一种见血青再生及快速繁殖方法.pdf

本发明属于濒危野生植物中重要植物材料的快速繁殖方法，特别是涉及一种见血青再生及快速繁殖方法。该方法包括材料选取与消毒、诱导培养、增殖培养、诱导生根和移栽。本发明是为了解决现有技术中种子自身没有营养体在自然环境下发芽率低、生根难、生长缓慢的问题，为规模化、产业化提供技术支持。本发明扩繁系数高，增殖时间短，大大缩短了生长过程，经20～25d诱导生根后可成苗、移栽成活率高达96%以上；节约了大量成本，成苗移植后成活率高，兰苗健壮挺拔，长势良好，整齐一致。为见血青的保护，以及规模化、产业化生产推广应用提供技术支持。

权利要求书1.  一种见血青再生及快速繁殖方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：1）材料选取与消毒：从见血青基部剪取3~10cm的新芽，用流水将新芽上泥土冲洗干净，然后剪去新芽上叶片后进行消毒，消毒完成后进行接种；2） 诱导培养：将经消毒处理后的材料，切成带1～2个节点、长1～2cm的茎段平放接种于经高温、高压灭菌的芽诱导培养基中；培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间10h/d，光照强度1000～1500lx；3） 增殖培养：将经上述诱导培养，所得到的生长良好的丛生芽切成长2.0～2.5 cm，接种在增殖培养基中，光照时间10h/d，光照强度1500～1800lx；4） 诱导生根：将增殖培养出来的带有叶2～3片，株高4～5cm的无根幼苗单株切下，转移到生根培养基中；光照时间11h/d，光照强度1500～2000lx；5） 移栽：当诱导生根培养试管苗生长至高5～6 cm，根3～5条，叶3～5片，叶长2～3cm时， 将试管苗放在自然光下炼苗4～6天，再打开瓶盖炼苗1-2天，然后从培养瓶中取出培养苗，洗去附着在根系上的培养基，移入蛭石和腐殖土质量比为1:2的混合基质中，保湿遮阴，获得生长健壮的完整再生植株。2.  根据权利要求1所述的见血青再生及快速繁殖方法，其特征在于：步骤2）所述芽诱导培养基：MS+2.0 mg/L-1 6-BA +0.5 mg·L-1  KT+0.3mg·L-1 NAA+ 0.5mg·L-1 ZE 1 g·L-1 花宝 1号+25g·L-1 Su+6.5g·L-1 Ag+1.5 g·L-1Ac+20 g·L-1 香蕉+30 g·L-1土豆，pH值为5.6。3.  根据权利要求1所述的见血青再生及快速繁殖方法，其特征在于：步骤3）所述增殖培养基：MS+3.0mg·L-1  6-BA  +0.5 mg·L-1  KT+ 0.5mg·L-1 NAA + 1.0mg·L-1 ZE+ 2 g·L-1 花宝 1号+25g·L-1 Su+6.5g·L -1 Ag+1.5 g·L-1Ac+ 20 g·L-1 香蕉+30 g·L-1土豆，pH值为5.6。4.  根据权利要求1所述的见血青再生及快速繁殖方法，其特征在于：步骤4）所述生根培养基：1/2MS+1.0 mg·L-1 IBA+0.1 mg·L-1 NAA+1 g·L-1花宝 2 号+20g·L-1 Su+6.5 g·L -1Ag+1.5 g·L-1Ac，pH值为5.6。

说明书一种见血青再生及快速繁殖方法
技术领域
本发明属于濒危野生植物中重要植物材料的快速繁殖方法，特别是涉及一种见血青再生及快速繁殖方法。
背景技术
见血青(Liparis nervosa(Thunb．)Lindl．)，又名脉羊耳蒜，别名毛慈菇、脉羊耳兰，兰科(Orchidaceae)羊耳蒜属(Liparis)1～2年生草本植物，见血青味苦，性凉，用于肺热咳血，吐血、肠风下血，血崩，肺热咳嗽，惊风等以及外用于刨伤出血，跌打损伤，皮炎，疮疖肿毒，蛇毒咬伤。见血青多糖和总生物碱具有较好的抗氧化性和抑菌效果，不仅对细菌有抑制作用，对真菌也有较强抑制作用。全草含见血青碱(nervosine)，在《民间常用草药汇编》、《浙江民间常用草药》、南川《常用中草药手册》、《四川常用中草药》、《贵州药植目录》等书中均有记载，是一种民间常用中草药，为国家二级保护植物。见血青种子没有营养体，在自然环境下发芽率极低、生根难（见血青在第一年秋季就已经开始萌芽，但直到 年5月上句开始才观察到有新根生出，并持续到7月下旬）、生长缓慢（第一年9月上旬开始在当年生植株第一圈脱落苞片的落痕处出现心形的芽苞，此后虽然不断增长，但生长量一直不大，到翌年4月中旬方才进入．快速生长时期）加上人为过度采收，野生资源遭破坏日益严重已经面临枯竭。采用组织培养技术快速繁殖大量优质种苗，有助于解决资源匮乏、缓解野生资源遭受严重破坏的压力，以有效地保护有限的野生资源，为规模化、产业化提供技术支持。有关见血青植株再生及快速繁殖技术未见报道。
发明内容
为了解决现有技术中种子自身没有营养体在自然环境下发芽率低、生根难、生长缓慢的问题，本发明提供了一种见血青再生及快速繁殖方法，为规模化、产业化提供技术支持。
本发明的方法是以如下方式实现的：
1.      一种见血青再生及快速繁殖方法，其具体步骤如下
1）材料选取与消毒：从见血青基部剪取3~10cm的新芽，用流水将新芽上泥土冲洗干净，然后剪去新芽上叶片后进行消毒，消毒完成后进行接种。
2） 诱导培养：将经消毒处理后的材料，切成带1～2个节点、长1～2cm的茎段平放接种于经高温、高压灭菌的芽诱导培养基中；培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间10h/d，光照强度1000～1500lx；
3） 增殖培养：将经上述诱导培养，所得到的生长良好的丛生芽切成长2.0～2.5 cm，接种在增殖培养基中，光照时间10h/d，光照强度1500～1800lx；
4） 诱导生根：将增殖培养出来的带有叶2～3片，株高4～5cm的无根幼苗单株切下，转移到生根培养基中；光照时间11h/d，光照强度1500～2000lx；
5）移栽：当诱导生根培养试管苗生长至高5～6 cm，根3～5条，叶3～5片，叶长2～3cm时， 将试管苗放在自然光下炼苗4～6天，再打开瓶盖炼苗1-2天，然后从培养瓶中取出培养苗，洗去附着在根系上的培养基，移入蛭石和腐殖土质量比为1:2的混合基质中，保湿遮阴（温度控制在15～35℃，湿度应保持在75％～85％，避免阳光直射），获得生长健壮的完整再生植株。
2 . 上述方法涉及的培养基：
1）芽诱导培养基  MS+2.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L KT+0.3mg/LNAA+ 0.5mg/LZE 1 g·L-1 花宝 1号+25 g /L Su+6.5g/L Ag+1.5 g·L-1Ac+20 g·L-1 香蕉+30 g·L-1土豆，pH值为5.6；
2）增殖培养基  MS+3.0mg/L 6-BA  +0.5 mg/L KT+ 0.5mg/LNAA + 1.0mg/LZE+ 2 g·L-1 花宝 1号+25g/L Su+6.5g/L -1 Ag+1.5 g·L-1Ac+ 20 g·L-1 香蕉+30 g·L-1土豆，pH值为5.6；
3）生根培养基  1/2MS+1.0 mg/LIBA+0.1 mg/LNAA+1 g·L-1花宝 2 号+20g/L Su+6.5g/L Ag+1.5 g·L-1Ac，pH值为5.6；
以上涉及：1、Ag为（Agar 培养基凝固剂和支持物琼脂粉的缩写）；
2、Su为（Sugar提供植物碳源和维持渗透压蔗糖的缩写）；
3、Ac为活性炭。
本发明选取饱满、无病虫害见血清植株茎段作为诱导材料， 在无菌条件下诱导培养 15～20d可萌发出生长健壮新芽；经20～30d增殖培养可产生大量增殖芽体，扩繁系数高，增殖时间短，大大缩短了生长过程，经20～25d诱导生根后可成苗、移栽成活率高达96%以上；节约了大量成本，成苗移植后成活率高，兰苗健壮挺拔，长势良好，整齐一致。
        本发明的显著优点：
一：通过本发明方法可以最大限度地应用现有资源，通过生物技术手段在短时间内解决稀缺资源的应用需求；
二：有助于解决资源匮乏、缓解野生资源遭受严重破坏的压力，有效地保护有限的野生，为规模化、产业化提供技术支持。
三：原生种生长缓慢、生长量不大，有关药用植物见血青植株再生及快速繁殖技术未见报道。
四：见血青植株再生及快速繁殖配方，增殖系数高、生根率高，植物生长需求时间短，栽培后适应性强，苗木健壮挺拔，长势良好，整齐一致，大大缩短了苗木培养过程，节约了大量成本。为见血青的保护，以及规模化、产业化生产推广应用提供技术支持。
五：总结出一套可供生产单位应用的见血青高效微体繁殖技术，通过应用该技术建立见血青生产基地。因此，见血青繁育的广泛应用可直接提高珍稀品种人工林地产量、质量和园林绿化水平，实现资源高效培育，具有十分广阔的产业化发展前景。本发明创新性强，技术含量高，公益性强，对于促进珍稀兰花品种的研究、利用，有着良好前景和及其重要意义，为开发利用该种资源提供了理论依据和技术支持。
具体实施方式
实施例1
一种见血青再生及快速繁殖方法，具体步骤如下
1）材料选取与消毒：1、从见血青基部剪取3~10cm的新芽，用湿纱布包好，带回实验室后用置流水将植株上泥土冲洗干净；2、植株消毒处理：用医用剪刀剪去植株上叶片后置饱和漂白粉上清液中浸泡10min，并用软毛刷轻微刷洗冲洗干净后在自来水下滴冲20 min，经双蒸水冲荡2次后置超净工作台内用75%酒精消毒30s，倒去酒精，加入0.1%升汞(HgCl2)处理10min，将汞液倒入废汞瓶，无菌水冲3遍，用消毒滤纸吸干表面水分后即可进行接种。
2） 诱导培养：将经消毒处理后的材料，切成带1个节点长1cm的茎段分别平放接种于经高温、高压灭菌的芽诱导培养基中；培养条件：培养室温度为23℃，光照时间10h/d，光照强度1200lx，培养时间15d；
3） 增殖培养：将经上述诱导培养，所得到的生长良好芽植株切成长2.0cm，分别接种在增殖培养基中，光照时间10h/d，光照强度1600lx,，增殖培养时间20d；
4） 诱导生根：将继代诱导培养出来的带有叶2片，株高4cm无根幼苗单株切下，转移到生根培养基中；光照时间11h/d，光照强度1800lx，诱导生根时间20d；
5） 试管苗培养完成：当诱导生根培养试管苗生长至高5 cm，根3条，叶3片，叶长约2cm时完成诱导见血清植株再生并可以进行周期性大量繁殖培养；
6）将完成生根培养试管苗放在自然光下炼苗5天，打开瓶盖炼苗1天，以增强试管苗对室外环境的适应能力；然后用摄子从培养瓶中取出培养苗，洗去附着在根系上的培养基，移入蛭石和腐殖土(1:2)混合的基质中，保湿遮阴（温度控制在25℃，湿度保持在80％，避免阳光直射，成活率可达97%以上。1周后植株适应能力逐渐增强，获得生长健壮的完整再生植株。
7）植株经过在大棚适应能力的适应性栽培30天后，即可进行迁地林下种植。
2 . 培养基：
培养基配制：基本培养基为MS，生长激素为BA、KT、NAA 、ZE、 花宝 1号，成熟度为80%香蕉20 g·L-1，土豆30 g·L-1  蔗糖Su为25g·L-1，琼脂粉Ag为6.5g·L-1，PH值为5.6，活性炭Ac为1.5 g·L-1；培养基厚度为1.5cm左右；
1)        芽诱导培养基  MS+2.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L KT+0.3mg/LNAA+ 0.5mg/LZE 1 g·L-1 花宝 1号+25g/L Su+6.5g/L Ag+1.5 g·L-1Ac+20 g·L-1 香蕉+30 g·L-1土豆；
2)        增殖培养基  MS+3.0mg/L 6-BA  +0.5 mg/L KT+ 0.5mg/LNAA + 1.0mg/LZE+ 2 g·L-1 花宝 1号+25g/L Su+6.5g/L -1 Ag+1.5 g·L-1Ac+ 20 g·L-1 香蕉+30 g·L-1土豆；
3)        生根培养基  1/2MS+1.0 mg/LIBA+0.1 mg/LNAA+1 g·L-1花宝 2 号+20g/L Su+6.5g/L Ag+1.5 g·L-1Ac。