具有抑制白细胞功能和凝血酶活性的双功能嵌合蛋白 白细胞抑制因子(neutrophil inhibitory factor，NIF)是正常存在于寄生性钩虫中的一种糖蛋白，它能有效地抑制中性粒细胞的活性，包括与内皮细胞的粘附、过氢化氢和超氧化离子的释放、中性粒细胞趋化和聚集、吞噬功能等。NIF的体外有效作用浓度IC50为10nm。进一步实验证明NIF主要通过与白细胞Mac-1受体结合，即CD116/CD18。来源于动物寄生性钩虫中的NIF基因已被克隆，由257个氨基酸组成，属于酸性蛋白，等电点为4.5，可与ConA结合，分子量为41Kd，含有五对二硫键，抑制白细胞功能，对白细胞无细胞毒性。重组的NIF在原核和真核细胞中的均成功表达。NIF的糖基化位点的点突变对其生物作用影响不大。由于NIF的特异药效功能，证明治疗感染性疾病有明显疗效，对于临床上与白细胞功能增强如白细胞粘附和凝集引起的微血管阻塞以及白细胞介导的组织损伤等引起了相关疾病如休克、中风、急慢性异体移植排斥反应、自身免疫性疾病等具有治疗价值。
水蛭素是由吸血水蛭的唾液腺分泌的一种具有特异抑制凝血酶功能的小肽，由65个氨基酸组成，主要由HV1、HV2和HV3三个亚型组成。自然存在地水蛭素变异体的C端14个氨基酸的同源性高，并证明是水蛭素与凝血酶的主要结合位点，能抑制凝血酶活性。应用基因工程重组表达的水蛭素已在临床上用于抗凝治疗。近年将水蛭素C端肽段53-64(NGDFEEIPEEYL)位氨基酸(又名Hirugen)与D-Phe-Pro-Arg-Pro-(Gly)4连结而成的二价水蛭素(又名Hirulog)，由人工肽合成制备的产品已在心脏血管手术后的抗凝血治疗中应用。水蛭素或其C端肽段所具有抗凝血的功能，与其它抗凝血药物如肝素不同，它是通过专一性与凝血酶结合抑制其活性而起作用。
本发明在于发明一种将白细胞抑制因子与水蛭素通过基因工程手段而形成的双功能嵌合蛋白，使其具有抑制中性粒白细胞的功能和抑制凝血酶活性。这种双功能嵌合蛋白(NHH，NIF-Hirudin Hybrid)的设计思路源于急性脑血管疾病的病理机理。
心脑血管性疾病是目前危害人体生命健康的主要疾病，其中因急性脑出血和脑血栓引起的死亡率极高。急性脑出血和脑血栓造成的脑组织损伤、脑水肿尚无有效的治疗手段。急性脑出血和脑血栓引起的脑组织损伤主要由白细胞介导引起，白细胞通过其与血管内皮细胞的粘附以及聚集引起微血管的阻塞，白细胞的功能活化引起局部脑组织的非感染性损伤。同时血小板的聚集形成微小血栓，造成脑组织的缺血。目前临床上在这方面仅靠应用抗凝血药物如肝素来抑制血小板聚集，改善凝血功能增加血管通透性。而对主要的白细胞引起的病变无治疗措施。因此，急性脑出血和脑血栓后的病人脑组织损伤的恢复效果差，由此造成的神经系统的后遗症严重。近来证明，因急性脑出血和脑血栓引起的脑水肿与局部的凝血酶活性有直接相关性。文献资料显示凝血酶在实验动物中可直接引起脑水肿，通过给予水蛭素治疗(局部或全身)可显著减经因凝血酶引起的脑水肿。急性脑出血和脑血栓后血液和全部组织中的凝血酶原在脑血肿中被组织因子激活成凝血酶，是引起脑组织损伤和脑血肿周围的脑水肿的主要原因。目前临床对此方面的治疗是应用甘露醇等来被动降低脑压减轻脑水肿的损伤，因其被动治疗效果不理想。
本发明依据白细胞抑制因子(NIF)和水蛭素的生物作用特点，以及急性脑出血和脑血栓引起的脑组织损伤和脑水肿的病理基础，发明了将白细胞抑制因子与水蛭素通过中间交联蛋白区连结成一种双功能嵌合蛋白(NHH)。重组NHH双功能嵌合蛋白应用基因工程手段如基因设计改造、人工基因合成、重组表达载体构建、发酵和纯化等而获得。NHH的设计中NIF区域的氨基酸序列位于嵌合蛋白的N端，为了保证嵌合蛋白中的水蛭素片段不会因三级结构构象而影响活性蛋白的功能，中间通过5-10个甘氨酸交链区与NIF的C末端连结而成。这种创新的设计能最有效地发挥NIF的白细胞抑制作用，发挥水蛭素的抑制凝血酶活性作用。本发明的另一特征在于通过NIF蛋白区域与Mac-I受体结合，使水蛭素在局部发挥更有效的抗凝血酶的功能，起到一种类似导向的作用。本发明发明的具有抑制白细胞功能和凝血酶活性的双功能嵌合蛋白(NHH)在于开发出一种治疗急性脑出血和脑血栓引起引起了脑组织损伤和脑水肿，以及抗凝血治疗的新型药物。本发明所述的重组双功能嵌合蛋白应用现有药物制剂技术，可制备成注射型和非注射型的药物制剂，如注射液、冻干粉、脂质体、胶囊、片剂以及缓释、控释等剂型。
本发明实例中NHH由含257个氨基酸残基的NIF和5个甘氨酸交联区和水蛭素C端53-64位的12个氨基酸残基组成，即含有274个氨基酸。根据酵母或大肠杆菌的编爱密码子的原则，用剃归PCR法人工全合成相对应cDNA基因片段。经测序证明人工合成的NHH全基因序列与设计值一致后，用限制性内切酶与酵母或大肠杆菌的高效表达载体在连结酶作用下连结，转化相应的酵母或大肠杆菌宿主菌后筛选获得高效表达的重组NHH(rNHH)菌种。经发酵和蛋白纯化(如离子吸附、反向层析和分子筛、超滤等)可制备具生物活性的rNHH。同样原理可将NHH双功能嵌合蛋白在真核哺乳细胞或昆虫细胞中获得高效表达。由此制备而成的重组NHH，可用于急性脑出血和脑血栓疾病的治疗。
实例1：双功能嵌合蛋白NHH的氨基酸序列和cDNA合成
本实例设计的NHH由274个氨基酸组成，其中N末端含NIF的257个氨基酸，C末端含水蛭素的第53-64位氨基酸肽段，中间含5个甘氨酸交链区。根据Seq1列出的NHH氨基酸序列，以GeneBank中NIF的cDNA序列为根据，结合酵母和大肠杆菌表达的偏爱密码子原则，设计了NHH相对应的用于人工合成的cDNA序列(Seq2)。设计的NHH cDNA序列由834个碱基组成(带有双终止子TAA TGA和5’端的AAA AGA用酵母的分泌表达)，同时在374位和492位处设计了HindIII和HpaI两个内切酶位点。
Seq1：(NHH的274个氨基酸序列)
NEHNLRCPQNGTEMPGFNDSIRLQFLAMHNGYRSKLALGHISITEESESDDDD
DFGFLPDFAPRASKMTYLEYDCEAEKSAYMSARNCSDSSSPPEGYDENKYIFE
NSNNISEAALKAMISWAKEAFNLNKTKEGEGVLYRSNHDINFANLAWDAREK
FGCAVVNCPLGEIDDETNHDGETYATTIHVVCHYPKINKTEGQPIYKVGTPCD
DCSEYTKKADNTTSADPVCIPDDGVCFIGSKADYDSKEFYRFRELGGGGGNG
DFEEIPEEYL
Seq2：(NHH cDNA的822个碱基序列)
aac gaa cac aac ttg aga tgt cca caa aac ggt act gaa atg cca ggt ttc aac gac tcc atc aga ttg
caa ttc ttg gct atg cac aac ggt tac aga tcc aag ttg gct ttg ggt cac atc tcc atc act gaa gaa
tcc gaa tcc gac gac gac gac gac ttc ggt ttc ttg cca gac ttc gct cca aga gct tcc aag atg aga
tac ttg gaa tac gac tgt gaa gct gaa aag tcc gct tac atg tcc tct aga aac tgt tcc gac tcc tcc
tcc cca cca gaa ggt tac gac gaa aac aag tac atc ttc gaa aac tcc aac aac atc tcc gaa gct
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ggt tgt gct gtt gtt aac tgt cca ttg ggt gaa atc gac gac gaa act aac cac gac ggt gaa act tac
gct act act atc cac gtt gtt tgt cac tac cca aag agc aac aag act gaa ggt caa cca atc tac aag
gtt ggt act cca tgt gac gac tgt tcc gaa tac act aag aag gct gac aac act act tcc gct gac cca
gtt tgt atc cca gac gac ggt gtt tgt ttc atc ggt tcc aag gct gac tac gac tcc aag gag ttc tac
aga ttc aga gaa ttg ggc ggt ggc ggt ggc aac ggt gac ttc gaa gaa atc cca gaa gaa tac ttg
根据Seq2的NHH cDNA碱基序列设计合成十对互补重叠引物，用递归PCR方法扩增获得NHH cDNA双链片段。经插入PUC57测序质粒，并由全自动DNA测序仪(ABI)测序确定人工合成的cDNA片段碱基序列与设计值完全一致后，用于酵母或大肠杆菌表达重组质粒的构建。
实例2：双功能嵌合蛋白NHH在毕节酵母中的分泌表达及制备
在NHH cDNA全基因人工合成时在5’端引入了XhoI，3’端引入了XbaI内切酶位点，用于毕节酵母的表达载体PICZα-A(Invitrogen公司)的重组质粒构建。首先从PUC57-NHH质粒中用XhoI和XbaI双酶切下NHH片段并回收，将PICZ α-A经同样双酶切后回收大片段。在T4连结酶作用下连结，转化大肠杆菌TOP10，筛选含NHH外源片段的重组表达质粒PICZα-NHH。此重组质粒经SalI线性化，用电转导仪(Bio-rad)转化GS115酵母宿主菌，在含组氨酸和Zeocin(1.0mg/ml)的YNB平板中筛选表达菌株。酵母菌的培养和甲醇诱导表达按常规文献方法进行，重组NHH的表达筛选用直接抗凝血酶活性测定方法。经72小时诱导表达后，筛选出培养液中抗凝血酶活性(AU)为200AU/ml的高效表达菌株。
分泌表达重组NHH的毕节酵母菌株经5升发酵培养和甲醇诱导60小时后，可获发酵液中重组NHH抗凝血酶活性1100AU/ml(相当于1.2克/升发酵液表达量)。经离心除去菌体，发酵液超滤浓缩除盐后，进行二次柱层析纯化。Q-Sepharose FF(Pharmacia)在25mM Tris(pH8.0)，0.35M NaCL洗下的目的蛋白，经透析后用羟基磷灰右(Bio-rad)柱层析，用40mM K2HPO4(pH7.4)洗下目的蛋白，纯度95％。再经G-25除盐换成10mM磷酸盐缓冲((pH7.0)。
实例3：双功能嵌合蛋白NHH在大肠杆菌中的重组表达
用带T7启动子的PET21a(Novagen)大肠杆菌表达载体构建NHH的重组质粒。首先合成一对用于PCR扩增的引物：
Seq4：(正向，32base)
5｀-CG CAT ATG AAC GAA CAC AAC TTG AGA TGT CCA-3｀
NdeI
Seq3：(反向，32base)
5｀-TG GGA TCC TTA CAA GTA TTC TTC TGG GAT TTC-3｀
BamHI
以PUC57-NHH质粒作模板，扩增出830bp左右的NHH片段。此PCR片段能被HindIII双酶切成370和460bp二个片段。将PET21a和NHH PCR片段经NdeI和BamHI双酶切并回收相应片段后，T4连结酶连结。转化大肠杆菌DH52，筛选含DHH外源基因重组质粒，命名为PET-NHH。此重组质粒转化BL21(DE3，plyS)，获得重组NHH的大肠杆菌的表达菌株。经0.5mM IPTG诱导表达4小时，目的蛋白表达量达25％。
重组NHH在大肠杆菌中主要以包涵体表达。经10升发酵的菌体，用25mM TrispH8.0，1.0mg/ml溶菌酶破菌和超声后，获得重组NHH包涵体。包涵体用6M尿素溶解后，对25mM Tris pH8.0，0.2M NaCL透析复性。复性液经实例二中的Q-Sepharose和Hydroxyapatite二层柱层析。最终的重组NHH用Sephacryl S-100凝胶分离获得纯度大于98％目的蛋白。
实例4：重组NHH的特性测定和生物作用
1.分子量：
经15％SDS-PAGE还原电泳酵母和大肠杆菌表达的重组NHH分子量接近，约35Kd。证明酵母表达的重组NHH未糖基化。
2.等电点：
经3-10pH范围的等电聚焦电泳，重组NHH的PI位3.5～4.1之间。
3.氨基酸组成：
经酸水解后，用氨基酸分析仪测定的氨基酸组成与理论值基本一致，含有45个碱性氨基酸，24个酸性氨基酸，10个半胱氨基酸。
4.N末端序测分析：
经Edman法氨基酸序列测定，重组NHH的N端氨基酸序列为NENNLRCPQNGTEMPG
5.抗凝血酶的生物活性：
用直接凝血酶每活性测定方法测定。具体方法简述为：取100ul人纤维蛋白原(5％)，加入不同稀释度的重组NHH样品100ul(25mMTris，pH8.0)混匀后，逐步加入人凝血酶4ul(250IU/ml)。倒置混匀后37℃中水浴1分钟，观察纤维蛋白凝固状态，以能抗一个单位凝血酶活性是确定为一个活性单位。根据本法测得酵母和大肠杆菌制备的重组NHH抗凝血酶比活性(AU/mg蛋白)分别为1250和1180，两者相近。
6.抗中性粒细胞的粘附作用
取健康人血用Ficoll分离中性白细胞，用HAS溶液(RPMI1640，20mMHEPES，pH2.4，1％HAS，1.2mM CaCL2，1mM MgCL2培养基)配成5×106细胞/ml细胞悬浮。依次将不同稀释度的重组NHH样品20ul，2.4mM的PMA溶液15ul，50mM的CaCL2溶液5ul，白细胞悬浮60ul加入96孔培养板中，混匀。37℃，5％CO2培养2-4小时后，用PBS洗去未粘附的细胞，0.5％(W/V)结晶紫染色，1％Triton X-100溶解染色后粘附细胞。经630nm波长的酶标仪测定OD值，与对照组相比较，计算中性白细胞粘附减少一半的重组NHH浓度，即IC50。根据本方法测定酵母和大肠杆菌制备的重组NHH抑制中性粒细胞粘附作用的IC50分别为11.2nM和12.5nM，两者相近。
7.抑制中性粒细胞的过氧化氢释放
取健康人白人Ficoll分离中性白细胞，用HBSS溶液(20mM葡萄糖，10％FBS，200mg/ml酚红，32mg/ml过氧化氢酶)配成6×106细胞/ml悬液。在塑料试管中(预先用HBSS带50％FBS包被1小时)，加入终浓度为250mM的fMLP(Sigma)和细胞悬浮及待测重组NHH样品，37℃湿育1小时后，离心取上清200ul加入96孔酶标板中。每孔加入10ul的1M NaOH后用波长610nm的酶标仪测定OD值。与标准过氧化氢的曲线比较，计算使过氧化氢释放减少一半的重组NHH的浓度IC50。根据本方法测得酵母和大肠杆菌制备的重组NHH抑制中性粒细胞释放过氧化氢的IC50分别为10.1nM和11.4nM。