一种萝卜游离小孢子的培养方法 【技术领域】
本发明涉及萝卜的组织培养方法，属于植物育种技术领域。
背景技术
游离小孢子培养是在花药培养基础上发展起来的一项新兴技术，是植物细胞工程领域最活跃的研究课题之一。通过游离小孢子培养技术可获得单倍体，单倍体在作物育种上极为珍贵：①单倍体一经加倍，便可获得纯合的二倍体，这样可以省去多代自交，快速地获得自交系；②单倍体植物的单套染色体不存在显性基因掩盖隐性基因的现象，因此单倍体植株的表现型和基因型是一致的，这在杂交育种和诱变育种中可避免“误选”，从而大大提高工作效率。常规育种获得一个遗传稳定的自交系一般需要5～8年的时间，而利用小孢子培养技术只需要1～2年。另外，游离小孢子培养技术也为现代基因工程研究提供了很好的受体材料。正是由于其上述优点，故在许多作物中均开展工作了游离小孢子培养的研究工作。尤其是在十字花科芸苔属上取得了巨大成功。目前，在几乎所有的芸薹属作物上均有成功的报道。萝卜是异花授粉作物，其杂种优势十分明显。利用游离小孢子培养技术可在较短时间内固定杂种优势。与常规育种技术相比，具有效率高、工作量小等优点。从亲缘关系上来讲，萝卜属与芸薹属同属于十字花科作物，具有一定的血缘关系。但该属是十字花科作物中最不容易进行游离小孢子培养成功的材料之一。故关于萝卜游离小孢子培养的成功报道极少，目前只见到1篇报道，记载于植物细胞报导(Plant Cell Report)1996年第16期第163-166页。但在这篇报道中，小孢子成胚率低，为0.2-8.3个/105个小孢子，尚不能将其应用于育种与基因工程研究；获得胚状体的基因型狭窄，只在日本类型地萝卜品种中获得了胚状体。而关于中国萝卜游离小孢子的培养尚未见报道。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种萝卜游离小孢子的培养方法。
为实现上述目的，本发明采取以下方案：
取3-4mm新鲜花蕾，在3-5℃冰箱中低温处理2天后进行小孢子的培养。将预处理后的花蕾用含2％活性Cl-的NaClO2灭菌15min，蒸馏水冲洗3次，每次5min，离心分离小孢子。B5-13培养基洗涤小孢子3次，然后以1/2NLN液体培养基培养小孢子，密度为1×105/ml。将小孢子悬浮液分装于培养皿中，石蜡膜封口。先在32.5℃下热激处理1天，而后转到25℃下暗培养，同时进行震荡以增加空气，直至长出胚状体。将胚状体转至B5-2生芽培养基中，置于25℃的光照培养箱中培养，直至长成小孢子植株；选择生长正常的小孢子植株，切下腋芽，置于B5-2生根培养基上生根，最终获得小孢子植株再生苗。
上段所述的各培养基的典型成份如下：
B5-13培养基：每升培养基中含大量元素硝酸钾(KNO3)2527.5毫克，硫酸镁(MgSO4·7H2O)246.5毫克，氯化钙(CaCl2·2H2O)150毫克，硫酸铵((NH4)2SO4)134毫克，磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)150毫克；微量元素硫酸锰(MnSO4·H2O)10毫克，硼酸(H3BO3)3.0毫克，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)2.0毫克，钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25毫克，硫酸铜(CuSO4·7H2O)0.025毫克，氯化钴(CoCl2·6H2O)0.025毫克，碘化钾(KI)0.75毫克；有机物肌醇100毫克，烟酸1毫克，盐酸吡哆醇1毫克，盐酸硫胺素10毫克；EDTA铁钠盐40毫克；蔗糖浓度13％。
B5-2固体培养基：大量元素、微量元素、有机物及铁盐含量均与B5-13相同，蔗糖浓度为2％，琼脂浓度0.8％。
1/2NLN培养基：每升培养基中含大量元素硝酸钾(KNO3)62.5毫克，硫酸镁(MgSO4·7H2O)62.5毫克，硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)250毫克，磷酸二氢钾(KH2PO4)62.5毫克；微量元素硫酸锰(MnSO4·4H2O)22.3毫克，硼酸(H3BO3)6.2毫克，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.6毫克，钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25毫克，硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025毫克，氯化钴(CoCl2·6H2O)0.025毫克；有机物甘氨酸2毫克，烟酸5毫克，盐酸吡哆醇0.5毫克，盐酸硫胺素0.5毫克，叶酸0.5毫克，生物素0.05毫克，肌醇100毫克，还原型谷胱甘肽30毫克，谷氨酰胺800毫克，丝氨酸100毫克；EDTA铁钠40毫克；蔗糖浓度13％。
本发明的优点是：本方法可将基因型扩大到中国萝卜(Raphanus satinus L.var.Longinnatus Bailey)中。通过采用低温预处理及震荡培养方式，提高了萝卜小孢子培养的成胚率，使得成胚率提高到16.0个/105个小孢子，并在中国萝卜中获得了再生株。利用该方法进行中国萝卜游离小孢子培养，可获得较高的频率的胚状体，解决了中国萝卜游离小孢子培养胚状体再生的难题。
【附图说明】
图1是正在培养的小孢子的显微照片。
图2是第一次分裂的小孢子的显微照片。
图3是细胞团的显微照片。
图4是胚状体的显微照片。
图5是发育中的再生芽的照片。
图6是再生苗的照片。
【具体实施方式】
取3-4mm新鲜花蕾，在4℃冰箱中处理2天后进行小孢子的培养。将预处理后的花蕾用含2％活性Cl-的NaClO2灭菌15min，蒸馏水冲洗3次，每次5min，离心分离小孢子。B5-13培养基洗涤小孢子3次，然后以1/2NLN液体培养基培养小孢子，密度为1×105/ml。将小孢子悬浮液分装于直径为60mm的培养皿中，每皿3ml，石蜡膜封口。先在32.5℃下热激处理1天，而后转到25℃下暗培养，同时进行震荡以增加空气，直至长出胚状体。将胚状体转至B5-2生芽培养基中，置于25℃的光照培养箱中培养，直至长成小孢子植株；选择生长正常的小孢子植株，切下腋芽，置于B5-2生根培养基上生根，最终获得小孢子植株再生苗。
图1至图6是培养各阶段的显微照片，可以清楚地看出本发明的积极效果。