嵌合的抗CD25单克隆抗体、其编码序列及应用 【技术领域】
本发明涉及医学领域。更具体地，本发明涉及嵌合的抗CD25单克隆抗体及其应用。本发明的抗体对于移植排斥反应的预防和治疗非常有用。
背景技术
目前，器官移植技术已成为脏器功能衰竭终末期的有效、常规性治疗手段。随着干细胞的研究的深入，干细胞的移植，以及用干细胞发育成器官的组织工程学的飞速发展，移植手术必将迅猛发展，其市场前景和经济效益无法估量。
但是，器官移植最大的问题是免疫排斥反应。患者术后每年单用于抗排斥反应药物的费用高达1-2万元。因此，在器官移植，特别是肾、肝、心脏、肺和骨髓移植中，减小免疫系统的移植排斥反应是非常必要的。
目前已经研制出许多免疫抑制剂，而且在临床上也获得了成功，比如包括类固醇、咪唑硫嘌呤和环孢菌素A。但是它们都必须严格进行控制，以避免产生不必要的副作用。另外还有一个难点，就是免疫抑制作用使移植器官易被细菌或病毒感染，而这类细菌或病毒感染在正常情况下是能够由个体的免疫系统消除的。
除了使用免疫抑制剂，还可以使用一些单克隆抗体(MAbs)来抑制免疫反应，特别是那些可以识别T细胞表面不同抗原的单克隆抗体。这些单克隆抗体通常根据相应的CD数命名，如CD3的抗体描述为“抗CD3”。但在应用于临床时出现一些问题：这些抗体不是作用过强就是不足以产生效果，甚至还可能引发严重的副作用，比如高烧。
T细胞膜上的抗原(如CD3抗原)的单克隆抗体是非常有应用潜力的抗体，它具有全面的免疫系统抑制活性。但是，一旦发生感染，人体将丧失由记忆T细胞介导的瞬时免疫应答，这在治疗移植排斥时是不希望出现的情况。一个可预防上述情况发生地途径是保持记忆T细胞的活性，同时使直接涉及排斥反应的T细胞失活，从而抑制同种异体排斥反应。
另一个途径是通过T细胞膜表面的高亲和力白介素2受体(IL-2R)抑制免疫系统活性。IL-2R高亲和力受体包含至少两条不同的多肽链：α链和β链。IL-2R是异多聚体糖蛋白，分子量约为140KD，其中α链55kD(p55)，β链70-75kD(p75)。
IL-2R的α链即CD25抗原，又称TAC，是活化T淋巴细胞的重要标志，并且它是IL-2特异性的，只与IL-2结合。人IL-2Rα链基因位于染色体10p14-15，长度25kB，有7个外显子，抗CD25单克隆抗体能够特异性结合α链，从而阻断IL-2与α链的相互作用。
休眠状态的T细胞不表达高亲和力受体，但是低表达或间歇表达包含α-β链同源二聚物的亲和受体。CD25抗体能够干扰IL-2结合到其高亲和受体上，有效地与IL-2竞争，抑制IL-2启动的T细胞增殖反应，从而选择性地抑制了免疫应答，防止了同种异体排斥反应。因此，CD25抗体是一种可用于预防器官移植排斥反应的抗体。
虽然在国内外已经建立了许多针对CD25抗原的单克隆抗体，但是这些单克隆抗体的特异性及中和能力均不够理想。
因此，本领域迫切需要建立既能够保持或提高抗体的亲和力和特异性，又能够降低或基本消除抗体免疫原性的单克隆抗体，从而可以用于临床治疗。
【发明内容】
本发明的目的提供一种特异性的、人鼠嵌合抗CD25单克隆抗体。
本发明的另一目的是提供一种所述特异性的、人鼠嵌合抗CD25单克隆抗体的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种含所述人鼠嵌合抗CD25单克隆抗体的药物组合物。
在本发明的第一方面，提供了一种单克隆抗体VH链，它的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：
SEQ ID NO：5或29所示的CDR1，
SEQ ID NO：6、16或37所示的CDR2，
SEQ ID NO：7、30、或38所示的CDR3。
较佳地，所述的单克隆抗体VH链具有SEQ ID NO：2、12、28、或36所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种单克隆抗体VL链，它的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：
SEQ ID NO：8、33、或41所示的CDR1，
SEQ ID NO：9或19所示的CDR2，
SEQ ID NO：10、34或42所示的CDR3。
较佳地，所述的单克隆抗体VL链具有SEQID NO：4、14、32、或40所示的氨基酸序列。
在本发明的第三方面，提供了一种单克隆抗体，其VH链具有SEQ ID NO：2、12、28、或36所示的氨基酸序列；
且其VL链分别具有SEQ ID NO：4、14、32、或40所示的氨基酸序列。
较佳地，所述的单克隆抗体的Fc区为人IgG的恒定区。
在本发明的第四方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的多肽：本发明所述的单克隆抗体VH链、单克隆抗体VL链或单克隆抗体。较佳地，所述的DNA分子，具有选自下组的DNA序列：SEQ ID NO：1、3、11、13、27、31、35、和39。
在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，它含有单克隆抗体和药学上可接受的载体，
其中所述单克隆抗体的VH链具有SEQ ID NO：5或29所示的CDR1，SEQ ID NO：6、16或37所示的CDR2，以及SEQ ID NO：7、30、或38所示的CDR3；
且所述单克隆抗体的VL链具有SEQ ID NO：8、33、或41所示的CDR1，SEQ ID NO：9或19所示的CDR2，以及SEQ ID NO：10、34或42所示的CDR3。
较佳地，在所述的药物组合物中，所述单克隆抗体的VH链具有SEQ ID NO：2、12、28、或36所示的氨基酸序列；且其VL链分别具有SEQ ID NO：4、14、32、或40所示的氨基酸序列。
【附图说明】
图1显示了混合淋巴细胞反应(MLR)抑制试验的结果。
图2显示了抗原特异性HPBM反应的抑制试验的结果。
图3显示了pMG18结构。
【具体实施方式】
本发明人通过筛选人源抗体库，成功获得了对CD25高特异性的单克隆抗体，并且对抗CD25人源化单克隆抗体基因和抗体可变区位点进行了独特的人工设计，即构建全人源的抗体库，筛选表达量高的抗体，并且将之与人IgGl-Fc相连和人源化，因此该抗体是全人源的。在此基础上完成了本发明。
本发明提供了一种嵌合或重组抗CD25人源化单克隆抗体，它包括人源恒区(如人源恒区IgGl-Fc)，经过人工设计后的重链可变区和轻链可变区具有独特的不同于现有技术的结构。
本发明还提供了嵌合抗CD25单克隆抗体的氨基酸序列及其其可变区链，以及具有这些链的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为超变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
此外，最近还发现由轻链可变区构成的相关结构，与相应的重链可变区相比，其结合的动力学比较小，分离的重链可变区域自身具有抗原结合活性。
此处鉴定的V链的超变区或互补决定区(complementarity determiningregion，CDR)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变链的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明还提供了编码上述单克隆抗体或其片段的DNA分子。本发明的单抗的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有；大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CH0、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明还提供了一种治疗移植排斥的药物组合物，它含有上述的单克隆抗体或免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于预防和治疗移植排斥。本发明的药物组合物还可用于治疗白癜风、免疫调节紊乱如自身免疫疾病(包括类风湿关节炎、牛皮癣、多发性硬化症、某种类型的肠胃炎、红斑狼疮等)。此外，还可同时使用其他治疗剂，如类固醇、咪唑硫嘌呤和环孢菌素A等。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的单克隆抗体以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的突出优点在于：本发明的单克隆抗体的具有很高的亲和力且是人源化的抗体。这种高亲和力的单克隆抗体在临床上具有重要的价值。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
抗CD25抗体的克隆筛选
1.免疫小鼠
采用白癜风病人的血清作为免疫原，加入完全佐剂，充分研磨至完全乳化后皮下多点注射10日龄Bal b/c小鼠，每点注射50微升，共6点。然后以1周间隔共5次重复注射以加强免疫反应，并用常规ELISA方法对血清抗体水平进行监测。最后一次静脉注射100ul血清/PBS混合液，3日后杀死小鼠，取出脾脏。
2.细胞融合：
常规方法分离脾脏单细胞，并确定细胞活性大于90％。将脾脏细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞10∶1混合离心共沉淀，在37度水浴锅中加入PEG(1400MW)进入细胞融合，融合时间为1分钟、2分钟、5分钟和10分钟。在不同时间点加入新鲜无血清培养基1毫升、2毫升、5毫升和10毫升。离心沉淀后将细胞加入到20％FCS RPM1-1640培养液中，转入96孔板进行培养。24小时后加入选择培养液，每3天更换新鲜培养基1次，至长出克隆。
3.克隆筛选：
选择单克隆形成孔，在第14天取出上清液，用ELISA法测定抗体的表达情况，阳性孔保留，亚克隆3次后选择3个高表达细胞株。3个克隆生长稳定，表达量大于1mg/L，在96孔培养条件下，稳定至第5代克隆。
经过鉴定，3个克隆的类型为：GH0为IgG1；GH1为IgG2a，GH2为IgG1。根据ELISA的测定结果，GH0和GH2细胞系的产率最高，可作为基本材料进行嵌合和人源化设计并进行改造。
实施例2
抗CD25抗体基因的克隆
1.引物的合成
根据人抗体基因的保守性，设计并合成以下引物以克隆该单克隆抗体的可变区编码序列：
VL-sense：5’-tcctctagacagctgacccagtctcca-3’(SEQ ID NO：21)含Xba I位点；
VL-antisense：5’-gttgctagcccagcttggtacchscdccgaa-3’(SEQ ID NO：22)含NheI位点；
VH-sense：5’-aggaagctttgcagsagtcwgg-3’(SEQ ID NO：23)含HindIII位点；
VH-anti sense：5’-tgacgtacgggtgaccgtggtcccttggccccat-3’(SEQ ID NO：24)含BsiWI位点。
上述引物中，H＝A，C或T；S＝C或G；D＝a，g或t；R＝A或G；W＝A或T。
2.总RNA的抽提、纯化与反转录
从上述获得的GH0和GH2高亲和力杂交瘤细胞株中抽提纯化总RNA，采用Invitrogen公司的Trizol，整个操作工程按照厂家的说明书进行。
上述纯化的总RNA在1％琼脂糖电泳上鉴定质量后，采用Pharmacia的反转录试剂盒进行反转录，获得总RNA的cDNA。
3.小鼠抗人CD25单抗VL和VH基因的获得
以上述引物和cDNA分别进行PCR扩增VL和VH片段。具体条件如下：
反应体系：
VL(ul) VH(ul)
10×PCR反应缓冲液 5 5
dNTP(10mmol/L) 5 5
MgCl2(25mmol/L) 6 6
cDNA 10 10
有义引物(10umol/L) 5 5
反义引物(10umol/L) 5 5
Pfu(5U/ul) 1 1
加水至 50ul 50ul
温度循环：
预变性：94度2分钟；
主循环：94度45秒，55度45秒，70度1分钟，共30循环；
后延伸：70度5分钟。
上述温度循环完成后，将扩增产物在1.2％琼脂糖电泳上进行鉴定，发现VL和VH反应体系均出现一条分子量约300～350bp的单一条带。用Promega公司的胶回收试剂盒回收两种扩增产物后连接于pUC18克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α后进行蓝白斑筛选，再经过酶切鉴定，获得8个阳性克隆。经测序验证，分别确认3个克隆为正确克隆。
对上述正确克隆进行DNA测序，获得GH0和GH2细胞株抗体基因的DNA序列和推测的氨基酸序列如下：
对于GH0细胞株而言，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3分别是其CD25单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的DNA编码序列；SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4分别是根据上述DNA编码序列推测的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。SEQ IDNO：5-7分别为重链的CDR1、CDR2和CDR3。SEQ ID NO：8-10分别为轻链的CDR1、CDR2和CDR3。
对于GH2细胞株而言，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13分别是其CD25单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的DNA编码序列；SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14分别是根据上述DNA编码序列推测的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。SEQID NO：15-17分别为重链的CDR1、CDR2和CDR3。SEQ ID NO：18-20分别为轻链的CDR1、CDR2和CDR3。
序列(相应位置) SEQ ID NO：
鼠GH0重链 CDR1 RYWMH(31-35) 5
(SEQ ID NO：1和2) CDR2 AIYPGNSDTSYNQKFEG(50-66) 6
CDR3 DYGYYFDF(99-106) 7
鼠GH0轻链 CDR1 SASSSISYMQ(24-33) 8
(SEQ ID NO：3和4) CDR2 DTSKLAS(49-55) 9
CDR3 HQRSSYT(88-94) 10
鼠GH2重链 CDR1 RYWMH 15
(SEQ ID NO：11和12) CDR2 AIYPGNTDTSYNQKFEG 16
CDR3 DYGYYFDF 17
鼠GH2轻链 CDR1 SASSSISYMQ(24-33) 18
(SEQ ID NO：13和14) CDR2 DTSKLLS(49-55) 19
CDR3 HQRSSYT(88-94) 20
值得注意的是，两种抗体的重链和轻链CDR1和CDR3是相同的，即SEQ ID NO：5＝SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：7＝SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：8＝SEQ ID NO：18，SEQ IDNO：10＝SEQ ID NO：20。
实施例3
嵌合基因表达载体的构建：
通过以下过程，分别将上述测序验证过的GH0和GH2的VH和VL基因克隆到pMG18载体上，使两个基因与相应的恒定区构成全长的抗体重链和轻链基因。
1.在重链可变区基因的5’-端加上Xba I，3’-端加上Nhe I切点；
2.在轻链可变区基因的5’-端加上Hind III和EcoR I切点；
3.用Xba I和Nhe I、Hind III和Bsi WI分别对重链和轻链可变区克隆进行酶切并对酶切片段进行1％琼脂糖电泳纯化。然后，分别克隆到pMG18载体的XbaI/Nhe I位点和Hind III/Bsi WI位点。
pMG18结构见图3。图中，Ck表示抗体kappa轻链的恒定区基因；IgG1恒定区表示人抗体IgG1的重链恒定区基因；pA表示SV40加poly A位点。
通过上述操作，获得了GH0VH/VL-Fc融合基因和GH2VH/VL-Fc融合基因表达载体。经过酶切鉴定，获得的是完全正确的克隆。将上述两个克隆送上海基康公司进行DNA测序。验证全序列是正确的。
嵌合的鼠轻链-人Fc的编码序列如SEQ ID NO：25所示。
嵌合的鼠重链-人Fc的编码序列如SEQ ID NO：26所示。
实施例4
VL和VH基因的人源化
参照已经发表的方法将上述克隆的鼠源抗体基因的VL和VH编码区进行人源化设计，将整个基因分成6套长度为28～85的寡核苷酸片段，在每个寡核苷酸的两端各有8～9个与模板互补良好的重叠区域。将上述各套寡核苷酸分别与模板进行变性和复性后用T4 DNA连接酶进行连接，然后用T7 DNA聚合酶进行延伸，用T4 DNA连接酶再次连接。最后用Dpn I将上述的杂合分子进行消化，除去模板DNA后用突变链转化大肠杆菌DH5α菌株。经过酶切筛选和测序后筛选出序列正确的克隆。[参照文献humanization of the murine anti-human CD3 monoclonal antibody OKT3.HumAntibod Hybridoma，1994，5(1，2)：41]。上述人源化基因的基因如同嵌合基因一样，克隆至表达载体并进行酶切鉴定。
序列(相应位置) SEQ ID NO：
人源化的GH0重链 CDR1 RYAMH(31-35) 29
(SEQ ID NO：27和28) CDR2 AIYPGNSDTSYNQKFEG(50-66) 6
CDR3 DYGYAFDF(99-106) 30
人源化的GH0轻链 CDR1 SASSSISAMQ(24-33) 33
(SEQ ID NO：31和32) CDR2 DTSKLAS(49-55) 9
CDR3 HQASSYT(88-94) 34
人源化GH2重链 CDR1 RYWMH 5
(SEQ ID NO：35和36) CDR2 AIYPGNTDTSYNQKAEG 37
CDR3 DYGAAFDF 38
人源化GH2轻链 CDR1 SASSSISAMQ(24-33) 41
(SEQ ID NO：39和40) CDR2 DTSKLLS(49-55) 19
CDR3 HQRSSAT(88-94) 42
实施例5
重组单克隆抗体细胞株的构建
接着将上述构建的含有嵌合和人源化抗体基因的表达载体在大肠杆菌DH5α菌株接种于100毫升LB培养基中进行扩增，用Qiagen公司的Ultrapure Plasmid DNAPurification Kit抽提纯化质粒DNA。将上述纯化的质粒DNA采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒转染CH0细胞，操作参照厂家的说明书进行。
转化的CH0细胞在选择培养基上进行连续9周的选择，最后在96孔板上进行极度稀释培养，连续进行3次，进行单克隆化。通过上述操作获得了两个嵌合抗体细胞株cGH0和cGH4。
挑出的单克隆细胞系在RPM1641培养基上进行培养，对上清进行WesternBlotting实验，根据染色反应判断表达强度。结果发现获得的表达重组单克隆抗体的细胞株具有明显较高的表达强度，分别表达人鼠嵌合抗体，分子量约150KDa。
实施例6
重组单克隆抗体的纯化
采用硫酸铵沉淀法进行纯化，将上面得到的表达重组单克隆抗体的细胞的培养上清过滤，经过简单离心，除去细胞残片后即可直接进行亲和层析。用protein A亲和层析。先在protein A柱按照每100毫升上清1毫升的比例加入填料后，在4度慢速搅拌24小时。然后在100mM pH8.2的Tris-H2SO4缓冲液中漂洗4次后，用含250mM氯化钠的同样缓冲液洗脱后进行硫酸铵分步沉淀，起始浓度为35％饱和度，终止浓度63％饱和度。4度处理12小时后高速离心，取沉淀，重新溶于上述不含氯化钠的缓冲液中，并于同样缓冲液透析过夜后浓缩10倍，待用。
上述步骤获得的纯化单抗用SDS-PAGE检定纯度，Follin酚法定量蛋白质含量。结果发现，其纯度达到了90％以上，并保留了高的生物活性。
实施例7
嵌合抗体的生理活性试验
1.特异性荧光染色(竞争试验)
用实施例6中获得的细胞株纯化的抗体对T淋巴细胞进行染色，发现T淋巴细胞可以被特异性染色，而对照细胞(成纤细胞，CD25阴性)株对染色无反应。嵌合抗体与阳性对照具有竞争性，说明它们结合的是同一个抗原决定簇。
2.沉淀实验检测
将获得的单克隆抗体进行Western Blotting试验，以Simulect为对照。结果表明，4种抗体(即鼠源GH0VH/VL-人Fc嵌合抗体，鼠源GH2VH/VL-人Fc嵌合抗体，人源化GH0VH/VL-人Fc抗体，和人源化GH2VH/VL-人Fc抗体)，与对照Simulect一样，可以与CD25蛋白发生特异性沉淀和结合。
3.混合淋巴细胞反应(MLR)抑制试验
用常规方法分离人外周血淋巴细胞(HPBM)，调整细胞密度为1_106细胞/毫升。加入不同浓度的纯化抗体，浓度范围从0到300ng/ml。然后将每一样品与100ul HLA不相容性X照射的HPBM混合。将混合物在37℃下放置6天，然后加入终浓度为0.02uCi/ml的3H-TdR。6小时后通过放射性测定来确定细胞的增殖情况。
结果见图1，样品在低浓度(0.5ng/ml)就显示了体外免疫调节活性，而在样品浓度为4ng/ml时，50％细胞的生长受到了抑制。
4.抗原特异性HPBM反应的抑制
本发明的抗体能够有效的抑制结合菌素(PPD)特异性的、HLA II限制性的T细胞反应的产生，也即具有抑制内源性IL-2与其受体结合的能力。
准备细胞浓度为106细胞/mlHPBM样品，加入不同浓度的纯化抗体，浓度范围从0到300ng/ml，加入终浓度为30ug/ml的PPD。将混合样品在37℃下放置6天，然后加入终浓度为0.02uCi/ml的3H-TdR，6小时后通过放射性测定来确定细胞的增殖情况。
结果见图2所示。被测抗体从8ng/ml浓度时开始显示出免疫调节活性，约在40ng/ml时50％细胞的生长受到了抑制。这说明该CD25抗体具有调节免疫活性的功能，因此有可能用于免疫功能紊乱相关的疾病，也有可能用于需要抑制免疫功能的临床治疗方案，如器官抑制。
上述结果表明，本发明的嵌合抗体和人源化抗体明显具有与CD25结合的能力。由于CD25在白癜风病人中具有异常表达，因此施用该上述这些单克隆抗体有可能治疗这种疾病。
5.小鼠器官移植试验
正常昆明种小白鼠，不分性别，每组12只。其中6只为受体，6只为供体进行心脏移植。将上述抗体用于小鼠心脏抑制试验，该试验的结果如下表所示，表明可以明显提高受试动物的存活率和平均存活天数。 抗体0.5ug/lg体重 抗体2.5ug/lg体重 抗体25ug/lg体重 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 30日存活率(％) 0 16 0 16 16 0 16 16 33 16 0 33 50 50 67 平均存活天数 1 7 3 5 9 1 9 12 13 10 1 10 14 19 24
其中，抗体为：0＝阴性对照抗人CD20单抗，1＝鼠源GH0VH/VL-人Fc嵌合抗体，2＝鼠源GH2VH/VL-人Fc嵌合抗体，3＝人源化GH0VH/VL-人Fc抗体，4＝人源化GH2VH/VL-人Fc抗体。
从上述实验中可以看出，鼠源和人源化的抗人CD25单克隆抗体都能显著提高器官移植受体的30日存活率和平均存活天数。
此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>马，菁
<120>抗CD25单克隆抗体、其编码序列及应用
<130>027426
<160>42
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>351
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(351)
<223>抗CD25抗体重链的编码序列
<400>1
gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtg ctggctaggc ctggggcttc cgtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta cagctttacc aggtactgga tgcactggat aaaacagagg 120
cctggacagg gtctagaatg gattggtgct atttatcctg gaaatagtga tactagttac 180
aaccagaagt tcgagggcaa ggccaaactg actgcagtca catccgccag cactgcctac 240
atggagctca gcagcctgac acatgaggac tctgcggtct attactgttc aagagactac 300
ggctactact ttgacttctg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351
<210>2
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(117)
<223>抗CD25抗体重链的氨基酸序列
<400>2
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Glu Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Ile tys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Glu Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr His Gly Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Asp Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210>3
<211>312
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(312)
<223>抗CD25抗体轻链的编码序列
<400>3
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aagtataagt tacatgcagt ggtaccagca gaagccaggc 120
acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccatcagcgg agtagttaca cgttcggagg ggggaccaaa 300
ctggaaataa aa 312
<210>4
<21l>104
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(104)
<223>抗CD25抗体轻链的氨基酸序列
<400>4
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Thr Phe Gly
85 90 95
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100
<210>5
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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<222>(1)..(5)
<223>重链CDR1
<400>5
Arg Tyr Trp Met His
1 5
<210>6
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(17)
<223>重链CDR2
<400>6
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Glu
1 5 10 15
Gly
<210>7
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(8)
<223>重链CDR3
<400>7
Asp Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Phe
1 5
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<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(10)
<223>轻链CDR1
<400>8
Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met Gln
1 5 10
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<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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<222>(1)..(7)
<223>轻链CDR2
<400>9
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210>10
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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<222>(1)..(7)
<223>轻链CDR3
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His Gln Arg Ser Ser Tyr Thr
1 5
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<211>354
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(354)
<223>抗CD25抗体重链的编码序列
<400>11
gaggtgcagc tgcagcagtc cgagaccgtg ctggcccgcc ccggcgcctc cgtgaagatg 60
tcctgcaagg cctccgacta ctccttcacc cgctactgga tgcactggat caagcagcgc 120
cccggccagg gcctggagtg gatcggcgcc atctaccccg gcaacaccga cacctcctac 180
aaccagaagt tcgagggcaa ggccaagctg accgccgtga cctccgcctc caccgcctac 240
atggagctgt cctccctgac ccacggcgac tccgccgtgt actactgctc ccgcgactac 300
ggctactact tcgacttctg gggcctgcag ggcaccaccc tgaccgtgtc ctcc 354
<210>12
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(118)
<223>抗CD25抗体重链的氨基酸序列
<400>12
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Glu Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Thr Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Glu Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr His Gly Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Asp Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Leu Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210>13
<211>312
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(312)
<223>抗CD25抗体轻链的编码序列
<400>13
cagatcgtgc tgacccagtc ccccgccatc atgtccgcct cccccggcga gaaggtgacc 60
atgacctgct ccgcctcctc ctccatctcc tacatgcagt ggtaccagca gaagcccggc 120
acctccccca agcgctggat ctacgacacc tccaagctgc tgtccggcgt gcccgcccgc 180
ttctccggct ccggctccgg cacctcctac tccctgacca tctcctccat ggaggccgag 240
gacgccgcca cctactactg ccaccagcgc tcctcctaca ccttcggcgg cggctccaag 300
ctggagatca ag 312
<210>14
<211>104
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(104)
<223>抗CD25抗体轻链的氨基酸序列
<400>14
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Leu Ser Gly Val Pr0 Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Thr Phe Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Lys Leu Glu Ile Lys
100
<210>15
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(5)
<223>重链CDR1
<400>15
Arg Tyr Trp Met His
1 5
<210>16
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(17)
<223>重链CDR2
<400>16
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Thr Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Glu
1 5 10 15
Gly
<210>17
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(8)
<223>重链CDR3
<400>17
Asp Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Phe
1 5
<210>18
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(10)
<223>轻链CDR1
<400>18
Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met Gln
1 5 10
<210>19
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(7)
<223>轻链CDR2
<400>19
Asp Thr Ser Lys Leu Leu Ser
1 5
<210>20
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(7)
<223>轻链CDR3
<400>20
His Gln Arg Ser Ser Tyr Thr
1 5
<210>21
<211>27
<212>DNA
<213>引物
<400>21
tcctctagac agctgaccca gtctcca 27
<210>22
<211>31
<212>DNA
<213>引物
<400>22
gttgctagcc cagcttggta cchscdccga a 31
<210>23
<211>22
<212>DNA
<213>引物
<400>23
aggaagcttt gcagsagtcw gg 22
<210>24
<211>34
<212>DNA
<213>引物
<400>24
tgacgtacgg gtgaccgtgg tcccttggcc ccat 34
<210>25
<211>636
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(636)
<223>嵌合的鼠轻链-人Fc的编码序列
<400>25
cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg ttgacaaatt gttctcaccc agtctccagc aatcatgtct 360
gcatctccag gggagaaggt caccatgacc tgcagtgcca gctcaagtat aagtgctatg 420
cagtggtacc agcagaagcc aggcacctcc cccaaaagat ggatttatga cacatccaaa 480
ctggcttctg gagtccctgc tcgcttcagt ggcagtgggt ctgggacctc ttattctctc 540
acaatcagca gcatggaggc tgaagatgct gccacttatt actgccatca ggccagtagt 600
tacacgttcg gaggggggac caaactggaa ataaaa 636
<210>26
<211>1344
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1344)
<223>嵌合的鼠重链-人Fc的编码序列
<400>26
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agcagagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gactacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720
ctgaccagga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tgagaggttc agctccagca gtctgggact 1020
gtgctggcta ggcctggggc ttccgtgaag atgtcctgca aggcttctgg ctacagcttt 1080
accaggtact ggatgcactg gataaaacag aggcctggac agggtctaga atggattggt 1140
gctatttatc ctggaaatag tgatactagt tacaaccaga agttcgaggg caaggccaaa 1200
ctgactgcag tcacatccgc cagcactgcc tacatggagc tcagcagcct gacacatgag 1260
gactctgcgg tctattactg ttcaagagac tacggctact actttgactt ctggggccaa 1320
ggcaccactc tcacagtctc ctca 1344
<210>27
<211>351
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(351)
<223>人源化GH0的重链的编码序列
<400>27
gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtg ctggctaggc ctggggcttc cgtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta cagctttacc aggtacgcca tgcactggat aaaacagagg 120
cctggacagg gtctagaatg gattggtgct atttatcctg gaaatagtga tactagttac 180
aaccagaagt tcgagggcaa ggccaaactg actgcagtca catccgccag cactgcctac 240
atggagctca gcagcctgac acatgaggac tctgcggtct attactgttc aagagactac 300
ggctacgctt ttgacttctg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351
<210>28
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(117)
<223>人源化GH0重链
<400>28
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Glu Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Glu Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr His Gly Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Asp Tyr Gly Tyr Ala Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210>29
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(5)
<223>CDR1
<400>29
Arg Tyr Ala Met His
1 5
<210>30
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(8)
<223>CDR3
<400>30
Asp Tyr Gly Tyr Ala Phe Asp Phe
1 5
<210>31
<211>312
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(312)
<223>人源化GH0的轻链编码序列
<400>31
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aagtataagt gctatgcagt ggtaccagca gaagccaggc 120
acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccatcaggcc agtagttaca cgttcggagg ggggaccaaa 300
ctggaaataa aa 312
<210>32
<211>104
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(104)
<223>人源化GH0的轻链
<400>32
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ala Met
20 25 30
Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ala Ser Ser Tyr Thr Phe Gly
85 90 95
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100
<210>33
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(10)
<223>CDR1
<400>33
Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ala Met Gln
1 5 10
<210>34
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(7)
<223>CDR3
<400>34
His Gln Ala Ser Ser Tyr Thr
1 5
<210>35
<211>354
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(354)
<223>人源化GH2的重链编码序列
<400>35
gaggtgcagc tgcagcagtc cgagaccgtg ctggcccgcc ccggcgcctc cgtgaagatg 60
tcctgcaagg cctccgacta ctccttcacc cgctactgga tgcactggat caagcagcgc 120
cccggccagg gcctggagtg gatcggcgcc atctaccccg gcaacaccga cacctcctac 180
aaccagaagg ctgagggcaa ggccaagctg accgccgtga cctccgcctc caccgcctac 240
atggagctgt cctccctgac ccacggcgac tccgccgtgt actactgctc ccgcgactac 300
ggcgcagcat tcgacttctg gggcctgcag ggcaccaccc tgaccgtgtc ctcc 354
<210>36
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(118)
<223>人源化GH2的重链
<400>36
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Glu Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Thr Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Ala
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Glu Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr His Gly Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Asp Tyr Gly Ala Ala Phe Asp Phe Trp Gly Leu Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210>37
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(17)
<223>CDR2
<400>37
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Thr Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Ala Glu
1 5 10 15
Gly
<210>38
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(8)
<223>CDR3
<400>38
Asp Tyr Gly Ala Ala Phe Asp Phe
1 5
<210>39
<211>312
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(312)
<223>人源化GH2的轻链编码序列
<400>39
cagatcgtgc tgacccagtc ccccgccatc atgtccgcct cccccggcga gaaggtgacc 60
atgacctgct ccgcctcctc ctccatctcc gccatgcagt ggtaccagca gaagcccggc 120
acctccccca agcgctggat ctacgacacc tccaagctgc tgtccggcgt gcccgcccgc 180
ttctccggct ccggctccgg cacctcctac tccctgacca tctcctccat ggaggccgag 240
gacgccgcca cctactactg ccaccagcgc tcctcctaca ccttcggcgc cggctccaag 300
ctggagatca ag 312
<210>40
<211>104
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(104)
<223>人源化GH2轻链
<400>40
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ala Met
20 25 30
Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Leu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Clu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Ala Thr Phe Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Lys Leu Glu Ile Lys
100
<210>41
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(10)
<223>CDR1
<400>41
Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ala Met Gln
1 5 10
<210>42
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(7)
<223>CDR3
<400>42
His Gln Arg Ser Ser Ala Thr
1 5