用于癌症基因治疗的靶向载体构建和用途 本发明属于生物医学专业领域，涉及含有人端粒酶催化亚基基因启动子基因部分核酸序列作为基因表达调控序列的载体构建，以及用于端粒酶阳性肿瘤细胞的基因治疗的用途。
癌症的基因治疗一直是分子生物学研究的热点，但是基因治疗并不如当初人们想象的那样完美。基因治疗关键中的首要问题是基因治疗的靶向性问题，即在治疗过程中，把治疗作用或药物效应限定在特定的靶细胞、组织或器官内，而不影响其它正常细胞。这对于基因治疗，尤其是恶性肿瘤的治疗尤为重要。利用特异性的基因启动子限制目的基因只在靶细胞中表达是靶向基因治疗的一种有效的治疗途径。
研究表明85％以上的肿瘤细胞和永生化的细胞具有高度的端粒酶活性。人端粒酶的主要成分有端粒酶RNA(hTR)、端粒酶相关蛋白(hTP)、端粒酶催化亚基蛋白(hTERT)。hTR和hTP在人端粒酶活性阴性的正常组织中广泛表达，hTERT只在端粒酶阳性的肿瘤细胞和永生化细胞中表达，正常组织中的hTERT表达被抑制。因此，认为hTERT是人端粒酶复合物的核心成分，其基因地表达状态是细胞调控端粒酶活性的主要环节。这些结果表明hTERT启动子将在肿瘤基因治疗中具有广泛作用。
通过对hTERT启动子序列分析表明在启动子区，一个最显著的特点是GC含量高，无典型的TATA和CAAT盒。在hTERT启动子核心区域存在许多潜在的转录因子结合位点。其中5个Sp1结合位点和2个E盒对hTERT的转录活性至关重要，每个位点发生突变都将导致不同程度的转录活性降低。当5个Sp1位点被同时突变，则可使核心启动子的转录活性下降90％以上。Sp1结合位点和E盒对hTERT的转录活性具有协同作用。
5’GACCCCCGGGTCCGCCCGGAGCAGCTGCGCTGTCGGGGCCAGGCCGGGC
TCCCAGTGGATTCGCGGGCACAGACGCCCAGGACCGCGCTTCCCACGTGG
CGGAGGGACTGGGGACCCGGGCACCCGTCCTGCCCCTTCACCTTCCAGCT
CCGCCTCCTCCGCGCGGACCCCGCCCCGTCCCGACCCCTCCCGGGTCCCCG
GCCCAGCCCCCTCCGGGCCCTCCCAGCCCCTCCCCTTCCTTTCCGCGGCCC
CGCCCTCTCCTCGCGGCGCGAGTTTCAGGCAGCGCTGCGTCCTGCTGCGCA
CGTGGGAAGCCCTGGCCCCGGC 3’
端粒酶催化亚基基因启动子部分DNA序列式
我们利用端粒酶催化亚基(hTERT)启动子在大部分肿瘤细胞中表达的特点，克隆了含有5个Sp1结合位点和2个E盒的319bp的hTERT启动子核心序列，成功构建了hTERT启动子调控的荧光素酶报告载体，并转染肿瘤细胞和正常细胞。结果表明，319bp的hTERT启动子核心片段在端粒酶阳性的肿瘤细胞中具有明显的转录活性，而在端粒酶阴性的正常细胞中则无转录活性。提示由hTERT启动子构建的载体可能是一种新颖和有前景的靶向性基因治疗载体。
为了在肿瘤细胞中诱导凋亡，许多研究者都将焦点集中在一些直接诱导凋亡的基因上，它们的过量表达均可诱发细胞凋亡。其中尤以caspase-3最引人注目。为此，我们选择caspase-3作为效应基因。构建了端粒酶催化亚基(hTERT)启动子调控caspase3基因的真核表达载体，结果表明hTERT启动子调控caspase3基因在端粒酶阳性肿瘤细胞HepG2中明显表达，而在正常人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblast，HEL)中未见表达；caspase3表达能明显对端粒酶阳性肿瘤细胞HepG2、HeLa、Glc和A549的增殖产生明显抑制作用，表明hTERT启动子调控的caspase-3基因表达载体是一种有应用潜力的肿瘤基因治疗载体。
抑瘤素(osm)是一种28KD的细胞因子，其前体由252个氨基酸残基组成，N端有25个氨基的信号肽，C端有类似的胰蛋白酶位点，能切除31个氨基酸残基，形成196个氨基酸的OSM，其抑制因子活性提高5-60倍。OSM的受体分布广泛，生物活性多样，可抑制多种肿瘤细胞系的生长。为此，我们将抑瘤素基因连接到构建好的带有端粒酶启动子序列的真核细胞表达载体中，研究端粒酶启动子在肿瘤细胞中特异表达抑瘤素对肿瘤细胞生长的影响。结果表明hTERT启动子调控的抑瘤素基因对转染的四种肿瘤细胞HepG2、HeLa、Glc和A549的生长均有不同程度的抑制作用。而对端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞的生长没有明显的抑制作用。这表明端粒酶启动子可以调控osm外源基因仅在端粒酶阳性肿瘤细胞中特异表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖，并能减少Osm对正常细胞的毒性。
mda-7(melanoma differentiation-associated gene-7)是在黑色素瘤细胞中首次克隆的基因，随着癌细胞的发育，mda-7的表达减少，并最终消失。mda-7能引起癌细胞的凋亡，而在正常细胞中却无此作用。此外，mda-7表达还有刺激免疫系统的作用。因此，mda-7是肿瘤基因治疗中采用的重要基因。apoptin即鸡贫血病毒(chicken anemia virus，CAV)的VP3蛋白，由121个氨基酸组成，apoptin作为一种转录调节物发挥调控作用。研究发现apoptin蛋白能选择性诱导肿瘤细胞凋亡，且不依赖于p53的介导，不被Bcl-2过表达所抑制，不易产生抗药性，可能成为一种非常有前景的抗肿瘤治疗剂。Apoptin被认为是真正意义上的第一个被发现的可以选择性诱导肿瘤细胞凋亡而不损伤正常细胞的凋亡蛋白。因此，我们也将mda-7和apoptin作为连接在端粒酶启动子序列下游的对癌细胞生长具有抑制或杀伤作用的基因用于肿瘤的基因治疗。
本文构建了hTERT启动子调控的端粒酶阳性肿瘤细胞特异表达的载体，并对其在肿瘤细胞中特异调控表达抑瘤素基因和caspase-3基因对端粒酶阳性肿瘤细胞的生长抑制作用进行了研究。结果表明含有人端粒酶催化亚基基因启动子基因部分核酸序列作为基因表达调控序列的载体可以用于端粒酶阳性肿瘤细胞的基因治疗的用途。
本发明用下列实施例进行解释，这些实施例的目的只是为了解释而不是以任何方式限制本发明。
以下为结合附图进一步说明本发明：
图1.人端粒酶催化亚基hTERT启动子调控的肿瘤靶向性基因治疗载体构建
图2.人端粒酶催化亚基hTERT启动子在肿瘤细胞和正常细胞中的转录活性
图3.人端粒酶催化亚基hTERT启动子调控的osm基因表达载体构建
图4.人端粒酶催化亚基hTERT启动子调控的osm基因表达在体外抑癌作用
图5.人端粒酶催化亚基hTERT启动子调控的caspase-3基因表达载体构建
图6.人端粒酶催化亚基hTERT启动子调控的caspase-3基因表达在体外抑癌作用
图7.人端粒酶催化亚基hTERT启动子调控的caspase-3基因表达在体外诱导细胞凋亡
实施例一
人端粒酶催化亚基hTERT启动子调控的肿瘤靶向性基因治疗载体
以本实验室保存的含有端粒酶催化亚基启动子DNA序列的质粒pcDNA3-hTERT/promoter为模板，设计寡核苷酸引物(引物1：5′-TAGAGCTCGACCCCCGGGTCCGC-3′，引物2：5′-TAGCTAGCCGGGGCCAGGGCTT-3′)，进行PCR扩增，得到hTERT基因起始位点上游的启动子序列，克隆入pGEM-T载体，得到pGEM-T/hTERT-promoter，测序结果表明序列正确。从pGEM-T/hTERT-promoter重组质粒中用SacI和NheI双酶切消化切出含有启动子的片段，将其插入pGL3-Enhancer载体，获得重组载体phTERTleu。图1为phTERTluc质粒构建示意图。
为了证实hTERT启动子在人端粒酶阳性肿瘤细胞中的转录活性，采用了荧光素酶报告质粒的瞬时转染。pGL3-basic载体缺少真核启动子和增强子序列，在本研究中主要作为阴性对照；pGL3-control载体包含SV40启动子和增强子序列，能在多种哺乳动物细胞中高表达荧光素酶基因，能很好地用来检测转染的效率，本研究中主要用来作为阳性对照。具有SV40启动子的阳性对照质粒(pGL3-control)的转录活性在每种细胞株中被认为100％。人肝癌细胞HepG2；肺癌细胞A549、Glc；宫颈癌细胞Hela及正常人胚胎肺成纤维细胞HEL分别接种细胞于6孔细胞培养板中，用含10％胎牛血清的DMEM培养基于37℃，5％CO2条件下培养至60％-80％融合。按等摩尔浓度将pGL3-basic、phTERTluc和pGL3-control三种质粒分别与pRL-CMV内对照质粒在LIPOFECTAMINETM的介导下共转染上述细胞，继续培养48h后收集细胞，每种质粒的用量为0.9μg/孔，内对照质粒用量为0.1μg/孔，脂质体用量为2μl/孔。转染程序按LIPOFECTAMINETM操作说明书进行。按Promega检测试剂盒进行活性检测，各孔细胞导入效率用pRL-CMV活性效正。如图2所示，hTERT启动子在所检测的4种端粒酶阳性肿瘤细胞中均具有明显的转录活性。尤其在Glc细胞株中，hTERT启动子的转录活性为阳性对照SV40启动子的70.6％；A549细胞株中转录活性最低，为23.7％。4种端粒酶阳性肿瘤细胞中，hTERT启动子的转录活性平均为阳性对照的45.2％。相比较而言，在端粒酶阴性的成纤维细胞株HEL中，hTERT启动子无明显的转录活性。这些结果表明，hTERT转录激活在端粒酶阳性的肿瘤细胞中明显上调，而在端粒酶阴性的正常细胞中不表达。
实施例二
人端粒酶催化亚基hTERT启动子调控osm基因表达在体外抑癌作用
将含有抑瘤素基因的质粒pEO-osm经xbaI与EcoRI双酶切后，回收约780bp的osm DNA片段，将其克隆入同样经xbaI与EcoRI双酶切的荧光素酶报告载体phTERTluc1(phTERTluc1为phTERTluc的改构质粒，加入了EcoRI酶切位点)和pGL3-control1(pGL3-control1为pGL3-control的改构质粒，加入了EcoRI酶切位点)中，得到重组载体phTERT-osm和pSV40-osm，图3。
体外验证重组载体phTERT-osm的抑癌作用方法如下，HepG2、HeLa、Glc、A549和HEL细胞均用含10％小牛血清的DMEM培养基、37℃，5％CO2条件下培养。转染前一天，取生长良好的细胞，胰酶消化，记数，将细胞浓度调至2.5×104个/ml，在96孔细胞培养板的每孔中加入0.2ml含上述细胞的DMEM培养液，每孔细胞数为5×103个。以phTERTluc1、phTERT-osm和pSV40-osm质粒DNA在LIPOFECTAMINE2000的介导下转染上述细胞，质粒用量为0.1μg/孔；脂质体Lipofectamine 2000用量为0.2μl/孔。每种质粒转染为10个孔，转染程序按LIPOFECTA MINETM操作说明书进行。继续培养48h后收集细胞。采用MTT法检测细胞增殖情况。
转染phTERT-osm质粒后，在四种端粒酶阳性的肿瘤细胞中细胞的增殖均出现了抑制，其中对HepG2的抑制率最高，达46％；而对A549的抑制率最低为12.4％，但也明显高于对端粒酶阴性的正常细胞的抑制率(1.8％)；而在转染阳性对照质粒pSV40-osm后，肿瘤细胞和正常细胞均现了细胞增殖抑制现象，其中HEL细胞的增殖抑制率为20.4％。这表明hTERT启动子调控的osm基因能在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达，同时对肿瘤细胞的增殖产生明显的抑制作用；而在端粒酶阴性的正常细胞中，hTERT启动子的活性不被激活，osm基因不能表达，对细胞的增殖没有明显的影响，图4。
实施例三
人端粒酶催化亚基hTERT启动子调控caspase-3基因表达在体外抑癌作用
将质粒pcDNA3-caspase3经xbaI与EcoRI双酶切后，回收约850bp的caspase3 DNA片段，将其克隆入经xbaI与EcoRI双酶切的荧光素酶报告载体phTERTluc1和pGL3-control1中，得到重组载体phTERT-caspase3和pSV40-caspase3，图5。
体外验证重组载体phTERT-caspase-3的抑癌作用方法如下，HepG2、HeLa、Glc、A549和HEL细胞均用含10％小牛血清的DMEM培养基、37℃，5％CO2条件下培养。转染前一天，取生长良好的细胞，胰酶消化，记数，将细胞浓度调至2.5×104个/ml，在96孔细胞培养板的每孔中加入0.2ml含上述细胞的DMEM培养液，每孔细胞数为5×103个。以phTERTluc1、phTERT-osm和pSV40-osm质粒DNA在LIPOFECTAMINE2000的介导下转染上述细胞，质粒用量为0.1μg/孔；脂质体Lipofectamine 2000用量为0.2μl/孔。每种质粒转染为10个孔，转染程序按LIPOFECTA MINETM操作说明书进行。继续培养48h后收集细胞。采用MTT法检测细胞增殖情况。
转染phTERT-caspase3质粒后，在四种端粒酶阳性的肿瘤细胞中细胞的增殖均出现了抑制，其中对HepG2的抑制率最高，达37.9％；而对A549的抑制率最低为10.5％，但也明显高于端粒酶阴性正常细胞的抑制率(0.3％)；而在转染对照质粒pSV40-caspase3后，肿瘤细胞和正常细胞均现了细胞增殖抑制现象，其中HEL细胞的增殖抑制率为11.5％。这表明hTERT启动子调控的caspase3基因能在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达，同时对肿瘤细胞的增殖产生明显的抑制作用；而在端粒酶阴性的正常细胞中，hTERT启动子的活性不被激活，caspase3基因不能表达，对细胞的增殖没有明显的影响，图6。
为了进一步阐明phTERT-caspase3的作用机制，采用流式细胞术(FCM)检测细胞的凋亡。方法如下：转染前一天，取生长良好的细胞记数，调整细胞浓度为4×104个/ml，在大号培养瓶中加入5ml含上述细胞的培养基，每瓶细胞数为2×105个，具体的转染步骤参照前面的有关内容。转染时质粒的用量为5μg/瓶；脂质体为10μl/瓶。收集的细胞用含5％小牛血清的PBS洗两次，细胞重悬于75％乙醇中，-20℃固定24h，1000g离心5min，再用1mlPBS洗一次，最后用1ml含50μg/μl RNase A和50μg/μl PI的PBS重悬细胞沉淀，置37℃水浴中作用30min，取出后，4℃避光保存，4h内上机检测。
转染phTERT-caspase3质粒后，在四种端粒酶阳性的肿瘤细胞中，均诱导了细胞凋亡，凋亡率为15.39-35.19％，而在HEL细胞中未发生明显的凋亡。转染对照质粒pSV40-caspase3后，肿瘤细胞和正常细胞均出现了细胞凋亡，其中HEL细胞凋亡率为11.5％，图7。