木酚素在食品中的用途 【发明领域】
本发明涉及具有消炎和/或防衰老性能的食品。
【发明背景】
木酚素是存在于许多天然产物如亚麻子、茶和咖啡中的公知化合物(参见例如EP-A-906 761和《英国营养杂志》(British Journal ofNutrition)第79期(1998)第37-45页“茶和咖啡中木酚素和异类黄酮浓度”)。
木酚素的实例有开环异落叶松树脂酚(SECO)和罗汉松树脂酚(MAT)。木酚素是2，3二苄基丁烷衍生物，并且SECO和MAT的化学结构以上面《英国营养杂志》中的图1表示。还已知SECO和MAT都可以是肠内酯和肠二醇(enterodiol)的前体和其改性物包括二糖苷(参见EP-A-906 761第2页第53-56行)。
已知木酚素的许多保健效果。EP-A-906 761公开了木酚素用于预防许多癌症、降低潮热、预防骨质疏松症、抗病毒活性、抗有丝分裂活性和杀真菌活性的用途。WO 00/13661公开了木酚素在防皮肤擦伤的局部组合物中的用途。WO 99/07239提出将得自亚麻子的木酚素用于目的在于减轻与绝经妇女有关的问题的功能食物制品中。WO00/19842公开了漂白亚麻子的摩擦碎片(富含木酚素)可用于在食品中获得口味或结构或色彩效果(参见第6页第29-31行)和/或增加经常食用这些食品的人的纤维摄取。没有公开物给出任何保健益处。
US 5,762,935公开了芝麻素家族的木酚素经肠道或者不经肠道，特别是以所有非肠道营养液或者作为膳食补充物释放这些木酚素治疗感染和炎症的用途。
US 5 837 256公开了开环异落叶松树脂酚和开环异落叶松树脂酚二糖苷以基本上纯的形式用于治疗狼疮肾炎、患者免疫系统攻击其自身器官的自身免疫疾病的用途。没有公开物给出这些木酚素当以基本纯的形式以外使用时是有效的。
US 6,039,955公开了在用于治疗炎症的试剂中地木酚素去甲二氢愈创木酸(NDGA)。该试剂可以是丸剂、胶囊或粉剂。
在EP-A-038 600和EP-A-043 150中公开了具有与SECO和MAT的化学结构类似(但是在苯基中仅有一个取代基，而在SECO和MAT中有两个取代基)的合成化合物。在EP-A-038 600和EP-A-043 150中公开的这些化合物据说具有消炎性能，但是仅用于药用组合物，不用于食品(可能由于这些化合物不是天然化合物的原因)。
已观察到，当健康的绝经后妇女，年龄为52-82，每天食用其习惯饮食加上0、5或10克碎亚麻子时，包括代谢物肠二醇和肠内酯的排泄增加的生物学效应(Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2000年10月；9(10)：1113-8)。
然而，现有技术没有公开木酚素的其它有益保健效果，例如防衰老效果，特别是皮肤防衰老效果。
在现有技术中也没有公开具有消炎益处并含有得自亚麻子、肠内酯、肠二醇及其前体的木酚素，特别是开环异落叶松树脂酚(SECO)和罗汉松树脂酚(MAT)的食品。
现在越来越需要食品不仅仅是提供给消费者令人愉快的口味、或者基本的营养价值。消费者和食品加工业都在着手寻求食品的其它益处，以便改善或保持食用这些食品的人群的常规健康和良好状态。
“营养价值”是指食品的维生素和矿物质含量。这在本领域中有时是指食品的微量营养素值。现在从食品中寻求的其它益处尤其包括消炎益处和防衰老益处。这些食品有时称之为“功能食品”。
另一问题是这些食品不总是具有可接受的物理参数或特性，例如稳定性(抗氧化剂性能)、改进的口味(固有风味)和改进的物理结构(交联)。这尤其对含有大量脂肪的食品来说可能是一个问题。
因此，在本领域中需要提供赋予益处以提高或保持有规律地食用这种食品的人的常规健康和良好状态的食品。这些食品理想地还具有令人愉快的口味和/或有营养。
而且，还需要提供具有例如本文上面提到的良好物理参数或特性的食品。
本发明旨在解决上面的一个或多个问题。
本文后面所用的术语SECO和MAT分别是指开环异落叶松树脂酚和罗汉松树脂酚。
发明概述
出人意料地发现，木酚素对人体具有防衰老效果，特别是对于皮肤可以使其外表得到改善，并且它可包含在食品中而将这些益处提供给其消费者。
还出人意料地发现，消炎益处可由含有得自亚麻子、肠内酯、肠二醇及其前体的木酚素，特别是开环异落叶松树脂酚(SECO)和罗汉松树脂酚(MAT)的食品获得，并且不需要以基本上纯的形式使用这些化合物。
不希望受理论约束，据信这些效果是由于木酚素在体内促进前胶原-1产生并减少PGE2产生而引起的。
而且，已发现也可以使用木酚素获得对食品，特别是含有大量脂肪的那些食品的许多物理参数或特性的有益效果。这些有益效果尤其涉及提高的稳定性(抗氧化剂性能)。其它益处包括改进的口味(固有风味)和改进的物理结构(交联)。
因此，本发明根据第一实施方案提供了选自木酚素的一种或多种保健组分在生产具有防衰老性能的食品中的用途。
就第一个方面而言，优选这些保健组分选自得自亚麻子、肠内酯、肠二醇及其前体的木酚素。
根据第二个方面，本发明提供了选自得自亚麻子、肠内酯、肠二醇及其前体的木酚素的一种或多种保健组分在生产具有消炎性能的食品中的用途。
根据第一个和第二个方面，特别优选木酚素选自开环异落叶松树脂酚(SECO)和罗汉松树脂酚(MAT)。
该食品可以既具有消炎性能又具有防衰老性能。
根据第三个方面，本发明提供了一种向需要摄取消炎组分或防衰老组分的人给予保健组分的方法，所述保健组分选自得自亚麻子、肠内酯、肠二醇及其前体的木酚素，其中通过给该人喂食含有10-100或200wt％的每日推荐量的该保健组分的食品，给予该人每日有效量的该保健组分。
该活性(保健)组分的典型消费(给药)量将是45-100mg/天，并且为了本发明的目的将其认为是每日推荐量。
特别地，根据本发明的第三个方面，给予开环异落叶松树脂酚和罗汉松树脂酚。
优选向需要对皮肤衰老有活性的防衰老组分的人给予这些木酚素。
向需要摄取消炎或防衰老组分的人给予的“每日有效量”是使得所讨论的缺陷显著改善的量。
在使用木酚素混合物时，本文所指的量是指该混合物的量。
每日一份该食品是在一天内通常食用所讨论的这类食品的量。它可以多次食用，但是理想地是一次(每天一份)或两次食用。
除了在操作或对比实施例中之外，或者除非另有明确说明之外，本说明书中指示物料量或反应条件、物料的物理性能和/或用途的所有数值都应理解为用词语“约”修饰。所有量都以重量计，除非另有说明。
发明详述
现在更详细地讨论本发明。
根据本发明可以使用的木酚素，除了开环异落叶松树脂酚和罗汉松树脂酚之外，选自大侧柏酸、松脂酚、落叶松树脂醇、鬼臼毒素、络石配基、肖楠素(shonanin)和肠呋喃(enterofuran)(参见Xia ZQc.s，J Biol Chem，2001年1月18日，PMID 11278426和Liggins c.s，Analytical Biochem，287，2000，第102-109页)。
保健组分(木酚素)在食品中的使用量可以有很大的变化，但是证实根据本发明，可以容易地使用经每日食用一份该食品足够提供10-100或200wt％，例如20-95wt％每日推荐量的该保健组分的量。
通常这些木酚素在食品中以足够提供0.01-95wt％的木酚素(以食品的重量计)，优选0.5-35wt％，更优选0.8-10wt％的量使用。就一些食品而言，可以优选这些范围内的较低量，例如0.02-5wt％，优选0.05-2.5wt％。
这些木酚素可以任何适宜的递送形式，包括以游离化合物、以天然产物的浓缩物或提取物，特别是以亚麻子的浓缩物，以包封形式(特别是经糖、淀粉或明胶包封)，或者以粉末或结晶，加入和掺入食品中。如果使用粉末或结晶，优选在载体上使用。
可以通过本领域中已知的任何适宜方法，例如通过用叶片混合器或其它已知的食品混合器混合，将这些木酚素加入到食品(或其组分)中。
就本发明的所有方面而言，这些木酚素可以掺入到许多种食品中。典型的实例包括涂酱(spread)、调味料、蛋黄酱、冰淇淋、奶油代用品、保健条、保健饮料、运动饮料、巧克力、糖果、焙烤产品、汤、谷物、酱油、饼馅和包衣。
根据本发明的第三个方面，木酚素的实际给予量将取决于食品种类、所用的递送形式和保健缺陷的类型。这些木酚素可以通过食用一种或多种食品或其份而给予。
而且，据信木酚素也可以用来协同地增强其它天然保健组分的保健效果，特别是食品中其它天然消炎或防衰老组分的消炎或防衰老效果。例如，本发明的木酚素与异黄酮类或黄酮类组合可以显示在仅对这些异黄酮类和黄酮类已知的保健效果的这种协同作用。这种其它的异黄酮类或其它的黄酮类可以任何适宜量用于食品中。
本发明的木酚素也可以与其它微量营养素，例如维生素，如维生素C和维生素E组合使用。
如上所述，这些木酚素也可以对食品的物理性能/特性具有有益效果。特别地，这些木酚素用于食品，特别是以上述量使用，可以使产品质量，特别是稳定性(抗氧化剂性能)提高。其它益处包括食品的口味(固有风味)和物理结构(交联)。
参照以下非限制性实施例进一步解释本发明。
实施例
实施例1-消炎效果；人皮肤成纤维细胞中PGE2量的测定步骤。
消炎细胞试验。
应强调的是，消炎效果是通过体外试验确定的，其中经炎性模量佛波基肉豆蔻基乙酸酯(PMA)诱导之后，测定由人皮肤成纤维细胞产生的前列腺素E2(＝PGE2)。PGE2量降低指示消炎效果。
成纤维细胞试验：将第2代(P2)的原生人包皮成纤维细胞以35000个细胞/孔接种到96孔平皿中并在5％二氧化碳的环境下在补充有10％胎牛血清的Dulbeccos Modified Eagles Medium(DMEM)中保持24小时。
将木酚素化合物(SECO或MAT)一式三份加入到100％乙醇(最终浓度1％)中的新鲜细胞培养基(DMEM，补充有10％胎牛血清)中，接着培养24小时。将乙醇/细胞培养基(10nm)中的佛波基肉豆蔻基乙酸酯(PMA)加入到用木酚素化合物(SECO)处理过的细胞中，并将这些细胞培养另外2 4小时。PMA代表外部应激子，它诱导细胞内的氧化应力和炎性反应。然后立即如下所述分析该成纤维细胞/培养基，或者在液氮中速冻并贮藏在-70℃，用于以后的分析。然后计数细胞以确保对细胞数量没有影响。
将不同浓度的SECO或MAT用于上面的方法中以研究浓度的影响。根据上面的方法还进行一系列对照试验；对照+veh+PMA(正对照)、对照+veh(负对照)和对照(标准对照)。
在轻轻摇动该培养平皿之后，从上面的样品中取出50μl培养基的前列腺素E2(PGE2)试验体积用于PGE2试验。用Biotrak PGE2免疫试验组件(Amersham，UK)测定培养基中PGE2的量。该试验以样品中未标记的PGE2和固定量的辣根过氧化物酶标记的PGE2之间对有限量的固定PGE2特异性抗体的竞争为基础。按照同时获得的标准曲线测定未标记的样品PGE2的浓度。
给予不同量的SECO或MAT的结果分别示于图1和2。结果显示SECO和MAT在人细胞中有效地产生消炎效果，这可以通过将对照+veh+PMA的结果与三个不同量的异黄腐酚所得的结果进行比较看出。通过测定PGE2降低，增加浓度的SECO和MAT产生增加的消炎效果。
实施例2-防衰老放果；前胶原-I的测定步骤和人皮肤成纤维细胞中的核心蛋白聚糖合成。
防衰老细胞试验；皮肤成纤维细胞调理培养基的制备
应强调的是，防衰老效果是通过体外试验测定的，其中在防衰老刺激物诱导之后，测定人皮肤成纤维细胞产生的前胶原-I和核心蛋白聚糖。前胶原-I的量增加指示防衰老效果。
皮肤成纤维细胞调理培养基的制备：将第2代(P2)的原生人包皮成纤维细胞以40000个细胞/孔接种到12-孔平皿中并在5％二氧化碳和4％氧气的环境下在补充有10％胎牛血清的Dulbeccos ModifiedEagles Medium(DMEM)中保持2 4小时。这段时间之后，将细胞用没有血清的DMEM洗涤，然后在没有血清的新鲜DMEM中接着培养60小时。然后将这些成纤维细胞单层再次用没有血清的DMEM洗涤。
将试验试剂(MAT和SECO，以不同浓度量)和载体对照(1％乙醇最终浓度)一式三份以0.4ml/孔无血清的新鲜DMEM的最终体积加入到这些细胞中，再培养24小时。对该成纤维细胞调理培养基立即进行分析，或者在液氮中速冻并贮藏于-70℃用于以后分析。然后计数细胞，接着将来自斑点印迹分析的数据标准化至细胞数。
皮肤成纤维细胞调理培养基中核心蛋白聚糖蛋白质的斑点印迹试验：将用载体(作为对照)或试验试剂处理过的来自皮肤成纤维细胞的调理培养基样品补充20mM二硫苏糖醇(1∶10稀释的200mM原液)和0.1％十二烷基硫酸钠(1∶100稀释的10％原液)，混合孔，然后在75℃下培养2分钟。
通过在175cm2烧瓶中系列稀释由以10000个细胞/cm2接种的成纤维细胞获得的纯成纤维细胞调理培养基，并如上所述在无血清DMEM中保持，产生该试验标准。
接着，使用得自Bio-Rad的96孔Bio-Dot设备，如厂商指南中所述，以一式三份将试验样品施加到预湿润的Immobilon-P转移薄膜片上。每一孔中大致施加200μl的培养基。使该培养基在重力下通过该膜过滤(30分钟)，之后用PBS(200μl)将该膜洗涤2次。将这些PBS洗液在重力下通过该膜过滤(2×15分钟)。然后将该Bio-Dot设备与一真空歧管相连，并在抽吸下进行第三次以及最后的PBS洗涤。拆下该设备，取下膜并根据需要快速切割，之后将其放置在封闭缓冲剂中于4℃下过夜。
将用于核心蛋白聚糖分析而制备的膜用3％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)/0.1％(v/v)吐温2 0的磷酸盐缓冲盐水(PBS)封闭，而将用于前胶原-I分析的那些用5％(w/v)无脂干奶粉/0.05％吐温20的PBS封闭。第二天，在室温下将这些膜用1∶10000稀释的原始抗体对人核心蛋白聚糖(兔多克隆物；Biogenesis)进行2小时的探针探测。接着用TBS/0.05％吐温20洗涤这些膜(3×15分钟)，然后在室温下根据需要用1∶1000稀释的125I-共轭的抗鼠或抗兔F(ab′)2片段(Amersham)培养1小时。之后将这些Immobilon条再次用TBS/吐温20洗涤(3×15分钟)，之后在空气中于室温下进行干燥。将这些干燥膜包在玻璃纸中并与分子动力学贮藏磷筛接触16-18小时。结束时将接触的筛通过磷光计(Molecular Dynamics PhosphorimagerSF)使用ImageQuantTM软件扫描。通过计算机辅助的图象分析，使用ImageQuantTM的定量工具评价点强度，标准化至细胞数量，并相对100随机单位的载体处理过的对照值确定各种测定试剂对核心蛋白聚糖和前胶原-I合成的影响。
对MAT和SECO获得的结果分别表示在图3和4中。这些结果显示，与对照样品相比，这些MAT和SECO样品在人细胞中显示增加的防衰老效果。
实施例3
根据以下配方可以制备冰淇淋；
Wt％
SECO 0.02
脂肪混合物 10.0
脱脂奶粉 10.0
冰糖 12.0
玉米糖浆固体 4.0
葡萄糖一水合物 2.0
Sherex IC 93300 0.6
加水至 100.0
Sherex IC 93300是得自Quest International的一种含有混合不同稳定剂的甘油单酸酯和甘油二酸酯的产品。
将除了水和脂肪混合物之外的组分混合。将水(冷)加入到该混合物中，然后在水浴中加热至70℃的温度。加入脂肪混合物(全液体棕榈油)，同时在高速混合器，例如Ultra-turax混合器中将该混合物“搅拌”形成一乳液。在水浴中将该混合物冷却至20℃，然后在例如ultra-turrax中再次搅拌。
将该乳液放入间歇式冰淇淋制造机中(在-28℃下保持24小时，然后使用)，并搅拌15分钟。
获得良好质量的冰淇淋。可用MAT代替SECO重复生产上面的冰淇淋。
实施例4
由以下组分使用下面的步骤可以制备含有SECO的涂酱：
wt％
SECO 5×10-3
油混合物 49.5
卵磷脂 0.205
蒸馏过的甘油单酸酯 0.3
风味剂 0.01
着色剂 0.0066
乳清 0.25
EDTA 0.007
柠檬酸 0.03
山梨酸钾 0.1
盐 1.6
加水至 100.0％
在约55℃下在加热罐内以约40份脂肪相与60份水相的比例将脂肪和水相混合在一起制得脂肪连续乳液。将水相加入到脂肪相中有助于获得脂肪连续乳液。
将该乳液通过一冷却的刮板表面热交换器(A-单元)，乳液在其中被冷却至脂肪开始结晶的温度(约8-20℃)并且水相的粘度开始上升。将该冷乳液通过一C-单元结晶器；其轴速可以变化并取决于其尺寸以及结晶脂肪所需的停留时间。典型的速度范围是100-900RPM。因结晶器中的结晶热导致温度升高，因此将该脂肪连续乳液通入另一冷却单元以降低乳液的温度。就筒装产品而言，将该冷乳液通过结晶器(C-单元)以提供另一停留时间，并调整其稠度以在筒中包装。就条或棒产品而言，将冷乳液通过B-单元持续另一停留时间并增加产品的包装硬度，从而以条或棒状包装。
获得一良好质量的涂酱。使用MAT代替SECO可以重复生产本实施例的涂酱。