用于原发性肝癌基因治疗的腺病毒载体及使用方法 技术领域 本发明涉及肿瘤的基因治疗及病毒治疗领域，具体涉及到，通过肿瘤特异性启动子调控腺病毒载体在特定条件下进行病毒复制和外源插入基因表达的技术，即利用甲胎蛋白启动子调控腺病毒载体，在表达甲胎蛋白的原发肝癌细胞中特异性地进行病毒复制和外源插入基因表达，从而在表达甲胎蛋白的肝癌细胞中，因受甲胎蛋白启动子控制而特异性地进行病毒复制和外源插入基因表达，从而杀死肝癌细胞的技术。
背景技术 恶性肿瘤严重威胁人类健康，是仅次于心血管疾病的人类第二号“杀手”，传统的肿瘤治疗方法有相当的局限性，例如，放、化疗杀死肿瘤细胞的同时，对肿瘤患者身体的毒副作用极强。
近年来分子生物学以及其它学科的发展，人们对各种基因的功能及其与疾病之间的关系逐渐了解，肿瘤的生物治疗迅速发展，其中主要包括肿瘤免疫治疗和基因治疗等方面，前者包括抗癌效应细胞的激活、细胞因子的诱发、抗癌抗体(即导向治疗)的筛选、新型疫苗的研制等方法，后者包括病毒载体和非病毒载体的治疗等方法。
以病毒为载体的恶性肿瘤的基因治疗，载体可以高效地、特异性地进入肿瘤细胞，并表达所携带的治疗用外源基因，或特异性地在肿瘤细胞中复制、繁殖，进而杀死肿瘤细胞。目前常见的基因治疗病毒载体有逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体和腺相关病毒载体，其中研究地最多的是腺病毒载体。
人的腺病毒根据颗粒表面表位的不同分为50个血清型，分别归A-F6个亚属。每个亚属的成员之间可相互交换遗传物质，但在不同的亚属之间不能相互重组。人5型腺病毒属人腺病毒C亚属。腺病毒是一种双链DNA病毒，其基因组长度约为36kb，分早期转录区(E区)和晚期转录区(L区)，早期转录区详细可分为6个独立的区域：E1A、E1B、E2(E2A和E2B)、E3、E4。
删除了E1区和E3区的腺病毒载体，通常被称为第一代腺病毒载体，这种载体可插入并表达长度不超过8kb的外源基因，这种腺病毒载体本身不能复制产生子代病毒，并具有下列特点：可感染多种类型细胞，包括静止期不分裂的细胞；基因组不与宿主细胞的基因组发生随机整合，较为安全；易于大规模生产，可获得较高滴度的病毒。
无论何种基因治疗载体，如何改进并提高其在肿瘤细胞中的特异性，是该载体能否安全应用于临床的关键。为达到此目的，人们通过基因工程方法，不断改造腺病毒载体：或者使改造后的病毒能在肿瘤细胞中特异性复制增殖，而在正常细胞内不能复制增殖，成为一种所谓溶瘤性病毒，如Onyx公司的Onyx-015病毒，特异杀伤p53基因突变的肿瘤细胞；或者，通过改造腺病毒基因组本身(Lieber A et al.)，通过腺病毒纤毛结构的修饰(Curiel D、et al.)，以及通过使用外源肿瘤特异性启动子控制重组腺病毒的复制(Yu DC et al.)，实现肿瘤特异性载体的目的，如Calydon公司的CN706病毒，通过前列腺肿瘤特异性启动子SPA的作用，特异杀伤前列腺癌细胞。
原发肝癌细胞与正常肝癌细胞的一个重要区别是，超过70％的原发肝癌细胞表达甲胎蛋白，而正常肝细胞则不表达，只有胚胎肝细胞中有甲胎蛋白的表达，这是癌细胞幼稚化的一种体现，在临床诊断中，甲胎蛋白的检测是原发肝癌诊断的重要手段之一。我们将腺病毒载体基因组中自身启动子基因删除，替换成甲胎蛋白启动子，使重组后的受控于甲胎蛋白启动子的腺病毒载体，只能在表达甲胎蛋白的情况下，因启动子被激活而进行复制和表达，在正常的肝细胞中，因没有甲胎蛋白的存在，腺病毒载体不能复制和表达，由此达到了对肝细胞选择性杀伤的目的。
应用甲胎蛋白启动子控制腺病毒产生肝癌组织特异性，是常见的抗肝癌肿瘤基因治疗研究方法。但由于甲胎蛋白启动子结构复杂，不同部位作用不同，具有不同功能，使得人们对甲胎蛋白启动子的肝癌特异性产生很大置疑。我们对常用的甲胎蛋白启动子进行了改进，使用一种具有特殊结构的甲胎蛋白启动子，它含有增强子(Enhancer)、沉默子(Silencer)及启动子核心区(Core promoter)等全部功能元件。此外，为了增强该启动子的特异性，我们在重组腺病毒载体的基因组中甲胎蛋白启动子基因序列的上游插入了特殊的基因调控元件——隔离子(Insulator)，使其达到了很高的特异性。
作为肿瘤基因治疗的载体，一方面要求具有肿瘤特异性；另一方面，应具有抗肿瘤特性，即在肿瘤特异性启动子控制条件下，将所携带的相关的抗肿瘤基因，在肿瘤细胞内特异性表达，从而有效地杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞没有杀伤作用。在此，我们将Ad5型腺病毒的E1a基因和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，简称TRAIL)基因通过基因工程手段，与腺病毒基因组进行基因重组，可以实现上述目标。
人类腺病毒5型E1a基因，位于腺病毒线性双链DNA基因组的左端，具有84％的保守性。该基因产生两种主要的mRNA，大小分别为13S和12S，分别编码289和243个氨基酸的两个蛋白，这两个蛋白通过激活病毒基因的表达，促使病毒的复制(Shenk T，1996)。这两个蛋白是腺病毒最初表达的蛋白，具有激活腺病毒其它基因，特别是E2区和E4区基因的功能，是腺病毒复制的关键。E1a基因编码的蛋白有3个转化必须的区域：非保守氨基酸末端(aa2-24)；保守区1(CR1；aa40-80)；保守区2(CR2；aa120-140)。E1a基因编码的蛋白的不同功能区域与细胞内的两类蛋白结合，从而使E1a编码的蛋白活化，发挥其功能：转录协同激活剂p300/CBP家族，与E1a基因的蛋白N末端和CR1结合，Rb家族与CR1和CR2结合，这些反应从功能上影响不同的生长调节途径，从而促进分化。虽然细胞实验表明，E1a在E1b和ras基因产物的协同作用下，可以使正常的胚胎成纤维细胞系恶性转化，接种于裸鼠时成瘤(Yu D & HungMC，1998)，但E1a基因本身不能使细胞系恶性转化(Chang JY et al.，1996)，迄今为止，没有证据表明E1a基因是致癌基因，相反，近年来发现E1a是具有抑癌作用的基因，它可以通过多种途径抑制肿瘤的形成和转移。
E1a基因对肿瘤的抑制是通过以下几个方面实现的：1.通过依赖p53的机制抑制肿瘤。当细胞DNA损伤时，p53基因可诱导细胞进入G1期，抑制细胞增殖直到DNA损伤得到修复，如果损伤的DNA得不到修复，p53能活化诱导细胞凋亡的基因使细胞发生凋亡。而E1a基因可以维持p53野生型构象，使p53蛋白处于较高的水平。这可能是E1a基因蛋白与细胞内P300蛋白结合的结果。2.通过非依赖p53的机制抑制肿瘤，可能与细胞内一些基因的激活或失活有关，从而促进细胞的凋亡，目前机制尚不清楚(Ricardo SP et al.，1996)。3.E1a基因通过调节肿瘤细胞的免疫反应抑制肿瘤。E1a基因能明显增加NIH3T3细胞对TNF细胞毒性的敏感性，通过NK细胞和激活巨噬细胞影响靶细胞对非依赖TNF溶细胞机制的易感性(Chen MJ et al.，1987)。4.E1a基因可通过将肿瘤细胞转变为上皮细胞表型，抑制不同人类肿瘤细胞的恶性行为(Yu D & Hung MC，1998)。5.E1a基因通过抑制蛋白酶基因表达抑制肿瘤侵袭，如IV型胶原酶、纤溶酶原激活剂、间质胶原酶、尿激酶及溶基质素等(Yu D & Hung MC，1998，RicardoSP et al.，1996)。6.E1a基因可通过增强转移抑制基因nm23的表达抑制转移(Steeg PS et al.，1988)。
此外，E1a基因可使肿瘤细胞对放射治疗和化学治疗的敏感性增加。其作用途径：1.通过阻断NB-的活性。转录因子NB-与肿瘤细胞对放射治疗和化学治疗的抗拒性有关，射线和一些化学治疗药物能激活NF-κB的活性，使肿瘤细胞对放射治疗和化学治疗产生抗拒性，而E1a基因可以阻断NF-κB的活性，从而提高肿瘤细胞对放射治疗和化学治疗的敏感性(Shao RP et al.，1997)。2.通过改变细胞内某些基因的活性。如erbB2基因的表达下降，野生型p53水平增加。Ricardo等(Ricardo SP et al.，1996)研究表明E1a基因提高肿瘤细胞对放射治疗和化学治疗的敏感性，不依赖p53的状态、H-ras和其他肿瘤基因的改变，甚至在HPV-E6基因高表达的癌细胞中，E1a基因的表达可使肿瘤细胞对DNA损伤类药物和放射线的敏感性提高4～10倍。
因此，人们开始广泛研究E1a基因对肿瘤的抑制作用：在用人类卵巢癌细胞株建立的裸鼠瘤模型中，通过局部注射脂质体介导的E1a基因，肿瘤的生长和播散较对照组明显受到抑制(Yu D et al.，1995)；人类气管内肺癌裸鼠模型中，通过尾静脉注射脂质体介导的E1a基因，取得了较好的生物治疗效果(Chang JY et al.，1996)；脂质体介导E1a基因治疗转移性乳腺癌、上皮性卵巢癌表明肿瘤生长受到抑制(Ueno NT et al.，1998)；E1a基因的对头颈肿瘤的治疗于1996年获FDA批准用于临床研究，用E1a基因治疗7例不可切除和复发的头颈癌患者，以四组不同的剂量(15、30、60和120μg DNA/cm3肿瘤)进行瘤体注射，未发现明显的毒性作用；评估的6例患者中，4例肿瘤得到控制，1例部分缩小，1例有较小的改变(Yoo GH et al.，1998)。E1a不仅静脉注射在动物模型中取得了较好的治疗效果，未见明显的毒副作用，临床研究也表现出肯定的疗效，通过多种途径，作用于不同基因，E1a在肿瘤治疗中应该具有光明前景。
本发明中，我们选用了具有抑制肿瘤作用的E1a基因作为外源治疗用插入基因之一的同时，选用了近来较为引人注目的细胞凋亡相关基因作为另外一个外源治疗用插入基因，二者有机结合的目的在于，提高肿瘤治疗效果。
凋亡是细胞自杀的过程，它使多细胞生物在组织中控制一定细胞数并消除个别威胁生物生存的细胞。细胞在严重DNA损伤后凋亡启动失败而导致恶性肿瘤的发生(Evan G et al.，1998)。某些细胞表面具独特传感器，被称为死亡受体，它能探测细胞外的死亡信号(凋亡激活因子)，并能迅速启动细胞的内在凋亡过程(Ashkenazi A et Dixit VM，1998)，近期研究发现了一种凋亡激活因子-TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)蛋白，是一II型膜蛋白。真核表达的全长膜蛋白TRAIL和pmol可溶性TRAIL能迅速诱导多种肿瘤细胞凋亡(Wiley SR et al.，1995；Pitti RM et al.，1996)。
TRAIL在许多组织有表达，其受体均不与其他细胞毒配体如TNF-α结合(Ashkenazi A et Dixit VM，1998)。正常和肿瘤组织均表达TRAIL的DR5、DR4受体，并介导TRAIL的凋亡作用(Pan G et al.，1997)，而TRAIL的DcR1和DcR2受体，在正常组织(含肝组织)中高表达，在胚胎(含胎肝)及肿瘤组织中低表达。尤为重要的是，DcR1和DcR2受体不能传递死亡信号，为具保护性作用的“诱饵”受体，使得正常细胞免于被杀伤。转染实验已证实这一保护性作用(Sheridan JP et al.，1997；Pan G et al.，1997)。根据TRAIL及其多种受体的表达推测，正常组织对其诱导凋亡作用不敏感(Lars EF et al.，2000)，同时，TRAIL杀伤瘤细胞与其家族其它因子一样不依赖于p53，这样可以更有效地杀伤一些p53发生突变了的细胞(Rohn TA et al.，2001)。
肿瘤的基因治疗，关键问题在于对肿瘤细胞的选择特异性和杀伤有效性两个方面。本发明通过使用甲胎蛋白启动子插入病毒载体，控制外源插入基因的表达，具有特异性杀伤肝癌细胞的特征，同时，外源插入的治疗用基因，选用已经进入临床研究的E1a基因和具有凋亡激活作用的TRAIL基因，通过内部核糖体进入位点IRES基因的调控作用，同时分别表达这两种基因编码的蛋白，增强了对肿瘤细胞杀伤作用的有效性。即，将5型腺病毒的E1区启动子删除，代之以甲胎蛋白启动子，研究甲胎蛋白启动子及隔离子的肿瘤特异性，并在它们基因序列的下游连接E1a和TRAIL，得到Ad.HS4.AFP.E1a/TRAIL重组腺病毒载体构建。研究表明，该重组腺病毒载体，具有在原发肝癌细胞中因甲胎蛋白的表达而特异性调控了甲胎蛋白启动子进行腺病毒复制的特点，使得该启动子控制下的两种不同治疗用基因得以表达，有效增强了特定条件下，即原发肝癌细胞中，该病毒载体对肿瘤细胞的杀伤作用。
本发明还提供了含有此肿瘤特异性的病毒载体及可用药用载体共同使用。
本发明还提供了此肿瘤特异性的病毒载体在用于肿瘤治疗的药物组合治疗用途。
本发明还提供了类似的肿瘤特异性的病毒载体在用于肿瘤治疗中的用途。
本发明还提供了类似的肿瘤特异性的病毒载体在用于肿瘤治疗中与其它药物和/或可用药用载体的组合治疗用途。
附图说明 图1.重组腺病毒Ad.HS4.AFP.E1a/TRAIL结构示意图。其中，HS4为鸡的β-球蛋白隔离子基因，AFP为甲胎蛋白启动子基因，分别由2个增强子、6-8个沉默子及启动子核心区基因构成，E1a是5型腺病毒早期基因E1a区基因，IRES为内部核糖体进入位点基因，TRAIL为肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体，ΔE3表示5型腺病毒早期基因E3区基因删除。
图2.通过活细胞比色检测试验研究感染系数MOI为100(TCID50)时，AFP阴性/阳性细胞中细胞毒特异性。HepG2，Hep3B，SMMC-7721，BEL-7404分别为肝癌细胞系，L-02为人的正常肝细胞，LS174T为人结肠癌细胞，Hek293为人胚肾细胞。上述细胞在96孔板中培养至每孔104个细胞时，分别加入AdHS4.AFP.E1a/TRAIL，dl1520，或培养液作为对照，6天后，进行MTS法检测490nm吸光值，结果为三次不同试验重复的结果均值。
图3.不同TCID50感染系数MOI条件下重组腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL对不同肝癌细胞系的剂量依赖细胞毒性作用。Hep3B，HepG2是AFP高表达细胞系，BEL-7404，SMMC-7721是AFP低表达细胞系，上述细胞在96孔板中培养至每孔104个细胞时，分别用MOI1000，100，10，1的AdHS4.AFP.E1A/TRAIL进行感染，感染后连续6天进行MTS法检测490nm吸光值，结果为三次不同试验重复的结果均值。
图4.E1A，TRAIL和Caspase-3表达的RT-PCR分析。BEL-7404，HepG2和L02细胞经MOI为100TCID50的Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL(如图所示)感染或不感染(作为对照)48h，E1A、TRAIL和Caspase-3转录的定量分析，以β-actin为内部对照。
图5.通过Caspase-3酶活性的比色检测研究TRAIL的凋亡作用。HepG2，Hep3B，SMMC-7721，BEL-7404分别为肝癌细胞系，上述细胞在6孔板中培养至每孔2×106个细胞时，通过低营养培养基培养和蚜肠霉素的阻碍，使得细胞生长趋于同步，然后更换细胞培养液，同时分别进行MOI为100的AdHS4.AFP.E1a/TRAIL，dl1520感染和培养液对照，感染30小时后，收集细胞，裂解细胞，用CaspaceTM检测比色试剂盒检测Caspase的活性，经405nm吸光值检测得到结果，凋亡作用通过纵坐标单位为pmol/mg/min的自由pNA物来表示，结果为二次不同试验重复的结果均值。
图6.重组腺病毒Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL在BEL-7404移植瘤中的复制能力以及Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL和dl1520E1A表达量的比较。对荷BEL-7404瘤的无胸腺裸小鼠的移植瘤分别进行Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL(1.0×107 TCID50/mm3，C和F)，dl1520(1.0×107 TCID50/mm3，B和E)，或者PBS(A和D，作为背景对照)注射，连续注射5天。荷瘤鼠在最后一次注射给药后第7天时被处死进行组织病理分析，肿瘤的薄切片用抗E1A抗体(棕色)染色，再用苏木精(蓝色)对其它部分进行复染。E1A定量分析(G)表明，Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL组和dl1520组与PBS组在统计上明显差异(p＜0.01，*)，同时，Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL组与定量dl1520组也具有统计意义上的差异。具体切片如图所示。
图7.重组腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL在体内荷人肝癌细胞BEL-7404瘤裸鼠中抗肿瘤作用的研究。PBS，AdHS4.AFP.E1a/TRAIL(1.0×107TCID50/mm3)，dl1520(1.0×107 TCID50/mm3)，或DDP直接注射到AFP低表达的BEL-7404移植瘤瘤内，注射体积为50μl，连续注射5天，DDP连续注射7天，肿瘤体积通过肿瘤直径的检测来计算，每周测量2次，注射日的肿瘤体积设定为100％，与阴性对照PBS组相比，其它3组均值均有显著抑瘤作用(p＜0.01，AVONA)。Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL组与dl1520组相比，其抑瘤作用亦有显著差异(p＜0.05，student t test)。
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发明内容 本发明中所构建的重组腺病毒载体是经过改造的5型腺病毒。5型腺病毒的基因组含35935个核苷酸，是目前研究的最为清楚的一种病毒，流行病学上主要引起人的呼吸道感染，并具有明显自愈性的病毒。腺病毒作为疫苗应用于人体已有几十年的历史，从未发现有转化人正常细胞及致癌现象发生。
本发明所构建的重组腺病毒载体AdHS4.AFP.E1a/TRAIL如图1中所示，腺病毒载体自身的E1a启动子区被删除，取而代之的是甲胎蛋白启动子(AFP Promoter)，并在其上游插入隔离子(Insulator)，是一段鸡的β-球蛋白基因序列HS4，用于控制和加强整个重组腺病毒载体的特异性复制和相关基因的特异性表达。甲胎蛋白启动子的下游是腺病毒早期基因E1a基因，以及通过内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)基因连接的肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体TRAIL基因，E1a基因和TRAIL基因在特异性甲胎蛋白启动子控制下，经IRES的调控作用，分别同时进行表达，增强了对肝癌细胞的有效杀伤作用。
本发明所构建的重组腺病毒载体AdHS4.AFP.E1a/TRAIL已于2003年9月9日提交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号是：V 2003010。
甲胎蛋白启动子结构复杂，序列长达8kb。使用不同部分，其肝癌特异性有很大差别。本发明采用基因工程方法，对人甲胎蛋白启动子结构进行优化，具体而言，即采用2次重复的增强子(Enhancer)，6次重复的沉默子(Silencer)，及甲胎蛋白启动子核心区(Core promoter)，共同组成一个全新的，高效的，将5型腺病毒基因组置于该启动子控制之下，并结合隔离子等调控元件，组成一个特异性在肝癌细胞中复制表达的重组腺病毒。
本发明的优点：本发明具有杀伤肿瘤特异性强和有效性高的优点。
特异性方面：
本发明中首先选择使用甲胎蛋白AFP启动子，使重组腺病毒载体所携带的外源插入基因在能够表达甲胎蛋白的原发性肝癌细胞中进行复制和表达，并且，所使用的甲胎蛋白启动子是经过研究和改进后的重组的甲胎蛋白启动子，从其性能上讲，其肿瘤特异性较其它文献报道的强，同时，其启动功能上有一点优化。
在此基础上，在启动子上游插入隔离子，进一步增强了该启动子的特异性。这里选择的是鸡的β-球蛋白基因序列HS4，其它类似的隔离子，均可用于增强启动子特异性的隔离子使用，由此使得腺病毒载体在肿瘤细胞中的复制和表达特异性增强。
有效性方面：
本方面中首先选择已经进入临床研究的并已被证明具有有效抑瘤作用的腺病毒早期基因E1a基因作为治疗用基因进行表达，同时，在内部核糖体进入位点IRES基因的特殊重要调控作用下，即可应用同一个转录单位的情况下，同时分别表达两种不同基因编码的蛋白，选择与细胞凋亡激活相关的TRAIL，加强对肿瘤细胞的杀伤作用。
凋亡是细胞自杀的过程，它使多细胞生物在组织中控制一定细胞数并消除个别威胁生物生存的细胞。细胞在严重DNA损伤后凋亡启动失败而导致恶性肿瘤的发生。TRAIL，即肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，是一II型膜蛋白，研究表明，可溶性TRAIL能迅速诱导多种肿瘤细胞凋亡。因此，TRAIL与E1a的共同表达，将增强对肿瘤细胞的杀伤效果。
本发明同样适应不同靶向的肿瘤特异性启动子，针对不同肿瘤的特异性治疗，同时选用不同肿瘤抑瘤基因和/或诱导激活基因、免疫相关基因等共同表达，以增强对肿瘤的有效杀伤作用。
定义
除非另有不同定义，在此使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域中一般技术人员通常所理解的一样。尽管任何与此描述的相似或相同的任何方法和材料都可用于本发明的实施或试验。在此仅对优选的方法和材料予以描述。为此本发明就以下术语予以定义：
在此使用的“隔离子”这一术语，是指编码任何具有与鸡的β-球蛋白隔离子基因序列，即HS4，同样增强启动子特异性功能的外源基因序列。
在此使用的“外源基因”这一术语，是指插入本发明中所用腺病毒载体中的编码任何感兴趣的、有生物功能的蛋白的基因序列，该插入外源基因所编码的蛋白，可以具有药用或其它特征。所插入的外源基因的长度的上限取决于腺病毒载体的包装限度。外源基因可通过常规方法，即合成、由天然来源提取、基因克隆等方法制备得到。
在此使用的“肝癌特异性基因表达”和“肝癌特异性”这两个术语，是指腺病毒载体在原发肝癌细胞中的复制和表达。虽然此载体在正常细胞中也会有表达，但表达水平很低，使得载体复制和包装无法有效进行，以至于可以将这样低的复制包装水平忽略不计。
在此使用的“第一代腺病毒载体”或“第一代重组腺病毒载体”这一术语，是指删除了早期基因E1区和E3区的腺病毒载体，该类腺病毒载体不能复制。
具体实施方式 实施例I重组腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL的构建
以下描述的重组腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL，是带有甲胎蛋白启动子的5型腺病毒载体，并且，在该启动子上游具有HS4隔离子基因，启动子下游携带外源插入基因为抑瘤作用相关的腺病毒早期E1a基因和细胞凋亡激活相关的肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体TRAIL基因，且二者通过内部核糖体进入位点IRES连接，共同使用同一转录单位，分别进行表达。
除非另外说明，本发明所采用的技术，均是本领域常规技术，如分子克隆技术、微生物学技术、细胞生物学技术，这些技术在文献中均有充分解释。如Sambrook等的《分子克隆实验室手册》第二版(1989)等。
质粒载体的构建：
人的甲胎蛋白启动子基因序列来源于质粒pXZAFP(Kaneko S et al.，1995)，人的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体hTRAIL基因序列来源于质粒pORF.TRAIL(Invivogen)，内部核糖体进入位点IRES来源于质粒pIRES2-EGFP(Clonetech Labotorary)，鸡的β-球蛋白隔离子基因HS4来源于质粒pSLJCa(Steinwaerder DS and Lieber A，2000)，腺病毒早期基因E1a基因序列来源于质粒pFG140(Microbix)的PCR产物，其扩增引物为5’-GGGACTGAAAATGAGAC-3’和5’-CGCCATGCAAGTTAAACA-3’。所有腺病毒构建所用的质粒pShuttle和拯救AdEasyl载体为AdEasy TM腺病毒载体系统试剂盒(Stratagene)，用于细菌转化的菌株为BJ5183和XL10-gold。
将质粒pORF-TRAIL用限制性内切酶SalI和NheI水解，得到TRAIL的DNA片段，经T4聚合酶作用，补平片段末端，插入pShuttle-pA质粒的AflII水解、T4聚合酶补平的DNA片段，得到质粒pShuttle-TRAIL-pA。将质粒pIRES2-EGFP经XhoI和BstXI限制性内切酶水解及T4聚合酶补平处理，连接到质粒pShuttle-TRAIL-pA的BglII酶切、补平位点，得到质粒pShuttle-IRES-TRAIL-pA。将以质粒pFG140为模板经PCR扩增得到的平端E1a基因插入质粒pShuttle-IRES-TRAIL-pA的EcoRVI平端水解位点，得到质粒pShuttle-E1A-IRES-TRAIL-pA。来自于质粒pXZAFP的、带有增强子、沉默子和核心启动子区域的AFP启动子基因，经SalI和AflII水解后，连接到质粒pShuttle-E1A-IRES-TRAIL-pA相应位点，得到质粒pShuttle-AFP-E1A-IRES-TRAIL-pA。然后将来自于质粒pSLJca的XbaI酶切水解位点的HS4基因，经补平后插入质粒pShuttle-AFP-E1A-IRES-TRAIL-pA的XhoI补平位点，得到最终质粒pShuttle-HS4-AFP-E1A-IRES-TRAIL-pA。
重组腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL的构建：
将质粒pShuttle-HS4-AFP-E1A-IRES-TRAIL-pA经PmeI限制性内切酶的进一步酶切水解线性化，与拯救质粒AdEasy1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，经分析得到的正确克隆将转化到大肠杆菌XL10-Gold中进行进一步的扩增和纯化。纯化所得质粒经PacI酶切线性化后，转染到人胚肾细胞中，经转录、翻译和包装，得到重组的腺病毒载体，经进一步的酶切分析鉴定后，将所构建的正确重组腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL进一步在AE25细胞中扩增，经CsCl梯度离心，透析和滴度标定(TCID50/ml)，分装储藏于-80℃(Dirk SS et al.，2000)。
实施例II重组腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL在肝癌细胞中的特异性作用研究
MTS法检测重组腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL对不同肿瘤细胞中的影响：
为了检测重组腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL的肿瘤特异杀伤性，通过使用MTS(Promega)试剂盒检测活细胞在感染系数MOI为100(TCID50)时，AFP阴性/阳性细胞中该病毒的细胞毒特异性。HepG2，Hep3B，SMMC-7721，BEL-7404分别为肝癌细胞系，L-02为人的正常肝细胞，LS174T为人结肠癌细胞，Hek293为人胚肾细胞。上述细胞在96孔板中接种至每孔104个细胞，24hr后，分别用AdHS4.AFP.E1a/TRAIL，dl1520感染，或培养液作为对照，在不同时间点加入MTS试剂，37℃保温一小时后，进行490nm吸光值检测(BIO-RAD)，结果见图2。
MTS法检测重组腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL对不同肝癌细胞的剂量依赖特异性影响
在不同TCID50感染系数MOI条件下重组腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL对不同肝癌细胞系的剂量依赖细胞毒性作用。Hep3B，HepG2是AFP高表达细胞系，BEL-7404，SMMC-7721是AFP低表达细胞系，上述细胞在96孔板中培养至每孔104个细胞时，分别用MOI1000，100，10，1的AdHS4.AFP.E1a/TRAIL进行感染，感染后连续6天进行MTS法检测490nm吸光值，结果见图3。
CaspaceTM法检测重组腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL中因TRAIL表达引起的肝癌细胞的凋亡作用研究
为了检测TRAIL编码的蛋白的活性，分别将肝癌细胞系HepG2，Hep3B，SMMC-7721，BEL-7404接种在6孔板中培养至每孔2×106个细胞时，通过低营养培养基，使得细胞生长趋于同步，0.5％FBS MEM培养12hr，换10％FBS MEM培养液继续培养9hr，加入Aphidicolin(4ug/ml)培养12hr，更换0.5％FBS MEM培养液培养6hr，然后更换正常细胞培养液，同时分别加入MOI为100的AdHS4.AFP.E1a/TRAIL，dl1520和培养液对照，感染30小时后，收集细胞，裂解细胞(1％NP40，20mM Hepes，PH7.4，2mM EDTA，蛋白酶抑制剂混合物(Roche))，4℃离心后其上清进行蛋白含量检测(Pierce Biotechnology)，30-50μg用于CaspaceTM检测比色试剂盒检测Caspase的活性，底物为Ac-DEVD-pNA(Promega)，经405nm吸光值检测得到结果，见图4，凋亡作用通过纵坐标单位为pmol/mg/min的自由pNA物来表示。
实施例III重组腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL在荷肝癌移植瘤裸鼠中的抗肿瘤作用研究
重组腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL在体内荷人肝癌细胞BEL-7404瘤裸鼠中抗肿瘤作用的研究：6周龄的BALB/C裸鼠，接种1×107 BEL-7404细胞悬浮液100μl。成瘤后，当移植瘤长至80-200mm3时，进行随机分组，每组7-12只裸鼠，PBS，AdHS4.AFP.E1a/TRAIL(1.0×107 TCID50/mm3)，dl1520(1.0×107 TCID50/mm3)，或DDP直接注射到移植瘤瘤内，注射体积为50μl，连续注射5天，DDP连续注射7天，肿瘤体积通过肿瘤直径的检测来计算，每周测量2次，第31天时处死所有荷瘤裸鼠，注射日的肿瘤体积设定为100％，与阴性对照组相比，其它3组均有显著抑瘤作用，结果见图5。
尽管本发明为了便于明确理解而通过举例方式在某些方面做了详细描述，但显然在权利要求的范围内进行一定的变化和修饰是可行的。