一种调控小鼠孤儿核受体的启动子及其用途.pdf

本发明公开了一个调控小鼠基因mLRH－1(mouse liver receptor homolog 1)在胚胎发育过程中高表达的启动子P2的核苷酸序列及其用途。此启动子在作为早期发育体外模型的小鼠胚胎干细胞中具有很强的活性，而在成体细胞株中只具有相对较弱的活性。P2启动子的发现为转基因动物研究和应用领域中选择性地调节异源基因或目的基因在胚胎发育早期高表达奠定了基础。

1.  一种启动子，其特征在于，它包括调控小鼠孤儿核受体(mLRH-1)在胚胎发育过程中高表达的启动子的核苷酸序列。

2.  如权利要求1所述的启动子，其特征在于，包括选自下述的核苷酸序列或具有功能活性的下述核苷酸序列的变体、同源物、片断或衍生物：
1)SEQ ID NO：1中975-1419位核苷酸；
2)SEQ ID NO：1中1-1419位核苷酸。

3.  如权利要求1所述的启动子，其特征在于，包括选自下述的核苷酸序列，且所述序列具有调控小鼠孤儿核受体(mLRH-1)在胚胎发育过程中高表达的启动子活性：
1)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有75％同源性的序列；
2)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有85％同源性的序列；
3)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有95％同源性的序列。

4.  如权利要求2所述的启动子，其特征在于，具有选自下述的核苷酸序列或具有功能活性的下述核苷酸序列的变体、同源物、片断或衍生物：
1)SEQ ID NO：1中975-1419位核苷酸；
2)SEQ ID NO：1中1-1419位核苷酸。

5.  如权利要求2所述的启动子，其特征在于，具有选自下述的核苷酸序列，且所述序列具有调控小鼠孤儿核受体(mLRH-1)在胚胎发育过程中高表达的启动子活性：
1)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有75％同源性的序列；
2)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有85％同源性的序列；
3)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有95％同源性的序列。

6.  一种用于调控外源基因在胚胎发育过程中高表达的构建物，其特征在于，所述构建物含有外源基因以及该外源基因可操作地连接与权利要求1所述的启动子。

7.  权利要求6所述的构建物，其特征在于，所述的启动子为包括选自下述的核苷酸序列或具有功能活性的下述核苷酸序列的变体、同源物、片断或衍生物：
1)SEQ ID NO：1中975-1419位核苷酸；
2)SEQ ID NO：1中1-1419位核苷酸。

8.  一种含有权利要求1至5任一项所述的核苷酸序列的载体。

9.  一种含有权利要求8所述载体的宿主或宿主细胞。

10.  权利要求1-5任一项所述启动子在转基因动物中的应用。

11.  权利要求1-5任一项所述启动子选择性调节外源基因在胚胎发育早期高表达的应用。

12.  一种在胚胎发育过程中高表达外源基因的方法，它包括以下步骤：
1)提供一构建物，所述构建物含有外源基因以及与该外源基因可操作地连接的权利要求1所述的启动子；
2)将步骤1)中的构建物转染或转化宿主或宿主细胞，使其表达外源基因。

13.  权利要求12所述的启动子为包括选自下述的核苷酸序列或具有功能活性的下述核苷酸序列的变体、同源物、片断或衍生物：
1)SEQ ID NO：1中975-1419位核苷酸；
2)SEQ ID NO：1中1-1419位核苷酸。

一种调控小鼠孤儿核受体的启动子及其用途
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体的涉及一种启动子及其用途。本发明特别涉及调控小鼠基因mLRH-1胚胎发育过程中高表达的启动子P2及其在转基因动物研究中的用途和其选择性调节外源基因在胚胎发育早期高表达的应用。
背景技术
小鼠孤儿核受体mLRH-1(mouse liver receptor homolog 1)在成体中主要的表达器官是胰腺、肝脏、小肠和卵巢。mLRH-1在上述组织中对多个基因的表达有重要的调控作用，广泛地参与了体内胆汁酸循环和胆固醇平衡的调节。另一方面，mLRH-1剔除(knock-out)的小鼠在胚胎发育的早期就致死，早于胰腺、肝脏等组织的分化，表明mLRH-1在胚胎发育的早期起了非常重要的作用。
已有的研究显示mLRH-1基因由9个外显子和8个内含子组成。mLRH-1在成体肝脏中的表达受到第一外显子上游的启动子P1(发明人以P1命名该启动子以区别于P2)的调控。P1具有较强的肝特异的活性。尚无明确的实验证据显示P1是否也调控mLRH-1在胚胎发育过程和其它组织中的表达。
小鼠胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ES Cell)普遍应用于基因的功能研究。可通过同源重组产生目的基因剔除的小鼠，观察由于目的基因的缺失而引起的小鼠表型变化，推测该基因在体内的生理功能。另一方面，ES细胞具有全能性，能根据环境因子的变化而定向分化，是体外研究早期发育和分化的优良模型。
因此，本领域迫切需要确立新的能发挥调控mLRH-1表达的启动子，而且该启动子在胚胎期和成体中有不同的表达调控作用。然后利用该启动子、或其表达载体在转基因动物中既可以生产有用物质，又可以进一步研究目的基因在体内特别是胚胎发育阶段的生理功能。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新的调控小鼠基因mLRH-1在胚胎发育过程中高表达的启动子的序列。
本发明的另一目的就是提供含有所述启动子序列的构建物，载体，以及它们的用途。
本发明的另一目的就是提供一种利用所述启动子在胚胎发育过程中高表达外源基因的方法。
本发明的第一方面提供了一种启动子，其特征在于，它包括调控小鼠孤儿核受体(mLRH-1)在胚胎发育过程中高表达的启动子的核苷酸序列。
在一优选例中，所述的启动子包括选自下述的核苷酸序列或具有功能活性的下述核苷酸序列的变体、同源物、片断或衍生物：
1)SEQ ID NO：1中975-1419位核苷酸；
2)SEQ ID NO：1中1-1419位核苷酸；
在另一优选例中，所述启动子包括选自下述的核苷酸序列，且所述序列具有调控小鼠孤儿核受体(mLRH-1)在胚胎发育过程中高表达的启动子活性：
1)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有75％同源性的序列；
2)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有85％同源性的序列；
3)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有95％同源性的序列；
在另一优选例中，所述的启动子具有选自下述的核苷酸序列或具有功能活性的下述核苷酸序列的变体、同源物、片断或衍生物：
1) SEQ ID NO：1中975-1419位核苷酸；
2) SEQ ID NO：1中1-1419位核苷酸；
在另一优选例中，所述的启动子具有选自下述的核苷酸序列，且所述序列具有调控小鼠孤儿核受体(mLRH-1)在胚胎发育过程中高表达的启动子活性：
1)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有75％同源性的序列；
2)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有85％同源性的序列；
3)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有95％同源性地序列；
本发明的第二方面，提供了一种用于调控外源基因在胚胎发育过程中高表达的构建物，所述构建物含有外源基因以及该外源基因可操作地连接与本发明上述的启动子。优选的，所述的启动子为包括选自下述的核苷酸序列或具有功能活性的下述核苷酸序列的变体、同源物、片断或衍生物：
1)SEQ ID NO：1中975-1419位核苷酸；
2)SEQ ID NO：1中1-1419位核苷酸；
3)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有75％同源性的序列；
4)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有85％同源性的序列；
5)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有95％同源性的序列；
本发明的第三方面，提供了一种含有本发明上述核苷酸序列的载体。
本发明的第四方面，提供了含有本发明上述载体的宿主或宿主细胞。
本发明的第五方面，提供了上述启动子在转基因动物中的应用。
本发明的第六方面，提供了上述启动子选择性调节外源基因在胚胎发育早期高表达的应用。
本发明的第七方面，提供了一种在胚胎发育过程中高表达外源基因的方法，它包括以下步骤：
1)提供一构建物，所述构建物含有外源基因以及与该外源基因可操作地连接的权利要求1所述的启动子；
2)将步骤1)中的构建物转染或转化宿主或宿主细胞，使其表达外源基因。
优选的，所述启动子为包括选自下述的核苷酸序列或具有功能活性的下述核苷酸序列的变体、同源物、片断或衍生物：
1)SEQ ID NO：1中975-1419位核苷酸；
2)SEQ ID NO：1中1-1419位核苷酸；
3)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有75％同源性的序列；
4)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有85％同源性的序列；
5)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有95％同源性的序列；
本发明还包括具有与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列75％、85％、90％、95％同源性的且具有相同调控功能活性的序列，可使用欧洲生物信息学研究所(EBI)提供的Clustal计算机程序测定序列同源性。还包括将SEQ ID NO：1核苷酸序列经过一个或多个(如1-10个)核苷酸的保守性取代、缺失、插入或添加而形成的，且具有相同调控活性功能的序列。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
在以下说明中所提到的“本发明的核苷酸序列”包括“本发明的启动子”的含义，反之亦然。另外，术语“本发明的核苷酸序列”与“本发明的多核苷酸序列”“P2启动子”“本发明启动子”是同义词，指具有P2启动子序列(SEQ NO：1)或其活性片段的多核苷酸序列。
本发明的功能活性是指本发明核苷酸序列的变体、同源物、片断或衍生物具有调控小鼠基因mLRH-1在胚胎发育过程中高表达的启动子活性。
有关本发明启动子和/或核苷酸序列的其他方面包括：含有本发明序列的结构；含有本发明序列的载体；含有本发明序列的质粒；含有本发明序列的转化细胞；含有本发明序列的转化组织；含有本发明序列的转化过的器官；含有本发明序列的转化过的宿主；含有本发明序列的转化过的动物。本发明还包括用所述启动子表达产物的方法，如在宿主动物细胞中表达；包括转移所述启动子的方法。
“可操作连接”是指DNA序列上游的启动子的连接，使得该启动子介导该DNA序列的转录。可以理解，启动子序列包括转录起始和翻译起始、翻译起始密码子之间的转录序列。
“构建物”是指能够影响与核苷酸序列相容的宿主中结构基因表达的核苷酸序列。该构建物至少包括启动子，并任选地包括转录终止信号。正如本文所述，还可使用其它实现表达所必需的或有帮助的因子。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个(较佳的小于10个)核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变该启动子的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上至P2启动子全长。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离上述多聚核苷酸。
P2启动子全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开P2启动子的核苷酸序列来设计引物，并用小鼠基因组DNA或含小鼠染色体的人工染色体克隆作为模板，扩增而得有关序列。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到本发明启动子(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该启动子序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，etal.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的启动子。
本发明也涉及包含本发明启动子的构建物或载体，以及用所述构建物或载体转化或转染的宿主细胞，以及经重组技术产生外源蛋白或功能性核酸的方法。
“外源”基因是指可操作地连接与本发明启动子且其转录和表达受到本发明启动子调控的任何基因、基因片断或具一定功能的多聚核苷酸。
“目的”基因是指实验者或生产者有意识的引入到某种载体中的基因或基因片断，其目的是为了在宿主或宿主细胞中表达该基因从而来研究该基因的生物学功能或获得有实用价值的该基因产物。
适用于本发明的外源基因没有特别限制，几乎所有的功能基因、功能基因片断或多聚核苷酸都可用于本发明。由于基因突变造成某蛋白在胚胎时期表达不足或不表达所导致的遗传病，可以从正常人细胞中分离得到有关基因，然后将其与本发明的启动子元件相连，形成含外源基因的构建物，然后将所述构建物用于基因治疗。
一种构建物的例子就是与P2启动子相连的外源基因。启动子一般应位于外源基因的上游。
本发明中，含P2启动子的核苷酸序列可优选地插入到载体，例如表达载体中。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：表达载体、克隆载体，例如适用于原核(如大肠杆菌等细菌)、低等真核细胞(如酵母)、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞中的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。在表达载体中，除了含有复制起点、P2启动子之外，还可含有标记基因和其他翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含P2启动子和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambrook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效地与待表达的外源基因相连接，以指导所述外源基因mRNA合成。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化或转染适当的宿主细胞，以使其能够表达外源蛋白质或功能性核酸。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化、转染宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。一些采用的转化、转染方法包括但并不限于：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多核苷酸序列来表达或生产外源蛋白。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明所述多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转染合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基、培养液中培养宿主细胞；
(3).从培养基、培养液或细胞中分离、纯化蛋白质。
具体而言，本发明的启动子可通过将相应的编码序列引入宿主细胞(直接引入或通过引入含外源基因编码序列的载体)，并在合适的条件下培养转化、转染的宿主细胞以表达外源蛋白，然后分离和纯化出外源蛋白。
在上面的方法中的外源蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
发明人采用RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)和5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)的方法确定了R1 ES细胞株中mLRH-1的表达和转录子起始位点。利用PCR获得了此转录起始位点上游1.4kb的序列(以P2命名，见图6)。通过细胞转染和报告基因分析验证P2是否具有启动子活性，结果显示P2在R1 ES细胞株中具有很强的活性，而在成体细胞株中只有较弱的活性。对小鼠胚胎发育各个时期的胚胎作RT-PCR检测表明P2是调控mLRH-1在胚胎发育早期表达的启动子。对此1.4kb的P2启动子进行缺失和细胞转染实验分析确定了调控mLRH-1基因在胚胎发育早期高表达所必需的核心启动子序列(见图7)。
图1.RT-PCR扩增R1 ES细胞中mLRH-1琼脂糖电泳结果。
1为DNA分子量标准；2为Primer-a与Primer-5r引物配对；3为Primer-1与Primer-5r引物配对；2与3的模板为R1 ES细胞总RNA经反转录酶处理后的产物；4为Primer-a与Primer-5r引物配对；5为Primer-1与Primer-5r引物配对；4与5的模板为R1 ES细胞总RNA未经反转录酶处理。
图2. 5’RACE inverse PCR的方法确定V2异构体的5’末端。
1为DNA分子量标准；2为5’RACE inverse PCR结果，经测序，大分子量的条带为小分子量条带所代表的DNA的双体。V2异构体的5’末端位于mLRH-1基因内含子1的6408A。
图3.P2启动子活性的细胞转染和报告基因分析。
数据来自三次不同转染实验的平均值。负对照pGL3basic的值为1，其它转染实验中的报告基因激活活性以相对负对照的激活倍数表示。
图4.RT-PCR检测小鼠胚胎发育各个时期的mLRH-1表达情况。
M为DNA分子量标准；1-8为Primer-1与Primer-5r配对检测V1异构体；9-16为Primer-a与Primer-5r配对检测V2异构体；17-24为HPRT对照；1，9，17分别为水对照；2，10，18为胚胎发育5.5天；3，11，19为胚胎发育6.5天；4，12，20为胚胎发育7.5天；5，13，21为胚胎发育8.5天；6，14，22为胚胎发育9.5天；7，15，23为胚胎发育10.5天；8，16，24为胚胎发育11.5天。
图5调控mLRH-1基因在胚胎发育早期高表达所必需的P2核心启动子的确定。
将不同长度的P2启动子构建物分别转染R1 ES细胞株和Y1细胞株。数据来自至少三次不同转染实验的平均值。负对照的值为1，其它转染实验中的报告基因活性以相对负对照的激活倍数表示。
图6 P2的完整序列(1419bp)
图7 调控mLRH-1基因在胚胎发育早期高表达所必需的P2核心启动子序列(445bp)
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：确定R1 ES细胞株中mLRH-1的表达和转录子起始位点
以已知的mLRH-1 cDNA(简称V1)检索EST(expressed sequence tag)数据库，发现一条EST(GI：16486133)与V1在5’末端不相同。在该EST中，V1中的第一外显子被一段未知序列所取代。进一步将此未知序列检索小鼠基因组数据库，发现该序列位于mLRH-1基因的第一内含子中。因此，该EST所代表的产物是mLRH-1的一个异构体(简称V2)。根据V2 5’末端序列合成正向引物Primer-a(表1)，与第五外显子内的反向引物Primer-5r(表1)配对，以R1 ES细胞总RNA经反转录后的cDNA为模板，可扩增出491bp的明显条带，而根据V1异构体中包含的第一外显子序列合成的正向引物Primer-1(表1)，与Primer-5r配对，却不能获得扩增产物(图1)。显示R1 ES细胞中只存在这种新的异构体V2，而不存在V1形式。
根据V2异构体的5’端序列设计反向引物Primer-br和Primer-cr(表1)，与位于第二、三外显子的正向引物Primer-2和Primer-3(表1)分别配对，利用5’RACE inverse PCR和测序确定了V2异构体的5’末端(图2)。