大红菇菌株的筛选及菌种制备方法 技术领域：
本发明属微生物技术领域，具体涉及大红菇的菌株筛选及菌种制备方法。
背景技术：
大红菇(Russula alutacea)是世界著名的名贵野生食用菌。大红菇还不能人工栽培，市场上的大红菇均来自野生。近年来野生大红菇由于过度采集和采集方式不科学以及无相应的技术措施，造成自然产量大幅下降。研究表明，在产区自然环境条件下，采用人工菌种和配套的技术措施，是解决大红菇供需矛盾的最经济有效的途径之一。
在大红菇保护扩繁技术中，优良菌种的获得是关键技术环节。大红菇菌株的获得通常是利用子实体或孢子进行分离、纯化，直接应用于大红菇的菌丝体生产。现有技术的不足在于大红菇菌种不能用出菇的方法进行菌种鉴定，只能根据菌丝形态及分离物来初步确定是否为大红菇纯培养物；生产的菌种一般用固体菌种。目前在国内采用液体菌种进行大红菇资源的保护扩繁应用不广泛。
发明内容：
本发明的主要目的就是克服现有技术不足，利用云南原产地大红菇子实体筛选出优良菌株，采用生物技术进行菌种鉴定，制备大红菇液体及固体优良菌种，为大红菇野生资源保护扩繁提供优良菌种。
本发明采用的真菌是大红菇(Russula alutacea)；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京.中关村；保藏日期：2009年12月15日；保藏登记入册的编号CGMCC NO.3525。
大红菇子实体中等大，菌盖6～16cm，扁半球形，后平展，中部下凹，湿时粘，不久干燥，深红色，鲜或暗紫红色，边缘平滑或有不明显条纹。菌肉白色。菌褶等长或几乎等长，褶间有横脉，直生或近延生，初乳白色，后淡赭黄色，褶前缘常常带红色。菌柄近圆形，长3～12cm，粗1～3.5cm，白色，上部或侧面常带红色，或全部粉红色而向下渐淡。孢子印黄色。
本发明的技术方案：
①采集野生大红菇子实体；
②组织分离或孢子分离；
③纯化菌株及菌株鉴定；
④生物学特性比较及生产性状比较；
⑤确定优良菌株；
⑥菌种生产及菌种应用；
经过筛选，获得菌丝体产量高、抗污染的大红菇液体菌种专用菌株菌苑-8。
本发明真菌(Russula alutacea)培养方法(以下为重量百分比)：
菌种分离纯化培养基：2％大红菇下脚料、0.001％VB1、2％葡萄糖、2％琼脂；
大红菇菌株分离及鉴定方法：
1、将大红菇子实体组织块或孢子液接种到上述试管琼脂培养基斜面上，于18-24℃下培养10-15天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得大红菇分离试管种。
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于18-24℃下培养10-15天，获得大红菇纯化试管种。
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的大红菇(Russula alutacea)Identities＝499/510(97％)，Gaps＝2/510(0％)，分析确定分离得到的纯培养物为大红菇菌丝体。
本发明大红菇菌种的制备方法分为：液体培养和固体培养两种。
液体菌种制备方法：
液体培养基配方为：5-10％麸皮、0.5-1％麦芽糖、1-2％可溶性淀粉，余下为水，pH自然。
1、将大红菇的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，于18-24℃下培养10-15天，获得试管菌种。
2、将试管种接种到500ml三角瓶(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为前述液体培养基配方，于20-26℃下摇床培养，转速为120-160r/min，培养时间5-7天。
3、将摇瓶菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1∶0.8v/(v·min)；搅拌转速为120-160r/min；接种量为5-10％；罐压：0.04Mpa；pH为6.0；温度为22-26℃；通气培养72-96小时，获得大红菇液体菌种。
固体菌种制备方法：
固体培养基配方为：木屑55-70％、棉籽壳20％、麸皮5-20％、磷肥1％、石膏1％、大红菇生长地腐殖土3％，含水量60％、pH自然。
1、将大红菇的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，于18-24℃下培养10-15天，获得试管菌种。
2、将试管种接种到500ml三角瓶(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为前述液体培养基配方，于20-26℃下摇床培养，转速为120-160r/min，培养时间5-7天。
3、采用前述固体培养基配方。将培养料混合后，加水拌均匀后，装入750ml的大口瓶中，压紧封口后在120℃灭菌60分钟，接入液体菌种，于22-26℃培养30-40天，直到菌丝长满。
具体实施方式：
实施例一：
1、将大红菇子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于22℃下培养15天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得大红菇分离试管种。
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于22℃下培养15天，获得大红菇纯化试管种。
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的大红菇(Russula alutacea)Identities＝499/510(97％)，Gaps＝2/510(0％)，分析确定分离得到的纯培养物为大红菇菌丝体。
4、将大红菇(Russula alutacea)菌苑-8的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，22℃下培养15天，获得试管种。
5、将试管种接种到500ml三角瓶中(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为马铃薯20％、葡萄糖2％、蛋白胨0.2％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸镁0.05％，余下为水，PH自然。于20℃下摇床培养，转速为120rpm，培养时间7天，获得一级液体菌种。
将一级液体菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1∶0.8v/(v·min)；搅拌转速为120r/min；接种量为5％；罐压：0.04Mpa；pH为6.0；温度为22℃；通气培养96小时，获得大红菇液体菌种。
实施例二：
菌种制备的步骤与实施例一相同。
1、将大红菇子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于25℃下培养10天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得大红菇分离试管种。
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于25℃下培养10天，获得大红菇纯化试管种。
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的大红菇(Russula alutacea)Identities＝499/510(97％)，Gaps＝2/510(0％)，分析确定分离得到的纯培养物为大红菇菌丝体。
4、将大红菇菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，22℃下培养6天，获得试管种。
5、将试管种接种到500ml三角瓶中(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为6％麸皮、0.6％麦芽糖、1.2％可溶性淀粉，余下为水，pH自然。于22℃下摇床培养，转速为140rpm，培养时间7天，获得一级液体菌种。
将一级液体菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1∶0.8v/(v·min)；搅拌转速为140r/min；接种量为8％；罐压：0.04Mpa；pH为6.0；温度为24℃；通气培养84小时，获得大红菇液体菌种。
实施例三：
1、将大红菇子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于25℃下培养6天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得大红菇分离试管种。
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于25℃下培养6天，获得大红菇纯化试管种。
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的大红菇(Russula alutacea)Identities＝499/510(97％)，Gaps＝2/510(0％)，分析确定分离得到的纯培养物为大红菇菌丝体。
4、将大红菇菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，25℃下培养5天，获得试管种。
5、将试管种接种到500ml三角瓶中(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为10％麸皮、0.5％麦芽糖、1％可溶性淀粉，余下为水，pH自然。于26℃下摇床培养，转速为160rpm，培养时间6天，获得一级液体菌种。
将一级液体菌种接种到固体培养基上，培养基配方为杂木屑78％、麸皮20％、蔗糖1％、石膏1％、含水量60％、PH自然。将木屑、麸皮、磷肥、石膏、腐殖土按比例称量后混合均匀，加水拌匀后装入750ml的菌种瓶中，每瓶装500ml，120℃灭菌60分钟后，接种后置于26℃培养30天，获得大红菇固体菌种。
实施例四：
1、将大红菇子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于24℃下培养5天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得大红菇分离试管种。
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于24℃下培养5天，获得大红菇纯化试管种。
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的大红菇(Russula alutacea)Identities＝499/510(97％)，Gaps＝2/510(0％)，分析确定分离得到的纯培养物为大红菇菌丝体。
4、将大红菇菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，24℃下培养5天，获得试管种。
5、将试管种接种到500ml三角瓶中(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为8％麸皮、1％麦芽糖、1％可溶性淀粉，余下为水，pH自然。于26℃下摇床培养，转速为160rpm，培养时间5天，获得一级液体菌种。
将一级液体菌种接种到固体培养基上，培养基配方为棉籽壳35％、木屑45％、麸皮18％、蔗糖1％、石膏1％，含水量60％、PH自然。将木屑、麸皮、磷肥、石膏、腐殖土按比例称量后混合均匀，加水拌匀后装入750ml地菌种瓶中，每瓶装500ml，120℃灭菌60分钟后，接种后置于20℃培养40天，获得大红菇固体菌种。