水稻蔗糖转运载体类似蛋白基因及其编码蛋白与应用 【技术领域】
本发明涉及一种水稻蔗糖转运载体类似蛋白基因及其编码蛋白与应用。
背景技术
植物蔗糖转运载体是定位于植物细胞质膜上担负着蔗糖跨膜运输的重要载体蛋白。蔗糖转运载体在调控植物源器官内光合同化物的输出、光合同化物的分配以及库器官内光合同化物的输入过程中发挥了重要功能(Hans Weber，Ljudmilla Borisjuk，Ute Heim，Norbert Sauer and Ulrich Wobus，(1997)A role for sugar transportersduring seed development：molecular characterization of a hexose and a sucrosecarrier in fava bean seeds.The Plant Cell 9：895-908；Andreas Weise，Laurence Barker，Christina Kühn，Sylvie Lalonde，Henrik Buschmann，WolfB.Frommer，and John M.Ward(2000)A New Subfamily of Sucrose Transporters，SUT4，with Low Affinity/High Capacity Localized in Enucleate Sieve Elementsof Plants.The Plant Cell.12：1345-1356)。
蔗糖转运载体蛋白分子具有12次疏水性跨膜结构域，且该蛋白分子的氮端与碳端均定位于胞质区(Laurence Barker，Christina Kühn，Andreas Weise，AlexanderSchulz，Christiane Gebhardt，Brigitte Hirner，Hanjo Hellmann，WaltraudSchulze，John M.Ward and Wolf B.Frommer(2000)Sut2，a putative sucrosesensor in sieve elements.The Plant Cell，12：1153-1164)。植物体的根、茎、叶、花和果实等许多器官中均有蔗糖转运载体的分布。双子叶植物蔗糖转运载体的研究进展迅速，当前的研究主要集中在三个方面：蔗糖转运载体基因的克隆及其性质研究；蔗糖转运载体的调控以及与植物组织和器官发育之间的关系研究。根据蔗糖转运载体功能以及氨基酸结构方面的特点，已经发现的双子叶植物蔗糖转运载体可分为三类：高亲和力/低运输量的蔗糖转运载体SUT1；低亲和力/高运输量的蔗糖转运载体SUT4和蔗糖转运载体类似蛋白亚家族SUT2(Laurence Barker，Christina Kühn，Andreas Weise，Alexander Schulz，Christiane Gebhardt，Brigitte Hirner，HanjoHellmann，Waltraud Schulze，John M.Ward and Wolf B.Frommer(2000)Sut2，a putative sucrose sensor in sieve elements.The Plant Cell，12：1153-1164)。如表1所示，这三个亚家族的成员在氨基酸结构、功能、定位等方面存在显著差异。SUT1和SUT4是具有不同蔗糖分子运输能力地蔗糖转运载体。SUT2虽然不具备跨膜转运蔗糖分子的能力，但是SUT2能够对外界环境中的蔗糖分子产生特异性的应答反应，在调控糖信号介导的相关基因的表达和具备蔗糖转运功能载体的活性等方面发挥重要的生理功能。蔗糖转运载体基因的表达具有组织器官特异性以及发育阶段特异性。而且，SUT的转运活性在转录水平和翻译后水平都能够进行调控(Chi-aki Matsukura，Toshikazu Saitoh，Toshiro Hirose，Ryu Ohsugi，Pierdomenico Perata，and JunjiYamaguchi，(2000)Sugar Uptake and Transport in Rice Embryo.Expression ofCompanion Cell-Specific Sucrose Transporter(OsSUT1)Induced by Sugar andLight.Plant Physiology，124：85-94)。外界信号分子如糖分子等能够在转录水平调控蔗糖转运载体的表达(Chi-aki Matsukura，Toshikazu Saitoh，Toshiro Hirose，Ryu Ohsugi，Pierdomenico Perata，and Junji Yamaguchi，(2000)Sugar Uptake andTransport in Rice Embryo.Expression of Companion Cell-Specific SucroseTransporter(OsSUT1)Induced by Sugar and Light.Plant Physiology，124：85-94)，蔗糖转运载体的磷酸化状态也能影响其转运活性(Gabriel Roblin，Soulaiman Sakr，Janine Bonmort，and Serge Delrot，(1998)Regulation of a plantplasma membrane sucrose transporter by phosphorylation.FEBS，424：165-168)。SUT2、SUT1及SUT4共定位于同一筛分子质膜上，而且SUT亚家族成员之间能够相互作用并形成具有不同蔗糖转运活性的同源低聚物或异源低聚物(Anke Reinders，Waltraud Schulze，Christina Kühn，Laurence Barker，Alexander Schulz，John M.Ward and Wolf B.Frommer(2002)Protein-protein interact ions between sucrosetransporters of different affinities colocalized in the same enucleate sieveelement.The Plant Cell 14：1567-1577)。与双子叶植物相比，单子叶植物蔗糖转运载体的研究进展较为缓慢。Hirose等从水稻颖果中分离出OsSUT1基因，该基因属于高亲和力/低运输量的蔗糖转运载体SUT1亚家族成员。OsSUT1在水稻种子的萌发过程以及水稻颖果的发育过程中均发挥生理作用。在水稻营养生长期旗叶中进行的OsSUT1的反义实验证明，OsSUT1在这一时期旗叶的碳水化合物代谢过程中并未发挥重要功能(Ken Ishimura，Tatsurou Hirose，Naohiro Aoki，Sakiko Takahashi，Kiyomi Ono，Shinichi Yamamoto Jiangzhong，Wu，Shoko Saji，Tomoya Baba，Masashi Ugaki，Takashi Matsumoto，and Ryu Ohsugi(2001)Antisense expression of a rice sucrosetransporter OsSUT1 in rice(Oryza sativa L.).Plant Cell Physiology，42：1181-1185)。在水稻中进行的蔗糖转运载体研究表明，水稻中也可能存在有多个成员组成的蔗糖转运载体家族。
表1植物蔗糖转运载体家族的组成及其性质 蔗糖转运载 体的种类氨基酸结构特点蔗糖分子亲和能力转运蔗糖的能力Km值(nM)植物体内分布功能 SUT112次跨膜结构、氮端和碳端位于胞质内侧高低0.3-2长成叶的叶脉、茎、根、果实等韧皮部装载及卸载、微管运输途中的扑救作用 SUT212次跨膜结构、氮端和碳端位于胞质内侧、包含两个保守结构域的较大的中央环结构域------幼叶、茎等感应胞外蔗糖分子 SUT412次跨膜结构、氮端和碳端位于胞质内侧低高10-20长成叶的次级叶脉、幼叶、茎、花、子叶等韧皮部装载及卸载
蔗糖转运载体与植物发育之间的关系研究主要是通过转基因手段实现的。蔗糖转运载体基因的正义与反义实验结果表明，蔗糖转运载体对光合同化物在植物体的各个器官间的合理分配是至关重要的(Lemoine，R.，Kuhn，C.，Thiele，N.，Delrot，S.，and Frommer，W.B.(1996)Antisense inhibition of the sucrosetransporter：Effects on amount of carrier and sucrose transport activity.PlantCell Environ.19：1124-1131；Burke，L.，Hibberd J.M.，Quick，W.P.，Kuhn，C.，Hirner，B.，and Frommer，W.B.(1998)The H+-sucrose cotransporter NtSUT1 isessential for sugar export from tobacco leaves.Plant Physiol.118：59-68)。因此，水稻结实器官胚乳中的蔗糖转运载体相关基因家族新成员的克隆及其功能研究，特别是对定位在细胞质膜上的感应外界环境中蔗糖浓度变化的家族新成员SUT2的研究，可为利用生物技术应用该基因资源，并通过在转录水平和翻译后水平调控其他类型的蔗糖转运载体的活性，从而调节植物体内蔗糖分子的跨膜运输，提高水稻贮藏组织的淀粉合成效率和产量水平，具有重要的实际价值。
发明创造内容
本发明的目的是提供一种水稻蔗糖转运载体类似蛋白基因及其编码蛋白。
本发明所提供的水稻蔗糖转运载体类似蛋白基因，来源于水稻，名称为OsSUT2，是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；
3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由1830个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第35位到第1822位碱基。
水稻蔗糖转运载体类似蛋白基因OsSUT2编码蛋白，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。
序列表中序列2氨基酸残基序列是由595个氨基酸残基组成的蛋白质，自氨基端第292-298位和自氨基端第351-360位氨基酸残基序列为SUT2亚家族成员的保守结构域。
含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围。
扩增水稻蔗糖转运载体类似蛋白基因OsSUT2中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明获得的水稻蔗糖转运载体类似蛋白基因OsSUT2的表达受蔗糖分子的调控，担负着胚乳发育糖信号转导蔗糖分子的感受器功能。作为水稻穎果发育过程的恒定表达重要组成成分，将通过蔗糖转运载体有效地调控蔗糖分子的转运和胚乳发育与淀粉合成相关基因的表达。应用转基因技术有效地利用该基因，将可通过改造OsSUT2对蔗糖分子的感受能力，调节水稻蔗糖转运载体的转运活性，提高籽粒淀粉合成碳素流的供应，改善光合同化物在水稻植株内的分配以及超高产潜力水稻的充实性，最终达到提高超高产潜力水稻的产量，将在水稻育种中发挥重要作用。
【附图说明】
图1a为OsSUT2对不同类型单糖及双糖分子的应答反应的电泳图谱
图1b为图1a中电泳图谱的定量扫描结果(Pharmacia)
图2a为三种酵母菌株在YPD-葡萄糖培养基上的生长情况
图2b为三种酵母菌株在YPD-蔗糖培养基上的生长情况
图2c为三种酵母菌株在CM/Trp-葡萄糖培养基上的生长情况
图2d为三种酵母菌株在CM/Trp-蔗糖培养基上的生长情况
图3为OsSUT2在水稻颖果发育过程的表达状态的RT-PCR检测结果
【具体实施方式】
实施例1、水稻蔗糖转运载体类似蛋白基因OsSUT2的获得
根据部分单子叶植物蔗糖转运载体基因，即ZmSUT1、HvSUT1、HvSUT2和OsSUT1的同源性比对的结果，选取了两段同源性较高的序列并据此设计了一对引物：上游引物：5’-GCTCTCGCTCCTCACGCCCTACAT-3’；下游引物：5’-TGGGTCCCCATGGTAAACCTCACG-3’。
利用这对引物，以抽穗后4天的水稻颖果总RNA的逆转录样品为模板进行PCR扩增。扩增体系：模板1μl总RNA逆转录产物，10×Taq缓冲液2μl，2.5mM dNTP 1.6μl，10μM上游引物和下游引物各1μl，1U Taq酶，加水补至总体积20μl。PCR循环条件：94℃变性3分钟后，按如下常数进行PCR扩增：94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。将经电泳分离纯化后的扩增产物与pGEMT-Easy Vector连接后转化宿主菌JM109，选取阳性克隆送至上海生工进行核苷酸序列测定。将测序结果提交至NCBI数据库中进行同源性比对，比对结果表明，扩增片断是一个新的水稻蔗糖转运载体的部分片断。
以获得的扩增片断为“探针”在华大基因组数据库(http：//btn.genomics.org.cn：8080/rice/)中进行Blastn分析，获取了包含扩增片断序列的contig5025，利用GENSCAN和Blastx对contig5025的序列进行分析，预测出上述扩增片断所代表的新基因的序列。根据预测的结果设计了扩增新基因编码区的一对引物：上游引物：5’-ATCTCACCAAACCCTACC-3’；下游引物：5’-TGTTCTGCTCAGCCAAAT-3’。利用这对引物，以抽穗后4天的水稻颖果总RNA的逆转录样品为模板进行PCR扩增。扩增体系：模板1μl总RNA逆转录产物，10×Pfx Taq缓冲液5μl，2.5mM dNTP 6μl，50mM MgSO4 1μl，20μM上游引物和下游引物各1μl，1.25U Pfx taq酶，加水补至总体积50μl。扩增程序为：94℃变性3分钟后，按如下常数进行PCR扩增：94℃变性15秒，53℃退火30秒，68℃延伸2分钟，共30个循环，最后68℃延伸10分钟。将分离纯化后的扩增产物与pGEMT-Easy Vector连接后转化宿主菌JM109，选取阳性克隆送至上海生工进行核苷酸序列测定。
测序结果显示，目的片段中包含一个长度为1788bp的完整的开放阅读框，该开放阅读框编码由595个氨基酸组成的蛋白质。将测序结果提交至NCBI数据库中进行同源性比对，核苷酸序列同源性比对的结果表明，目的片断与LeSUT2和OsSUT1基因的同源性分别为61.2％和53.0％。将目的片断编码的氨基酸序列提交至TMPRED数据库(www.ch.embnet.org/software/TMPRED.form.html)中进行蛋白质结构的预测，预测结果表明目的蛋白具有蔗糖转运载体典型的12次跨膜结构域，而且，目的蛋白的中央环和氮端的长度比SUT1和SUT4的相应区域长。此外，目的蛋白具有双子叶植物SUT2的两个保守的结构域。因此，该基因是SUT2亚家族在单子叶植物中的一个新成员，命名为OsSUT2。OsSUT2基因序列及其编码蛋白OsSUT2的氨基酸序列分别如序列表中的序列1和序列2所示，序列表中的序列1由1830个碱基组成，自5′端第35-1822位碱基为开放阅读框，编码序列表中序列2的蛋白质OsSUT2，它由595个氨基酸残基组成，自氨基端第292-298位和自氨基端第351-360位氨基酸残基序列为SUT2亚家族成员的保守结构域。
实施例2、水稻蔗糖转运载体类似蛋白基因OsSUT2对糖分子的应答反应
利用浓度均为50mmol/L的甘露醇溶液、果糖溶液、蔗糖溶液和蔗糖同分异构体Paltinose溶液对水稻叶片进行处理，并通过RT-PCR的方法检测蔗糖转运载体基因对不同类型的糖分子的应答反应。扩增引物如下：上游引物：5’-GCTCTCGCTCCTCACGCCCTACAT-3’；下游引物：5’-TGGGTCCCCATGGTAAACCTCACG-3’。扩增体系：模板1μl总RNA逆转录产物，10×Taq缓冲液2μl，2.5mM dNTP 1.6μl，10μM上游引物和下游引物各1μl，1U Taq酶，加水补至总体积20μl。PCR循环条件：94℃变性3分钟后，按如下常数进行PCR扩增：94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共20个循环。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行检测。
检测结果以及定量结果如图1a和图1b所示，OsSUT2对Paltinose分子有特异性的应答反应，而对甘露醇分子以及果糖分子没有应答反应。在本实验中，甘露醇以及Paltinose分别作为渗透压以及代谢过程的对照。甘露醇和Paltinose溶液的处理结果表明，OsSUT2对Paltinose分子的特异性应答反应与溶液中的渗透压以及代谢过程没有关系。而OsSUT1基因对上述糖分子均没有应答反应。图1a和图1b中，H2O、Man、Fru、Suc和Pal分别表示无菌水、甘露醇溶液、果糖溶液、蔗糖溶液以及蔗糖同分异构体Paltinose溶液；rRNA和OsActin的扩增结果表明模板量一致。
通过水稻蔗糖转运载体类似蛋白基因OsSUT2对糖分子应答实验证明，获得的OsSUT2能够特异识别细胞外蔗糖分子，并导致其在转录水平的变化，从而将引起细胞内的一系列信号级联应答反应。
实施例3、酵母突变体互补实验
将OsSUT2基因的编码区亚克隆到大肠杆菌/酵母穿梭质粒112A1NE中(张雷，刁丰秋，杨志攀，黄美绢和吴乃虎(2001)一种胡萝卜蔗糖转运蛋白基因家族新成员的分离及功能鉴定科学通报，第46卷第14期：1190-1195)。以112A1NE为对照，与112A1NE-OsSUT2一同转化酵母突变体SUSY3/ura3(Laurence Barker，Christina Kühn，Andreas Weise，Alexander Schulz，Christiane Gebhardt，Brigitte Hirner，Hanjo Hellmann，Waltraud Schulze，John M.Ward and WolfB.Frommer(2000)Sut2，a putative sucrose sensor in sieve elements.The PlantCell，12：1153-1164)。根据酵母突变体、112A1NE转化子和112A1NE-OsSUT2转化子在不同酵母培养基上的生长情况，检验OsSUT2是否具有转运蔗糖分子的能力。结果如图2a、图2b、图2c和图2d所示：酵母菌株SUSY3/ura3是蔗糖转运载体以及细胞壁结合的转化酶缺失的酵母突变体，因而，该突变体只能在YPD-葡萄糖培养基上生长，而不能在YPD-蔗糖培养基上生长(图2a和图2b)；图2b表明OsSUT2转化子不能在YPD-蔗糖培养基上生长，所以OsSUT2不具备转运蔗糖的能力。为了检验112A1NE和112A1NE-OsSUT2是否转移进酵母突变体内，选用了CM/Trp-葡萄糖培养基对112A1NE和112A1NE-OsSUT2进行培养。图2C表明只有112A1NE和112A1NE-OsSUT2能在CM/Trp-葡萄糖培养基上生长，而SUSY3/ura3则在该培养基上不能生长；图2d表明同样三种酵母菌株在CM/Trp-蔗糖培养基都不能生长。这一实验结果证明，112A1NE和112A1NE-OsSUT2已经成功转移进酵母突变体内。图2a、图2b、图2c和图2d中，SUSY3/ura3、112A1NE和112A1NE-OsSUT2分别表示酵母突变体、空载体转化子和OsSUT2转化子；A、B、C和D分别表示酵母菌株分别接种于YPD-葡萄糖、YPD-蔗糖、CM/Trp-葡萄糖和CM/Trp-蔗糖培养基。
本实施例通过应用特异酵母突变体的互补实验证明，获得的OsSUT2不具备转运蔗糖的能力。
实施例4、OsSUT2在水稻颖果发育过程中的表达
以水稻颖果总RNA的逆转录样品为模板通过RT-PCR的方法检测水稻蔗糖转运载体基因的表达。扩增引物如下：上游引物：5’-GCTCTCGCTCCTCACGCCCTACAT-3’；下游引物：5’-TGGGTCCCCATGGTAAACCTCACG-3’。扩增体系：模板1μl总RNA逆转录产物，10×Taq缓冲液2μl，2.5mM dNTP 1.6μl，10μM上游引物和下游引物各1μl，1U Taq酶，加水补至总体积20μl。PCR循环条件：94℃变性3分钟后，按如下常数进行PCR扩增：94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共20个循环。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行检测。
OsSUT在水稻穎果发育过程中的表达状态的RT-PCR检测结果如图3所示，表明在水稻颖果发育过程中，具有蔗糖转运功能的OsSUT1的表达与发育进程具有密切的相关，呈现显著的发育时期特异性；相对而言，OsSUT2呈现组成型恒定表达的特征。图3中，泳道上的数字表示抽穗后的天数，“-”表示抽穗前；rRNA表示模板量。
序列表
<160>2
<210>1
<211>1830
<212>DNA
<213>水稻属水稻(Oryza sativa var.Lansheng)
<400>1
atctcaccaa accctaccag atctacgccc cgccatggac tccgccgccg gcggtggcgg 60
cctcacggcc atccgcctgc cctaccgcca cctccgcgac gccgagatgg agctcgtcag 120
cctcaacggc ggcacccccc gcggaggctc ccccaaggac cccgacgcca cgcaccagca 180
ggggcccccc gccgcccgta ccaccaccac caggaagctc gtcctcgcct gcatggtcgc 240
cgccggcgtg cagttcggct gggcgcttca gctctcgctc ctcacgccct acatccagac 300
cctaggaata gaccatgcca tggcatcatt catttggctt tgtggaccta ttactggttt 360
tgtggttcaa ccatgtgttg gtgtctggag tgacaaatgc cgttcaaagt atggaagaag 420
gagaccgttc attttggctg gatgcttgat gatatgcttt gctgtaactt taatcggatt 480
ttctgcagac cttggttaca ttttaggaga taccactgag cactgcagta catataaagg 540
ttcaagattt cgagccgcta ttattttcgt tcttgggttc tggatgttgg atctcgcaaa 600
ccatacagtt caaggtcctg ctcgtgccct tttagctgac ctttcaggtc ctgatcagtg 660
taattctgca aatgcaattt tttgcacatg gatggctgtt ggaaacgttc ttggtttttc 720
atctggtgct agtgggaatt ggcacaagtg gtttcctttt ctaatgacaa gagcatgctg 780
tgaagcttgt agtaatttga aagccgcttt tctggttgca gttgtattcc ttttgttttg 840
tatgtctgtt accctgtact ttgctgaaga gatcccgctg gaaccaacag atgcacaacg 900
attatctgat tctgcgcctc tcctgaatgg ttctagagat gataacaatg catcaaatga 960
acctcgtaat ggagcacttc ctaatggtca tacagatgga agcaatgtcc cagctaactc 1020
caacgctgag gactccaatt caaacagaga gaatgtcgaa gttttcaatg atggaccagg 1080
agcagttttg gtgaatattt tgactagcat gaggcatcta cctcctggaa tgtactctgt 1140
tcttctagtt atggctctaa catggttgtc gtggtttccc tttttccttt ttgatactga 1200
ctggatggga cgtgaggttt accatgggga cccaaatggc aacttgagtg aaaggaaagc 1260
ttatgacaac ggtgtccgag aaggtgcatt tggtttgcta ttgaattcag ttgtccttgg 1320
atttgggtcc ttccttgttg atccactatg ccggctgatg ggtgctagac tggtttgggc 1380
aatcagcaac ttcacagtgt ttatctgcat gctggctaca gcaatattaa gttggatctc 1440
ttttgatttg tactcaagta aacttcacca catcattgga gcaaataaaa cagtgaagaa 1500
ttcagccttg attgttttct ccctacttgg actgccactc tcgatcacat atggcgttcc 1560
tttttctgtg actgctgagc tgactgctgg aacaggaagt ggacaaggtc tggcaacagg 1620
agtcctgaac cttgcaatcg ttgttccgca gatagtagtg tcactaggag caggtccatg 1680
ggatgctctc tttgggggag ggaacgtccc tgctttcgcc ttggcttccg ttttctcact 1740
aggagctggt gtcctcgcgg tccttaagct acccaagctg ccaaactctt acagatctgc 1800
tgggttccat ggatttggct gagcagaaca 1830
<210>2
<211>595
<212>PRT
<213>水稻属水稻(Oryza sativa var.Lansheng)
<400>2
Met Asp Ser Ala Ala Gly Gly Gly Gly Leu Thr Ala Ile Arg Leu Pro
1 5 10 15
Tyr Arg His Leu Arg Asp Ala Glu Met Glu Leu Val Ser Leu Asn Gly
20 25 30
Gly Thr Pro Arg Gly Gly Ser Pro Lys Asp Pro Asp Ala Thr His Gln
35 40 45
Gln Gly Pro Pro Ala Ala Arg Thr Thr Thr Thr Arg Lys Leu Val Leu
50 55 60
Ala Cys Met Val Ala Ala Gly Val Gln Phe Gly Trp Ala Leu Gln Leu
65 70 75 80
Ser Leu Leu Thr Pro Tyr Ile Gln Thr Leu Gly Ile Asp His Ala Met
85 90 95
Ala Ser Phe Ile Trp Leu Cys Gly Pro Ile Thr Gly Phe Val Val Gln
100 105 110
Pro Cys Val Gly Val Trp Ser Asp Lys Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Arg
115 120 125
Arg Arg Pro Phe Ile Leu Ala Gly Cys Leu Met Ile Cys Phe Ala Val
130 135 140
Thr Leu Ile Gly Phe Ser Ala Asp Leu Gly Tyr Ile Leu Gly Asp Thr
145 150 155 160
Thr Glu His Cys Ser Thr Tyr Lys Gly Ser Arg Phe Arg Ala Ala Ile
165 170 175
Ile Phe Val Leu Gly Phe Trp Met Leu Asp Leu Ala Asn Asn Thr Val
180 185 190
Gln Gly Pro Ala Arg Ala Leu Leu Ala Asp Leu Ser Gly Pro Asp Gln
195 200 205
Cys Asn Ser Ala Asn Ala Ile Phe Cys Thr Trp Met Ala Val Gly Asn
210 215 220
Val Leu Gly Phe Ser Ser Gly Ala Ser Gly Asn Trp His Lys Trp Phe
225 230 235 240
Pro Phe Leu Met Thr Arg Ala Cys Cys Glu Ala Cys Ser Asn Leu Lys
245 250 255
Ala Ala Phe Leu Val Ala Val Val Phe Leu Leu Phe Cys Met Ser Val
260 265 270
Thr Leu Tyr Phe Ala Glu Glu Ile Pro Leu Glu Pro Thr Asp Ala Gln
275 280 285
Arg Leu Ser Asp Ser Ala Pro Leu Leu Asn Gly Ser Arg Asp Asp Asn
290 295 300
Asn Ala Ser Asn Glu Pro Arg Asn Gly Ala Leu Pro Asn Gly His Thr
305 310 315 320
Asp Gly Ser Asn Val Pro Ala Asn Ser Asn Ala Glu Asp Ser Asn Ser
325 330 335
Asn Arg Glu Asn Val Glu Val Phe Asn Asp Gly Pro Gly Ala Val Leu
340 345 350
Val Asn Ile Leu Thr Ser Met Arg His Leu Pro Pro Gly Met Tyr Ser
355 360 365
Val Leu Leu Val Met Ala Leu Thr Trp Leu Ser Trp Phe Pro Phe Phe
370 375 380
Leu Phe Asp Thr Asp Trp Met Gly Arg Glu Val Tyr His Gly Asp Pro
385 390 395 400
Asn Gly Asn Leu Ser Glu Arg Lys Ala Tyr Asp Asn Gly Val Arg Glu
405 410 415
Gly Ala Phe Gly Leu Leu Leu Asn Ser Val Val Leu Gly Ile Gly Ser
420 425 430
Phe Leu Val Asp Pro Leu Cys Arg Leu Met Gly Ala Arg Leu Val Trp
435 440 445
Ala Ile Ser Asn Phe Thr Val Phe Ile Cys Met Leu Ala Thr Ala Ile
450 455 460
Leu Ser Trp Ile Ser Phe Asp Leu Tyr Ser Ser Lys Leu His His Ile
465 470 475 480
Ile Gly Ala Asn Lys Thr Val Lys Asn Ser Ala Leu Ile Val Phe Ser
485 490 495
Leu Leu Gly Leu Pro Leu Ser Ile Thr Tyr Ser Val Pro Phe Ser Val
500 505 510
Thr Ala Glu Leu Thr Ala Gly Thr Gly Gly Gly Gln Gly Leu Ala Thr
515 520 525
Gly Val Leu Asn Leu Ala Ile Val Val Pro Gln Ile Val Val Ser Leu
530 535 540
Gly Ala Gly Pro Trp Asp Ala Leu Phe Gly Gly Gly Asn Val Pro Ala
545 550 555 560
Phe Ala Leu Ala Ser Val Phe Ser Leu Gly Ala Gly Val Leu Ala Val
565 570 575
Leu Lys Leu Pro Lys Leu Pro Asn Ser Tyr Arg Ser Ala Gly Phe His
580 585 590
Gly Phe Gly
595