一种重组腺病毒在脑缺血、创伤修复和组织粘连治疗中的应用 技术领域 本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及一种携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒对脑缺血、创伤愈合和组织粘连的治疗方法。
背景技术 肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)最初被认为是一种肝细胞有丝分裂原，后来发现其对多种组织细胞的分裂、扩散和形态发生起重要的调节作用。HGF具有促进血管内皮细胞增生和新生血管形成的作用，可以用于治疗各种原因所致组织缺血性疾病；HGF还能调节胶原纤维的合成和炎性反应，在治疗创伤愈合、防治组织纤维化中起着重要的作用；此外HGF还可促进组织细胞的发生、生存和再生，抑制细胞凋亡，对神经有营养作用，可用于预防和治疗神经损伤。由此可见，HGF是一生物活性极为广泛的细胞因子，HGF将以其多种药理作用渗透于临床治疗的各个领域。
在HGF蛋白制剂给药中，因HGF在体内半衰期较短，因而需要大剂量、反复给药才能维持局部较高的药物浓度；然而，因局部或体内的蛋白酶解作用，即使重复给药也往往难以达到有效治疗浓度。因而应用蛋白制剂花费较高，且因纯化工艺不成熟，易产生不良作用，从而给临床治疗带来副作用。近年来兴起的一种新的治疗模式——基因治疗地方法，有可能克服上述缺点。
基因治疗所用的基因导入系统，大致可分为非病毒载体和病毒载体两类。常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒等，腺病毒因其容易生产、感染率高、感染细胞范围广，而成为基因治疗普遍应用的载体。
随着现代社会医疗条件的提高和人口老龄化趋势，脑血管病已成为危害人类生命的三大杀手之一，其中又以缺血性疾病最为多见，它的发生率和致残率都很高，给社会和家庭带来极大的负担。目前由于它发病急及神经元死亡的不可逆性，临床治疗效果并不理想。神经营养因子作为酪氨酸激酶受体的配体，在神经元的发生。生长和存活中发挥着非常重要的作用，可用来治疗神经系统疾病及损伤。HGF的受体c-Met也是一种酪氨酸激酶受体，在脑内分布广泛，因此HGF与神经系统细胞之间关系密切。HGF不但可以促进血管新生，改善组织缺血，而且可以提高bcl-2的表达，抑制细胞凋亡，所以HGF可能对脑缺血性疾病有改善和治疗作用。
创伤、烧伤包括手术切口的愈合仍然是临床存在的一大难题，尤其是糖尿病人的创伤愈合、局部放疗伤口的愈合、大面积烧伤或褥创等难愈合伤口的愈合，给患者造成巨大痛苦，也给医疗工作带来巨大负担，目前还没有非常有效的方法来促进这些伤口的快速愈合。HGF在理论上可从多方面促进伤口的有效、高质量愈合。首先，HGF可刺激血管内皮细胞的迁移、增殖，形成新生血管，促进局部血液循环，从而加速愈合；HGF可刺激皮肤角质细胞运动、增殖，促使伤口的再表皮化。
组织创伤或手术后产生的组织粘连问题也困扰着医患双方，组织粘连不仅影响器官的正常功能，而且有的粘连给患者的生活造成很大不便。现代研究表明，创伤或手术后缺血组织引起的炎症是粘连的重要原因，由于缺血，组织纤溶活性降低而发生粘连。因此改善组织血供，是预防和减轻粘连的重要环节。HGF作为促血管生长因子，不仅可以改善损伤组织的血供，还能调节组织炎性反应，减少组织液体渗出，此外还可显著抑制TGF-β的产生。而TGFβ是迄今了解最多、与胶原蛋白形成最密切的细胞因子，HGF由于对抗TGF-β的产生而可减少组织粘连的形成。另外HGF可增强胶原酶的活性，促使多余形成的胶原蛋白有效地降解，这些都有助于防止和减轻组织粘连的发生。
发明内容 本发明所要解决的技术问题是构建携带人肝细胞生长因子的重组腺病毒载体(Ad-HGF)；Ad-HGF能减轻脑缺血引起的神经细胞死亡、促进创伤修复和减少损伤后的组织粘连。解决上述技术问题的技术方案：
1.通过细胞内质粒同源重组将人肝细胞生长因子基因整合到腺病毒载体上，获得重组腺病毒，并制备一定量的病毒颗粒。
2.建立脑缺血动物模型和合适的基因转移方法，观察腺病毒在脑内的表达(图1)，证明人肝细胞生长因子能减轻脑缺血引起的神经细胞死亡(图2，3)。
3.建立创伤动物模型和合适的基因转移方法，证明人肝细胞生长因子能促进创伤的愈合，促进毛发和皮脂腺的再生(图4)。
4.建立组织粘连动物模型和合适的基因转移方法，证明人肝细胞生长因子能减轻因组织损伤而形成的粘连。
【附图说明】
图1是动物右侧大脑室注射Ad-GFP后三天，作冰冻切片，在荧光显微镜下(×100)可见荧光蛋白在双侧侧脑室壁及其内部的脉络膜细胞表达。
图2是动物缺血治疗后三天，取大脑平均切成四片，进行1％TTC染色观察，缺血区不着色，非缺血区被染成砖红色。左侧四片为对照，右侧四片为Ad-HGF治疗组。
图3是Ad-HGF对动物脑缺血的影响(实验组与对照比较，P＜0.05)。
图4是涂抹Ad-HGF组创口愈合后的组织切片，可见毛囊及皮脂腺的存在，并可见毛囊及皮脂腺的分裂相(×200)。
具体实施例 下面的实施例是对本发明的进一步详细说明但不意味着对本发明的任何限制。
实施例1：重组腺病毒的构建和制备
(1)重组腺病毒的构建
构建携带人肝细胞生长因子基因的穿梭质粒，命名为pXCJL1-CMV/HGF/P。将pXCJL1-CMV/HGF/P与携带腺病毒基因组DNA的重组质粒GT4050共转染293细胞，二者在细胞内发生同源重组，形成携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒，命名为Ad-HGF，结构如下：5’ITR V40pA HGF hCMV启动子Ad5 3533-3’ITR
携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒(Ad-GFP)由美国百特医疗用品公司基因治疗部(Gene Therapy Unit，Baxter Healthcare Company，USA)惠赠，293细胞系购自ATCC。
(2)病毒扩增与纯化
将293细胞接种于150mm平皿中，待细胞生长至90％汇合状态时，加入病毒，感染强度(multiplicity of infection，MOI)约为10个空斑形成单位(plaque forming unit，pfu)/细胞，36-48h后，细胞出现完全CPE(cell pathology effect)时，收集细胞，冻存于-80℃，待累计到50-60个平皿时，统一纯化病毒。
将出现CPE的293细胞于-80℃和37℃水浴间反复冻融三次，2500rpm离心10min以除去细胞碎片；配制1.5g/ml CsCl溶液(取30g CsCl，加PBS至终体积42.5ml)、1.35g/ml CsCl溶液(取15ml 1.5g/ml的CsCl液，加PBS至终体积21ml)和1.25g/ml CsCl溶液(取11ml1.5g/ml的CsCl液，加PBS至终体积20ml)；制备CsCl密度梯度：依次将0.5ml 1.5g/ml CsCl溶液、2.5ml 1.35g/ml CsCl溶液和2.5ml 1.25g/ml CsCl溶液加入12ml超速离心管中；将冻融后的待纯化病毒液加于各管的CsCl梯度液之上；150,000g，10℃离心1h，于1.35g/mlCsCl溶液和1.25g/ml CsCl溶液之间出现白色雾状病毒带；收集病毒带，并与1.35g/ml CsCl溶液混和；150,000g，10℃离心18h，进一步纯化病毒；吸出病毒带，以1-2倍体积的Hanks液稀释病毒，以Hanks液为透析液于4℃透析病毒，每2h更换一次透析液，共换液5次；取出纯化的病毒液，加无菌甘油至终浓度为10％，分装后于-80℃冻存。
实施例2：重组腺病毒介导人肝细胞生长因子对大脑局灶性缺血基因治疗的实验研究
(1)动物模型与基因转移
Wistar雄性大鼠体重200-250g，腹腔注射异戊巴比妥钠(100mg/kg)麻醉，无菌分离右侧颈总，颈外和颈内动脉，结扎颈外动脉分支起始处和颈总动脉近心端，动脉夹夹住颈内动脉，在颈总动脉剪一小口，把末端为球型4-0的尼龙线水平向颈内动脉端插入约20mm左右，至大脑中动脉造成大鼠右侧大脑局灶性缺血，缝合伤口。然后在立体定位仪的辅助下，于大鼠大脑前囱尾侧1.5mm，右侧2mm，深度3.5mm，用微量进样器向侧脑室注入107pfu/10μl腺病毒载体。HGF组给予Ad-HGF，对照组给予生理盐水。
(2)携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒(Ad-GFP)在大鼠脑内的表达和分布
大鼠侧脑室注入107pfu/10μl Ad-GFP后三天麻醉，心脏进行生理盐水灌注后，取大脑作全脑冰冻切片，荧光显微镜下可见荧光蛋白主要表达在大鼠双侧侧脑室壁和脑室内的脉络膜细胞(图1)。
(3)大脑局灶性缺血基因治疗的效果
动物在治疗三天后麻醉，对心脏进行生理盐水灌注后，取大脑平均切成四片，用含1％TTC(四氮唑红)的磷酸盐缓冲液在37℃染色30分钟，然后用4％甲醛PBS溶液固定后观察，缺血区不着色，非缺血区被染成砖红色(图2)。染色后的大脑切片经高分辨率扫描仪扫描进计算机内，用ImageTool软件计算出大脑不着色区占全脑体积的百分比，用Excel的TTEST统计实验组(10只)和对照组(8只)动物差别的显著性，结果显示HGF基因治疗组动物大脑缺血体积明显小于对照组(图3)。
实施例3.重组腺病毒介导人肝细胞生长因子(Ad-HGF)对皮肤创伤修复的作用
(1)动物模型与基因转移
选用2.5kg左右健康的雌性新西兰大白兔10只，戊巴比妥钠静脉麻醉(30mg/kg)，在双耳腹侧以无菌手术方法切除圆形全层皮肤直至软骨，切口直径0.7cm，每侧耳5个。被随机分成5组，每组两只：Ad-HGF1组，Ad-HGF2组，Ad-HGF3组，Ad-GFP组和溶剂组。手术即刻将6×107pfu Ad-HGF，6×108pfu Ad-HGF，6×109pfu Ad-HGF，6×109pfu Ad-GFP或同体积的溶剂一次性依次涂抹于上述各组伤口表面。
涂抹重组腺病毒后，每天观察各组伤口愈合情况，并对伤口未愈合面积进行测量。至第23天时动物全部活杀，并将创面及其临近无创伤处皮肤全层一并切下，10％福尔马林固定，做常规石蜡切片，进行HE染色。
(2)效果评价
兔耳创面局部涂抹重组腺病毒后第6天，大体外观即可观察到Ad-HGF组创口愈合速度较Ad-GFP及溶剂组快，至第8天时，两组创口未愈合面积百分比在统计学上有显著意义：Ad-HGF1、Ad-HGF2和Ad-HGF3分别为9.36％，4.46％和4.59％，Ad-GFP及溶剂组分别为26.88％和32.16％(p＜0.05)，而Ad-GFP及溶剂组之间无显著性差异(p＞0.05)。至第23天时，涂抹Ad HGF组创口已全部愈合(20/20)，而Ad-GFP及溶剂组各有2/20和6/20个创口明显地未完全愈合。而且Ad-HGF组创口愈合较为平坦，有的甚至与周围邻近正常皮肤完全相同，而Ad-GFP及溶剂组均明显增厚。光学显微镜下观察表明，涂抹Ad-HGF组创口只有2/20个尚未完全再表皮化，而Ad GFP及溶剂组各有10/20个未完全再表皮化。涂抹Ad-HGF组创口真皮中纤维薄且排列整齐，而对照组的纤维厚且排紊乱。
另外，在涂抹Ad-HGF组创口组织中可见毛囊及皮脂腺的存在，并可见毛囊及皮脂腺的分裂相，尤以大剂量组(109pfu和108pfu组)较为明显(图4)，表明HGF可促进毛发的生长，对皮肤功能的恢复有重要意义。
实施例4：重组腺病毒介导人肝细胞生长因子(Ad-HGF)对组织粘连的作用
(1)Ad-HGF治疗脊髓半离断效果评价
Wistar雌性大鼠体重200-250g，异戊巴比妥钠腹腔注射(100mg/kg)麻醉，背部备皮，分层切开皮肤、皮下组织和椎旁肌，咬除脊突和椎板，暴露胸10节段脊髓作左侧半离断，实验组局部肌注109pfuAd-HGF，对照组用100μl生理盐水，逐层缝合切口。术后六周，心脏灌流生理盐水和4％多聚甲醛的PBS溶液固定动物，取脊髓观察，可见用药组动物局部脊髓与周围肌肉粘连较对照组明显减轻，且瘢痕亦明显减少。
(2)Ad-HGF治疗肠粘连效果评价
Wistar雄性大鼠体重200-250g，麻醉后剪开腹腔，暴露小肠回盲部，用止血钳由回盲部起，钳夹回肠三处，间隔1.5cm。夹后肠管局部发绀，有少量渗血，在钳夹部位涂抹109pfuAd-HGF或生理盐水情20μl，关闭腹腔。10天后处死，剖腹观察，用药组动物形成的粘连较少且粘连带短于对照组。