一种治疗出血病的药物组合及其用途 【技术领域】
本发明属于药物技术领域,具体的说,涉及一种治疗出血病症的药物组合物及其在制备各种出血病症药物中的应用。
背景技术
出血,是平时和战时涉及临床各科常见急症之一。创伤、手术或某些疾病的并发症导致的出血,可以引起有效血循环量减少、组织灌流不足、细胞缺氧、代谢障碍及重要脏器功能损害,从而造成休克。一个成年人如果急性出血超过血容量的15%(约800ml),就会引起休克;而心脏损伤或胸内大血管损伤引发的出血,则可能立即威胁生命;内脏器官病变造成的出血,如上消化道出血和下消化道出血等,是较难处理的临床症状。
由于出血的原因和凝血、止血的机制十分复杂,因此对凝血、止血的研究,一直是医药工作者的重要课题之一。
血液系统包含着凝血和抗凝两个方面,两者间的动态平衡是正常机体维持体内血液流动状态和防止血液丢失的关键。正常人体出血后通常会迅速启动凝血机制,凝血是血液由液体状态转为凝胶状态的过程,它是止血功能的重要组成部分。人们很早就注意到血液流出血管后即迅速凝固的现象,而对这一现象发生机制地认识是一个经历数百年而逐步深入的过程。现代凝血理论认为凝血是由系列凝血因子参与的复杂的生理过程。
近年来,随着研究的进一步深入,凝血理论又得到不断的发展和完善。尤其分子生物学技术的应用使多种凝血因子和凝血过程的多个环节在分子水平上得到阐述。即便如此,迄今机体内正常的凝血过程尚未完全弄清。
出血后的止血方法和止血药物也是临床研究的重点。常见的止血手段有手术治疗和非手术治疗。手术治疗一般是在出血较为严重难以控制的情况下采用。非手术治疗包括药物治疗(如注射止血药物、血管收缩药物等)、机械治疗(如使用止血夹、止血圈等)、物理治疗(如电凝法、热疗法、微波法等)。
药物治疗是临床常用的非手术治疗手段,止血药的种类也较多。有血管收缩药如垂体后叶素、麻黄素,降低血管壁脆性和通透性的药物如路丁、止血敏、肾上腺皮质激素,凝血类药物如凝血酶、纤维蛋白海绵,促血小板生成药如血小板生成素(TPO),以及其它类型的止血药。
当前对止血机理研究的许多方面已进入分子生物化学阶段,并以凝血、止血机理为基础,研制出大量动、植物及人工合成的止血剂,但在实际应用中仍不能满足临床要求,因此研制一种高效、低毒的止血剂,起到减少出血量、快速及时挽救患者生命,仍是急需研究与开发的目标,具有显著的社会效益和广泛的市场前景。
迄今为止,我国现有技术中已经报道过少量三七素作为止血药物,如公开号为CN1292376A的专利申请中介绍(见说明书第1页),少量三七素能达到止血效果,但同时指出了稍微过量的三七素的使用即会产生神经毒作用,以及三七素在水中溶解度小不利于治疗过程中的溶出等问题,均没有任何解决的办法。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种治疗出血病的药物组合物,其中含有有效量式(I)化合物即三七素钠盐或钾盐与其药用载体和/或赋形剂,提供药物组合物在制备治疗各种出血病症的药物中的应用,其中三七素钠盐或钾盐在克服了以上使用量小、易产生毒副作用以及在水中溶解性差的缺陷的同时,使止血作用达到更好的效果。
为了实现上述目标,本发明提供了如下的技术方案:
用于治疗各种出血病的药物组合物,其中含有治疗各种出血的有效量式(I)化合物即三七素钠/钾盐及其可药用载体和/或赋形剂。
R=H、Na或K
(I)
本发明式(I)化合物用作药物时,可以直接使用,或者以药物组合物的形式使用。药物组合含有0.1-99.9%,优选20.0-99.9%的式(I)化合物或含有该化合物的有效成分,其余为药物学上可以接受的,对人体无害和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅料。将所述的药物组合以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物组合物可经口服和注射(静注、肌注)、外用等多种形式给药。
口服可服用其固体或液体制剂,如片剂、散剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、颗粒剂、糖浆剂、口服溶液剂、混悬剂、乳剂以各种缓释、控释制剂等。
注射制剂可用其固体或液体制剂,如粉针剂或冻干粉针剂、溶液型注射剂等。
外用制剂可以是贴剂、膏剂、搽剂、气雾剂和喷雾剂、栓剂、外用散剂、凝胶剂等多种剂型。
为了更好的说明本发明的本质,下面将本发明的式(I)化合物及其可药用载体或赋形剂组成的药物组合物的药理作用结果来说明它在医药领域中的应用。
一、配制方法
取三七粉,加入80%乙醇渗漉,药渣加入水渗漉,渗漉液40℃下减压浓缩,加等量水饱和正丁醇萃取三次,收集水层。水层通过Sephadex-LH-20凝胶柱,用蒸馏水洗脱,收集茚三酮显阳性部分,减压浓缩,通过CM-Sephadex-C25离子交换树脂,蒸馏水洗脱,收集茚三酮显阳性部分,减压浓缩,低温放置过液,过滤结晶,用冰水洗涤,干燥,得三七素;
或者天冬酰氨加对甲苯磺酰氯,加入氧化镁溶液中,室温反应24小时,过滤,滤液加盐酸酸化至PH2-3,过滤,冰水洗涤,干燥,得化合物I,化合物I加入次溴酸钠溶液中,0℃以下反应5-10分钟,升温至80℃,反应15分钟,冷却,用盐酸酸化到PH为7,过滤,冰水洗涤,干燥,得化合物II,化合物II加入适量苯酚,加到HBr/HoAc溶液中,70℃密封反应8小时,冷却,过滤,乙醚洗涤,干燥。加适量水溶解,加乙醇,到含醇量66%,过滤,干燥,得化合物III,化合物III加入草酸单甲酯的钾盐,于50%甲醇溶液中反应24h,过滤,沉淀加入适量水溶解,用盐酸酸化到PH为2,过滤,冰水洗涤,干燥,得化合物IV,得到三七素;
将0.1g三七素+0.227g氢氧化钠+2ml水+7ml药用乙醇,得结晶粉末,使用时将粉末用蒸馏水稀释成不同浓度。由于三七素难溶于水,制成钠盐;
将0.1g三七素+0.325g氢氧化钾+2ml水+7ml药用乙醇,得结晶粉末,使用时将粉末用蒸馏水稀释成不同浓度。由于三七素难溶于水,制成钾盐;
生成的三七素钠/钾盐的溶解性增加,可以溶解的样品量增加,治疗过程中药物溶出度得到显著增大,药效得到显著提高。同时在制备三七素盐的过程中研究试验表明,只有钠盐和钾盐的溶解度能达到最大。
二、溶解性对比试验
三七素与三七素钠(钾)溶解试验结果 样品 样品量(mg) 溶剂结果 三七素 100 注射用水依次加1ml、2ml、5ml均不溶、50ml微溶 100 聚乙二醇1ml、2ml、5ml、50ml均不溶 三七素钠 100 注射用水加入1ml部份溶解,2ml时全部溶解 100 聚乙二醇1ml、2ml、5ml均不溶、50ml微溶 三七素钾 100 注射用水加入1ml部份溶解,2ml时全部溶解 100 聚乙二醇1ml、2ml、5ml均不溶、50ml微溶
三七素钠盐的药理作用
一、三七素钠盐对家兔肝脏实质器官出血的影响
1、预防作用:健康家兔,雌雄各半,体重2-2.5kg,随机分为5组,每组6只,即(分为)生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钠盐组、立止血0.5KU/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量)。手术前禁食(不禁水)12h,兔以30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,上腹部去毛,碘酒、酒精消毒手术局部,打开腹腔,轻轻拉出肝脏,用纱布固定。上述组分均经家兔耳缘静脉以2mL/kg注射给药,静注后30min,用手术刀切下一块肝组织,创面长2cm、宽1cm、高0.5cm,且创面出血至少有一个以上的小动脉呈喷射状出血。立即用秒表计时,记录各组动物肝脏出血时间(以s表示)(自切下肝组织到创口不再出血、渗血为止),同时用中性滤纸垫于出血部位下,称量所用滤纸在出血前后的重量,重量差值代表出血量(以g表示)。以组间t检验比较在不用其它外科止血措施的条件下出血时间的长短和出血量的多少。
结果表明,静脉注射后,25和50mg/kg的三七素钠盐明显缩短家兔肝脏出血时间并减少出血量,12.5mg/kg的三七素钠盐、三七素组对肝脏出血时间和出血量均无显著影响(P>0.05与生理盐水组比较);50mg/kg的三七素钠盐对该两项指标的作用强度与0 5KU/kg的立止血相当(P>0.05)。
2、治疗作用:健康家兔,雌雄各半,体重2-2.5kg,随机分为5组,每组6只,即生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钠盐组、立止血0.5KU/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量)。手术前禁食(不禁水)12h,兔以30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,上腹部去毛,碘酒、酒精消毒手术局部,打开腹腔,轻轻拉出肝脏,用纱布固定。用手术刀切下一块肝组织,创面长2cm、宽1cm、高0.5cm,且创面出血至少有一个以上的小动脉呈喷射状出血。立即经耳缘静脉以2mL/kg注射上述组分并及时用秒表计时,记录各组动物肝脏出血时间(秒)(自切下肝组织到创口不再出血、渗血为止),并同上记录出血量多少。所得数据亦同上行统计学处理。
结果显示,肝脏出血并立即注射药物后,12.5mg/kg的三七素钠盐和15mg/kg三七素,明显减少肝脏出血量,对出血时间无影响;25和50mg/kg的三七素钠盐均显著缩短出血时间同时减少肝脏出血量;三七素钠盐50mg/kg组的出血时间略长于立止血组,但无统计学差异,对出血量的影响,50mg/kg的三七素钠盐与立止血相当。
二、三七素钠盐对公鸡鸡冠出血的影响
1、预防作用:取1.5-2kg的公鸡,随机分成5组,每组4只,即(分为)生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钠盐组、立止血0.5KU/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量)。生理盐水清洁鸡冠后,上述组分均经公鸡翼下静脉注射(2mL/kg体重),30 min后用眼科剪于鸡冠前端处剪一0.3cm长的创口,并立即用秒表计时,观察并记录各组鸡冠出血时间的长短(s),行组间t检验统计学处理。
结果表明,静脉注射后,15mg/kg三七素、25和50mg/kg的三七素钠盐均显著减少公鸡鸡冠的出血时间,50mg/kg三七素钠盐的作用强度相当于0.5KU/kg的立止血(P>0.05与立止血组比较)。
2、治疗作用:取1.5-2kg的公鸡,随机分成5组,每组4只,即生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钠盐组、立止血0.5kU/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量)。生理盐水清洁鸡冠后,用眼科剪于鸡冠前端处剪一0.3cm长的创口,立即经公鸡翼下静脉注射上述组分并及时用秒表计时,观察并记录各组鸡冠出血时间的长短(s),行组间t检验统计学处理。
结果表明,鸡冠出血并注射药物后,15mg/kg三七素、25和50mg/kg的三七素钠盐均显著缩短公鸡鸡冠的出血时间,50mg/kg三七素钠盐的作用强度与0.5KU/kg的立止血相当(P>0.05与立止血组比较)。
三、三七素钠盐对大鼠胃出血的影响
1、预防作用:健康SD大鼠,雌雄各半,体重180-220g,随机分为5组,每组10只,即生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钠盐组、立止血0.5KU/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量)。手术前禁食(不禁水)12h,以30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,上腹部去毛,碘酒、酒精消毒手术局部,打开腹腔,暴露胃部,沿胃大弯剪开,清除胃内容物后,用无菌棉球揩净。上述组分均经大鼠股静脉以1mL/100g体重注射给药,静注后30min,用小号活检钳钳取胃体粘膜一块,形成急性胃出血病灶模型。立即用秒表记录大鼠胃粘膜出血时间(秒)。
结果显示,先注射药物后,15mg/kg三七素、12.5mg/kg的三七素钠盐无明显作用,25和50mg/kg的三七素钠盐显著缩短大鼠胃出血时间,50mg/kg三七素钠盐组的胃出血时间略长于立止血组的,但无统计学意义(P>0.05与立止血组比较)。
2、治疗作用:健康SD大鼠,雌雄各半,体重180-220g,随机分为5组,每组10只,即生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钠盐组、立止血0.5KU/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量)。手术前禁食(不禁水)12h,以30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,上腹部去毛,碘酒、酒精消毒手术局部,打开腹腔,暴露胃部,沿胃大弯剪开,清除胃内容物后,用无菌棉球揩净。用小号活检钳钳取胃体粘膜一块,形成急性胃出血病灶模型,立即大鼠股静脉注射上述组分,同时用秒表记录大鼠胃粘膜出血时间(秒)。
胃出血后,立即注射给药,15mg/kg三七素、12.5mg/kg的三七素钠盐无明显作用,25和50mg/kg的三七素钠盐明显缩短大鼠胃出血时间,12.5mg/kg的三七素钠盐则无明显影响;50mg/kg三七素钠盐组的胃出血时间略长于立止血组的,但无统计学意义(P>0.05与立止血组比较)。
四、三七素钠盐对大鼠肠系膜动脉出血的影响
1、预防作用:雄性SD大鼠,体重180-220g,随机分为5组,每组10只,即生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钠盐组、立止血0.5KU/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量)。以30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,上腹部去毛,碘酒、酒精消毒手术局部,上述各组分均经股静脉以1mL/100g体重注射,然后打开腹腔,提出十二指肠上端的肠系膜于一盛有37℃台氏液的塑料盘上,给药30min后用25号针穿刺一根小动脉,低倍镜下观察并记录肠系膜动脉的出血时间(从针刺出血至止血为止)。
实验结果表明,给药30min后再穿刺肠系膜动脉,15mg/kg三七素、12.5和25mg/kg的三七素钠盐对大鼠肠系膜动脉的出血时间均无明显影响;50mg/kg的三七素钠盐显著缩短出血时间,但其出血时间明显长于立止血组(P<0.05与立止血组比较)。
2、治疗作用:雄性SD大鼠,体重180-220g,随机分为5组,每组10只,即生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钠盐组、立止血0.5KU/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量)。以30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,上腹部去毛,碘酒、酒精消毒手术局部,打开腹腔,提出十二指肠上端的肠系膜于一盛有37℃台氏液的塑料盘上。用25号针穿刺一根小动脉,立即股静脉注射给药,同上观察并记录出血时间(从针刺出血至止血为止)。
穿刺肠系膜动脉并立即注射药物后,15mg/kg三七素、三七素钠盐在12.5mg/kg剂量下对出血时间无明显影响;25和50mg/kg时,三七素钠盐显著缩短肠系膜动脉的出血时间,且50mg/kg三七素钠盐的作用强度与立止血相当。
五、三七素钠盐对大鼠股动脉出血的影响
1、预防作用:健康SD大鼠,雌雄各半,体重180-220g,随机分为5组,每组10只,即生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钠盐组、立止血0.5KU/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解解量)。手术前禁食(不禁水)12h,以30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,并固定于手术台上。手术前30min,经股静脉注射上述组分。腹股沟部去毛,用碘酒和酒精棉球消毒,分离股动脉,做一占横向直径1/3的切口。立即用秒表记录股动脉出血时间(s);以出血40min为记录终点,用中性滤纸在出血前后的重量差值作为出血量(g)。t检验进行组间统计学处理。
结果表明,50mg/kg的三七素钠盐和0.5KU/kg的立止血均明显减少大鼠股动脉的出血时间和出血量,15mg/kg三七素、12.5和25mg/kg的三七素钠盐对股动脉的出血时间及其出血量均无明显影响。
2、治疗作用:健康SD大鼠,雌雄各半,体重180-220g,随机分为5组,每组10只,即生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钠盐组、立止血0.5KU/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量)。手术前禁食(不禁水)12h,以30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,并固定于手术台上。腹股沟部去毛,用碘酒和酒精棉球消毒,分离股动脉,做一占横向直径1/3的切口,并立即股静脉注射给药。同时用秒表记录股动脉出血时间(s);以出血40min为记录终点,用中性滤纸在出血前后的重量差值作为出血量(g)。t检验行组间统计学处理。
结果说明,50mg/kg的三七素钠盐有缩短出血时间的趋势,三种剂量的三七素钠盐和三七素组对出血时间无明显影响;立止血显著缩短出血时间,减少股动脉出血量。
六、三七素钠盐对小鼠尾尖出血时间的影响
雄性ICR小鼠(18~22g)分为5组,每组10只,即生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钠盐组、0.5KU/kg的立止血组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量)。各组动物于尾静脉1次性注射上述组分,30min后距尾尖0.5cm处横切。前1min内每30s用中性滤纸轻擦尾尖1次,1min后则每10s用滤纸轻擦尾尖1次。从横断尾尖至滤纸未见血迹的时间为小鼠尾尖出血时间(s)。
结果显示,三七素有缩短家兔全血出血凝血时间的趋势,三七素钠盐呈剂量相关性明显缩短小鼠尾尖出血时间;50mg/kg的三七素钠盐缩短出血时间作用明显弱于立止血(P<0.05与立止血组比较)。
七、三七素钠盐对家兔全血凝血时间的影响(试管法)
健康家兔,雌雄均用,随机分5组,每组5只,即生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钠盐组、50mg/kg止血芳酸组,15mg/kg三七素,上述药物均从耳缘静脉以2mL/kg体重注射给药。给药前及注毕后30和60min,分别自家兔耳缘静脉取血1mL,轻轻沿试管壁放入试管内。当血液吸进注射器即开始用秒表记录时间,每隔30s轻轻倾斜试管1次,角度约30度,观察血液是否流动,直至试管倾斜到90度而血液不再流动且完全凝固为止,停止计时,该段时间即为全血凝血时间。数据以t检验进行组间统计学处理。以测定药物对凝血功能及其内源性凝血途径的影响。
结果表明,三七素组和三七素钠盐静脉注射后呈剂量相关性明显减少家兔全血凝血时间,可持续至60min。
三七素钠盐的止血作用机制探讨
一、对白陶土部份凝血活酶时间(kaolin partial thromboplastin time,KPTT)和凝血酶原时间(prothrombin time,PT)的影响
健康家兔,体重2-2.5kg,雌雄各半,随机分为生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钠盐组和Vit K1 10mg/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量),每组4只,动物均从耳缘静脉注射给药。给药前及注毕后30和60min,分别自家兔颈动脉取血,3.8%枸橼酸钠抗凝(血与抗凝剂的体积比为9∶1),经3000rpm离心10min得贫血小板血浆(platelet poor plasma,PPP)。采用KPTT和PT试剂盒检测药物对内、外源性凝血系统的影响。
结果显示,三七素和三七素钠盐静脉注射后30和60min对KPTT及PT均无明显影响。
二、对凝血酶时间(thrombin time,TT)的影响
健康家兔,体重2-2.5kg,雌雄各半,随机分为生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钠盐组和Vit K1 10mg/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量),每组4只,动物均从耳缘静脉注射给药。给药前及注毕后30和60min,分别自家兔颈动脉取血,3.8%枸橼酸钠抗凝(9∶1),经3000rpm离心10min得PPP。采用凝血酶试剂盒检测药物对TT的影响,以判定药物对凝血系统的影响。
结果表明,三七素和三七素钠盐(12.5-50mg/kg)静脉注射后对TT均无明显影响;10mg/kg的Vit K1与静注后30min可明显缩短TT。
三、对纤维蛋白溶解活性的影响(优球蛋白溶解法)
健康家兔,体重2-2.5kg,雌雄各半,随机分为生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钠盐组和止血芳酸50mg/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量),每组4只,动物均从耳缘静脉注射给药。给药前及注毕后30和60min,自家兔颈动脉取血于硅化的离心管中,3.8%枸橼酸钠抗凝(9∶1),4℃下经3000rpm离心10min得PPP,冰水浴保存待用。取0.5mL PPP加至预先冷却并含有9mL蒸馏水的锥形离心管中,再加入1%乙酸溶液0.1mL,混匀后置4℃冰箱内静置15min,优球蛋白呈絮状沉淀析出,3000rpm离心5min以分离沉淀。弃上清液,保留沉淀部分,将离心管倒置在滤纸上约2min,吸尽剩余酸液,再将离心管置37℃的摇床内,加0.5mL pH9.0的硼酸-硼砂钠缓冲液(将优球蛋白部分溶解),并用玻棒轻搅,使沉淀溶解,再加原始浓度为25mmol/L的CaCl2溶液混匀(纤维蛋白凝块形成)。管内液体开始凝固。记录从凝块开始形成至凝块完全溶解的时间,即为优球蛋白溶解时间(euglobulin lysis time,ELT)(单位:min)。
实验结果显示,三七素和12.5mg/kg的三七素钠盐于给药后30min有延长ELT趋势,但无统计学意义;25和50mg/kg的三七素钠盐静脉注射后30和60min均明显延长ELT。
四、对血小板数目及其聚集功能的影响
健康家兔,体重2-2.5kg,雌雄均用,随机分为生理盐组、12.5、25、50mg/kg的三七素钠盐组、立止血0.5KU/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量),每组5只,动物均从耳缘静脉注射给药。给药前及注毕后30和60min,分别自家兔颈动脉取血,以3.8%枸橼酸钠抗凝收集于塑料离心管中,血与抗凝剂体积比为9∶1。分别经1000和3000rpm离心10min得富血小板血浆(PRP)和PPP。按文献方法[18]计数血小板数目,Born比浊法,记录5min内血小板聚集的最大聚集率。观察三七素钠盐在体内对血小板聚集自发聚集功能和对ADP(3μmol/L的终浓度)诱导血小板聚集功能的影响。
结果表明,三七素组和三种剂量的三七素钠盐和0.5KU/kg的立止血静脉注射后对血小板数目均无明显影响(表20)。三七素组和三七素钠盐(12.5-50mg/kg)和立止血对家兔血小板自发性聚集亦无明显作用(表21);立止血静注后30和60min明显抑制ADP诱导的血小板聚集功能,50mg/kg的三七素钠盐静注后对ADP引起的血小板聚集具协同作用趋势(P>0.05与生理盐水组比较)。
五、对D-二聚体(D-dimer)水平的影响
健康家兔,体重2-2.5kg,雌雄各半,随机分为生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钠盐组和止血芳酸50mg/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量),每组4只,动物均从耳缘静脉注射给药。给药前及注毕后30和60min,分别自家兔颈动脉取血,3.8%枸橼酸钠抗凝(9∶1),经3000rpm离心10min得PPP。
用酶联免疫吸附(ELISA)方法测定药物对D-二聚体含量的影响,可间接反映药物对机体凝血状态和纤溶活力的作用。
结果显示,三七素组和12.5-50mg/kg的三七素钠盐静脉注射后对血浆D-二聚体的水平均无明显影响;50mg/kg的止血芳酸仅于静注后60min表现出升高D-二聚体水平作用。
六、对血浆纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator,tPA)和纤溶酶原激活物抑制物(type-1 plasminogen activator inhibitor,PAI-1)水平的影响[21]
雄性家兔,体重2-2.5kg,随机分为生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钠盐组和20000U/kg的尿激酶组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量),每组4只,动物均从耳缘静脉注射给药。给药后30min,分别自家兔颈动脉取血,用含有EDTA(270mmol/L)、Na2CO3(1.9mmol/L)和PGE1(282mmol/L)的抗凝剂抗凝(血与抗凝剂体积比为9∶1)。于4℃ 3000rpm离心30min,得到PPP,于-40℃冻存。按试剂盒说明书,应用发色底物法于96孔酶标板上用全自动酶标仪(EL340,美国Bio-TekInstruments公司产品)测定血浆tPA和PAI-1的含量。
结果表明,静脉注射后30min,三七素组和三七素钠盐(12.5-50mg/kg)对血浆PAI-1含量均无影响;25和50mg/kg的三七素钠盐明显降低血浆tPA含量。尿激酶对tPA无显著作用,明显提高血浆PAI-1含量。
七、对血浆血小板α颗粒膜蛋白(α-granule membrane protein,GMP-140)表达的影响
健康家兔,体重2-2.5kg,雌雄各半,随机分为生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钠盐组和5mg/kg的花生四烯酸(arachidonic acid,AA)组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量),每组4只,动物均从耳缘静脉以2mL/kg体重注射给药。给药前及注毕后30和60min,分别自颈动脉取血,收集于盛有2%EDTA-Na2(含0.7%NaCl)抗凝剂的塑料离心管中(抗凝剂与全血的体积比为1∶9)。4℃ 3000rpm离心10min,血浆置-20℃保存。按试剂盒说明书采用双抗夹心免放于γ计数仪上测定三七素钠盐静脉注射对家兔血浆GMP-140水平的影响。
结果表明,50mg/kg的三七素钠盐和AA于静注后30及60min均显著升高GMP-140的水平;三七素钠盐在25mg/kg时于静注后60min明显增加血浆GMP-140水平;12.5mg/kg和15mg/kg的三七素无明显影响。
八、对血浆血栓素B2(thromboxane B2)和6-keto-prostaglandin F1α水平的影响
健康家兔,体重2-2.5kg,雌雄各半,随机分为生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钠盐组和10mg/kg的阿司匹林组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量),每组4只,动物均从耳缘静脉注射给药。给药前及注毕后30和60min,分别自颈动脉取血,以2%EDTA-Na2(含0.7%NaCl)抗凝(血与抗凝剂体积比为9∶1)。血液于4℃ 3000rpm离心10min得到PPP,-20℃保存待用。按试剂盒说明书操作,用放射免疫方法(γ计数)测定其cpm值,据标准曲线计算血浆TXB2和6-keto-PGF1α浓度(pg/mL)。
结果显示,15mg/kg的三七素和三种剂量的三七素钠盐静注后60min均提高血浆TXB2浓度,25mg/kg和50mg/kg的三七素钠盐给药后30min亦明显增加血浆6-keto-PGF1α水平;阿司匹林静注后30和60min均显著降低TXB2浓度,同时具有降低6-keto-PGF1α趋势,但无统计学意义(P>0.05与给药前比较)。
九、三七素钠盐对凝血酶激活的血小板与中性粒细胞之间粘附反应的影响(玫瑰花结试验)
洗涤血小板和中性粒细胞的制备:家兔颈动脉取血,以2.7%EDTA-Na2抗凝收集于塑料离心管中,血与抗凝剂体积比为9∶1。按照Hamburger方法分别制备洗涤血小板和中性粒细胞。血小板和中性粒细胞的数目分别控制在108cell/mL和2×106cell/mL左右,用胎盼兰排斥试验证实其成活率>95%。
改良Hamburger和Jungi等方法[24],即取50μL血小板与凝血酶(终浓度0.2U/mL)37℃温育15min,然后分别加入0.9%生理盐水或药液(三七素钠盐、15mg/kg的三七素或阿司匹林)各50μL,继续静置15min,再加入中性粒细胞悬液100μL,于4℃振荡30min。取出少许细胞悬液,在常规计数板上于40倍镜下随机计数100个中性粒细胞,其周围粘附有2个或2个以上血小板者为玫瑰花结试验阳性。每样本计数3次,取其均值,并计算花结形成百分率,以反映粘附率大小。
结果说明,三七素和三七素钠盐均表现为浓度相关性明显促进血小板与中性粒细胞之间的粘附作用;阿司匹林则显著抑制该两种细胞之间的粘附反应。
十、三七素钠盐对激活的中性粒细胞诱导洗涤血小板聚集功能的影响
上述中性粒细胞悬液中加入0.1%葡萄糖、1mmol/L CaCl2和1.3mmol/L MgCl2,用肉豆蔻佛波醇(fMLP)(终浓度2μmol/L)激活中性粒细胞10min。
将生理盐水或不同浓度待测药液与洗涤血小板悬液于37℃共同温育10min,然后加入激活的中性粒细胞悬液并按Bom比浊法记录5min内洗涤血小板的最大聚集率。
结果显示,三七素钠盐对激活的中性粒细胞引起血小板聚集功能无明显作用。
十一、三七素钠盐对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响
ICR小鼠,体重18-22g,雌雄各半,随机分为5组,每组10只,即生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钠盐组和50mg/kg的阿司匹林组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量)。各组动物均以0.1mL/10g体重尾静脉注射,30min后,0.5%伊文思蓝以0.2mL/只尾静脉注射并及时腹腔注射0.7%醋酸0.2mL/只,15min后处死动物,腹腔注射生理盐水5mL,轻揉后抽取腹腔液,离心,上清液于590nm处测定其OD值,数据进行组间t检验。
本实验结果显示,50mg/kg的三七素钠盐可明显降低小鼠腹腔毛细血管的通透性,12.5和25mg/kg的三七素钠盐和15mg/kg的三七素则无显著影响。
十二、三七素钠盐对血液流变学的影响
健康家兔,体重2-2.5kg,雌雄各半,随机分为生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钠盐组和50mg/kg的止血芳酸组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量),每组4只,动物均从耳缘静脉注射给药。给药前及注毕后30和60min,分别自颈动脉取血。测定全血粘度、血浆粘度、红细胞压积和红细胞电泳。
静脉注射后,15mg/kg的三七素和三种剂量的三七素钠盐对家兔全血粘度、血浆粘度、红细胞压积和红细胞电泳均无明显影响。止血芳酸静注30和60min后明显升高高切应力、中切应力、低切应力、全血粘度,延长红细胞电泳时间。
综上所述,三七素钠盐静脉注射在多种出血模型中均具有明显的预防性和治疗性的止血作用。缩短全血凝血时间、促进血液凝固、减少血浆tPA水平并降低纤维蛋白溶解活性是三七素钠盐止血作用的直接原因。升高血浆GMP-140浓度,提示三七素钠盐具有活化血小板作用,同时促进细胞之间的粘附反应有利于出血部位的血小板粘附到血管内皮和白细胞上,共同促进出血部位止血凝块的形成,这可能是三七素钠盐止血作用的重要机制。抑制毛细血管通透性可减少相关血液物质的渗出,有助于减轻出血及出血后的炎症等反应。三七素钠盐提高血浆TXB2水平同时增加6-keto-GF1α浓度,表明血小板的活化释放功能明显提高,对血小板自发性聚集和ADP及激活的中性粒细胞诱导的血小板聚集无明显影响,提示三七素钠盐在止血的同时并不因此导致血小板性的血栓形成。对KPTT、PT、TT及血液流变学均无明显影响,提示三七素钠盐不会造成明显的血淤征象。
三七素钾盐的药理作用:
一、三七素钾盐对家兔肝脏实质器官出血的影响
1、预防作用:健康家兔,雌雄各半,体重2-2.5kg,随机分为5组,每组6只,即生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钾盐组、立止血0.5KU/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量),。手术前禁食(不禁水)12h,兔以30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,上腹部去毛,碘酒、酒精消毒手术局部,打开腹腔,轻轻拉出肝脏,用纱布固定。上述组分均经家兔耳缘静脉以2mL/kg注射给药,静注后30min,用手术刀切下一块肝组织,创面长2cm、宽1cm、高0.5cm,且创面出血至少有一个以上的小动脉呈喷射状出血。立即用秒表计时,记录各组动物肝脏出血时间(以s表示)(自切下肝组织到创口不再出血、渗血为止),同时用中性滤纸垫于出血部位下,称量所用滤纸在出血前后的重量,重量差值代表出血量(以g表示)。以组间t检验比较在不用其它外科止血措施的条件下出血时间的长短和出血量的多少。
结果表明,静脉注射后,25和的三七素钾盐明显缩短家兔肝脏出血时间并减少出血量,15mg/kg的三七素和12.5mg/kg的三七素钾盐对肝脏出血时间和出血量均无显著影响(P>0.05与生理盐水组比较);50mg/kg的三七素钾盐对该两项指标的作用强度与0.5KU/kg的立止血相当(P>0.05)。
2、治疗作用:健康家兔,雌雄各半,体重2-2.5kg,随机分为5组,每组6只,即生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钾盐组、立止血0.5KU/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解解量),。手术前禁食(不禁水)12h,兔以30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,上腹部去毛,碘酒、酒精消毒手术局部,打开腹腔,轻轻拉出肝脏,用纱布固定。用手术刀切下一块肝组织,创面长2cm、宽1cm、高0.5cm,且创面出血至少有一个以上的小动脉呈喷射状出血。立即经耳缘静脉以2mL/kg注射上述组分并及时用秒表计时,记录各组动物肝脏出血时间(秒)(自切下肝组织到创口不再出血、渗血为止),并同上记录出血量多少。所得数据亦同上行统计学处理。
结果显示,肝脏出血并立即注射药物后,15mg/kg的三七素和12.5mg/kg的三七素钾盐明显减少肝脏出血量,对出血时间无影响;25和50mg/kg的三七素钾盐均显著缩短出血时间同时减少肝脏出血量;三七素钾盐50mg/kg组的出血时间略长于立止血组,但无统计学差异,对出血量的影响,50mg/kg的三七素钾盐与立止血相当。
二、三七素钾盐对公鸡鸡冠出血的影响
1、预防作用:取1.5-2kg的公鸡,随机分成5组,每组4只,即生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钾盐组、立止血0.5KU/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量)。生理盐水清洁鸡冠后,上述组分均经公鸡翼下静脉注射(2mL/kg体重),30min后用眼科剪于鸡冠前端处剪一0.3cm长的创口,并立即用秒表计时,观察并记录各组鸡冠出血时间的长短(s),行组间t检验统计学处理。
结果表明,静脉注射后,25和50mg/kg的三七素钾盐均显著减少公鸡鸡冠的出血时间,50mg/kg三七素钾盐的作用强度相当于0.5KU/kg的立止血(P>0.05与立止血组比较)。
2、治疗作用:取1.5-2kg的公鸡,随机分成5组,每组4只,即生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钾盐组、立止血0.5KU/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量)。生理盐水清洁鸡冠后,用眼科剪于鸡冠前端处剪一0.3cm长的创口,立即经公鸡翼下静脉注射上述组分并及时用秒表计时,观察并记录各组鸡冠出血时间的长短(s),行组间t检验统计学处理。
结果表明,鸡冠出血并注射药物后,25和50mg/kg的三七素钾盐均显著缩短公鸡鸡冠的出血时间,50mg/kg三七素钾盐的作用强度与0.5KU/kg的立止血相当(P>0.05与立止血组比较)。
三、三七素钾盐对大鼠胃出血的影响
1、预防作用:健康SD大鼠,雌雄各半,体重180-220g,随机分为5组,每组10只,即生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钾盐组、立止血0.5KU/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量)。手术前禁食(不禁水)12h,以30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,上腹部去毛,碘酒、酒精消毒手术局部,打开腹腔,暴露胃部,沿胃大弯剪开,清除胃内容物后,用无菌棉球揩净。上述组分均经大鼠股静脉以1mL/100g体重注射给药,静注后30min,用小号活检钳钳取胃体粘膜一块,形成急性胃出血病灶模型。立即用秒表记录大鼠胃粘膜出血时间(秒)。
结果显示,先注射药物后,15mg/kg的三七素和12.5mg/kg的三七素钾盐对大鼠胃出血无影响,25和50mg/kg的三七素钾盐显著缩短大鼠胃出血时间,50mg/kg三七素钾盐组的胃出血时间略长于立止血组的,但无统计学意义(P>0.05与立止血组比较)。
2、治疗作用:健康SD大鼠,雌雄各半,体重180-220g,随机分为5组,每组10只,即生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钾盐组、立止血0.5KU/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量)。手术前禁食(不禁水)12h,以30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,上腹部去毛,碘酒、酒精消毒手术局部,打开腹腔,暴露胃部,沿胃大弯剪开,清除胃内容物后,用无菌棉球揩净。用小号活检钳钳取胃体粘膜一块,形成急性胃出血病灶模型,立即大鼠股静脉注射上述组分,同时用秒表记录大鼠胃粘膜出血时间(秒)。
胃出血后,立即注射给药,15mg/kg的三七素和12.5mg/kg的三七素钾盐对大鼠胃出血无影响,25和50mg/kg的三七素钾盐明显缩短大鼠胃出血时间;50mg/kg三七素钾盐组的胃出血时间略长于立止血组的,但无统计学意义(P>0.05与立止血组比较)。
四、三七素钾盐对大鼠肠系膜动脉出血的影响
1、预防作用:雄性SD大鼠,体重180-220g,随机分为5组,每组10只,即生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钾盐组、立止血0.5KU/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量)。以30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,上腹部去毛,碘酒、酒精消毒手术局部,上述各组分均经股静脉以1mL/100g体重注射,然后打开腹腔,提出十二指肠上端的肠系膜于一盛有37℃台氏液的塑料盘上,给药30min后用25号针穿刺一根小动脉,低倍镜下观察并记录肠系膜动脉的出血时间(从针刺出血至止血为止)。
实验结果表明,给药30min后再穿刺肠系膜动脉,15mg/kg和三七素、12.5和25mg/kg的三七素钾盐对大鼠肠系膜动脉的出血时间均无明显影响;50mg/kg的三七素钾盐显著缩短出血时间,但其出血时间明显长于立止血组(P<0.05与立止血组比较)。
2、治疗作用::雄性SD大鼠,体重180-220g,随机分为5组,每组10只,即生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钾盐组、立止血0.5KU/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量)。以30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,上腹部去毛,碘酒、酒精消毒手术局部,打开腹腔,提出十二指肠上端的肠系膜于一盛有37℃台氏液的塑料盘上。用25号针穿刺一根小动脉,立即股静脉注射给药,同上观察并记录出血时间(从针刺出血至止血为止)。
穿刺肠系膜动脉并立即注射药物后,15mg/kg的三七素、三七素钾盐在12.5mg/kg剂量下对出血时间无明显影响;25和50mg/kg时,三七素钾盐显著缩短肠系膜动脉的出血时间,且50mg/kg三七素钾盐的作用强度与立止血相当。
五、三七素钾盐对大鼠股动脉出血的影响
1、预防作用:健康SD大鼠,雌雄各半,体重180-220g,随机分为5组,每组10只,即生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钾盐组、立止血0.5KU/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量)。手术前禁食(不禁水)12h,以30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,并固定于手术台上。手术前30min,经股静脉注射上述组分。腹股沟部去毛,用碘酒和酒精棉球消毒,分离股动脉,做一占横向直径1/3的切口。立即用秒表记录股动脉出血时间(s);以出血40min为记录终点,用中性滤纸在出血前后的重量差值作为出血量(g)。t检验进行组间统计学处理。
结果表明,50mg/kg的三七素钾盐和0.5KU/kg的立止血均明显减少大鼠股动脉的出血时间和出血量,15mg/kg的三七素、12.5和25mg/kg的三七素钾盐对股动脉的出血时间及其出血量均无明显影响。
2、治疗作用:健康SD大鼠,雌雄各半,体重180-220g,随机分为5组,每组10只,即生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钾盐组、立止血0.5KU/kg组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量)。手术前禁食(不禁水)12h,以30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,并固定于手术台上。腹股沟部去毛,用碘酒和酒精棉球消毒,分离股动脉,做一占横向直径1/3的切口,并立即股静脉注射给药。同时用秒表记录股动脉出血时间(s);以出血40min为记录终点,用中性滤纸在出血前后的重量差值作为出血量(g)。t检验行组间统计学处理。
结果说明,50mg/kg的三七素钾盐有缩短出血时间的趋势,三种剂量的三七素钾盐和15mg/kg的三七素对出血时间无明显影响;立止血显著缩短出血时间,减少股动脉出血量。
六、三七素钾盐对小鼠尾尖出血时间的影响
雄性ICR小鼠(18~22g)分为5组,每组10只,即生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钾盐组和0.5KU/kg的立止血组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量)。各组动物于尾静脉1次性注射上述组分,30min后距尾尖0.5cm处横切。前1min内每30s用中性滤纸轻擦尾尖1次,1min后则每10s用滤纸轻擦尾尖1次。从横断尾尖至滤纸未见血迹的时间为小鼠尾尖出血时间(s)。
结果显示,三七素钾盐呈剂量相关性明显缩短小鼠尾尖出血时间;15mg/kg的三七素对小鼠尾尖出血无影响;50mg/kg的三七素钾盐缩短出血时间作用明显弱于立止血(P<0.05与立止血组比较)。
七、三七素钾盐对家兔全血凝血时间的影响(试管法)
健康家兔,雌雄均用,随机分5组,每组5只,即生理盐水组、12.5、25、50mg/kg的三七素钾盐组和50mg/kg止血芳酸组,三七素组15mg/kg(10mL最大溶解量),上述药物均从耳缘静脉以2mL/kg体重注射给药。给药前及注毕后30和60min,分别自家兔耳缘静脉取血1mL,轻轻沿试管壁放入试管内。当血液吸进注射器即开始用秒表记录时间,每隔30s轻轻倾斜试管1次,角度约30度,观察血液是否流动,直至试管倾斜到90度而血液不再流动且完全凝固为止,停止计时,该段时间即为全血凝血时间。数据以t检验进行组间统计学处理。以测定药物对凝血功能及其内源性凝血途径的影响。
结果表明,三七素钾盐静脉注射后呈剂量相关性明显减少家兔全血凝血时间,可持续至60min。15mg/kg的三七素也能减少部分家兔全血凝血时间,但作用不强。
以上试验在做的过程中,三七素的各组试验由于三七素在水中的溶解性很小,1mL的溶解量不足2mg,试验中无法达到预期的量,所以疗效欠佳。三七素钠/钾盐的安全性评价:
本品静脉注射急性毒性:雄性872.6mg/kg,雌性899.3mg/kg;对三大系统无不良影响,不引起过敏、溶血和血管刺激反应,无致突变、致畸作用;长期毒性试验发现本品无细胞毒作用,对Beagle犬、SD大鼠所有脏器、组织组胞生长无异常促进作用,Beagle犬大剂量注射后出现流涎、恶心、呕吐等现象,停药后自然恢复。
根据以上结果,三七素钠/钾盐作为一种新型止血药,有以下优势:
(1)口服和静脉注射均可使用,止血药效肯定,作用强。
(2)克服了目前临床常用的止血药易形成血栓的副作用。
(3)口服和静脉注射基本无毒副作用。
(4)其止血的重要机制是具有活化血小板作用,同时促进细胞之间的粘附反应,有利于出血部位的血小板粘附到血管内壁和白细胞上,共同促进出血部位止血凝块的形成。
(5)本品可制成注射剂、各种口服制剂,为临床各种出血病的病人提供一种新型止血药。
(6)比原三七素的作用更为明显,疗效得到显著增强。
(7)本品安全、有效。
【具体实施方式】
实施例1:
取三七粉1kg,加入10L80%乙醇渗漉,药渣加入10L水渗漉,渗漉液40℃下减压浓缩到1000mL,加等量水饱和正丁醇萃取三次,收集水层。
水层通过Sephadex-LH-20凝胶柱,用蒸馏水洗脱,收集茚三酮显阳性部分,减压浓缩到500mL,通过CM-Sephadex-C25离子交换树脂,蒸馏水洗脱,收集茚三酮显阳性部分,减压浓缩到100mL,低温放置过液,过滤结晶,用冰水洗涤,干燥,得三七素。将0.1g三七素+0.227g氢氧化钠+2ml水+7ml药用乙醇,得结晶粉末,使用时将粉末用蒸馏水稀释成不同浓度,制成钠盐;或者将0.1g三七素+0.325g氢氧化钾+2ml水+7ml药用乙醇,得结晶粉末,使用时将粉末用蒸馏水稀释成不同浓度,制成钾盐
该方法得到的三七素钠(钾)盐,化学名为:β-N-乙酰基-N-L-α,β-二氨基丙酸纳(钾)。结构式为:
R=H、Na或K
实施例2:
本品还可以用合成的方法得到。以天冬酰氨为先导,经磺酰化,霍夫曼重排,酸解,草酰化得到。
天冬酰氨加对甲苯磺酰氯,加入氧化镁溶液中,室温反应24小时,过滤,滤液加盐酸酸化至PH2-3,过滤,冰水洗涤,干燥,得化合物I。
化合物I加入次溴酸钠溶液中,0℃以下反应5-10分钟,升温至80℃,反应15分钟,冷却,用盐酸酸化到PH为7,过滤,冰水洗涤,干燥,得化合物II。
化合物II加入适量苯酚,加到HBr/HoAc溶液中,70℃密封反应8小时,冷却,过滤,乙醚洗涤,干燥。加适量水溶解,加乙醇到含醇量66%,过滤,干燥,得化合物III。
化合物III加入草酸单甲酯的钾盐,于50%甲醇溶液中反应24h,过滤,沉淀加入适量水溶解,用盐酸酸化到PH为2,过滤,冰水洗涤,干燥,得化合物IV,得到三七素,将0.1g三七素+0.227g氢氧化钠+2ml水+7ml药用乙醇,得结晶粉末,使用时将粉末用蒸馏水稀释成不同浓度,制成钠盐;或者将0.1g三七素+0.227g氢氧化钾+2ml水+7ml药用乙醇,得结晶粉末,使用时将粉末用蒸馏水稀释成不同浓度,制成钾盐
该方法得到的三七素钠(钾)盐与植物中提取的三七素制得的钠(钾)盐结构,理化性质均一致。
实施例3:
可以用得到的三七素钠(钾)盐制备成注射剂、各种口服制剂,外用各种剂型。
(1)注射剂制备工艺
操作步骤:取三七素20-200克与400-4000ml注射用水在适当的容器中混合,在搅拌下加入氢氧化钠4.54-45.4克(20%)或氢氧化钾6.5-65克,在常温下搅拌溶解后,加入注射用活性炭适量,再搅拌30分钟,过滤。向滤液中加入乙醇1400-14000毫升,放置1h,过滤,固体在60℃下真空干燥,得到白色结晶性粉末,测定固体中三七素含量,折算后于无菌状态下分装入1000支5ml的西林瓶中,轧盖,包装。
(2)片剂制备工艺
取三七素钠(钾)20-200克,加适量微晶纤维素17-170g,乳糖28-280g,二氧化硅0.4-4g,或其它如淀粉、糊精、羧甲基纤维素钠等可药用辅料,加入硬脂酸镁1.5-15g等赋形剂,用高效混合器混匀,压片、检验、包装,即得成品。或加入一定的缓、控释剂,制成缓、控释制剂。
(3)硬胶囊剂制备工艺
取三七素钠(钾)20-200克,粉碎,加入2%-10%的赋形剂,如硬脂酸镁、淀粉、糊精、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、乳糖、甘露醇等可药用辅料,混匀,按比例装入不同型号的空胶囊囊壳中,检验,包装,即得成品。
(4)软胶囊剂
取明胶适量,加入等量蒸馏水和30-40%的甘油,40-50℃溶解,升温至65-75℃,分次加入防腐剂和色素,静置、过滤、备用。取三七素钠(钾)20-200克,粉碎,过120目以上筛,加聚乙二醇400 100-500g,或其它油溶性基质,如花生油、大豆油、各种可食用油,混匀,在软胶囊上与胶液一起制成较胶囊,干燥、定型、检验、包装、合格后入库。
(5)滴丸剂的制备工艺
取聚乙二醇6000 400-800g,置铝锅中,于油浴中加至80-100℃待全部溶融后,保温,备用。取三七素钠(钾)20-200克,粉碎,过160目以上筛,加入到融化的聚乙二醇6000中,搅拌至融化,转移至贮液罐中,密封保温至80-100℃,调节液体定量阀,滴入10-15℃的液体石蜡中,将成形的滴丸沥尽并擦除液体石蜡,干燥,包装、检验、合格后即得成品。
(6)气雾剂的制备工艺
取三七素钠(钾)20-200克,超微粉碎为5μm以下的微粉,加入司盘6-60g,油酸乙酯10-100g,(或其它可药用分散剂),混匀备用,洗净烘干玻璃瓶,预热至120-130℃,趁热浸入搪塑液中,使瓶颈以下粘附一层浆液,倒置,在150-170℃下烘干约15分钟,备用。将配制好的药液定量分装在容器中,安装阀门,轧紧封帽,采用压灌法将热射剂F11300-400g,F14300-400g,F12600-800g,压入容器中即得成品,包装、检验、合格后使用。
(7)外用散剂制备工艺
取三七素钠(钾)20-100克,按比例分装,检验,即得成品。
(8)搽剂的制备工艺
取三七素钠(钾)20-100克,溶于蒸馏水中,加入0.5-1%苯甲酸钠、尼泊金乙酯等防腐剂,包装、检验、合格后即得成品。