《土壤和水体的重金属污染修复的组合物及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《土壤和水体的重金属污染修复的组合物及其应用.pdf（11页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103160283 A(43)申请公布日 2013.06.19CN103160283A*CN103160283A*(21)申请号 201310060021.8(22)申请日 2013.02.26C09K 17/14(2006.01)C02F 1/00(2006.01)C02F 1/62(2006.01)B09C 1/08(2006.01)C07K 14/00(2006.01)C12N 15/11(2006.01)C12P 21/02(2006.01)C02F 101/20(2006.01)(71)申请人成都新朝阳作物科学有限公司地址 611630 四川省成都市蒲江县鹤。
2、山镇工业五路35号(72)发明人何其明(54) 发明名称土壤和水体的重金属污染修复的组合物及其应用(57) 摘要本发明提供了土壤和水体的重金属污染修复的组合物，即重金属固化剂，其包含聚谷氨酸和硫代三聚氰酸，其中聚谷氨酸优选是能基因工程表达的聚谷氨酸，可以用于固化诸如水体、土壤中的重金属。本发明还提供了涉及该重金属固化剂的固化方法以及制备中间体等。(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书6页序列表3页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书6页序列表3页(10)申请公布号 CN 103160283 ACN 103160283 A1/1页21.重金属固化剂。
3、，其包含聚谷氨酸和硫代三聚氰酸，优选其中，聚谷氨酸和硫代三聚氰酸的重量比是1100：0.550，优选是250：125，更优选是520：2.510，最优选是10：5。2.权利要求1所述的重金属固化剂，其pH为48，优选为57，更优选为5.56.5，最优选为6。3.权利要求1或2所述的重金属固化剂，其中聚谷氨酸是能基因工程表达的聚谷氨酸，优选是序列如SEQ ID No：1所示的多肽或其变体。4.权利要求3所述的重金属固化剂，其中序列如SEQ ID No：1所示的多肽或其变体是由核苷酸序列如SEQ ID No：2所示的基因在酵母中表达而得的上清液提供的。5.权利要求1或2所述的重金属固化剂，其中聚谷。
4、氨酸是-聚谷氨酸。6.聚谷氨酸和硫代三聚氰酸联合在制备重金属固化剂中的应用。7.权利要求15之任一所述的重金属固化剂在固化重金属中的应用。8.能用于重金属固化的多肽或其变体，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，所述变体的氨基酸序列是对SEQ ID No:1缺失、添加和取代一个或几个氨基酸残基而获得的保留SEQ ID No:1固化重金属活性的序列。9.编码权利要求8所述的多肽或其变体的基因，优选其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。10.获得包含权利要求8所述的多肽或其变体的上清液的方法，其包括在发酵条件下培养分泌表达菌（如，酵母），过滤后保留上清液，任选对上清液进行浓缩和/或。
5、干燥，优选其中分泌表达菌（如，酵母）包含权利要求9所述的基因，或者用包含权利要求9所述的基因的载体（如，大肠杆菌-酵母穿梭载体）转化或者转染。权 利 要 求 书CN 103160283 A1/6页3土壤和水体的重金属污染修复的组合物及其应用技术领域0001 本发明属于土壤或水体废弃物处理领域，具体而言，本发明涉及含聚谷氨酸和硫代三聚氰酸的土壤和水体的重金属污染修复的组合物（重金属固化剂）及其应用等。背景技术0002 重金属污染随着矿业的发展，正日趋严重。重金属一般通过雨水或流水的溶解进入土壤和水体中，从而危害人们的生活和健康。0003 -聚谷氨酸很早就被发现具有絮凝重金属的效果，因而被用于作为。
6、去除水体中重金属污染。例如，中国专利200610057085、200710132375、200710132376和200710187463记载了用-聚谷氨酸沉淀去除各类重金属的策略，尤其是其中中国专利200710187463还特别认为-聚谷氨酸在弱碱性条件下去除重金属的效果好，“而在接近中性的条件下，对重金属离子的脱除效果弱，无法有效去除水体中的金属离子”。这被本发明人发现是误导性的偏见。0004 另外，中国专利200910154321公开了能够通过基因工程表达生产的聚（L-谷氨酸）的类似多肽，也能够起到结合并沉淀重金属的效果。然而，本发明人发现，该多肽的结构虽然在原核生物中表达量很高，但是原。
7、核生物通常是胞内表达，需要繁杂的后续纯化工作，这对于低成本、大用量的重金属固化来说是难以实行的；而该多肽在真核细胞（如，酵母）中进行封闭表达，表达量却只有0.51.5g/L，这可能是该多肽的等电点太低造成的。0005 以上聚谷氨酸产品制成凝胶膜，对含有重金属离子的污染水体进行过滤或吸附工作，一般没有什么问题，因为最后会收集掉结合了重金属的凝胶进一步处理。然而本发明在长期研究和实践中发现，在现实中，尤其是在大面积水体、土壤和突发的污染事件中，都是将重金属离子的结合剂往水体中一抛洒就结束，根本就没有、也往往无力回收结合了重金属的物质。这对于可生物降解（酶降解）的聚谷氨酸来说是很严重的问题，因为自然。
8、环境中的微生物可以降解掉聚谷氨酸，从而重新溶出重金属。0006 为此，经本发明人长期研究和实验发现，使用少量的硫代三聚氰酸能够显著地增强聚谷氨酸的结合重金属离子的能力，而且形成的重金属结合物稳定，基本不会受生物降解（酶降解）的影响。另外，本发明人还改造了聚谷氨酸类似物的多肽结构，不但增加了结合重金属离子的能力，更使之适合在酵母等真核细胞中大量分泌表达，只需简单地进行固液分离即可获得富含该多肽的上清液而直接使用。发明内容0007 本发明要解决的技术问题在于提供新的重金属固化剂，其中的成分组合能够协同增强其重金属固化的效果，而且其中优选的能基因工程表达的聚谷氨酸本身不但增加了结合重金属离子的能力，。
9、而且适合在酵母中大量分泌表达。另外，本发明还提供了涉及该重金属固化剂的固化方法以及制备中间体等。0008 具体而言，在第一方面，本发明提供了重金属固化剂，其包含聚谷氨酸和硫代三聚说 明 书CN 103160283 A2/6页4氰酸。在本中，重金属固化剂，指的是能够结合水体中、土壤中重金属离子，从而有助于通过过滤和/或离心等简单水处理步骤将结合的重金属离子从水体中去除的试剂，或者有助于结合的重金属离子固化在土壤中而不易重新溶解出来或者溶解出来的速度减小的试剂。在有些文献中，重金属固化剂从表述上也可以称为重金属结合剂、重金属螯合剂或重金属污染修复的组合物。0009 其中，硫代三聚氰酸，也称三聚硫氰。
10、酸或三巯基均三嗪，具有如式I所示的结构，常作为硫化剂而用于电池等生产中。0010 式I聚谷氨酸和硫代三聚氰酸的重量比优选是能够有协同起效效果的配比。优选在本发明第一方面的固化剂中，聚谷氨酸和硫代三聚氰酸的重量比是1100：0.550，例如优选是250：125，更优选是520：2.510，最优选是10：5。0011 本发明第一方面的固化剂在接近中性的水体里和/或土壤中能够结合重金属。因此优选本发明第一方面的固化剂的pH为48，例如优选为57，更优选为5.56.5，最优选为6。为了使得固化剂达到相应的pH值，可以在本发明第一方面的固化剂中，可以进一步pH调节剂，如酸或碱，优选是碱，如碱金属或碱土金。
11、属的氢氧化物和/或碱金属或碱土金属的碳酸盐等，更优选是氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙和/或碳酸钠等。0012 本发明第一方面的固化剂还可以包括溶剂，从而作为上述聚谷氨酸、硫代三聚氰酸和/或pH调节剂的载体。常用的溶剂是水。所以，优选本发明第一方面的固化剂包括聚谷氨酸、硫代三聚氰酸、pH调节剂（如，碱金属或碱土金属的氢氧化物等）和水，更优选本发明第一方面的固化剂由聚谷氨酸、硫代三聚氰酸、pH调节剂（如，碱金属或碱土金属的氢氧化物等）和水组成。当然，不包括容积的固化剂也是本发明第一方面所优选的。此时，本发明第一方面的固化剂由聚谷氨酸、硫代三聚氰酸和pH调节剂（如，碱金属或碱土金属的氢氧化物等）组成。。
12、0013 在本文中，聚谷氨酸可以是-聚谷氨酸。这类聚谷氨酸有许多已经商用化，可以在市场上购买。更优选聚谷氨酸是能基因工程表达的聚谷氨酸，在本文中，其也被称为聚谷氨酸类似物多肽，其保持（甚至加强）了聚谷氨酸的固化重金属的性能，而且能通过基因工程表达获得。本发明人研究获得了适宜在酵母等真核细胞中分泌表达的聚谷氨酸类似物多肽，方便了下游纯化过程，仅需要简单的固液分离保留上清液或其冻干粉即可。因此优选在本发明第一方面的固化剂中，聚谷氨酸是能基因工程表达的聚谷氨酸，而且其是氨基酸序列如SEQ ID No：1所示的多肽或其变体。即，本发明第一方面的固化剂包含氨基酸序列如SEQ ID No：1所示的多肽或其。
13、变体和硫代三聚氰酸。0014 在本文中，聚谷氨酸类似物多肽的变体的氨基酸序列是对SEQ ID No:1缺失、添加和取代一个或几个（优选不超过7个，更优选不超过5个，如不超过3个）氨基酸残基而获得的保留SEQ ID No:1的固化重金属活性的序列。本领域技术人员通过重组DNA技术，能够制备出经缺失、添加和/或取代氨基酸残基而获得的变体。说 明 书CN 103160283 A3/6页50015 本领域技术人员可以根据多肽的氨基酸序列推导出其编码的核苷酸序列，优选是密码子优化的核苷酸序列。在本发明的具体实施方式中，聚谷氨酸类似物多肽是由如SEQ ID No:2所示的核苷酸序列编码的。0016 更优选。
14、在本发明第一方面的固化剂中，聚谷氨酸类似物多肽是由核苷酸序列如SEQ ID No：2所示的基因在酵母中表达而得的上清液提供的。即，本发明第一方面的固化剂包含由核苷酸序列如SEQ ID No：2所示的基因在酵母中表达而得的上清液体或其冻干粉和硫代三聚氰酸。0017 多核苷酸可以通过各种本领域技术人员所熟知的方式被导入菌中，使该菌表达所述多核苷酸编码的蛋白。所述多核苷酸可以直接被导入，例如利用微粒体、基因枪等导入细胞；也可以间接被导入，例如可以通过构建在质粒载体上导入细胞。导入的所述多核苷酸可以整合在细胞的基因组上表达，也可以游离表达。优选本发明中，编码蛋白的多核苷酸可以利用穿梭质粒导入菌中，如聚。
15、谷氨酸类似物多肽的多核苷酸可以利用大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒导入分泌表达菌（如毕氏酵母）中，其表达的上清液中含有氨基酸序列如SEQ ID No：1所示的聚谷氨酸类似物多肽。0018 在第二方面，本发明提供了聚谷氨酸和硫代三聚氰酸联合在制备重金属固化剂中的应用。聚谷氨酸和硫代三聚氰酸的联合应用能够对重金属固化效果起到协同增效效果，即比两者分别使用的简单叠加效果要优秀，尤其是对存在较高浓度的重金属离子的水体、土壤来说。优选其中重金属固化剂是本发明第一方面的固化剂。0019 在第三方面，本发明提供了本发明第一方面的重金属固化剂在固化重金属中的应用。在本文中，（重金属的）固化指的是能够通过结合含水物体（。
16、如水体或土壤）中重金属离子，从而有助于通过过滤和/或离心等简单水处理步骤将结合的重金属离子从水体中去除的过程，或者有助于结合的重金属离子固化在土壤中而不易重新溶解出来或者溶解出来的速度减小的过程。优选本发明第三方面的应用是本发明第一方面的重金属固化剂在固化土壤或含水土壤中的重金属的应用；也优选本发明第三方面的应用是本发明第一方面的重金属固化剂在固化水体中的重金属的应用。在本文中，重金属根据上下文语境，通常指的是重金属离子，如可以是镍、镉、铅、锌、汞或铜等的重金属离子，优选是铅离子。0020 在第四方面，本发明提供了能用于重金属固化的多肽或其变体，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。
17、，所述变体的氨基酸序列是对SEQ ID No:1缺失、添加和取代一个或几个（优选不超过7个，更优选不超过5个，如不超过3个）氨基酸残基而获得的保留SEQ ID No:1固化重金属活性的序列。0021 在第五方面，本发明提供了编码本发明第四方面的多肽或其变体的基因，优选其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。0022 在第六方面，本发明提供了包含本发明第五方面的基因的载体，优选是大肠杆菌-酵母穿梭载体。0023 在第七方面，本发明提供了菌种，尤其是分泌表达菌（如，酵母），其包含第五方面的基因，或用第六方面的载体转化或者转染。0024 在第八方面，本发明提供了获得包含本发明第四方面的多肽或其变体。
18、的上清液的方法，其包括在发酵条件下培养本发明第七方面的菌种，过滤后保留上清液，任选对上清液进行浓缩和/或干燥。说 明 书CN 103160283 A4/6页60025 在第九方面，本发明提供了本发明第八方面的方法获得的上清液在制备重金属固化剂中的应用，优选在制备本发明第一方面的固化剂中的应用。0026 本发明具有以下有益效果：本发明的固化剂能够协同起效地结合重金属离子，而且形成的重金属结合物稳定，基本不会受生物降解（酶降解）的影响；优选的聚谷氨酸类似物的多肽结构，能够比常规聚谷氨酸更显著地提高结合重金属离子的能力，并适合在酵母等真核细胞中大量分泌表达，只需简单地进行固液分离即可获得富含该多肽的。
19、上清液而直接使用，因此生产成本低、步骤简便，便于在实践中推广使用。0027 为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。0028 另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。0029 具体实施方式0030 以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂。
20、，可参见分子克隆实验指南（第3版）（科学出版社）、微生物学实验（第4版）（高等教育出版社）以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。0031 实施例1 聚谷氨酸类似物的基因的表达构建体根据我们的设计，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成编码聚谷氨酸类似物多肽的基因，其核苷酸序列如序列表的SEQ ID No:2所示，所编码的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。然后，根据分子克隆实验指南以及所用商品化试剂的操作指南构建分泌表达的酵母，简而言之，即将编码该木聚糖酶的基因用正向引物如序列表的SEQ ID No: 3所示（引入了EcoR I内切酶位点）、反向引物如序列表的SEQ ID No:4所示（。
21、引入了Not I内切酶位点）扩增后用EcoR I和Not I双酶切，并与经这两个内切酶酶切的pPIC3.5质粒（可购自Invitrogen公司）用T4 DNA连接酶进行连接，转化入大肠杆菌DH5中。挑出阳性克隆，抽提出其中的质粒，经测序验证正确后，将阳性质粒用Sal I酶切线性化后，通过电转化法转化入毕氏酵母GS115株，在含G418的平板上挑出阳性酵母转化株，寄回。0032 实施例2 聚谷氨酸类似物的表达将实施例1获得的阳性酵母转化株接种到50ml BMGY液体培养基（100mM磷酸钾缓冲液（pH6.0），其中含1%酵母提取物、2%蛋白胨，酵母含氮碱基1.34%，生物素4*10-5%，葡萄糖。
22、2%，甘油1%）中，于30、200rpm培养至OD600达到5.0。0033 将上述培养物转接到1L BMGY液体培养基中，于30、200rpm培养24小时，加入5ml甲醇，然后继续于30、200rpm培养8天，期间每24小时补加5ml甲醇，通气控制溶氧说 明 书CN 103160283 A5/6页7（DO）大于20%，并控制pH为6.0（用氨水调节）。培养完成后，用0.22m滤膜过滤并保留上清液，该上清液经SDS-PAGE检测其中对应15kDa的聚谷氨酸类似物，其表量达到15g/L。可以直接使用，也可以直接冷冻干燥后在使用时用水重溶。0034 实施例3 聚谷氨酸/聚谷氨酸类似物和硫代三聚氰酸。
23、的重金属固化试验分别取实施例2制备的聚谷氨酸类似物，溶于水中，加入硫代三聚氰酸，再加入NaOH溶液调节pH至6.0，配制成含0.010（W/V（g/mL）聚谷氨酸类似物、并含0.005（W/V（g/mL）硫代三聚氰酸的溶液（溶液A）；同样，以-聚谷氨酸（可购自南京轩凯生物科技有限公司）为原料，配制成pH6.0的含0.010（W/V（g/mL）-聚谷氨酸、并含0.005（W/V（g/mL）硫代三聚氰酸的溶液（溶液B）。另外，分别配制pH6.0的0.010（W/ V（g/mL）聚谷氨酸类似物溶液（溶液C1）、pH6.0的0.010（W/V（g/mL）-聚谷氨酸溶液（溶液C2）、pH6.0的0.00。
24、5（W/V（g/mL）硫代三聚氰酸溶液（溶液C3）作为对照。0035 分别取Pb(NO3)2溶于水中配制成0.30、0.50、1.0和1.50mmol/L的Pb(NO3)2溶液，各取15ml分别与25ml 0.016(w/v)的溶液A、B、C1、C2、C3混合，然以10的NaOH溶液调整pH至pH 6.0，加去离子水定容至50ml。静置120分钟固化完全，然后分别取一半溶液以10000rpm离心15分钟，取上清液通过能截留分子量为3000Da的超滤膜进行超滤；另一半溶液分别加入木瓜蛋白酶，使酶量达到1U/mL，于37温箱内静置24小时，用过量的蛋白酶来模拟自然条件下长时间的生物（酶）降解，之后。
25、也以10000rpm离心15分钟，取上清液通过能截留分子量为3000Da的超滤膜进行超滤。质谱检测滤过液中的Pb含量，结果如表1所示。0036 结果表明，本发明的聚谷氨酸类似物固化Pb等重金属离子的能力最强，强于-聚谷氨酸可能的原因是其中碱性氨基酸也能进行重金属结合，而且多肽一节结构折叠形成的口袋也能容纳重金属；-聚谷氨酸具有一定的固化Pb等重金属离子的能力，尽管有一定的蛋白酶耐受性，但是长期在自然条件下，固化效果一般；硫代三聚氰酸本身有一定的固化Pb等重金属离子的能力并且不受蛋白酶的影响，但是固化能力较弱，令人意想不到的是，其与聚谷氨酸（无论是聚谷氨酸类似物还是-聚谷氨酸）的联合使用，效果（。
26、尤其是针对高重金属浓度的效果）优于单独使用的叠加，该协同增效的原因可能是其固化的重金属颗粒更容易吸附或包裹在聚谷氨酸的形成的结合物上，而且重金属颗粒的吸附所带来的生物毒性（蛋白变性性能）也可能抑制了蛋白酶对聚谷氨酸的降解。0037 表1各种溶液处理前后水体（滤过液）中的Pb离子浓度（mmol/L）说 明 书CN 103160283 A6/6页8说 明 书CN 103160283 A1/3页9成都新朝阳作物科学有限公司土壤和水体的重金属污染修复的组合物及其应用中国申请4 PatentIn version 3.51115PRT人工序列1Met Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu。
27、 Glu His Glu His His Glu Glu Glu1 5 10 15 Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Lys Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu20 25 30 Glu Arg Glu Arg Arg Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Lys35 40 45 Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu His Glu His His Glu Glu Glu50 55 60 Glu Glu Glu Glu Glu Arg Glu Arg Arg Glu Gl。
28、u Glu Glu Glu Glu Glu65 70 75 80 Glu Arg Glu Arg Arg Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu His Glu His序 列 表CN 103160283 A2/3页1085 90 95 His Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Lys Lys Glu Glu Glu100 105 110 Thr Gly Ala1152348DNA人工序列2atggaagaag aagaagaaga agaagaacat gaacatcatg aagaagaaga agaagaagaa 60g。
29、aaaaagaaa aaaaagaaga agaagaagaa gaagaagaac gcgaacgccg cgaagaagaa 120gaagaagaag aagaaaaaga aaaaaaagaa gaagaagaag aagaagaaga acatgaacat 180catgaagaag aagaagaaga agaagaacgc gaacgccgcg aagaagaaga agaagaagaa 240gaacgcgaac gccgcgaaga agaagaagaa gaagaagaac atgaacatca tgaagaagaa 300gaagaagaag aagaaaaaga aaaaaaagaa gaagaaaccg gcgcgtaa 348321DNA人工序列3cgaattcgat ggaagaagaa g 21序 列 表CN 103160283 A10。