中药雷公藤及其提取物减毒增效的改性工艺 【技术领域】
本发明涉及天然药物提取、纯化和鉴定方法，特别涉及中药雷公藤及其提取物的改性工艺。
背景技术
雷公藤泛指卫矛科雷公藤植物，中国产四种，其中有三种入药，即雷公藤(Triptergium wilfordii Hook.f.)，产于浙江、安徽、湖南、福建等省区，主要在长江中下游地区；昆明山海棠(T.hypoglaucum Hutch)，产于长江流域及西南；东北雷公藤(T.regelii Spragnc et Takcda)又称黑蔓，主要产于东北和日本。雷公藤最早收载于《神农本草经》，多年来临床广泛用于治疗类风湿性关节炎、慢性肾炎、肝炎、血小板减少性紫癜和各种皮肤病。目前在抗生育、抗肿瘤、抗器官移植后体内排斥等方面的研究也已取得较大进展，是一种很有发展前途的药物。自1936年首次报道从雷公藤根部提取分离得萜类色素雷公藤红以来，已从雷公藤属植物中分离出100多种成分，其中二萜类和生物碱类是主要的活性成分。
雷公藤全株都有毒，若使用不当，服药期间常伴有毒副反应发生。动物实验显示雷公藤毒性最敏感的靶器官是胃肠系统，造血系统和生殖系统，以消化道反应最常见。环氧二萜类化合物雷公藤内酯醇(I)为治疗类风湿关节炎的主要有效成分，也是主要毒性成分，且有效剂量与毒性剂量几乎相当，这大大妨碍中药雷公藤在临床应用方面的进一步推广。雷公藤中的另外一个重要的环氧二萜类化合物是雷公藤氯内酯醇(II)，药理活性筛选结果表明，II具有I的抗炎、免疫抑制和抗生育活性，效价约为I的100～200倍，而且已被证实无致突变作用。基于化合物II和I之间有化学关联，在实验室内利用相对含量较高地I已经实现了II的半合成。但是化合物I在原植物中的含量也不高，这就大大限制了半合成方法的应用，再加上化合物II由原植物提取得率极低，其原料来源已成为一个至关重要的问题。
实验研究显示，文火长时间煎煮可以有效地降低雷公藤的毒性，但因许多有效成分被破坏，其疗效也有所下降。因此可利用改性方法对药材中的I进行结构改造，以获得高效低毒的雷公藤药物。国内在雷公藤减毒增效改性方面的主要技术尚属空缺。
【发明内容】
本发明的目的在于弥补现有技术中存在的不足之处，而提供一种成本低、毒性小的中药雷公藤提取物的改性工艺。
本工艺原理是：采用酸体系，处理雷公藤(全草或部分)或从雷公藤中提取制得的浸膏，根据主要活性、毒性成分的理化特性的特点，使其主要活性成分，也是主要毒性成分结构发生改变，这样雷公藤的毒性降低，促进其作为抗炎、抗肿瘤等药物开发的产业化。
本发明目的可以通过如下措施来实现：首先采用将雷公藤(全草或部分)或从雷公藤提取中制得的浸膏，用中等极性有机溶剂抽提，抽提物先过中性氧化铝柱进行初步纯化，除去色素及小极性杂质部分，将收集到的活性部分，用酸体系处理。最后酸体系直接处理雷公藤(全草或部分)或从雷公藤提取中制得的浸膏及其中等极性有机溶剂提取物，经药理实验证明，其毒性降低，疗效不变。
本发明的具体改性工艺按以下步骤进行：
第一步：雷公藤(全草或部分)中总成分提取，得浸膏
将一定量的雷公藤根，用极性溶剂或中等极性有机溶剂提取，雷公藤在溶剂中的量为0.001--1.8g/ml，抽滤提取液，回收溶剂，得浸膏。
第二步：雷公藤(全草或部分)或由第一步所得雷公藤的浸膏的纯化
将雷公藤(全草或部分)或由第一步所得雷公藤的浸膏，分别用中等极性有机溶剂提取，雷公藤在溶剂中的量为0.001-1.2g/ml，提取物浓缩后，层析柱分离纯化得，得纯度更高的二萜类化合物。
第三步：纯化后的雷公藤(全草或部分)或由第一步所得雷公藤的浸膏的酸处理
纯化后的雷公藤(全草或部分)或由第一步所得雷公藤的浸膏，分别用盐酸或含盐酸的酸性溶液处理，其中浸膏的含量为0.001--2.0g/ml。
第四步：1)、雷公藤或由第一步所得雷公藤的浸膏，分别进行酸溶液浸泡、再用中等极性有机溶剂萃取、水洗，得浓缩改性物；
取一定量的雷公藤或由第一步所得雷公藤的浸膏，分别用盐酸或含盐酸的酸性溶液浸泡，在0-40℃下处理，使其中的雷公藤内酯醇大部分转化为雷公藤氯内酯醇；再用中等极性有机溶剂如乙酸乙酯萃取，其中浸膏的含量为0.001--2.0g/ml，将萃取液水洗至中性，浓缩得到浓缩物；
2)、雷公藤或由第一步所得雷公藤的浸膏，分别进行中等极性有机溶剂提取、酸溶液浸泡；
将雷公藤或由第一步所得雷公藤的浸膏，分别用中等极性有机溶剂提取，其中，浸膏在溶剂中的含量为0.001--2.0g/ml，提取物浓缩后，分别用盐酸或含盐酸的酸性溶液浸泡，在0-40℃下，使其中的雷公藤内酯醇转化为雷公藤氯内酯醇。
所述盐酸，浓度为0.002-2.0N；酸性溶液选自硫酸、醋酸、硝酸、乙酸、碳酸、磷酸、草酸、氢氟酸、柠檬酸；用盐酸或含盐酸的酸性溶液的pH值为-2.0-6.0。
本发明的改性工艺和现有技术相比具有如下优点：本发明工艺操作简便，成本低廉，经药理实验证明，雷公藤(全草或部分)、雷公藤制得的浸膏经酸体系处理后，毒性明显下降。而目前的传统工艺，无法降低雷公藤毒性，大量临床应用受到限制。
【附图说明】
图1：本发明的改性工艺流程图
【具体实施方式】
下面列举8个实施例，对本发明加以进一步说明，但本发明不只限于这些实施例。本发明以我国丰富的雷公藤属植物—雷公藤、昆明山海棠和东北雷公藤等为材料，根据其主要活性、毒性成分的基本理化特性，通过特殊的改性工艺，最后降低其毒性。
实施例1：
称取雷公藤120g，用0.03N的HCl溶液浸泡，同时在10℃冰箱内放置48小时，使样品中的雷公藤内酯醇大部分转化为雷公藤氯内酯醇，转化率达到25％以上。取出后用氯仿提取3次，每次300ml，提取液用水洗至中性，再用无水Na2SO4干燥，减压浓缩后得到浓缩物0.98g。
实施例2：
第一步：称取雷公藤650g，加入800ml95％乙醇，回流提取3次，每次6小时，过滤，合并乙醇液，减压回收乙醇，得总成分浸膏12.0g。
第二步：称取雷公藤130g，加入300ml乙酸乙酯，回流提取3次，每次6小时，过滤，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯，得主要为中等极性化合物的浸膏1.56g。将第一步得到的浸膏6.0g，加入25ml乙酸乙酯，超声提取3次，每次45min，过滤，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯，得浸膏1.31g。将1.56g浸膏，用少量乙酸乙酯溶解后，拌入4.4g中性氧化铝，过氧化铝柱，弃去乙酸乙酯∶石油醚(1∶9)洗脱液250ml，收集乙酸乙酯∶石油醚(1∶1)的洗脱液450ml，减压浓缩得样品A。将1.31g浸膏用少量乙酸乙酯溶解后，拌入3.2g中性氧化铝，过氧化铝柱，弃去乙酸乙酯∶石油醚(1∶9)洗脱液250ml，收集乙酸乙酯∶石油醚(1∶1)的洗脱液450ml，减压浓缩得样品B。
第三步：将样品A和样品B分别用0.4N的HCl-冰HAc体系，在4℃处理36小时，室温下挥去溶剂，提取后的样品A和样品B中的雷公藤内酯醇，大部分转化为雷公藤氯内酯醇，转化率均达到87％以上。
第四步：1、称取雷公藤120g，浸膏4.0g，分别用0.4N的HCl-冰HAc溶液浸泡，同时在冰箱内放置36小时，使原来样品中的雷公藤内酯醇大部分转化为雷公藤氯内酯醇，转化率分别达到78％和80％以上。取出后用乙酸乙酯提取3次，雷公藤每次300ml，浸膏每次20ml，合并提取液后用水洗至中性，再用无水Na2SO4干燥，减压浓缩后分别得到浓缩物1.09g和1.0g。
2、称取雷公藤130g，加入300ml乙酸乙酯，回流提取3次，每次6小时，过滤，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯，得浸膏(主要为中等极性化合物)1.67g。将第一步得到的浸膏6.0g，加入25ml乙酸乙酯，超声提取3次，每次45min，过滤，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯，得浸膏1.10g。分别用0.4N的HCl-冰HAc溶液浸泡，同时在冰箱内放置36小时，使样品中的雷公藤内酯醇大部分转化为雷公藤氯内酯醇，转化率均达到80％以上。
实施例3：
第一步：雷公藤600g，加入700ml95％乙醇，工艺同实施例2笫一步，得总成分浸膏12.0g。
第二步：称取雷公藤100g，加入250ml乙酸乙酯，工艺同实施例2笫二步，得主要为中等极性化合物浸膏1.24g。将第一步得到的浸膏5.6g加入20ml乙酸乙酯，工艺同实施例2笫二步，得浸膏1.16g。将1.24g浸膏用少量乙酸乙酯溶解后，拌入4.0g中性氧化铝，过氧化铝柱，弃去乙酸乙酯∶石油醚(1∶9)洗脱液190ml，收集乙酸乙酯∶石油醚(1∶1)的洗脱液400ml，减压浓缩得样品A。将1.16g浸膏用少量乙酸乙酯溶解后，拌入3.0g中性氧化铝，过氧化铝柱，弃去乙酸乙酯∶石油醚(1∶9)洗脱液190ml，收集乙酸乙酯∶石油醚(1∶1)的洗脱液400ml，减压浓缩得样品B。
第三步：将样品A和样品B，工艺同实施例2笫三步，使提取后的样品A和样品B中的雷公藤内酯醇，大部分转化为雷公藤氯内酯醇，转化率均达到82％以上。
第四步：1称取雷公藤120g，浸膏4.0g，工艺同实施例2笫四步1，使样品中的雷公藤内酯醇大部分转化为雷公藤氯内酯醇，转化率分别达到77％和80％以上。取出后用氯仿提取3次，雷公藤每次300ml，浸膏每次20ml，合并提取液后用水洗至中性，再用无水Na2SO4干燥，减压浓缩后分别得到浓缩物0.98g和0.76g。
2称取雷公藤100g，加入250ml乙酸乙酯，工艺同实施例2笫四步2，得浸膏1.11g。将第一步得到的浸膏5.6g加入20ml乙酸乙酯，超声提取3次，每次45min，过滤，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯，得浸膏1.80g。分别用0.4N的HCl-冰HAc溶液浸泡，同时在冰箱内放置36小时，使样品中的雷公藤内酯醇大部分转化为雷公藤氯内酯醇，转化率均达到80％以上。
实施例4：
第一步：称取雷公藤600g，加入700ml95％乙醇，工艺同实施例2笫一步，减压回收乙醇得浸膏9.0g。
第二步：称取雷公藤100g，加入200ml氯仿，工艺同实施例2笫二步，得主要为中等极性化合物浸膏1.05g。将第一步得到的浸膏4.0g加入20ml氯仿，超声提取3次，每次45min，过滤，合并氯仿液，减压回收氯仿，得浸膏0.96g。将1.05g浸膏用少量氯仿溶解后，拌入3.0g中性氧化铝，过氧化铝柱，弃去乙酸乙酯∶石油醚(1∶9)洗脱液180ml，收集乙酸乙酯∶石油醚(1∶1)的洗脱液350ml，减压浓缩得样品A。将0.96g浸膏用少量氯仿溶解后，拌入3.0g中性氧化铝，过氧化铝柱，弃去乙酸乙酯∶石油醚(1∶9)洗脱液180ml，收集乙酸乙酯∶石油醚(1∶1)的洗脱液350ml，减压浓缩得样品B。
第三步：将样品A和样品B，工艺同实施例2笫三步，使提取后的样品A和样品B中的雷公藤内酯醇大部分转化为雷公藤氯内酯醇，转化率达到88％以上。
第四步：1、称取雷公藤100g，浸膏4.0g，工艺同实施例2笫四步1，使提取后样品中的雷公藤内酯醇大部分转化为雷公藤氯内酯醇，转化率分别达到70％和78％以上。取出后用乙酸乙酯提取3次，雷公藤每次200ml，浸膏每次20ml，合并提取液后用水洗至中性，再用无水Na2SO4干燥，减压浓缩后分别得到浓缩物1.03g和0.92g。
2、称取雷公藤100g，加入200ml氯仿，工艺同实施例2笫四步2，得浸膏1.02g。将第一步得到的浸膏4.0g加入20ml氯仿，超声提取3次，每次45min，过滤，合并氯仿液，减压回收氯仿，得浸膏0.90g。分别用0.4N的HCl-冰HAc溶液浸泡，同时在冰箱内放置36小时，使样品中的雷公藤内酯醇大部分转化为雷公藤氯内酯醇，转化率达到80％以上。
实施例5：
第一步：雷公藤600g，加入700ml95％乙醇，工艺同实施例2笫一步，减压回收乙醇得总成分浸膏13.0g。
第二步：称取雷公藤100g，加入250ml氯仿，工艺同实施例2笫二步，得主要为中等极性化合物浸膏1.04g。将第一步得到的浸膏5.8g加入20ml氯仿，超声提取3次，每次45min，过滤，合并氯仿液，减压回收氯仿，得浸膏0.95g。将1.04g浸膏用少量氯仿溶解后，拌入3.0g中性氧化铝，过氧化铝柱，弃去乙酸乙酯∶石油醚(1∶9)洗脱液180ml，工艺同实施例2笫三步，使提取后的样品A和样品B中的雷公藤内酯醇大部分转化为雷公藤氯内酯醇，转化率达到82％以上。
第四步：1、称取雷公藤120g，浸膏4.0g，工艺同实施例2笫四步1，使样品中的雷公藤内酯醇大部分转化为雷公藤氯内酯醇，转化率分别达到74％和80％以上。取出后用氯仿提取3次，雷公藤每次300ml，浸膏每次20ml，合并提取液后用水洗至中性，再用无水Na2SO4干燥，减压浓缩后分别得到浓缩物0.95g和0.78g。
2、称取雷公藤100g，加入250ml氯仿，工艺同实施例2笫四步2，得浸膏1.16g。将第二步得到的浸膏5.8g加入20ml氯仿，超声提取3次，每次45min，过滤，合并氯仿液，减压回收氯仿，得浸膏0.89g。分别用0.4N的HCl-冰HAc溶液浸泡，同时在冰箱内放置36小时，使样品中的雷公藤内酯醇大部分转化为雷公藤氯内酯醇，转化率达到80％以上。
实施例6：
第一步：称取雷公藤650g，加入800ml95％乙醇，工艺同实施例2笫一步，减压回收乙醇得总称分浸膏10.0g。
第二步：称取雷公藤130g，加入300ml乙酸乙酯，工艺同实施例2笫二步，得主要为中等极性化合物浸膏1.66g。将第一步得到的浸膏5.0g加入25ml乙酸乙酯，超声提取3次，每次45min，过滤，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯，得浸膏1.01g。将1.66g浸膏用少量乙酸乙酯溶解后，拌入4.0g中性氧化铝，过氧化铝柱，弃去乙酸乙酯∶石油醚(1∶9)洗脱液250ml，收集乙酸乙酯∶石油醚(1∶1)的洗脱液450ml，减压浓缩得样品A。将1.01g浸膏用少量乙酸乙酯溶解后，拌入3.0g中性氧化铝，过氧化铝柱，弃去乙酸乙酯∶石油醚(1∶9)洗脱液250ml，收集乙酸乙酯∶石油醚(1∶1)的洗脱液450ml，减压浓缩得样品B。
第三步：将样品A和样品B，工艺同实施例2笫三步，提取后的样品A和样品B中的雷公藤内酯醇大部分转化为雷公藤氯内酯醇，转化率达到66％以上。
第四步：1、称取雷公藤120g，浸膏5.0g，工艺同实施例2笫四步1，使原来样品中的雷公藤内酯醇大部分转化为雷公藤氯内酯醇，转化率分别达到50％和57％以上。。取出后用乙酸乙酯提取3次，雷公藤每次300ml，浸膏每次20ml，合并提取液后用水洗至中性，再用无水Na2SO4干燥，减压浓缩后分别得到浓缩物1.15g和1.3g。
2、称取雷公藤130g，加入300ml乙酸乙酯，工艺同实施例2笫四步2，得浸膏1.27g。将第一步得到的浸膏5.0g加入25ml乙酸乙酯，超声提取3次，每次45min，过滤，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯，得浸膏1.03g。分别用0.1N的HCl-冰HAc溶液浸泡，同时在冰箱内放置36小时，使样品中的雷公藤内酯醇大部分转化为雷公藤氯内酯醇，转化率达到60％以上。
实施例7：
第一步：称取雷公藤600g，加入700ml95％乙醇，工艺同实施例2笫一步，减压回收乙醇得总成分浸膏12.0g。
第二步：称取雷公藤100g，加入250ml乙酸乙酯，工艺同实施例2笫二步，得主要为中等极性化合物浸膏1.20g。将第一步得到的浸膏6.0g加入20ml乙酸乙酯，超声提取3次，每次45min，过滤，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯，得浸膏1.35g。将1.20g浸膏用少量乙酸乙酯溶解后，拌入3.5g中性氧化铝，过氧化铝柱，弃去乙酸乙酯∶石油醚(1∶9)洗脱液190ml，收集乙酸乙酯∶石油醚(1∶1)的洗脱液400ml，减压浓缩得样品A。将1.35g浸膏用少量乙酸乙酯溶解后，拌入4.0g中性氧化铝，过氧化铝柱，弃去乙酸乙酯∶石油醚(1∶9)洗脱液190ml，收集乙酸乙酯∶石油醚(1∶1)的洗脱液400ml，减压浓缩得样品B。
第三步：将样品A和样品B，工艺同实施例2笫三步，使提取后的样品A和样品B中的雷公藤内酯醇大部分转化为雷公藤氯内酯醇，转化率达到60％以上。
第四步：1、称取雷公藤120g，浸膏4.0g，工艺同实施例2笫四步1，使样品中的雷公藤内酯醇大部分转化为雷公藤氯内酯醇，转化率分别达到52％和59％以上。取出后用氯仿提取3次，雷公藤每次300ml，浸膏每次20ml，合并提取液后用水洗至中性，再用无水Na2SO4干燥，减压浓缩后分别得到浓缩物0.88g和0.81g。
2、称取雷公藤100g，加入250ml乙酸乙酯，工艺同实施例2笫四步2，得浸膏1.24g。将第一步得到的浸膏6.0g加入20ml乙酸乙酯，超声提取3次，每次45min，过滤，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯，得浸膏1.63g，分别用0.1N的HCl-冰HAc溶液浸泡，同时在冰箱内放置36小时，使样品中的雷公藤内酯醇大部分转化为雷公藤氯内酯醇，转化率达到60％以上。
实施例8：
第一步：雷公藤600g，加入700ml95％乙醇，工艺同实施例2笫一步，减压回收乙醇得总成分浸膏12.0g。
第二步：称取雷公藤100g，加入250ml乙酸乙酯，工艺同实施例2笫二步，得主要为中等极性化合物浸膏1.24g。将第一步得到的浸膏5.6g加入20ml乙酸乙酯，超声提取3次，每次45min，过滤，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯，得浸膏1.16g。将1.24g浸膏用少量乙酸乙酯溶解后，拌入4.0g中性氧化铝，过氧化铝柱，弃去乙酸乙酯∶石油醚(1∶9)洗脱液190ml，收集乙酸乙酯∶石油醚(1∶1)的洗脱液400ml，减压浓缩得样品A。将1.16g浸膏用少量乙酸乙酯溶解后，拌入3.0g中性氧化铝，过氧化铝柱，弃去乙酸乙酯∶石油醚(1∶9)洗脱液190ml，收集乙酸乙酯∶石油醚(1∶1)的洗脱液400ml，减压浓缩得样品B。
第三步：将样品A和样品B，分别用0.03N的HCl溶液浸泡，同时在冰箱内放置48小时，使提取后的样品A和样品B中的雷公藤内酯醇大部分转化为雷公藤氯内酯醇，转化率达到35％以上。
第四步：1、称取雷公藤120g，浸膏4.0g，分别用0.03N的HCl溶液浸泡，同时在冰箱内放置48小时，使样品中的雷公藤内酯醇大部分转化为雷公藤氯内酯醇，转化率分别达到25％和30％以上。取出后用氯仿提取3次，雷公藤每次300ml，浸膏每次20ml，合并提取液后用水洗至中性，再用无水Na2SO4干燥，减压浓缩后分别得到浓缩物0.98g和0.76g。
2、称取雷公藤100g，加入250ml乙酸乙酯，工艺同实施例2笫四步2，得浸膏1.11g。将第一步得到的浸膏5.6g加入20ml乙酸乙酯，超声提取3次，每次45min，过滤，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯，得浸膏1.80g，分别用0.03N的HCl溶液浸泡，同时在冰箱内放置48小时，使样品中的雷公藤内酯醇大部分转化为雷公藤氯内酯醇，转化率达到35％以上。
在其他酸体系条件下，处理方法同上。
综合评价
通过药理实验表明，与未经改性的雷公藤和浸膏相比，用新工艺改性过的雷公藤(即雷公藤氯内酯醇活性成分)和浸膏，其毒性明显下降，LD50由分别由原来的(279.4±0.02)mg/kg、(252.0±0.02)mg/kg变为(931.10±0.02)mg/kg、(840.10±0.02)mg/kg。并且本改性工艺操作简便，成本低廉，可有效降低雷公藤和浸膏的毒性，并充分利用雷公藤药用资源，具有广阔的应用前景。
本发明产品用于治疗类风湿性关节炎、慢性肾炎、肝炎、血小板减少性紫癜和各种皮肤病关节炎，目前在抗生育、抗肿瘤、抗器官移植后体内排斥等方面的研究，也已取得较大进展。