯二酚等为底物进行生物转化和生物催化提供新的种质资源。
附图说明
图1菌株Rhodococcus sp.T3‑1降解乙草胺的紫外扫描图谱
图2菌株Rhodococcus sp.T3‑1降解乙草胺的HPLC分析
图3Rhodococcus sp.T3‑1降解乙草胺产物的GC/MS分析
图4菌株Rhodococcus sp.T3‑1降解乙草胺和生成CMEPA的曲线
图5菌株Delftia sp.T3‑6降解CMEPA的紫外扫描图谱
图6菌株Delftia sp.T3‑6降解CMEPA产物的GC/MS分析
图7菌株Delftia sp.T3‑6降解CMEPA和生成MEA的曲线
图8菌株Sphingobium sp.MEA3‑1对MEA的降解
图9MEA降解曲线及Sphingobium sp.MEA3‑1生长曲线
图10菌株Rhodococcus sp.T3‑1、Delftia sp.T3‑6和Sphingobium sp.MEA3‑1对乙草胺的联合降解曲线
图11菌株Rhodococcus sp.T3‑1对除草剂丁草胺的降解
图12菌株Delftia sp.T3‑6和菌株Sphingobium sp.MEA3‑1对其他苯环类物质的降解 a.苯胺；b.2,6‑甲乙基苯胺；c.邻苯二酚；d.对苯二酚
图13菌株Rhodococcus sp.T3‑1、Delftia sp.T3‑6和Sphingobium sp.MEA3‑1的电镜照片
图14菌株Rhodococcus sp.T3‑1、Delftia sp.T3‑6和Sphingobium sp.MEA3‑1的系统发育树
生物材料保藏信息
Rhodococcus sp.T3‐1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年12月17日，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2012525。
Delftia sp.T3‐6，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年12月17日，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2012526。
Sphingobium sp.MEA3‐1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年12月17日，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2012527。
具体实施方式
下面结合实施对本发明进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。
实施例1：乙草胺降解菌株Rhodococcus sp.T3‑1的筛选分离
取5g土样置于100mL含25mg·L‑1乙草胺的富集培养基（g·L‑1：NH4NO31.0，KH2PO40.5，K2HPO41.5，NaCl1.0，MgSO4·7H2O0.1，酵母汁0.02，pH7.0。）中，于30℃、180r·min‑1培养5d。用紫外扫描仪测定富集液对乙草胺的降解情况，发现乙草胺被降解后，以10%的接种量接入到50mg·L‑1乙草胺富集培养基中，继续富集并测定降解情况，按此方法直至乙草胺浓度提高至100mg·L‑1，并传代3次。
将乙草胺富集液经梯度稀释后分别涂布于LB平板和以100mg·L‑1乙草胺为唯一碳源的MSM平板（无机盐培养基，g·L‑1：NH4NO31.0，KH2PO40.5，K2HPO41.5，NaCl1.0，MgSO4·7H2O0.1，乙草胺0.1，琼脂1.8，pH7.0。）上，于30℃培养箱中分别培养2d和7d。将两种平板上长出的菌落形态不同的单菌落分别划线于LB平板纯化，并接种于以25mg·L‑1乙草胺为唯一碳源的液体无机盐培养基中，于30℃、180r·min‑1摇床培养2d后，在待测定的样品中加入等体积的二氯甲烷，剧烈振荡1min，静置分层后吸出水相，加足量无水硫酸钠去除二氯甲烷中残余的水分，在波长200‑350nm范围内进行紫外扫描，乙草胺最大吸收峰为228nm，根据特征吸收峰的变化情况来确定富集液和菌株对乙草胺的降解能力。通过紫外扫描发现，编号为T3‑1的菌株可以使乙草胺的紫外吸收图谱发生细微变化，如图1所示。
利用HPLC对菌株T3‑1降解乙草胺前后培养液的二氯甲烷抽提物进行分析发现，未接菌的对照培养液中乙草胺的保留时间为3.97min（图2，a）。而接种T3‑1菌株并培养24h后，培养液中乙草胺的含量明显下降，并在保留时间为3.386min处有新的吸收峰出现（图2，b）。利用GC/MS对菌株T3‑1降解乙草胺形成的中间代谢产物进行了鉴定，其结果如图3。结合乙草胺的化学结构，分析认为该产物为2’‑甲基‑6'‑乙基‑2‑氯乙酰苯胺（CMEPA）。
通过鉴定，该菌株为Rhodococcus sp.命名为Rhodococcus sp.T3‑1。16SrRNA在Genbank中的登录号为JN595857。
将Rhodococcus sp.T3‑1单菌落接种于3mL液体LB培养基（g·L‑1：酵母粉5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl10.0，pH7.0。）中，37℃、180r·min‑1培养12h，以5%接种量转接至50mL液体LB培养基中37℃、180r·min‑1培养12h制成种子液。在乙草胺终浓度为100mg·L‑1的无机盐培养基（g·L‑1：NH4NO31.0，KH2PO40.5，K2HPO41.5，NaCl1.0，MgSO4·7H2O0.1，pH7.0。）中，按5%接种量接入OD600nm=1.0菌株Rhodococcus sp.T3‑1种子液，于30℃、180r·min‑1摇床培养，每隔2h取样一次，测定乙草胺及其产物的浓度。并在接种后0h和24h分别取样，采用稀释平板法测定培养液中菌株Rhodococcus sp.T3‑1的活细胞数量。通过检测发现，菌株Rhodococcus sp.T3‑1在以100mg/L乙草胺为唯一碳源的生长时，8h时，降解率达93%，如图4所示。
实施例2：2'‑甲基‑6'‑乙基‑2‑氯乙酰苯胺降解菌株Delftia sp.T3‑6的筛选分离
以实施例1中通过划线得到的不同形态单菌落纯化后分别接种于3mL液体LB培养基中培养，离心收集菌体，接种于含25mg/L2'‑甲基‑6'‑乙基‑2‑氯乙酰苯胺的无机盐培养基中，于30℃、180r·min‑1摇床培养2d后，在待测定的样品中加入等体积的二氯甲烷，剧烈振荡1min，静置分层后吸出水相，加足量无水硫酸钠去除二氯甲烷中残余的水分，在波长200‑350nm范围内进行紫外扫描，2'‑甲基‑6'‑乙基‑2‑氯乙酰苯胺最大吸收峰为228nm，根据特征吸收峰的变化情况来确定菌株对2'‑甲基‑6'‑乙基‑2‑氯乙酰苯胺的降解能力。通过紫外扫描发现，编号为T3‑6的菌株可以使2'‑甲基‑6'‑乙基‑2‑氯乙酰苯胺的紫外吸收图谱发生明显变化，如图5所示。
利用GC/MS对菌株T3‑6降解CMEPA形成的中间代谢产物进行了鉴定，其结果如图6。结合CMEPA的化学结构，分析认为该产物为2‑甲基‑6‑乙基苯胺（MEA）。通过鉴定，该菌株为Delftia属.命名为Delftia sp.T3‑6。16SrRNA在Genbank中的登录号为JN595858
将Delftia sp.T3‑6单菌落接种于3mL液体LB培养基（g·L‑1：酵母粉5.0，胰蛋白胨10.0， NaCl10.0，pH7.0。）中，30℃、180r·min‑1培养12h，以5%接种量转接至50mL液体LB培养基中30℃、180r·min‑1培养12h制成种子液。在CMEPA终浓度为100mg·L‑1的无机盐培养基（g·L‑1：NH4NO31.0，KH2PO40.5，K2HPO41.5，NaCl1.0，MgSO4·7H2O0.1，pH7.0。）中，按1%接种量接入OD600nm=1.0菌株Delftia sp.T3‑6种子液，于30℃、180r·min‑1摇床培养，每隔2h取样一次，测定CMEPA及其产物的浓度。并在接种后0h和12h分别取样，采用稀释平板法测定培养液中菌株Delftia sp.T3‑6的细胞数量。通过测定发现，在CMEPA终浓度为100mg·L‑1的无机盐培养基中，按1.0%接种量接入菌株Delftia sp.T3‑6种子液，每2h取样测定培养液中CMEPA和MEA含量，菌株Delftia sp.T3‑6对CMEPA的降解没有延滞期，其降解速度非常快，并且随着CMEPA的降解，MEA的量也呈线性增加。如图7所示。
实施例3：2‑甲基‑6‑乙基苯胺降解菌株Sphingobium sp.MEA3‑1的筛选分离
以实施例1中通过划线得到的不同形态单菌落，纯化后分别接种于3mL液体LB培养基中培养24h，以5%接种量接种于含50mg/L2‑甲基‑6‑乙基苯胺（MEA）的无机盐培养基（g·L‑1：NH4NO31.0，KH2PO40.5，K2HPO41.5，NaCl1.0，MgSO4·7H2O0.1，pH7.0。）中，于30℃、180r·min‑1摇床培养2d后，以二氯甲烷抽提，紫外扫描检测MEA的降解情况，结果发现编号为MEA3‑1的菌株在24h内可将50mg·L‑1的MEA完全降解（图8），通过鉴定，该菌株为Sphingobium属。命名为Sphingobium sp.MEA3‑1。16SrRNA在Genbank中的登录号为JN595860。
将Sphingobium sp.MEA3‑1单菌落接种于3mL液体LB培养基中，30℃、180r·min‑1培养12h，以5%接种量转接至50mL液体LB培养基中30℃、180r·min‑1培养12h制成种子液。在MEA终浓度为50mg·L‑1的无机盐培养基中，按5%接种量接入OD600nm＝1.0菌株Sphingobium sp.MEA3‑1种子液，于30℃、180r·min‑1摇床培养，每隔2h取样一次，测定OD600nm和MEA的浓度。由图9可以看出，菌株Sphingobium sp.MEA3‑1接种到培养基中2h，就开始降解MEA，而没有明显的延滞现象；之后降解速率逐渐增加，到12h就已将50mg·L‑1的MEA基本降解完全。
实施例4三株菌株对乙草胺的联合降解
在pH为7.0的无机盐培养基（g·L‑1：NH4NO31.0，KH2PO40.5，K2HPO41.5，NaCl1.0，MgSO4·7H2O0.1，pH7.0。）中，添加终浓度为200mg·L‑1的乙草胺，菌株Rhodococcus sp.T3‑1、Delftia sp.T3‑6和Sphingobium sp.MEA3‑1的接种量分别为10%、5%和5%。于30℃、180r·min‑1摇床培养，每2h取样一次，培养液经二氯甲烷抽提后，利用HPLC测定乙草胺和CMEPA 含量，利用紫外扫描测定MEA含量。24h后三个菌株可将200mg/L的乙草胺降解90%（图10）
三株菌株的联合降解效果远高于已报道的各种菌株。说明该三株菌的联合作用可用于乙草胺的污染环境修复和农药残留降解。
实施例5三株菌对其它化合物的转化作用
在含终浓度为50mg·L‑1丁草胺的无机盐培养基中，按5%接种量接入OD600nm=1.0的Rhodococcus sp.T3‑1种子液，于30℃、180r·min‑1摇床培养，24h后取样经二氯甲烷抽提后，利用紫外扫描和HPLC测定各除草剂残留量。结果如图11所示。从图11可以看出，丁草胺紫外扫描图谱发生变化，HPLC检测亦发现经Rhodococcus sp.T3‑1降解的丁草胺吸收峰明显降低，并有新的吸收峰出现，即形成了新的产物。
在分别含有50mg·L‑1苯胺、邻苯二酚、对苯二酚和2,6‑甲乙基苯胺的无机盐培养基中，按5%接种量分别接入OD600nm=1.0的菌株Delftia sp.T3‑6和Sphingobium sp.MEA3‑1种子液，于30℃、180r·min‑1摇床培养24h后，在200‑350nm范围内紫外扫描测定各物质的变化情况。其中苯胺和2,6‑甲乙基苯胺用等体积二氯甲烷抽提后经紫外扫描测定其降解情况，而邻苯二酚和对苯二酚则在水相中直接扫描测定其降解情况。其结果如图12所示。由图12中可以看出，菌株Delftia sp.T3‑6可以完全降解苯胺和邻苯二酚，并可以使对苯二酚转化形成新的化合物。菌株Sphingobium sp.MEA3‑1可以完全降解2,6‑甲乙基苯胺，但不能降解苯胺，并可使邻苯二酚和对苯二酚转化形成新的化合物。
实施例6三株菌降解乙草胺产生的中间代谢产物的杀草效果
以小旱稗（Echinochloa crusgalli(L.)Beauv.var.austrojaponensis Ohwi）和马唐（Digitaria sanguinalis(L.)Scop.）为试验靶标，采用平皿法对乙草胺及其代谢中间产物CMEPA和MEA的除草活性进行了测定，结果见表1。
由表1可以看出，乙草胺与CMEPA对两种试验材料的抑制活性较强，并且CMEPA的抑制活性较乙草胺更强。而代谢产物MEA对试验材料的生长抑制较弱，且在浓度低于20mg·L‑1时对两种杂草的生长似乎有刺激作用，即使其浓度在60mg·L‑1时对小旱稗和马唐的抑制率也分别只有10.26%和25.68%。该结果表明，若能利用微生物菌剂使施用到农田里的多余乙草胺降解形成MEA或彻底降解，就可以减少其对农作物的药害。
表1乙草胺、CMEPA和MEA对小旱稗和马唐胚轴生长的抑制（％）

表2Rhodococcus sp.T3‑1、Delftia sp.T3‑6和Sphingobium sp.MEA3‑1的部分生理生化特征

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1、(10)申请公布号 CN 103122312 A(43)申请公布日 2013.05.29CN103122312A*CN103122312A*(21)申请号 201310042034.2(22)申请日 2013.02.01CCTCC NO：M 2012525 2012.12.17CCTCC NO：M 2012527 2012.12.17CCTCC NO：M 2012526 2012.12.17C12N 1/00(2006.01)C12N 1/20(2006.01)A62D 3/02(2007.01)C02F 3/34(2006.01)B09C 1/10(2006.01)C12R 1/01(200。

2、6.01)A62D 101/04(2007.01)A62D 101/26(2007.01)A62D 101/28(2007.01)C02F 101/38(2006.01)C02F 101/34(2006.01)(71)申请人南京农业大学地址 210095 江苏省南京市玄武区卫岗1号(72)发明人崔中利侯颖王飞黄艳(74)专利代理机构南京天华专利代理有限责任公司 32218代理人徐冬涛傅婷婷(54) 发明名称一种降解乙草胺和/或丁草胺的微生物组合物及其应用(57) 摘要本发明属于生物处理技术领域，公开了一种降解乙草胺和/或丁草胺的微生物组合物及其应用。微生物组合物，包括：Rhodoco。

3、ccus sp.T3-1、Delftia sp.T3-6和/或Sphingobium sp.MEA3-1；均于2012年12月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号依次为：Rhodococcus sp.T3-1：CCTCC NO：M2012525，Delftia sp.T3-6：CCTCC NO：M2012526，Sphingobium sp.MEA3-1：CCTCC NO：M2012527。本发明所述的微生物组合物可在联合降解乙草胺和/或丁草胺中应用。(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.权利要求书1页说明书7页附图9页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请。

4、权利要求书1页说明书7页附图9页(10)申请公布号 CN 103122312 ACN 103122312 A1/1页21.一种微生物组合物，包括：Rhodococcus sp.T31、Delftia sp.T36和/或Sphingobium sp.MEA31；均于2012年12月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号依次为：Rhodococcus sp.T31：CCTCC NO：M 2012525，Delftia sp.T36：CCTCC NO：M2012526，Sphingobium sp.MEA31：CCTCC NO：M2012527。 2.权利要求1所述的微生物组合物在联合降。

5、解乙草胺和/或丁草胺中的应用。 3.权利要求1所述的微生物组合物在水体和土壤环境中乙草胺和/或丁草胺污染修复中的应用。 4.Rhodococcus sp.T31，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年12月17日，保藏编号为CCTCC NO：M2012525。 5.Delftia sp.T36，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年12月17日，保藏编号为CCTCC NO：M2012526。 6.权利要求5所述的Delftia sp.T36在降解苯胺和/或邻苯二酚中的应用。 7.Sphingobium sp.MEA31，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年。

6、12月17日，保藏编号为CCTCC NO：M2012527。 8.权利要求7所述的Sphingobium sp.MEA31在降解邻苯二酚和/或对苯二酚中的应用。权利要求书CN 103122312 A1/7页3一种降解乙草胺和 / 或丁草胺的微生物组合物及其应用技术领域0001 本发明属于生物处理技术领域，涉及一种降解乙草胺和/或丁草胺的微生物组合物及其应用。背景技术0002 氯代乙酰胺类除草剂是一类高效、高选择性的触杀性除草剂，对禾本科杂草具有非常显著的杀除效果，其主要代表品种乙草胺和丁草胺是我国使用最多的三种除草剂中的两种，年使用量分别超过1万吨和5千吨。氯代乙酰胺类除草剂对鱼。

7、类有较强的毒性，乙草胺和丁草胺被美国环保局定为B-2类致癌物，它们还有不易挥发、不易光解、土壤残留期长的特点，对生态环境和人体健康有着巨大威胁。另外，氯代乙酰胺类除草剂对作物存在隐性药害，对农业造成严重的损失。 0003 生物降解是农药在环境中的一类重要转化过程。微生物由于大量存在于自然界、并且具有种类繁多、繁殖迅速和对环境适应性强等特点，在农药的生物降解过程中起到了重要作用。当前研究者已分离到一些能降解乙草胺的微生物，但普遍对乙草胺的降解能力不高：Xu等报道了Pseudomonas oleovorans LCa2对乙草胺的降解，该菌株在7d内能将7.6mgL-1的乙草胺降解98.03。赵野等。

8、分离到一株Stenotrophomonas maltophilia，对50mgL-1乙草胺14d的降解率为29.2。倪俊等分离到一株能以乙草胺为唯一碳源和能源生长的菌株Shinella sp.Y-4，在48h内对50mgL-1乙草胺的降解率达到83.3。董滨等分离到1株能以乙草胺为氮源生长的细菌Ensifer adhaerens A-3，在10d内对10mgL-1乙草胺的降解率为33.6。因此，筛选到能够高效降解乙草胺的菌株，对降解基因资源的开发利用和环境污染修复非常具有现实意义。发明内容0004 本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种降解乙草胺和/或丁草胺的微生物组合物。 0005。

9、本发明的另一目的是提供该微生物组合物的应用。 0006 本发明的目的可以通过如下技术方案实现： 0007 一种微生物组合物，包括：Rhodococcus sp.T3-1、Delftia sp.T3-6和/或Sphingobium sp.MEA3-1；均于2012年12月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号依次为：Rhodococcus sp.T3-1：CCTCC NO：M2012525，Delftia sp.T3-6：CCTCC NO：M2012526， Sphingobium sp.MEA3-1：CCTCC NO：M2012527。 0008 菌株Rhodococcus sp.T。

10、3-1能将乙草胺降解为2-乙基-6-甲基-N-氯代乙酰替苯胺（CMEPA），菌株Delftia sp.T3-6再将CMEPA降解为2-乙基-6-甲基苯胺(MEA)和氯代乙酸，而菌株Sphingobium sp.MEA3-1则可将MEA完全降解。经Rhodococcus sp.T3-1和Delftia sp.T3-6联合处理后的乙草胺和丁草胺失去了对小旱稗、马唐等杂草的杀灭效果。说明书CN 103122312 A2/7页40009 本发明所述的微生物组合物在联合降解乙草胺和/或丁草胺中的应用。 0010 所述的微生物组合物在水体和土壤环境中乙草胺和/或丁草胺污染修复中的应用。 0011 R。

11、hodococcus sp.T3-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年12月17日，保藏编号为CCTCC NO：M2012525。 0012 Rhodococcus sp.T3-1在LB平板上可形成桔红色菌落，菌落边缘整齐，无光泽，突起，粘稠，干燥，粗糙，不透明。菌体成杆状（0.82.0m），有荚膜，无鞭毛。 0013 Rhodococcus sp.T3-1在无机盐培养基中能利用乙草胺为唯一碳源对其进行降解，生成2-乙基-6-甲基-N-氯代乙酰替苯胺（CMEPA），在14h内即可将200mgL-1的乙草胺降解95以上。同时Rhodococcus sp.T3-1也能将丁草胺转化。

12、成为2，6二乙基N-氯代乙酰替苯胺。 0014 Delftia sp.T3-6，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年12月17日，保藏编号为CCTCC NO：M2012526。 0015 Delftia sp.T3-6在LB平板上形成乳白色菌落，菌落边缘整齐，无光泽，扁平，粘稠，湿润，光滑，半透明。菌体呈长杆状（0.82.5m），无荚膜，有鞭毛。 0016 Delftia sp.T3-6，在无机盐培养基中能快速将2-乙基-6-甲基-N-氯代乙酰替苯胺（CMEPA）水解为2-乙基-6-甲基苯胺(MEA)和氯代乙酸，当接种量为5时，在8h即可将500mgL-1CMEPA降解99以上。。

13、Delftia sp.T3-6也可将2，6二乙基N-氯代乙酰替苯胺转化成为2，6二乙基苯胺，并能降解苯胺和邻苯二酚，并使对苯二酚发生部分转化。 0017 所述的Delftia sp.T3-6在降解苯胺和/或邻苯二酚中的应用。 0018 Sphingobium sp.MEA3-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年12月17日，保藏编号为CCTCC NO：M2012527。 0019 Sphingobium sp.MEA3-1在LB平板上生长较慢，30，72h可形成直径为2mm的黄色菌落，菌落边缘整齐，有光泽，突出，粘稠，湿润，光滑，不透明。菌体呈长杆状（0.81.8m）。 00。

14、20 Sphingobium sp.MEA3-1在无机盐培养基中能利用2-乙基-6-甲基苯胺和2，6二乙基苯胺为唯一碳源对其进行降解，5接种量的MEA3-1在10h内即可将50mgL-1的MEA降解完毕。Sphingobium sp.MEA3-1能使邻苯二酚和对苯二酚发生部分转化。 0021 所述的Sphingobium sp.MEA3-1在降解邻苯二酚和/或对苯二酚中的应用。 0022 有益效果： 0023 与现有技术相比，本发明菌株在无机盐培养基（MSM）中，对200mg/L乙草胺24h降解率达到80。此外，菌株Rhodococcus sp.T3-1对丁草胺也有一定的降解效果，菌株Delf。

15、tia sp.T3-6还可降解2，6二乙基苯胺、苯胺和邻苯二酚，菌株Sphingobium sp.MEA3-1还可使邻苯二酚和对苯二酚发生部分转化。利用这些特点，该组菌株可用于乙草胺和丁草胺的生物降解，或者用于乙草胺和丁草胺污染土壤的修复，并为利用乙草胺、丁草胺、苯胺、2，6二乙基N-氯代乙酰替苯胺、2，6二乙基氯代乙酰替苯胺、2，6二乙基苯胺邻苯二酚、对苯二酚等为底物进行生物转化和生物催化提供新的种质资源。说明书CN 103122312 A3/7页5附图说明0024 图1菌株Rhodococcus sp.T3-1降解乙草胺的紫外扫描图谱 0025 图2菌株Rhodococcus sp.。

16、T3-1降解乙草胺的HPLC分析 0026 图3Rhodococcus sp.T3-1降解乙草胺产物的GC/MS分析 0027 图4菌株Rhodococcus sp.T3-1降解乙草胺和生成CMEPA的曲线 0028 图5菌株Delftia sp.T3-6降解CMEPA的紫外扫描图谱 0029 图6菌株Delftia sp.T3-6降解CMEPA产物的GC/MS分析 0030 图7菌株Delftia sp.T3-6降解CMEPA和生成MEA的曲线 0031 图8菌株Sphingobium sp.MEA3-1对MEA的降解 0032 图9MEA降解曲线及Sphingobium sp.MEA3-1。

17、生长曲线 0033 图10菌株Rhodococcus sp.T3-1、Delftia sp.T3-6和Sphingobium sp.MEA3-1对乙草胺的联合降解曲线 0034 图11菌株Rhodococcus sp.T3-1对除草剂丁草胺的降解 0035 图12菌株Delftia sp.T3-6和菌株Sphingobium sp.MEA3-1对其他苯环类物质的降解 a.苯胺；b.2,6-甲乙基苯胺；c.邻苯二酚；d.对苯二酚 0036 图13菌株Rhodococcus sp.T3-1、Delftia sp.T3-6和Sphingobium sp.MEA3-1的电镜照片 0037 图14菌株R。

18、hodococcus sp.T3-1、Delftia sp.T3-6和Sphingobium sp.MEA3-1的系统发育树 0038 生物材料保藏信息 0039 Rhodococcus sp.T31，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年12月17日，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2012525。 0040 Delftia sp.T36，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年12月17日，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2012526。 0041 Sphingobium sp.MEA31，保藏于中国典型培养物保。

19、藏中心，保藏日期为2012年12月17日，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2012527。具体实施方式0042 下面结合实施对本发明进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。 0043 实施例1：乙草胺降解菌株Rhodococcus sp.T3-1的筛选分离 0044 取5g土样置于100mL含25mgL-1乙草胺的富集培养基（gL-1：NH4NO31.0，KH2PO40.5，K2HPO41.5，NaCl1.0，MgSO47H2O0.1，酵母汁0.02，pH7.0。）中，于30、180rmin-1培养5d。用紫外扫描仪测定富集液对乙草胺的降解情况，发现乙草胺被降。

20、解后，以10%的接种量接入到50mgL-1乙草胺富集培养基中，继续富集并测定降解情况，按此方法直至乙草胺浓度提高至100mgL-1，并传代3次。 0045 将乙草胺富集液经梯度稀释后分别涂布于LB平板和以100mgL-1乙草胺为唯一碳源的MSM平板（无机盐培养基，gL-1：NH4NO31.0，KH2PO40.5，K2HPO41.5，NaCl1.0，MgSO47H2O0.1，乙草胺0.1，琼脂1.8，pH7.0。）上，于30培养箱中分别培养2d和7d。将两种平板上长出的菌落形态不同的单菌落分别划线于LB平板纯化，并接种于以25mgL-1乙草胺为唯一碳源的液体无机盐培养基中，于30、180rmin。

21、-1摇床培养2d后，在待测定说明书CN 103122312 A4/7页6的样品中加入等体积的二氯甲烷，剧烈振荡1min，静置分层后吸出水相，加足量无水硫酸钠去除二氯甲烷中残余的水分，在波长200-350nm范围内进行紫外扫描，乙草胺最大吸收峰为228nm，根据特征吸收峰的变化情况来确定富集液和菌株对乙草胺的降解能力。通过紫外扫描发现，编号为T3-1的菌株可以使乙草胺的紫外吸收图谱发生细微变化，如图1所示。 0046 利用HPLC对菌株T3-1降解乙草胺前后培养液的二氯甲烷抽提物进行分析发现，未接菌的对照培养液中乙草胺的保留时间为3.97min（图2，a）。而接种T3-1菌株并培养24h后。

22、，培养液中乙草胺的含量明显下降，并在保留时间为3.386min处有新的吸收峰出现（图2，b）。利用GC/MS对菌株T3-1降解乙草胺形成的中间代谢产物进行了鉴定，其结果如图3。结合乙草胺的化学结构，分析认为该产物为2-甲基-6-乙基-2-氯乙酰苯胺（CMEP A）。 0047 通过鉴定，该菌株为Rhodococcus sp.命名为Rhodococcus sp.T3-1。16SrRNA在Genbank中的登录号为JN595857。 0048 将Rhodococcus sp.T3-1单菌落接种于3mL液体LB培养基（g L-1：酵母粉5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl10.0，pH7.0。）中，3。

23、7、180rmin-1培养12h，以5%接种量转接至50mL液体LB培养基中37、180rmin-1培养12h制成种子液。在乙草胺终浓度为100mgL-1的无机盐培养基（g L-1：NH4NO31.0，KH2PO40.5，K2HPO41.5，NaCl1.0，MgSO47H2O0.1，pH7.0。）中，按5%接种量接入OD600nm=1.0菌株Rhodococcus sp.T3-1种子液，于30、180rmin-1摇床培养，每隔2h取样一次，测定乙草胺及其产物的浓度。并在接种后0h和24h分别取样，采用稀释平板法测定培养液中菌株Rhodococcus sp.T3-1的活细胞数量。通过检测发现，菌。

24、株Rhodococcus sp.T3-1在以100mg/L乙草胺为唯一碳源的生长时，8h时，降解率达93%，如图4所示。 0049 实施例2：2-甲基-6-乙基-2-氯乙酰苯胺降解菌株Delftia sp.T3-6的筛选分离 0050 以实施例1中通过划线得到的不同形态单菌落纯化后分别接种于3mL液体LB培养基中培养，离心收集菌体，接种于含25mg/L2-甲基-6-乙基-2-氯乙酰苯胺的无机盐培养基中，于30、180rmin-1摇床培养2d后，在待测定的样品中加入等体积的二氯甲烷，剧烈振荡1min，静置分层后吸出水相，加足量无水硫酸钠去除二氯甲烷中残余的水分，在波长200-350nm范围内进行。

25、紫外扫描，2-甲基-6-乙基-2-氯乙酰苯胺最大吸收峰为228nm，根据特征吸收峰的变化情况来确定菌株对2-甲基-6-乙基-2-氯乙酰苯胺的降解能力。通过紫外扫描发现，编号为T3-6的菌株可以使2-甲基-6-乙基-2-氯乙酰苯胺的紫外吸收图谱发生明显变化，如图5所示。 0051 利用GC/MS对菌株T3-6降解CMEPA形成的中间代谢产物进行了鉴定，其结果如图6。结合CMEPA的化学结构，分析认为该产物为2-甲基-6-乙基苯胺（MEA）。通过鉴定，该菌株为Delftia属.命名为Delftia sp.T3-6。16SrRNA在Genbank中的登录号为JN595858 0052 将Delfti。

26、a sp.T3-6单菌落接种于3mL液体LB培养基（gL-1：酵母粉5.0，胰蛋白胨10.0， NaCl10.0，pH7.0。）中，30、180rmin-1培养12h，以5%接种量转接至50mL液体LB培养基中30、180rmin-1培养12h制成种子液。在CMEPA终浓度为100mgL-1的无机盐培养基（g L-1：NH4NO31.0，KH2PO40.5，K2HPO41.5，NaCl1.0，MgSO47H2O0.1，pH7.0。）中，按1%接种量接入OD600nm=1.0菌株Delftia sp.T3-6种子液，于30、180rmin-1摇床说明书CN 103122312 A5/7页7培。

27、养，每隔2h取样一次，测定CMEPA及其产物的浓度。并在接种后0h和12h分别取样，采用稀释平板法测定培养液中菌株Delftia sp.T3-6的细胞数量。通过测定发现，在CMEPA终浓度为100mgL-1的无机盐培养基中，按1.0%接种量接入菌株Delftia sp.T3-6种子液，每2h取样测定培养液中CMEPA和MEA含量，菌株Delftia sp.T3-6对CMEPA的降解没有延滞期，其降解速度非常快，并且随着CMEPA的降解，MEA的量也呈线性增加。如图7所示。 0053 实施例3：2-甲基-6-乙基苯胺降解菌株Sphingobium sp.MEA3-1的筛选分离 0054 以实施例。

28、1中通过划线得到的不同形态单菌落，纯化后分别接种于3mL液体LB培养基中培养24h，以5%接种量接种于含50mg/L2-甲基-6-乙基苯胺（MEA）的无机盐培养基（gL-1：NH4NO31.0，KH2PO40.5，K2HPO41.5，NaCl1.0，MgSO47H2O0.1，pH7.0。）中，于30、180rmin-1摇床培养2d后，以二氯甲烷抽提，紫外扫描检测MEA的降解情况，结果发现编号为MEA3-1的菌株在24h内可将50mgL-1的MEA完全降解（图8），通过鉴定，该菌株为Sphingobium属。命名为Sphingobium sp.MEA3-1。16SrRNA在Genbank中的登录。

29、号为JN595860。 0055 将Sphingobium sp.MEA3-1单菌落接种于3mL液体LB培养基中，30、180rmin-1培养12h，以5%接种量转接至50mL液体LB培养基中30、180rmin-1培养12h制成种子液。在MEA终浓度为50mgL-1的无机盐培养基中，按5%接种量接入OD600nm1.0菌株Sphingobium sp.MEA3-1种子液，于30、180rmin-1摇床培养，每隔2h取样一次，测定OD600nm和MEA的浓度。由图9可以看出，菌株Sphingobium sp.MEA3-1接种到培养基中2h，就开始降解MEA，而没有明显的延滞现象；之后降解速率逐。

30、渐增加，到12h就已将50mgL-1的MEA基本降解完全。 0056 实施例4三株菌株对乙草胺的联合降解 0057 在pH为7.0的无机盐培养基（gL-1：NH4NO31.0，KH2PO40.5，K2HPO41.5，NaCl1.0，MgSO47H2O0.1，pH7.0。）中，添加终浓度为200mgL-1的乙草胺，菌株Rhodococcus sp.T3-1、Delftia sp.T3-6和Sphingobium sp.MEA3-1的接种量分别为10%、5%和5%。于30、180rmin-1摇床培养，每2h取样一次，培养液经二氯甲烷抽提后，利用HPLC测定乙草胺和CMEPA 含量，利用紫外扫描测定。

31、MEA含量。24h后三个菌株可将200mg/L的乙草胺降解90%（图10） 0058 三株菌株的联合降解效果远高于已报道的各种菌株。说明该三株菌的联合作用可用于乙草胺的污染环境修复和农药残留降解。 0059 实施例5三株菌对其它化合物的转化作用 0060 在含终浓度为50mgL-1丁草胺的无机盐培养基中，按5%接种量接入OD600nm=1.0的Rhodococcus sp.T3-1种子液，于30、180rmin-1摇床培养，24h后取样经二氯甲烷抽提后，利用紫外扫描和HPLC测定各除草剂残留量。结果如图11所示。从图11可以看出，丁草胺紫外扫描图谱发生变化，HPLC检测亦发现经Rhodococ。

32、cus sp.T3-1降解的丁草胺吸收峰明显降低，并有新的吸收峰出现，即形成了新的产物。 0061 在分别含有50mgL-1苯胺、邻苯二酚、对苯二酚和2,6-甲乙基苯胺的无机盐培养基中，按5%接种量分别接入OD600nm=1.0的菌株Delftia sp.T3-6和Sphingobium sp.MEA3-1种子液，于30、180rmin-1摇床培养24h后，在200-350nm范围内紫外扫描测定各物质的变化情况。其中苯胺和2,6-甲乙基苯胺用等体积二氯甲烷抽提后经紫外扫描测定其降解说明书CN 103122312 A6/7页8情况，而邻苯二酚和对苯二酚则在水相中直接扫描测定其降解情况。其结果。

33、如图12所示。由图12中可以看出，菌株Delftia sp.T3-6可以完全降解苯胺和邻苯二酚，并可以使对苯二酚转化形成新的化合物。菌株Sphingobium sp.MEA3-1可以完全降解2,6-甲乙基苯胺，但不能降解苯胺，并可使邻苯二酚和对苯二酚转化形成新的化合物。 0062 实施例6三株菌降解乙草胺产生的中间代谢产物的杀草效果 0063 以小旱稗（Echinochloa crusgalli(L.)Beauv.var.austrojaponensis Ohwi）和马唐（Digitaria sanguinalis(L.)Scop.）为试验靶标，采用平皿法对乙草胺及其代谢中间产物CMEPA和M。

34、EA的除草活性进行了测定，结果见表1。 0064 由表1可以看出，乙草胺与CMEPA对两种试验材料的抑制活性较强，并且CMEPA的抑制活性较乙草胺更强。而代谢产物MEA对试验材料的生长抑制较弱，且在浓度低于20mgL-1时对两种杂草的生长似乎有刺激作用，即使其浓度在60mgL-1时对小旱稗和马唐的抑制率也分别只有10.26%和25.68%。该结果表明，若能利用微生物菌剂使施用到农田里的多余乙草胺降解形成MEA或彻底降解，就可以减少其对农作物的药害。 0065 表1乙草胺、CMEPA和MEA对小旱稗和马唐胚轴生长的抑制（） 0066 0067 表2Rhodococcus sp.T3-1、Delftia sp.T3-6和Sphingobium sp.MEA3-1的部分生理生化特征 0068 说明书CN 103122312 A7/7页9说明书CN 103122312 A1/9页10图1说明书附图CN 103122312 A10。

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