获得大菱鲆优质受精卵的方法 技术领域：
本发明属于大菱鲆养殖繁育技术，是一种在亲鱼培育和采卵授精中获得大菱鲆优质受精卵的方法。
背景技术：
大菱鲆自1992年引入中国以来，获得了苗种繁育和养殖的成功，已在我国北方沿海形成了大菱鲆的养殖产业，但大菱鲆产卵质量的不稳定，卵子质量差，已严重制约了大菱鲆产业的发展。如何获得优质受精卵是亟待解决的问题。在本发明做出之前，对于获得大菱鲆优质受精卵的综合技术还没有相关报道。国际上关于捕获大菱鲆受精卵的胚胎发育有研究报道，但在如何获得优质受精卵并没有提供相关技术，法国布雷斯特渔业研究中心的N.Devauchelle(1988)研究了捕获大菱鲆的产卵，在文中仅对大菱鲆受精卵进行了生化分析，并探讨了受精卵的初步发育。黄海水产研究所雷霁霖、马爱军等(2003)详细研究了大菱鲆的胚胎及仔稚幼鱼发育。英国康威渔业研究所的Howell，B.R.1989.发现大菱鲆卵子存在过熟现象。过熟的受精卵将导致卵质和受精卵质量下降。上述研究，他们都是集中在卵子的生化组成和胚胎发育等方面地研究，而并没有提出如何获得优质受精卵的综合技术。
发明内容：
本发明的目的是提供一种获得大菱鲆优质受精卵的技术，是在亲鱼培育和人工授精技术的过程中，通过关键环节技术措施的掌握，获得大菱鲆优质受精卵。
本发明是按以下技术方案实现的：它的技术内容包括亲鱼培育和人工采卵授精两方面：
一、亲鱼的培育：包括亲鱼的优选及培育条件、亲鱼的饲料及饲喂、亲鱼的水温、光照调控：
1、亲鱼的优选及培育条件：优选体色为正常体色的大菱鲆。大菱鲆雌鱼3-6龄，体重3000-6000克，全长达40-60厘米；雄鱼达2-6龄以上，体重达2000-5000克以上，全长30-50厘米；海水流水充气养殖，全周年水质条件变化情况为：溶解氧为＞6.0mg/L，PH范围为：7.8-8.，盐度为25-35‰，水温为8-20℃。
2、亲鱼的饲料及饲喂：
亲鱼的饲料：为配制的人工配合饲料，蛋白质的适宜含量为≥45％；脂类的适宜含量为≥10％，其中∑n-3HUFA的适宜比例≥20％。
饲料的配制：在100公斤配料物质中，按饲料原料及用量配制成半湿颗粒饲料：其配料和用量是：新鲜的脱脂鱼粉60公斤、豆粕10公斤、花生粕10公斤、饲料酵母4公斤、复合多维2公斤、复合矿物质2公斤、鱼油12公斤。
亲鱼的饲喂：日投喂2次，日投喂量为鱼体体重的2％-5％，应在繁殖季节前五个月就开始进行，整个繁殖季节保持投喂。
3、亲鱼的水温、光照调控：在繁殖期到来的前五个月，将大菱鲆的水温控制在8-10℃左右，光照时间为8小时，光照强度为100-500Lx左右。先是经过两个月的低温的积累发育，再将光照时间由每天8小时逐渐增至每天16小时，水温由8℃逐步增至14℃，然后再经过连续2-3个月的人工调控，使亲鱼充分成熟，获得优质卵子。产卵期温度控制在13-14℃，光照时间16小时，光照强度在100-500Lx左右。
二、人工采卵授精：
1、人工采卵：大菱鲆雌鱼的排卵间隔，多数在80-90h之间。在12-14℃时，人工采卵必需在大菱鲆雌鱼排卵后10小时之内挤卵。整个繁殖群体，每天进行1次对排卵亲鱼的挤卵。
2、人工授精操作：先从两尾雄鱼挤精液放入烧杯中，然后挑选成熟的雌鱼挤卵，挤卵时擦干鱼体和器皿，防止水及排泄物的混入。然后按1×105粒卵加入1ml～2ml精液，快速搅拌均匀使精卵充分接触，再加入少量经沉淀沙滤的海水，使精液、卵子、水的体积比约为精液、卵子、水的适宜体积比为1∶200∶200，继续搅拌1分钟，然后静置5分钟，再加入海水，静置10～15分钟，待受精卵吸水膨胀后，清水冲洗1次～2次，放入2000ml量筒中，用海水使上浮卵和沉淀卵分离，记录上浮卵数，上浮卵经冲洗后放入孵化器中孵化。
本发明与已有技术对比其特点：
本发明是一种获得大菱鲆优质受精卵的综合技术方法。从大菱鲆亲鱼的培育到人工采卵授精，进行了全过程关键环节的综合控制。通过综合措施的采取，提高了卵子和受精卵的质量，经镜检每批卵的平均活卵率在87.8％，受精成功率为89.6％，。
实施方式：
大菱鲆是新引进的优良海水养殖品种，发展迅速，但技术尚不完善。大菱鲆在苗种生产过程中，卵子的质量和受精率极不稳定，受精率较低时不到10％，严重影响了大菱鲆苗种生产的进行。通过综合措施的采取，提高大菱鲆卵子和受精卵质量，受精成功率为89.6％。
下面通过实施例详细叙述本发明的技术内容：
本研究在山东蓬莱市海水鱼类养殖试验场进行，并实施了综合技术措施，具体过程如下：
首先进行大菱鲆亲鱼的培育和人工采卵授精方法的确定，然后进行亲鱼培育和人工授精的规模化繁育试验。
实施例一、大菱鲆亲鱼的培育和采卵授精方法的确定：
1、亲鱼培育方法的确定：
实验选用大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)亲鱼共40尾，分4个不同的试验组，每组4尾雌鱼，6尾雄鱼。每组有3个平行。亲鱼为优选的正常体色的健康大菱鲆，正常体色大菱鲆背面呈青褐色有骨质突起，腹面光滑呈白色。亲鱼的年龄：雌鱼和雄鱼均为3龄。平均规格为体重2650±12.0g，全长45±4cm。置于12个20m3水泥池中进行流水充气养殖，养殖用水为地下海水与自然海水，经砂滤后混合使用，全周年水质条件变化情况为：DO＞6.0mg/L，pH＝7.8-8.2，S＝30-32，T＝8-18℃。
亲鱼的水温光照调控：挑选好的亲鱼，先在10℃的水温及8小时的光照条件下培育2个月。之后培育水温由8℃以每天0.5℃的速度逐渐增至14℃，光照时间也由每天0.5h的速度渐增至16个小时，光照强度为400LUX。
亲鱼的饲料及饲喂：亲鱼饲料为配制的人工配合饲料，蛋白质的适宜含量为≥45％；脂类的适宜含量为≥10％，其中∑n-3HUFA的适宜比例≥20％。
实验配制配合饲料：实验设计了4组实验饲料，分别投喂4组亲鱼，每日投喂1～2次。
1)、实验组1：饲料的配方是新鲜的脱脂鱼粉35公斤、豆粕18公斤、花生粕10公斤、面粉15，麦麸6，饲料酵母4公斤、复合多维2公斤、复合矿物质2公斤、鱼油8公斤。
2)、实验组2：饲料的配方是新鲜的脱脂鱼粉40公斤、豆粕20公斤、花生粕10公斤、面粉10，麦麸3，饲料酵母4公斤、复合多维2公斤、复合矿物质2公斤、鱼油9公斤。
3)、实验组3：饲料的配方是新鲜的脱脂鱼粉50公斤、豆粕10公斤、花生粕10公斤、面粉10，麦麸2，饲料酵母4公斤、复合多维2公斤、复合矿物质2公斤、鱼油10公斤。
4)、实验组4：饲料的配方是新鲜的脱脂鱼粉60公斤、豆粕10公斤、花生粕10公斤、饲料酵母4公斤、复合多维2公斤、复合矿物质2公斤、鱼油12公斤
配制的人工配合饲料经生化分析，结果见表1和表2.
表1 大菱鲆亲鱼4组试验饲料的蛋白、脂肪、能量组成
项目 试验组 试验组 试验组 试验组
1 2 3 4
蛋白质(％) 40.6 45.5 47.9 49.3
脂肪(％) 9.9 10.2 12.4 14.6
能量(kJ/100g) 113 119 115 108
表2 大菱鲆亲鱼4组试验饲料脂类脂肪酸组成
饲料组
脂肪酸(％) 1 2 3 4
C14:0 5.8 4.3 2.9 1.6
C16:0 23.3 21.5 17.4 10.7
C16:1 5.8 6.0 2.0 2.8
C18:0 4.9 3.8 7.8 6.5
C18:1 19.9 14.1 15.1 10.4
C18:2(n-6) 10.0 8.9 7.2 5.9
C18:3(n-3) 0.6 0.8 0.9 1.3
C18:4(n-3) 0.2 0.1 0.2 0.2
C20:1 11.6 12.3 4.5 5.7
C20:3(n-6) 1.3 1.0 0.6 0.9
C20:4(n-6) 0.5 0.3 0.2 0.9
C20:5(n-3) 6.4 8.7 10.9 10.8
C22:4(n-6) 2.8 1.8 4.7 5.6
C22:5(n-3) 2.0 1.8 2.2 2.4
C22:6(n-3) 10.3 11.0 13.0 16.1
∑n-3HUFA 18.7 21.5 26.1 29.3
试验结果：经过5个月的投喂，不同试验组雌鱼产卵的结果见表3和表4：
表3各组亲鱼的产卵的主要指标
项目 实验组
1 2 3 4
平均每尾产卵量 0.68×106 1.21×106 1.36×106 1.45×106
卵径(mm) 0.999 1.023 1.036 1.053
平均活卵率(％ ) 60 78 80 92.2
表4 各亲鱼组所产卵子脂类主要脂肪酸的组成百分比(％)
脂肪酸 亲鱼组
1 2 3 4
14:0 3.55 3.55 3.35 3.49
16:0 14.93 14.93 15.51 15.69
16:1 10.38 10.38 11.76 10.01
18:0 10.56 7.56 7.65 5.55
18:1 36.23 37.00 30.00 25.38
18:2(n-6) 6.02 6.02 4.80 5.90
18:3(n-3) 3.97 3.8 1.38 1.06
18:4(n-3) 2.37 2.01 1.97 2.20
20:1 1.09 1.12 1.58 1.15
20:3(n-6) 0.26 0.45 1.39 1.67
20:4(n-6) 0.41 0.80 1.10 1.53
20:5(n-3) 0.41 0.51 4.24 4.98
22:4(n-6) 3.75 2.98 2.44 2.04
22:5(n-3) 1.24 1.20 2.09 2.50
22:6(n-3) - 2.14 5.39 12.90
∑n-3HUFA 1.65 3.85 11.72 20.38
从试验结果中筛选出试验组4的人工配合饲料投喂亲鱼，可获得优质卵子。试验组4亲鱼培育人工饲料的的配制如下：
在100公斤配料物质中，其饲料配料及用量为：新鲜的脱脂鱼粉60公斤、豆粕10公斤、花生粕10公斤、饲料酵母4公斤、复合多维2公斤、复合矿物质2公斤、鱼油12公斤，配制成的饲料为半湿颗粒。
2、人工采卵授精方法的确定
A、人工采卵：试验组亲鱼10尾，通过光温调控和营养调控发育成熟，通过不同的采卵方式比较活卵率。
结果如下： 挤卵天数/次每天挤卵一次每两天挤卵一次每三天挤卵一次每四天挤卵一次 平均活卵率 90.2％ 50.8％ 30.2％ 20.8％
试验结果表明：大菱鲆在人工养殖条件下，很难自然产卵受精，且特殊的产卵方式使卵子极易过熟。大菱鲆特殊的排卵节律为：大菱鲆雌鱼的排卵间隔，多数在80-90h之间。在12-14℃时，人工采卵必需在大菱鲆雌鱼排卵后10小时之内挤卵(在人工养殖条件下，大菱鲆雌鱼不能自然产卵，而是卵子成熟后先排到排卵腔中，然后再由人工将其卵子挤出)，才能保证优质卵子的获得。整个繁殖群体，经试验证明：每天进行1次对排卵亲鱼的挤卵，效果好，平均活卵率为90.2％。活卵指卵子是圆的，透明的，缺少卵周系，活卵率为活卵/总卵数。
B、试验人工授精操作方法：
精液、卵子、水的体积比的试验：采卵，每100ml卵子为1组，共16个试验组，每组有三个平行。每个试验组加入精液(为了保证人工授精的质量，大菱鲆精液是从两尾雄鱼中采得。)不同的精液、卵子、水的体积比，及不同的受精时间，快速搅拌均匀使精卵充分接触，再加入少量经沉淀沙滤的海水，使不同试验组精液、卵子、水的体积比分别为1∶200∶200；1∶200∶100；0.5∶200∶200；0.5∶200∶100，使不同试验组配子接触时间分别为1～15分钟再加入海水，静置10分钟，待吸水膨胀后，清水冲洗2次，记录不同试验组受精率。
试验结果如下：
试验结果表明：精液、卵子、水的最佳体积比为1∶200∶200，配子接触时间以5分钟为宜。
实施例二、进行亲鱼培育和人工授精的规模化繁育试验。
大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)亲鱼240尾，亲鱼为优选的正常体色的健康大菱鲆。亲鱼的年龄：雌鱼和雄鱼均为3龄。平均规格为体重2700±15.0g，全长46±4cm。置于8个20m3水泥池中进行流水充气养殖，养殖用水为地下海水与自然海水，经砂滤后混合使用，全周年水质条件变化情况为：DO＞6.0mg/L，pH＝7.8-8.2，S＝30-32，T＝8-18℃。
亲鱼的饲料及饲喂：亲鱼的饲料为配制的人工配合饲料，由如下饲料原料及用量(在100公斤配料物质中)配制而成的半湿颗粒饲料：新鲜的脱脂鱼粉60公斤、豆粕10公斤、花生粕10公斤、饲料酵母4公斤、复合多维2公斤、复合矿物质2公斤、鱼油12公斤。亲鱼人工配合饲料的投喂时间是在2004年1月份开始进行的。整个繁殖季节保持投喂，日投喂2次。日投喂量为鱼体体重的2％-5％。
亲鱼的水温、光照调控：2004年1-3月水温控制在8-10℃，目光照时间为8小时，光照强度为400LUX，自此时期起亲鱼进入强化培育阶段，开始投喂人工配合饲料。2004年3-5月份开始，水温由8-10℃逐步增至14℃。光照时间由每天8小时逐渐增至每天16小时，如此在温光调控和营养强化培育条件下，亲鱼性腺发育加快，2个月后，亲鱼性腺发育完全成熟，到5月出现排卵。
人工采卵：经温光调控的亲鱼自5月初开始成熟、排卵，于5月中旬进入产卵高峰期，一直持续到6月底。整个繁殖群体，每天进行1次对排卵亲鱼的挤卵，以保证每次可采出优质的卵子。经镜检每批卵的平均活卵率在87.8％。
人工授精，大菱鲆精液从从两尾雄鱼中采得，精液、卵子、水的体积比为1∶200∶200。配子接触时间为5分钟，再加入海水，静置10～15分钟，待吸水膨胀后，清水冲洗1次～2次，放入2000ml量筒中，用海水使上浮卵和沉淀卵分离，记录上浮卵数，上浮卵经冲洗后放入孵化器中孵化。
在繁殖期内共获得1520万粒上浮卵，将获得的上浮卵进行脂肪酸含量的分析，其中∑n-3HUFA占脂肪酸含量的20.38％，平均受精成功率(4细胞数/活卵数)为89.6％，孵化率为50.8％。获得初孵仔鱼770万尾。